JP3284127B2 - オリゴヌクレオチドの固相支持体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は連結分子を介するオ
リゴヌクレオチド３'位末端に結合した低分子量の尾分
子(tail molecules)を有するオリゴヌクレオチドの合成
法、３'位末端に結合した低分子量尾分子を有するオリ
ゴヌクレオチドおよびかかるオリゴヌクレオチド合成に
利用される中間体に関する。

【０００２】

【従来の技術】オリゴヌクレオチドはＤＮＡのポリメラ
ーゼ連鎖反応の合成に関しプライマーとして作用するこ
とを含め、種々の用途を有する。オリゴデオキシヌクレ
オチド(ＯＤＮ)はホスファイト-トリエステル合成法を
用い、固相担体で都合よく合成される。かかる合成の詳
細はティ・アトキンスらの文献を参照〔Ｔ.Ａtkinson,
Ｍ.Ｓmith,Ｏligonucleatide Ｓynthesis,Ａ practica
l Ａpproach,Ｍ.Ｊ.Ｇait(ed.),ＩＲＬ press,pp３５〜
８１(１９８４)〕。この文献は、オリゴヌクレオチドの
実際の合成につき工程条件による詳細な工程を開示す
る。事実、この文献に記載された方法は、現在種々の製
造業者から入手可能な市販のオリゴヌクレオチド合成機
において利用されている。

【０００３】アセラインら〔Ａsselin eet.al(Ｐroc.
Ｎatl.Ａcad.Ｓci．８１,３２９７〜３３０１(１９８
４))〕はある種のオリゴヌクレオチドの合成を開示す
る。そこでは、インターカレーティング試薬をオリゴデ
オキシヌクレオチドに共有結合的に結合させている。用
いたインターカレーティング試薬は２-メトキシ-６-ク
ロロ-９-アミノアクリジンである。アクリジン分子はオ
リゴヌクレオチドに、オリゴデオキシヌクレオチドの
３'-ホスフェートを当該アクリジン分子の９-アミノ基
に連結させる炭素数３〜６のメチレン鎖を介して、共有
結合的に結合されている。この研究の著者は、アクリジ
ン修飾のオリゴヌクレオチドが相補的配列の存在下にイ
ンターカレーティング試薬(即ち、アクリジン)によって
大きな安定性を示すことを見出だしている。この著者は
ある種の熱力学的パラメーターを測定し、これらのパラ
メーターを介して、アクリジン環の共有結合が合成オリ
ゴヌクレオチドの相補的配列への結合を強力に安定化さ
せることを示している。結合したインターカレーティン
グ試薬および相補的な鎖を有するオリゴヌクレオチドの
溶融温度(Ｔm)は、インターカレーティング試薬および
相補的鎖を有しない同様なオリゴヌクレオチドの溶融温
度よりもより高い。以上の結果は、インターカレーティ
ング試薬の存在がオリゴヌクレオチドとその相補的鎖の
間において形成された複合体（コンプレックス）を強力
に安定化させることを明確に示していると、かかる著者
は結論している。

【０００４】同様の研究で、レットシンガーらは(Ｌets
inger et.al.(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.sci.８６,６５５３〜
６５５６(１９８９)))、ヌクレオチドの３'位末端の間
のホスフェート結合において共有結合したコレステリル
基を持った１群のオリゴヌクレオチドを製造している。
種々の長さのオリゴマーが合成されている。３'位末端
または３'位と５'の両末端のいずれかに隣接してコレス
レリル部分を持つオリゴマーを、そのように置換しなか
ったオリゴマーと比較している。これらの化合物はＨＩ
Ｖ-複製に対する抑制作用について試験された。２０個
のオリゴヌクレオチドの３'位末端に隣接して１つのコ
レステリル基を固定すると、オリゴヌクレオチドの抗菌
活性が実質的に増大した。第２コレステリル基をオリゴ
ヌクレオチドの５'末端に固定すると、モノコレステリ
ル誘導体オリゴマーに比し、抗菌活性が減少した。

【０００５】レットシンガーらの化合物は、まず、支持
体結合・ジヌクレオシド水素ホスホネート誘導体を手作
業で製造された。次いで、コレステリル基をヌクレオチ
ド相互間のリンに、酸化ホスホロアミド化により結合さ
せる。オリゴヌクレオチドはホスホロアミド化を用い、
市販のＤＮＡ合成機により最初のジヌクレオシドから伸
張合成された。

【０００６】市販のオリゴヌクレオチド合成用に制御さ
れた細孔付ガラスビーズは、入手可能である〔ＣＰＧ,
Ｉnc.,Ｐierce Ｃhemical Ｃo.およびＳigma Ｃhemical
Ｃo.〕。前記のごとく(アトキンスおよびスミス)、制
御された細孔付ガラスビーズ(以下、ＣＰＧ)は、長鎖の
アルキルアミン、たとえばその末端において利用可能な
遊離のアミノ基を有し一方ではＣＰＧに結合されている
アルキルアミンを用い、製造業者により変性される。そ
の合成の間に成長するオリゴヌクレオチドへの結合のた
めに、ＣＰＧ上の長鎖のアルキルアミンの末端アミンと
の種々なアミド結合が得られる。この合成の改良はポン
ら〔Ｐon et.al.ＢioＴechniques６(８),７６８(１９８
８))〕によって報告された。この報告に．おいて、ポン
らは長鎖アルキルアミンＣＰＧ上の有り得る汚染側鎖を
予めキヤップし、ごく普通に用いられる有毒な結合試薬
ＤＣＣ(ジシクロヘキシルカルボジイミド)に代えて、Ｄ
ＥＣ(水溶性カルボジイミドである１-(３-ジメチルアミ
ノプロピル)-３-エチルカルボジイミドまたはＥＤＣ)の
使用を導入している。

【０００７】ネルソンら〔Ｎelson et.al(Ｎuc.Ａcids
Ｒesearch １７(１８),７１８７〜７１９４(１９８
９))〕は近年３'末端置換基を組み込んだオリゴヌクレ
オチドの合成を報告する。３'位末端尾分子付オリゴヌ
クレオチドの製造ために、ネルソンらはＤＭＡＰ(ジメ
チルアミノピリジン)の存在下に無水コハク酸で処理し
て第二級ヒドロキシ基のＮ-Ｆmoc-Ｏ-ＤＭＴ-アミノ-
１,２-プロパンジオールを誘導し、その後、ＤＣＣ中p-
ニトロフェノールで処理した。活性化した誘導体は次い
で長鎖アルキルアミンＣＰＧ担体に固定する。ジメトキ
シトリチル保護基を第一級アルコールのプロパンジオー
ルからはずし、オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体に固定
したまま第一級ヒドロキシ基から段階的に合成する。合
成ヌクレオチドを脱保護し、ＣＰＧ担体から分離させ
た。しかし、この３'-アミン修飾オリゴヌクレオチドの
純度は証明されていない。この合成のこの段階では、
３'位末端置換基が未だオリゴヌクレオチドと結合せね
ばならない。粗製のオリゴヌクレオチドをビオチン-Ｘ
Ｘ-ＮＨＳエステルでビオチニル化する。ビオチニル化
ののち、セファデックスとＨＰＬＣの両方による第２精
製が必要である。

【０００８】ネルソンらの上記方法は尾分子形成試薬で
誘導、修飾可能な官能基を有するオリゴヌクレオチドを
形成し、次いで再精製している。しかし、尾分子形成試
薬での誘導化は、オリゴヌクレオチド合成の完了後にお
いてのみ行なわれるものである。系統的に段階を経てヌ
クレオチドをヌクレオチドによって組み立てようやく完
成した貴重なオリゴヌクレオチドが、かかるオリゴヌク
レオチドに対する誘導化に起因する不完全な反応、副反
応、誘導化後に必要な多数の精製操作で損失を被るので
ある。加えて、この合成は、前記したポンらの改善を採
用していない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】オリゴヌクレオチドの
有用性は、例えば、ＬetsingerらおよびＡsselineらの
３'−尾分子付コレステロールおよび３'−尾分子付アク
リジンオリゴヌクレオチドに関する上記の例のように
３'末端に低分子量の基を含むことによって、向上させ
ることができる。血清中の３'−尾分子付オリゴヌクレ
オチドの安定性もまた増大される。例えば、未修飾のＯ
ＤＮは血清を含む媒体中では３'−オキソヌクレアーゼ
により急速に分解される。３'−末端ホスホジエステル
のある種の化学修飾はこの分解を防ぐことができる。シ
ョーら［Ｓhow ｅｔ．ａｌ．(Ｎucl.Ａcids Ｒes.１９
(４),７４７(１９９１))］は最後の二つのヌクレオチド
間のホスホジエステル結合をホスホロチオエート、ホス
ホロアミデート、または逆の結合に変換するとヌクレア
ーゼに対する安定性を著しく改善した。ヌクレアーゼ安
定性を改善することが明らかとなった他の結合にはα−
デオキシヌクレオチド誘導体およびメチルホスホネート
誘導体がある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の第一の態様で
は、オリゴヌクレオチドの３'末端に結合した低分子量
の尾分子をもつオリゴヌクレオチド合成の改良法を提供
することが大きな目的である。さらに別の目的は連結分
子を介してオリゴマーに結合した低分子量をもつオリゴ
ヌクレオチドの合成法を提供することである。本発明の
もう一つの目的は３'末端につき、ホスホネートエステ
ルおよびホスホネートエステルに結合した尾分子で誘導
化されたオリゴヌクレオチドを供給することである。さ
らに、当該目的はオリゴヌクレオチドの製造に適当な連
結分子および支持体を提供することである。さらに、オ
リゴヌクレオチドを組み立てることができるような適当
な低分子量分子をもつ連結分子を提供することも目的で
ある。

【００１１】本発明の第二の態様は、オリゴヌクレオチ
ドの合成に使用可能な、保護アミノ基をもつ連結分子を
開示する。本発明の第三の態様はアミノ基で修飾したオ
リゴヌクレオチドに添加可能な挿入基（インターカレー
テイング基）をもつ尾分子付試薬を提供する。本発明の
第四の態様はオリゴヌクレオチドの合成に使用可能な、
保護アルカノール基をもつ連結分子を開示する。

【００１２】これらの目的および本明細書の残りの部分
から明らかとなるような目的は、連結分子を介して３'
末端に結合した低分子量尾分子をもつオリゴヌクレオチ
ド合成法で達成される。最初の態様の方法は、他の二つ
の官能基の反応性とは隔っていて、異なるような各々の
化学反応性を示した三つの独立した官能基をもつ分子を
連結分子として選択することからなる。連結分子の一番
目の官能基を低分子量の尾分子と反応させて、その尾分
子を連結分子に結合する。連結分子の二番目の官能基を
コハク酸無水物で処理し、生成するカルボン酸残基を固
相支持体と反応させて、その固相支持体に結合した尾分
子をもつ連結分子に結合または固定する。

【００１３】本明細書の開示を通して、水酸基をもつ連
結分子(例えばＲ−ＯＨ)の固相支持体への結合は、上述
のように、サクシネート結合を介して完成する。したが
って、"支持体−ＯＲ"式において、"支持体−Ｏ"の表示
にはこのようなサクシネート結合が包含される。

【００１４】第１の３'−ホスホロアミダイトヌクレオ
チドを次いで連結分子の三番目の官能基と反応させ、そ
のヌクレオチドを３'末端を介して連結分子に結合す
る。第１のヌクレオチドを連結分子に結合すると、その
ヌクレオチドは連結分子を経て尾分子に結合し、かつ連
結分子を経て固相支持体にも接続または固定する。さら
に、３'−ホスホロアミダイトヌクレオチドを引き続い
て先行するのヌクレオチドの５'末端と反応させ、その
オリゴヌクレオチドの３'末端で連結分子に結合した合
成オリゴヌクレオチドを生成する。第１のヌクレオチド
についてと同じように、その合成ヌクレオチドが３'末
端を経て連結分子に結合すると同時にそれは尾分子およ
び固相支持体に結合する。このように、生長するオリゴ
ヌクレオチドはさらにオリゴヌクレオチドと反応する間
に、固相支持体に結合される。連結分子を介して３'末
端に結合した尾分子をもつオリゴヌクレオチドは次いで
連結分子の二番目の官能基と固相支持体との間の連結を
断つことによって固相支持体から切り離される。連結分
子を介して３'−末端に結合した尾分子をもつオリゴヌ
クレオチドがそれから単離される。

【００１５】本発明の第一の態様の好ましい実施例で
は、連結分子上の官能基は一級アルコール、二級アルコ
ールおよびアミンを含む。尾分子をアミンと反応させ尾
分子を連結分子に結合し、その尾分子をもつ連結分子を
固相支持体につなぐために固相支持体をその二級アルコ
ールと反応させ、それから第１のホスホロアミダイトヌ
クレオチドをその一級アルコールと反応させ、連結分子
と結合する。

【００１６】(２Ｓ,４Ｒ)−４−ヒドロキシ−２−ヒド
ロキシメチルピロリジン(４−ヒドロキシ−２Ｓ−トラ
ンス)−２−ピロリジンメタノールまたはトランス−４
−ヒドロキシ−Ｌ−プロリノールとも表示される)は連
結分子として特に好ましい。

【００１７】尾分子はレポーター基、インターカレーテ
ィング基、親油性基、および開裂基（切断基）を含め、
数多くの注目の分子の任意の一つとして選別される。親
油性基として適当なのはコレステロールである。レポー
ター基として適当なのはビオチンおよびフルオロホア
ー、例えばアクリジン、フルオレセイン、ローダミン、
リッサミンローダミンＢ、マラカイトグリーン、エリス
ロマイシン、テトラメチルローダミン、エオシン、ピレ
ン、アンスラセン、４−ジメチルアミノナフタレン、２
−ジメチルアミノナフタレン、７−ジメチルアミノ−４
−メチルクマリン、７−ジメチルアミノクマリン、７−
ヒドロキシ−４−メチルクマリン、７−ヒドロキシクマ
リン、７−メトキシクマリン、７−アセトキシクマリ
ン、７−ジエチルアミノ−３−フェニル−４−メチルク
マリン、イソルミノール、ベンゾフェノン、ダンシル、
ダブシル、マンシル、スルホホダミン、４−アセチルア
ミド−４'−スチルベン−２,２'−ジスルホン酸ジナト
リウム塩および４−ベンツアミド−４'−スチルベン−
２,２'−ジスルホン酸ジナトリウム塩である。インター
カレーティング基として適当なのはアクリジン、エリプ
チシン、メチジウム、エチジウム、フェナン、フェナン
トロリン、スロリン、２−ヒドロキシエタンチオレート
−２,２',２"−ターピリジン−プラチナム(II)およびキ
ノキサリンであろう。また、開裂基(cleaving group)
として適当なのは、鉄(Ｆe)を結合するためのＥＤＴＡ
リガンドまたはポルフィリンリガンド、および銅(Ｃu)
を結合するためのフェナンスロリン(フェナントロリン)
リガンドである。

【００１８】連結分子のアミンとの反応に関し、尾分子
が固有の接続基を含むように選択されるかまたは付加的
な接続基(connecting group)が適当な化学合成を経て尾
分子に取り付けられる。付加的な接続基を用いると、そ
れは結合したのちは、固有の接続基のように尾分子を連
結分子に連結するのにつかわれる。固有のまたは付加的
な接続基のいづれを使用するにしろ、連結分子と反応し
て尾分子を当該連結分子に連結させるようなものが接続
基である。尾分子を一番目の官能基を介して連結分子に
結合した後であってその連結分子を固相支持体に結合す
る前に、連結分子の三番目の官能基は選択的に保護され
る。その保護された三番目の官能基をもつ連結分子が、
それから二番目の官能基を介して固相支持体に取り付け
られる。次いで三番目の官能基は脱保護され、第１のホ
スホロアミダイトヌクレオチドはその脱保護された官能
基を介して連結分子に結合される。

【００１９】本発明の第一態様の目的は３'−末端水酸
基(ヒドロキシ基)を有するオリゴヌクレオチド誘導体で
さらに達成される。ホスフェートエステルは３'−末端
水酸基上に位置し、式

【化２】 または

【化３】 (式中、Ｚは−ＣＯ−Ｑn−Ｒ,−ＣＯ−Ｏ−Ｑn−Ｒ,−
ＣＯ−ＮＨ−Ｑn−Ｒ,−ＣＳ−ＮＨ−Ｑn−Ｒ,または−
ＳＯ₂−Ｑn−Ｒ、mおよびm'は独立して１１より小さい
正の整数、nは０または１、Ｑは接続基、Ｒはレポータ
ー基、インターカレーティング基、親油性基および開裂
基からなるグループから選ばれる)を有する。

【００２０】この群のうち、特に好ましいのは構造式

【化４】 の化合物である。

【００２１】特に好ましい３'−尾分子付オリゴヌクレ
オチドは、オリゴマーの３'末端に連結分子を介して結
合したコレステロールまたはアクリジンのいづれかをも
つオリゴヌクレオチドを包含する。コレステロール基は
カルバメート結合を利用して連結分子に結合され、ま
た、アクリジン基、好ましくは９−エチルアクリジンま
たは別の９−アルキルアクリジンはアミド結合(実際に
は、９−エチルアクリジンのエチル基を仮定する場合に
はアルキルアミン結合)を利用してオリゴヌクレオチド
に結合される。他の尾分子はウレア、チオウレアまたは
スルホンアミド結合を介して連結分子に結合される。

【００２２】尾分子を連結分子に結合する際には、接続
基Ｑは好ましくはアルキル、アルコキシ、アルコキシア
ルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、アリ
ールオキシ、アラルキル、ヘテロ環状、ヘテロアリー
ル、置換アリール、置換アラルキルから成る群から選ば
れる。

【００２３】さらに本発明の第一の態様の目的は、構造
式

【化５】 または

【化６】 (式中、Ｚは−ＣＯ−Ｑn−Ｒ,−ＣＯ−Ｏ−Ｑn−Ｒ,−
ＣＯ−ＮＨ−Ｑn−Ｒ,−ＣＳ−ＮＨ−Ｑn−Ｒ,または−
ＳＯ₂−Ｑn−Ｒ、mおよびm'は独立して１１より小さい
正の整数、nは０または１、Ｑは接続基で、Ｒはレポー
ター基、インターカレーティング(挿入)基、親油性基お
よび開裂基からなるグループから選ばれ、ＹはＨまたは
ジメトキシトリチルおよびＸは固相支持体である)の化
合物を含むオリゴヌクレオチド合成のための化合物と支
持体で達成される。有用な支持体としては、長鎖アルキ
ルアミンで誘導され制御された細孔のガラス支持体が含
まれる。

【００２４】この群のうち、特に好ましいのは構造式

【化７】 の化合物である。

【００２５】本発明の第一の態様の目的はさらに構造式

【化８】 または、

【化９】 (式中、Ｚは−ＣＯ−Ｑn−Ｒ,−ＣＯ−Ｏ−Ｑn−Ｒ,−
ＣＯ−ＮＨ−Ｑn−Ｒ,−ＣＳ−ＮＨ−Ｑn−Ｒ,または−
ＳＯ₂−Ｑn−Ｒ、mおよびm'は独立して１１より小さい
正の整数、ｎは０または１、Ｑは接続基で、Ｒはレポー
ター基、インターカレーティング基、親油性基および開
裂基からなるグループから選ばれ、ＹはＨまたはジメト
キシトリチルである)の化合物で達成される。

【００２６】この群のうち、特に好ましいものは構造式

【化１０】 の化合物である。

【００２７】上記の各構造式で、mおよびm'は１１より
も小さい正の整数、すなわち、各々独立してに１,２,
３,４,５,６,７,８,９または１０である。特に好ましい
のは、mおよびm'が６またはそれ以下、すなわち、独立
して１,２,３,４,５または６である化合物である。

【００２８】ここに特許請求した発明の別な態様は通常
のカルボン酸のテトラフルオロフェニル(ＴＦＰ)の合成
のための改良された化合物および方法を提供することで
ある。このような活性化エステル誘導体は有利には(１)
アクリジン−ＣＰＧの合成に使用され（これは、３'−
尾分子付オリゴヌクレオチドの合成にも使用することが
できる）、（２)３'−アミン−尾分子付オリゴヌクレオ
チド合成後の修飾に使用され、(３)内部アミン修飾オの
リゴヌクレオチドの修飾に使用することができる。

【００２９】本発明の態様は、さらに、３'−尾分子付
オリゴヌクレオチドの合成に有利に用いられるアミノヘ
キシル修飾・固相支持体およびヘキサノール修飾・固相
支持体を開示する。

【００３０】

【発明の実施の形態】Ａ.１.３'−尾分子付オリゴヌク
レオチドの直接合成のための３'−尾分子を有する修飾
固相支持体(方法Ａ) 本発明者らは、連結分子を用いて、オリゴヌクレオチド
の３'末端に結合した低分子量尾分子をもつオリゴヌク
レオチドが合成できることを見出した。連結分子は三個
の化学的に明確に異なる官能基をもつように選ばれる。
このような連結分子を用いると、低分子量の尾分子がま
ず始めに連結分子に結合される。その低分子量尾分子を
もつ連結分子は次いで固相支持体に結合または固定され
る。それからオリゴヌクレオチドが合成される。合成の
間、オリゴヌクレオチドは連結分子に固定され、その連
結分子が次いで固相支持体系に固定される。オリゴヌク
レオチドは、手作業またはＤＮＡ合成機のいづれにして
も、標準的なホスホルアミダイト化学を駆使して合成さ
れる。オリゴヌクレオチドの合成が完成すると、連結分
子およびそれに結合した低分子量尾分子を有する合成オ
リゴヌクレオチドが、固相支持体から切り離される。こ
れは、オリゴヌクレオチドを固相系から遊離させる。オ
リゴヌクレオチドは連結分子を介して３'末端に結合し
た低分子量尾分子をもつに至る。

【００３１】上記の製造工程を用いれば、３'末端に結
合した低分子量尾分子をもつオリゴヌクレオチドは、単
一の精製工程に付す必要があるにすぎない。こうして、
従来の技術に比べて、３'末端に結合した当該分子をも
つオリゴヌクレオチドは容易に、しかも迅速に製造され
る。

【００３２】そこに結合した好適な低分子量をもつ連結
分子は、オリゴヌクレオチド合成とは無関係に合成され
る。結合した当該尾分子をもつ連結分子が、その連結分
子の一番目の官能基と尾分子を反応させることによって
一旦製造されると、その連結分子と尾分子の組合せ体
は、各々に３'末端に結合した低分子量分子をもつ多数
の異なるオリゴヌクレオチドの製造のために、ＤＮＡ合
成機に用いるのにふさわしい試薬として見なすことがで
きる。これは、所望により連結分子と尾分子の組合せ体
の多量の合成および保存を可能にさせる。さらに、連結
分子の種々の他の尾分子との別な組合せ体も同じように
作られる。これらは、ＤＮＡ合成機を用いるオリゴヌク
レオチド合成の非有機化学者らによって使用することが
できる。このように、合成有機化学の学科に熟練してい
ない人でも、３'末端に結合した選択低分子量尾分子を
もつヌクレオチドの合成のために、かゝる自動ＤＮＡ合
成機における最初の試薬としてその連結分子−尾分子の
組合せの一部を容易につかうことができる。

【００３３】さらに、多くのヌクレオチドについて共通
の配列をもちかつオリゴヌクレオチドの残部については
異なる配列を有するが問題となる同じ３'−尾分子を連
結分子を有するような多くのオリゴヌクレオチドは、単
に、部分的に生成した"共通の"オリゴヌクレオチドを有
する固相支持体を分割しこれを連結分子および関心のあ
る尾分子と結合させることによって製造することができ
る。オリゴヌクレオチドの異なる部分の合成は、オリゴ
ヌクレオチドの共通部分をもつ固相支持体の個々の部分
をＤＮＡ合成機に充填することで遂行され、ヌクレオチ
ドの所望の配列を完成することができる。

【００３４】化合物(２Ｓ,４Ｒ)−４−ヒドロキシ−２
−ヒドロキシメチルピロリジン、工程Iの化合物２、(４
−ヒドロキシ−(２Ｓ−トランス)−２−ピロリジンメタ
ノールまたはトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリノ
ールとも同一)はオリゴヌクレオチドの３'末端に関心の
分子を結合するのに特に有用な連結分子として役立つ。
この化合物は容易に市販のＮ−ＣＢＺ−Ｌ−ヒドロキシ
プロリン(sigma chemical Ｃo.)から製造される。スタ
ンフィールドら［stanfield et.al.(Ｊ.Ｏrg.chem.４
６,４７９９(１９８１))によって記述されたと同様の方
法を利用するＮ−ＣＢＺ−Ｌ−ヒドロキシプロリンの還
元は、ボラン−テトラヒドロフランコンプレックス(Ａl
drich chemical Ｃo.)を用いて達成される。この還元は
光学純度を保持しつゝ進行し、化合物１が得られる。化
合物１のＣＢＺ保護基は水素気流の下でパラジウム−炭
素還元を用いて容易に除去される。この反応は円滑に進
行し、化合物２の定量的収量を与える。

【００３５】化合物２は、オリゴヌクレオチドが合成さ
れる基礎物質として利用される一級水酸基を含む。さら
に、化合物２は固相支持体に結合するのに利用される二
級アルコール基と関心の尾分子を結合するのに利用され
る二級アミンを含む。オリゴヌクレオチドの合成が完成
すると、関心の尾分子は連結分子を介してオリゴヌクレ
オチドに結合したまゝで残る。連結分子を介し結合した
関心の分子を含む完成オリゴヌクレオチドを固相支持体
から切断ののち、連結分子の二級水酸基は、本質的に空
間的に強固に保持され、連結分子を第１ヌクレオチドに
結合させるホスフェート結合の付近から離れる。これ
は、連結分子とオリゴヌクレオチドの３'末端ホスホネ
ート基の間の結合の増大した安定性をもたらす。

【００３６】さらに、化合物２は単一の光学異性体であ
って種々の立体異性体の混合物ではないから、オリゴヌ
クレオチドの３'末端と連結分子の間の結合はまた単一
の異性体を生じ、物理的性質に影響するような立体異性
体の混合物を生じない。これは、インターカレーティン
グ基または他の反応性基をオリゴヌクレオチドの３'末
端に結合する際に特に重要である。なぜなら、インター
カレーティング剤の、二本鎖ヌクレオチドおよび相補的
ＤＮＡ部分との最適な結合には、立体形態に関する正確
で重要な必須条件があるためである。

【００３７】他の連結分子は構造式

【化１１】 の化合物(式中、mおよびm'は１〜１０までの正の整数)
である。これらの連結分子はまた、構造中にアミノ基、
一級水酸基、二級水酸基の官能基も有する。このクラス
の二つの特に有用な連結分子は３−アミノ−１,２−プ
ロパンジオールおよび４−アミノ−１,３−ブタンジオ
ール(１３)(工程III参照)である。

【００３８】関心の尾分子の連結分子への結合は、上述
のオリゴヌクレオチド合成と完全に無関係に行われる。
関心の低分子量尾分子は有機化学技術や反応を駆使して
連結分子に結合される。連結分子の二級アミノ基は、関
心の低分子量尾分子を当該連結分子、例えば化合物２
に、数多くの適当な接続基または例えばアミド結合、カ
ルバメート結合、ウレア結合、チオウレア結合またはス
ルホンアミド結合のような結合のいづれかを介して結合
するのに利用される。この開示があれば、連結分子、例
えば化合物２の二級アミンと関心の化合物が適当な接続
基または連結基との間における他の適切な反応もまた、
当業者に示唆されるであろう。

【００３９】本明細書並びに添付の特許請求の範囲を明
確にすべく、前記"連結分子"なる語と、尾分子をこの連
結分子に結合するのに用いられるような"連結基"なる語
の間における混同を避けるために、"接続基"(Ｃonnecti
ng group")なる語が用いて、接続する基または連結す
る基を示す。これらの基に与えられた名前に無関係に、
これらの基は尾分子を連結分子に連結、接続または結合
する。

【００４０】オリゴヌクレオチドの３'尾分子となる関
心の分子が、かくして連結分子に接続されると、その連
結分子上の一級水酸基は好適には、例えばジメトキシト
リチル基のような基で保護される。これは、４−ジメチ
ルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)の存在下にピリジン中ジメ
トキシトリチルクロライド(ＤＭＴrcl)を用いて都合よ
く達成される。これは、連結分子の一級アルコール基を
選択的に保護する。次いで、連結分子の二級アルコール
を無水コハク酸を用いてコハク酸エステルに変換する。
関心の低分子量化合物を有する連結分子のコハク酸エス
テルは、アトキンスら［Ａtkinson et.al.］のp−ニト
ロフェノール−ＤＣＣ従来法（前掲）または好ましくは
Ｐonら(前掲)の改良ＤＥＣ法のいずれかを用い、制御さ
れた細孔のガラス支持体に連結される。ＤＥＣは、ＤＣ
Ｃよりもより毒性が少ない限り、水溶性であってコハク
酸エステルをp−ニトロフェノールで処理する必要性を
排除する点で、それが現在のところ好ましい方法であ
る。

【００４１】ジメトキシトリチル基で保護した、関心の
結合低分子量化合物を有する連結分子は、次いで結合・
長鎖状アルキルアミン基をもつ規制された細孔のガラス
支持体に標準の方法で連結または固定される。長鎖状ア
ルキルアミンで誘導化され規制された細孔のガラス支持
体は入手可能である［Ｐierce ＣhemicalまたはＳigma
Ｃhemical］。これらは、ポンら(上記)の方法を用い
て、ジクロロ酢酸で予め活性化し、次いでカップリング
試薬としてＤＥＣを用い、関心の結合分子をもつジメト
キシトリチル基で保護した連結分子とピリジン中で反応
させて、連結分子を固相支持体に連結した後、支持体上
の過剰の長鎖状のアルキルアミノ基を無水酢酸でアセチ
ル化することでキャップする。

【００４２】ジメトキシトリチル基は、ジクロロエタン
中３％ジクロロ酢酸で処理することによって連結分子の
一級アルコールから取り除かれる。連結分子を介し結合
した低分子量尾分子とともに脱保護された連結分子の一
級水酸基をもつ、得られた規制細孔ガラス支持体は、オ
リゴヌクレオチドの合成のために用意されるに至る。連
結分子および関心の分子を有する固相支持体をまた大量
に製造し、次いで多数のオリゴヌクレオチドの合成のた
めに小分けするかまたは後で使えるように保存すること
ができる。いずれにせよ、オリゴヌクレオチド合成は、
標準の方法で、例えばＭilligen ＤＮＡ合成機のような
ＤＮＡ合成機でホルホルアミド化学を用いて、連結分子
の一級水酸基から出発する。

【００４３】一旦、オリゴヌクレオチドの合成が完成す
ると、そのオリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成機で
合成したオリゴヌクレオチドの標準的な方法で脱保護さ
れる。連結分子を介して３'末端に結合した低分子量尾
分子をもったオリゴヌクレオチドは、次いで常法にて室
温で濃縮アンモニアを用いる自動ＤＮＡ合成の標準方法
により固相支持体から切り離される。

【００４４】連結分子を介して３'末端に結合した低分
子量尾分子を有するオリゴヌクレオチドを精製するに
は、一回のみの精製で足りる。これは、逆相高速液体
(ＨＰＬＣ)クロマトグラフィーを用いて都合よく行うこ
とができる。オリゴヌクレオチドの３'末端に結合され
るべき低分子量尾分子は生物学的関心のある多くの分子
の一つとすることができる。この群に包含されたものは
レポーター基、インターカレーティング(挿入)基、親油
性基および開裂基とすることができる。親油性基につ
き、現在、特に好ましいのはコレステロールである。現
在のところレポーター基についで特に好ましいのはビオ
チンおよびプルオロホアーズ、例えばアクリジン、フル
オレセイン、ローダミン、リサミンローダミンＢ、マラ
カイトグリーン、エリスロシン、テトラメチルローダミ
ン、エオシン、ピレン、アントラセン、４−ジメチルア
ミノナフタレン、２−ジメチルアミノナフタレン、７−
ジメチルアミノ−４−メチルクマリン、７−ジメチルア
ミノクマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、
７−ヒドロキシクマリン、７−メトキシクマリン、７−
アセトキシクマリン、７−ジエチルアミノ−３−フェニ
ル−４−メチルクマリン、イソルミノール、ベンゾフェ
ノン、ダンシル、ダブシル、マンシル、スルホ・ローダ
ミン、４−アセトアミド−４'−スチルベン−２,２'−
ジスルホン酸ジナトリウム塩、４−ベンツアミド−４'
−スチルベン−２,２'−ジスルホン酸ジナトリウム塩で
ある。インターカレーティング基に対して現在とくに好
ましいのはアクリジン、エリプチシン、メチジウム、エ
チジウム、フェナントロリン、２−ヒドロキシエタンチ
オレート−２,２',２"−ターピリジン−プラチナム(II)
およびキノキサリンである。現在、開始基につき、特に
好ましいのは鉄を結合するためのＥＤＴＡリガンドまた
はポルフィリンリガンドおよび銅を結合するためのフェ
ナンスロリンリガンドである。

【００４５】尾分子を連結分子のアミノ基に結合させる
ための固有の接続基を含まない当該尾分子については、
当該尾分子を適当な試薬と反応させ、連結分子のアミン
置換基と反応可能な付加的接続基を結合させる。したが
って、尾分子が連結分子のアミンと反応可能な固有の接
続基を有するか否か、または、付加的な接続基が結合し
て連結分子のアミノ基と反応ねばならぬか否かにかかわ
りなく、尾分子を連結分子のアミン基と反応させて当該
尾分子を連結分子に結合させる。以下の式：

【化１２】 または

【化１３】 を介して尾分子Ｒを結合で示される連結分子を介して尾
分子Ｒを結合させるには、Ｚは以下の群から選ばれる。 −ＣＯ−Ｑn−Ｒ、−ＣＯ−Ｏ−Ｑn−Ｒ、−ＣＯ−ＮＨ
−Ｑn−Ｒ、−ＣＳ−ＮＨ−Ｑn−Ｒ または −ＳＯ−
Ｑn−Ｒ 式中、mおよびm'は独立して１１よりも小さい正の整数
として選択され、nは０または１として選択され、Ｑは
接続基である。尾分子Ｒはレポーター基、インターカレ
ーティング基、親油性基および切断基からなるグループ
から選別され、ＹはＨまたはジメトキシトリチルであ
る。

【００４６】例として、コレステロールクロロホーメー
トを連結分子と反応させて、カルバメート接続基を介し
て連結分子に当該コレステロール基を結合する。さらに
例として、９−アクリジンプロピオン酸を連結分子と反
応させるとアミド結合を介して９−エチルアクリジンの
結合した連結分子を生ずる(工程II参照)。

【００４７】上に述べたコレステロールクロロホルメー
トが尾分子の前駆体として用いられるなら、nは０、従
ってＱはなく、Ｚは−ＣＯ−Ｏ−コレステロールであ
る。上述の９−アクリジンプロピオン酸が尾分子の前駆
体として用いられるなら、nは１、従ってＱは存在し、
アルキル残基、すなわち、エチルである（工程II）。こ
の例ではＺは −ＣＯ−(ＣＨ₂)₂−９−アクリジンであ
る。

【００４８】nが１でＱが存在するとき、アルキル、ア
ルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニル、シクロア
ルキル、アリール、アリールオキシ、アラルキル、ヘテ
ロ環状、ヘテロアリール、置換アリールおよび置換アラ
ルキル基が接続基Ｑとして用いるのに適当である。Ｚが
構造式−ＣＯ−Ｏ−Ｑn−Ｒのカルバメートである場合
の上式の化合物の製造に対する前駆体分子として有用な
のはクロロホルメートである。Ｚが構造式−ＣＯ−ＮＨ
−Ｑn−Ｒのウレアである場合の上式の化合物の製造に
対する前駆体分子として有用なのはイソシアネートであ
る。Ｚが構造式−ＣＳ−ＮＨ−Ｑn−Ｒのチオウレアの
場合の上式の化合物の製造に対しては、イソチオシアネ
ートは前駆体分子として有用である。また、Ｚが構造式
−ＳＯ₂−Ｑn−Ｒのスルホンアミドである場合の上式の
化合物の製造に対しては、スルホニルハライドが前駆体
分子として有用である。

【００４９】種々のスルホニルハライド系前駆体尾分子
がＭolecular Ｐrobes, Ｉnc., Ｅugene, Ｏregon か
ら入手可能である。このようなスルホニルハライドは芳
香族スルホニルハライドであって、ここに、スルホニル
ハライド部分は例えば、ローダミン、ナフタレン、ピレ
ンまたはアントラセン環のような関心の尾分子の環の一
つに固有の接続基(部分)として存在する。このような例
では上式でnは０で、従って接続基Ｑはない。一般に、
ハライドイオンは塩素またはフッ素であるが、臭素およ
びヨウ素も有用であろう。

【００５０】有用なスルホニルハライドはスルホローダ
ミン("Ｊexas Ｒed"の商品名で、Ｍolecular Ｐrobe
s, Ｉnc.により売られている)を含む。さらに、有用な
のはリサミンローダミンＢスルホニルクロライド、リサ
ミンローダミンＢスルホニルフルオライド、５−ジメチ
ルアミノナフタレン−１−スルホニルクロライド(ダン
シルクロライド)、２−ジメチルアミノナフタレン−５
−スルホニルクロライド、２−ジメチルアミノナフタレ
ン−６−スルホニルクロライド、６−(Ｎ−メチルアニ
リノ)−ナフタレン−２−スルホニルクロライド(マンシ
ルクロライド)、１−ピレンスルホニルクロライド、２
−アンスラセンスルホニルクロライド、５−ジメチルア
ミノナフタレン−１−スルホニルフルオライド(ダンシ
ルフルオライド)、および４−ジメチルアミノ−アゾベ
ンゼン−４'−スルホニルクロライド(ダブシルクロライ
ド)であろう。

【００５１】種々のイソチオシアネート系前駆体尾分子
は尾分子と連結分子の間のチオウレア結合をつくるのに
有用である。上記のスルホニルハライドと同じ様に、一
般にイソチオシアネートは尾分子の芳香環上に固有の接
続基として存在し、ここに、上式ではnは０で、従って
Ｑは存在しない。このようなイソチオシアネートもまた
Ｍolecular Ｐrobes, Ｉnc.から入手可能である。

【００５２】連結分子と反応させるに適当なイソチオシ
アネートはフルオレセイン−５−イソチオシアネート、
フルオレセイン−６−イソチオシアネート、テトラメチ
ルローダミン−５−(および−６−)−イソチオシアネー
ト、ローダミンＸイソチオシアネート、マラカイトグリ
ーンイソチオシアネート、エオシン−５−イソチオシア
ネート、エリスロシン−５−イソチオシアネート、７−
ジエチルアミノ−３−(４'−イソチオシアネートフェニ
ル)−４−メチルクマリン、p−(５−ジメチルアミノナ
フタレン−１−スルホニル)アミノフェニルイソチオシ
アネート、Ｎ−(４−(６−ジメチルアミノ−２−ベンゾ
フラニル)フェニルイソチオシアネート塩酸塩、１−ピ
レンイソチオシアネート、２−アンスラセンイソチオシ
アネート、４−ジメチルアミノナフチル−１−イソチオ
シアネート、９−アクリジンイソチオシアネート、４−
イソルミノールイソチオシアネート、４−ジメチルアミ
ノフェニルアゾフェニル−４'−イソチオシアネート、
ベンゾフェノン−４−イソチオシアネート、４,４'−ジ
イソチオシアネートスチルベン−２,２'−ジスルホン酸
ジナトリウム塩、４,４'−ジイソチオシアネートジヒド
ロスチルベン−２,２'−ジスルホン酸ジナトリウム塩、
４−アセチルアミド−４'−イソチオシアネートスチル
ベン−２,２'−ジスルホン酸ジナトリウム塩、および４
−ベンツアミド−４'−イソチオシアネートスチルベン
−２,２'−ジスルホン酸ジナトリウム塩を含む。

【００５３】nが１で、従って接続基Ｑが存在する場合
の例を含め、尾分子の他の有用な前駆体分子はテトラフ
ルオロフェニル(ＴＦＰ)エステル、５−(および６−)カ
ルボキシフルオレセインジアセテートスクシニミジルエ
ステル、７−ジメチルアミノクマリン−４−酢酸、７−
アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、７−ジエチル
アミノクマリン−３−カルボン酸、７−ヒドロキシクマ
リン−４−酢酸、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン
−３−酢酸、７−ヒドロキシ−クマリン−３−カルボン
酸、７−メトキシクマリン−３−カルボン酸、７−カル
ボキシメトキシ−４−メチルクマリン、７−アセトキシ
クマリン−３−カルボン酸、アクリドン−２−酢酸、ア
クリドン−１０−酢酸、９−アンスラセンプロピオン
酸、１−ピレンブタン酸(ピレン酪酸)およびＮ−(５−
ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニル)グリシン
(ダンシルグリシン)を含む。

【００５４】ＥＤＴＡ・Ｆe(ＩＩ)はオリゴヌクレオチ
ドと共に切断基として用いられてきた。ＥＤＴＡ分子は
ウリジンヌクレオシドの塩基に結合される。カルボキシ
ル基を末端とした鎖がウラシル基から伸ばされ、それに
ＥＤＴＡが結合された。この方法は、ＥＤＴＡ結合・ヌ
クレオシドが得られる一方、かかるヌクレオシドを組み
込んだオリゴヌクレオチドは、ＥＤＴＡが塩基上に存在
するため、当該ＥＤＴＡ分子によって干渉され、その結
果オリゴマーと相補的なＤＮＡ鎖の間における１次的塩
基結合が妨害されうる。本発明の連結分子の使用によっ
て、ＥＤＴＡ基は、ヌクレオチド塩基から離れ、従っ
て、ＤＮＡの相補的鎖での初めの塩基対のために、もっ
と干渉しない位置に、連結分子から延長される。

【００５５】連結分子を、例えばエチルイソシアネート
アセテートのようなアルキルイソシアネートと反応さ
せ、次いでエチレンジアミンおよびＥＤＴＡ−トリエチ
ルエステル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで
処理することはアミド結合を介して、連結分子にＥＤＴ
Ａ基を結合するのに役立つことになろう。この場合に、
付加的な接続基はＥＤＴＡ切断基の連結分子との結合を
形成するために用いられる。切断反応の条件は、Ｄreye
r(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．８２, ９６８〜９７２
(１９８５))により示されているような方法で、水溶液
中、Ｆe(ＩＩ)およびジチオスレイトールのような適当
な酸化剤を添加することによって開始される。

【００５６】さらに、切断基、フェナントロリン−Ｃu
(Ｉ)錯体を結合する際には、１,１０−フェナントロリ
ンが５または６位でアミノ化される。次いで、このアミ
ンがスクシニル化される。得られた末端カルボキシレー
トは、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに
変換することによって活性化され、連結分子のアミンと
の反応または連結分子に結合される付加的な接続基との
反応に使用される。この試薬での切断は、Ｆrancoisら
(Ｂiochemistry ２７, ２２７２〜２２７６(１９８
８))と同様の方法で硫酸銅とメルカプトプロピオン酸を
添加することによって始められる。

【００５７】同様に、エリプチシンの二級アミノ置換基
はピリジン中、無水コハク酸で直接スクシニル化され、
次いで、連結分子への結合のためにテトラヒドロフラン
(ＴＨＦ)中ＤＣＣ(１,３−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド)でＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＮＨＳ
エステル)に活性化される。キノキサリンはスクシニル
化および活性化に先立って、ペリフエナントロリンと同
様の方法で、その環のアミノ化を必要とする。

【００５８】長鎖状のスペーサーを有するビチオンはス
クシンイミジルエステルとして、Ｍolecular Ｐrobes
からも市販されている。この製品、６−(６−ビオチノ
イルアミノ)ヘキサノイルアミノ)ヘキサン酸コハク酸イ
ミドエステルはまた、ビオチン−ＸＸ−コハク酸イミド
エステルとも呼ばれている。上記のフェナントロリンコ
ハク酸イミドエステルと同じ方法で、それは連結分子の
アミノ基と反応させ、ビオチン尾分子をその連結分子に
結合する。

【００５９】Ｄervanら(Ｊ．Ａm．Ｃhem．Ｓoc．１０
０, １９６８(１９７８))と同様の方法で、p−カルボキ
シメチジウムがそのカルボキシル基を介して連結分子と
結合するために製造することができる。同様に、エチジ
ウムも製造される。

【００６０】Ａ．２．アクリジンＴＦＰエステルの合成
とアクリジンＣＰＧの改良製造法 ９−アクリジンアルカン酸を強くＤＮＡに結合させ
(Ｓ．Ｔahenakaら、Ａnal．Ｓci．４, ４８１(１９８
８))、種々の異なる鎖長で製造できる。アクリジンで修
飾したＯＤＮはＤＮＡの二本鎖の塩基対の間においてア
クリジン分子が効率よく挿入するための厳密な幾何学的
必要条件をもつが、しかし、これらの幾何学的条件は予
測するのが難しい。従って、容易に修正できる連結用の
鎖長さをもつことが好ましい。加えて、種々の結合手の
長さは結合強度に関し評価される。オリゴヌクレオチド
(ＯＤＮ)のその相補的核酸鎖に対する結合強度は容易に
熱変性(Ｔm)研究により決定される。

【００６１】種々のアルキル鎖長をもったアクリジンア
ルカン酸は、Ｈ．ＪenseおよびＬ．Ｈowland(Ｊ．Ａm．
Ｃhem．Ｓoc．４８, １９２６(１９８９))の変法を用い
て、対応する脂肪族ジカルボン酸をジフェニルアミンお
よび塩化亜鉛と加熱することによって製造される。例え
ば、アジピン酸との縮合反応では５−(９−アクリジニ
ル)ペンタン酸の４５g(１６％収率)が得られた。アクリ
ジン−ＣＰＧの製造のために用いた二つのアルキル鎖長
は、他の３'−アクリジン尾分子付ＯＤＮ(Ｕ．Ａsseine
ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ ８１, ３２
９７(１９８４))に対する最適なＴmを与えるべく前に報
告された長さに近似するように選択した。

【００６２】本発明のこの態様の一つの実施例はアクリ
ジン−ＣＰＧの合成に対する改良法を提供する。この改
良法は前駆体分子として、アクリジニルカルボン酸の活
性エステル誘導体を使用する。

【００６３】種々のアクリジニルカルボン酸活性エステ
ルは、アクリジン−ＣＰＧ(１０,２３)にとっての潜在
的前駆体と評価された。Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド
(ＮＨＳ)エステルおよびp−ニトロフェニルエステルは
カルボン酸をジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)
で活性化し、次いで、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドま
たはp−ニトロフェノールと反応することによって製造
された。しかしながら、これらの縮合反応は、出発のカ
ルボン酸と副生成物のジシクロヘキシルウレア(ＤＣＵ)
が双方とも、ＤＣＣ活性化に普通用いられる有機溶媒に
不溶であるために、実施が困難である。さらに、これら
の反応は完結せず、所望のエステルはその不安定性のた
めにシリカゲルカラムクロマトグラフィーで容易に精製
できなかった。対照的に、ＴＦＰ(テトラフルオロフェ
ニル)エステルはトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リノール ２の求核性アミノ基と好適に反応性で、しか
も、フラシュクロマトグラフィーにより精製できる程十
分安定である。

【００６４】カルボン酸をＴＦＰエステルに活性化する
ための代表的な方法を説明する。ＴＦＰエステル１９ま
たは２０は初めカルボン酸を２−フルオロメチルピリジ
ニウムトシレート(ＦＭＰＴ)で活性化し、これにより、
不安定な中間体を形成し、次いで、この不安定中間体を
２,３,５,６−テトラフルオロフェノールと反応させて
安定な生成物を形成することによって製造される（工程
ＩＶ, 方法a参照）。この反応では不溶性のＤＣＵは生
じないし、不溶性のアクリジニルカルボン酸は反応が進
行するにつれ可溶性となる。得られた均一混合物は溶媒
を取り除いてからフラッシュクロマトグラフィーにより
精製された。ＦＭＰＴは極性の非プロトン性有機溶媒
(エーテル、ＴＨＦ、ＤＭＦおよびアセトニトリルなど)
に余り可溶性でないカルボン酸にとって、特に好ましい
活性化剤である。

【００６５】本発明は、またＴＦＰエステルの製造のた
めの改良試薬を開示する。要約すれば、２,３,５,６−
テトラフルオロフェノールを無水トリフルオロ酢酸で処
理するとＴＦＰトリフルオロアセテート１８を得る。こ
の改良試薬１８を、工程ＩＶ, 方法bに示したように、
トリエチルアミンの存在下カルボン酸と反応させるとＴ
ＦＰエステルを得る。例えば、９−アクリジニルプロパ
ン酸を塩化メチレン中ＴＦＰトリフルオロアセテート１
８およびトリエチルアミンで処理すると所望のアクリジ
ニルＴＦＰエステル１９を得る。

【００６６】さらに、他のカルボン酸もＴＦＰトリフル
オロアセテート１８との反応に適当である。この点で、
代表的なカルボン酸はＮ−ＣＢＺ−Ｌ−フェニルアラニ
ルグリシン、プロトポルフィリンＩＸ、３−アミノ−９
−エチルカルバゾールコハク酸イミドなどを含む。開示
した試薬１８およびその使用方法の利点は、以下の利点
を含む。(１)ＴＦＰトリフルオロアセテートは容易に安
価な出発原料から製造される。(２)この合成法を用い、
ＴＦＰエステルを製造するために高価な縮合試薬は必要
とされない。(３)トリフルオロアセテートが開示の反応
の唯一の副産物であるから、ＴＦＰエステル生成物の精
製が改善される。

【００６７】特に、好ましい方法(実施例ＸＸＶＩＩ
Ｉ、方法２)では、アクリジン−ＣＰＧ支持体(１０およ
び２３)は、工程Ｖに示したように、トランス−４−ヒ
ドロキシ−Ｌ−プロリノール２および適当なアクリジニ
ルプロピオン酸またはペンタン酸ＴＦＰエステル(１９
または２０)から製造される。精製したＴＦＰエステル
１９または２０をアミノジオール２と反応させると重要
な中間体のアミド生成物７または２１の定量的収量を得
る。この方法(方法２)は、中間体のＮ−メチルピリジニ
ウムエステルを経てアクリジンカルボン酸から直接ジオ
ールアミド７を製造するときよりもより再現性のある結
果を得る（実施例IX、方法１、工程II参照）。７または
２１の一級水酸基は標準条件でＤＭＴrエーテルとして
選択的に保護され、８または２２が良好な収率で得られ
る。残る二級水酸基をスクシニル化し、得られたカルボ
ン酸を長鎖アルキルアミンで制御の細孔ガラス支持体
(ＬＣＡＡ−ＣＰＧ)に固定すると、所望のＡＣr−ＣＰ
Ｇ(１０または２３)を得る。これらのＣＰＧのＤＭＴr
充填度は夫々１８.５μmol／gおよび２０.６μmol／gで
ある。

【００６８】Ｂ．アクリジンＴＦＰエステルを用いる
３'−アミン修飾ＯＤＮのポスト合成 修飾(方法Ｂ) ３'−尾分子付オリゴノヌクレオチドは、３'−尾分子を
共有結合した固相支持体から直接合成される(方法Ａ、
Ａ.１項およびＡ.２項参照)。別法として、３'−尾分子
付ＯＤＮは、保護された求核性のアミノ基またはチオー
ル基を組み込んだ特別の固相支持体を用いて合成され
る。次いで、脱保護されたＯＤＮの、適当な親電子試薬
とのポスト合成処理によって、コンジュゲート基をこの
ような３'−尾分子付ＯＤＮに導入される。この特許請
求する発明の態様では、方法Ｂによるポスト合成修飾が
有利に使われ、方法Ａに要求された合成条件では残存で
きない敏感な３'−尾分子を導入する。さらに、方法Ｂ
の利点は、相当する出発原料に利用される多数の親電子
性共役基に関係する。その上に、方法Ｂは少量の修飾Ｏ
ＤＮの製造に有利に用いられる。

【００６９】本明細書に開示された３'−尾分子付ＯＤ
Ｎ製造のための二つの方法(方法Ａおよび方法Ｂ)は、ア
クリジンＴＦＰエステル１９および２０の３'−アミン
−尾分子付ＯＤＮとの反応を検討することによって比較
された。更に詳しくは、Ｂ型肝炎の表面抗原蛋白質に対
応するmＲＮＡの開始コドン領域に相補的な配列を有す
る３'−アミン−尾分子付１１単位のＯＤＮが製造され
た。改善した標的核酸結合性をもつこのような３'−尾
分子付ＯＤＮはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして
有利に用いられよう。

【００７０】Ｃ．３'−アミン−尾分子付ＯＤＮの合成
のための修飾支持体 本発明の態様は、さらに工程ＩＶに示したように、３'
−アミン−尾分子付ＯＤＮの合成のための改良した固相
支持体を提供する。この点で特に好ましい支持体は、６
−アミノヘキサン−１−オールを用い製造されたアミノ
ヘキシル修飾ＣＰＧ(ＡＨ−ＣＰＧ)である。

【００７１】現在は、ＯＤＮの３'−末端の修飾は市販
の支持体(例えば、Ｃlonrech Ｌaboratories, Ｉnc.,
Ｐalo Ａlto, ＣＡによる"アミン−ＯＮ−ＣＰＧ")を
用いて行われる。しかし、上記のごとく、かかる支持体
(前掲のＮelsonらによって開示された支持体に相当)
は、ＰＡＧＥ分析によって少なくとも二つの明確に異な
る３'−尾分子付ＯＤＮ生成物(約１:１)の生成を含め、
重大な付加的不利益をもつ。加えて、３'−アミン尾分
子の種々の活性エステルとの誘導化はたえず低収量に終
わり、ＨＰＬＣ(高速液体クロマトグラフィー)分析で
は、出発の３'−アミン−尾分子付ＯＤＮの５０％以下
しか反応しないことを示す。

【００７２】示唆された混合生成物は、 (１) 市販の固相支持体でＯＤＮの合成の間の第１ヌク
レオチドのホスフエート部分のＯ→Ｎへの移動 (２) ＯＤＮ合成の間の尾分子のＦＭＯＣ部分の脱保護
および無水酢酸による後続のキャッピングおよび／また
は (３) ＯＤＮの付随する損失を伴う、尾分子の一級と二
級水酸基の間の環状ホスフエートの形成の結果であろ
う。すべての場合に、得られる３'−尾分子付ＯＤＮ
は、その後、活性エステルと反応せずに、ＰＡＧＥ分析
によれば明確に異なる種を形成しうる。

【００７３】本明細書における修飾固相支持体は、ＯＤ
Ｎの３'末端の修飾用の市販固相支持体に関係のあるこ
れらの欠点を克服する。特許請求する修飾固相支持体に
よって得られるほかの有利な特徴は(１)ＣＰＧ結合部位
としても働く独特なアミン保護基および(２)ジメトキシ
トリチル保護した水酸基を含む。さらに、これらの修飾
支持体は市販のＤＮＡ合成機で用いられるすべての方法
に適合できる。

【００７４】３'−アミン−尾分子付ＯＤＮは好ましく
はＤＮＡ合成機でＣＰＧ支持体から取り除かれる。特許
請求する支持体は、隣接するジオールをもたないので、
３'−アミン−尾分子付ＯＤＮを支持体から水酸化アン
モニウムで脱離することはＯＤＮの３'末端のアミノヘ
キシル基の保存に適合する。反対に、アミン−ＯＮ−Ｃ
ＰＧは隣接ジオールを含むので、この支持体から水酸化
アンモニウムを用いてＯＤＮを脱離すると、ＯＤＮから
の尾分子の重大な損失をもたらす。

【００７５】Ｕ．Ａsseline およびＮ．Ｔ．Ｔhuong(Ｔ
rt．Ｌete．３１, ８１〜８４(１９９０))はＯＤＮに
３'−アミノヘキシル尾分子を導入するための固相支持
体を報告した。この固相支持体に関係する欠点は(１)支
持体を作るための７工程の合成法(本明細書に記載した
４工程法を参照)、(２)報告の方法によれば、非常に低
い収量の固相支持体しか得られないことを示唆するデー
タ分析、(３)この固相支持体の３'−尾分子付ＯＤＮの
理論的な収量を得ることを示唆するデータの欠如を含
む。

【００７６】特許請求する固相支持体を作るために、好
ましい６−アミノヘキサン−１−オール試薬に加えて、
他のアミノアルカノールは市販であり、本発明による修
飾ＣＰＧの生産に適している。種々のアルキル鎖長のア
ミノアルカノールを６−アミノヘキサン−１−オールの
代わりとすることによって色々な長さの３'−アミン尾
分子を有するＯＤＮが本明細書に開示した方法によって
合成される。これに対し、種々の長さのアミノジオール
は一般に市販されていないし、従って、ある範囲のアル
キル鎖長を持つ固相支持体はＮelsonらの方法によって
容易に生産することができない。従って、種々の３'−
アミン尾分子を有するＯＤＮはアミン−ＯＮ−ＣＰＧま
たはその変法を用いても容易に合成できない。さらに、
他のスペーサー基(すなわち、式中、Ｒがアルキル、ア
リール、アリールアルキル、ヘテロアルキルまたはヘテ
ロアリール)は、特許請求する修飾固相支持体のアミノ
基とＤＭＴrで保護の水酸基の間に挿入される。好まし
い実施例では、Ｒは(ＣＨ₂)nでnは１〜１０である。特
に、好ましい実施例では、Ｒは(ＣＨ₂)₆である。

【００７７】３'−アミン尾分子を有するオリゴヌクレ
オチドは本発明の修飾固相支持体を用いて効率よく合成
することができる。このような３'−アミン−尾分子付
オリゴヌクレオチドは市販のアミン−ＯＮ−ＣＰＧ支持
体を用いて製造された類似の３'−尾分子付ＯＤＮと対
比される。特許請求する発明の代表的な修飾固相支持体
は、ＨＰＬＣおよびＰＡＧＥ双方によって単一生成物と
して３'−アミン尾分子付ＯＤＮの高収量を得た。特許
請求する修飾固相支持体から作った３'−アミン−尾分
子付ＯＤＮの後続の誘導化は急速に完結し、ＨＰＬＣ精
製の必要なく、３'−修飾ＯＤＮの定量的収量を得た。

【００７８】Ｄ．アクリジンＴＦＰエステルの分子内ア
ミン修飾ＯＤＮとの反応 本発明は多数の内部インターカレーティング基をＯＤＮ
に導入する手段を提供する。このような多数の内部イン
ターカレーティング基はＯＤＮの標的核酸鎖に対する増
大した結合を得られるが、効果的なインターカレーショ
ンにつき厳密な数学的必要条件を有しうる。インターカ
レーティング基に起因する核酸の結合親和性における予
想される増加は、二本鎖の正常のワトソン−クリックの
塩基対を乱す立体効果によって中和または縮減されう
る。

【００７９】特許請求する方法は、アクリジンＴＦＰエ
ステルを用い、ＯＤＮと標的の間に形成した最小の二本
鎖の一つまたは二つの塩基対のいずれかをはさむ二重修
飾のＯＤＮを製造することを含む。本発明によれば、イ
ンターカレーティング基と標的の核酸鎖の間の相互作用
を最適化する連結手を有する内部的に修飾したＯＤＮが
設計される。例えば、５−アミノプロピル−デオキシウ
リジン基はＯＤＮに選択的に導入され、一つおよび二つ
の内部的アクリジン修飾のＴmに及ぼす影響を実験し
た。単一の内部アミン修飾に対しては、結合効率(Ｔm)
に及ぼす鎖長の影響を測定するためにＯＤＮをアクリジ
ンＴＦＰエステル１９または２０と反応させた。５個の
炭素長の結合手を有するアクリジン修飾のＯＤＮは未修
飾コントロールと比べ、Ｔmを５.９℃だけ増大させた
が、一方、３個の炭素長の結合手は同じコントロールと
比べ、１.１℃を増加したにすぎない。二つの内部的ア
クリジン修飾が実験した時、最適化した結合手長で、４
５.５℃(未修飾ＯＤＮ)〜５６.２℃(二方挿入ＯＤＮ)の
Ｔmにおける増加が観察された。さらに、多数の内部的
アクリジン修飾はＯＤＮの細胞消費およびヌクレアーゼ
消化に対する安定性を改善することができる。

【００８０】Ｅ．細胞培養における３'−尾分子付ＯＤ
Ｎの改善された安定性(ヘキサノール−ＣＰＧ) 未修飾ＯＤＮは、血清含有媒体中３'−エキソヌクレア
ーゼによって急速に分解される。３'−末端ホスホジエ
ステル結合のある種の化学修飾(すなわち、最後の二つ
のヌクレアーゼ間ホスホジエステル結合のホスホロチオ
エート、ホスホロアミデート、または逆結合体への変
化)は、ＯＤＮのヌクレアーゼに対する安定性を著しく
改善する。他の化学結合がα−デオキシヌクレオチド誘
導体(Ｃ．Ｃazenaveら Ｎucl．Ａcids Ｒes．１５,
１０５０７(１９８７))およびメチルホスホネート誘導
体のように、増大したヌクレアーゼ安定性を得ることが
できる。インターカレーティング基はかさ高い３'−置
換基であるので、それはまた３'−エキソヌクレアーゼ
から末端のホスホジエステル結合を保護することができ
る(Ｅ．ＵhlmannおよびＡ．Ｐyman, Ｃhem．Ｒev．９
０, ５４３(１９９０))。例えば、３'−コレステロー
ル、３'−アクリジン−および３'−ヘキシルアミン−尾
分子付ＯＤＮが細胞培養分析で検討され、未修飾ＯＤＮ
と比較して増大した安定性を示した。

【００８１】本発明の一つの実施例で、修飾固相支持体
を用いて３'−エキソヌクレアーゼによる分解を防ぐオ
リゴヌクレオチドを合成する方法が開示される。この修
飾固相支持体は他の３'−修飾を含まないＯＤＮおよび
コレステロールまたはアクリジンのような他の３'−修
飾の構造−活性相関の in vivo 評価にとって有用なＯ
ＤＮを合成するのに有利に使用することができる。この
方法で作った３'−修飾ＯＤＮはハイブリッド形成を妨
害しないので、本明細書に記載した修飾固相支持体は、
現在、ＯＤＮ合成に用いられている固定しＤＭＴrで保
護したヌクレオシドに対して適当な代用品である。これ
らの固定したヌクレオシドに関係した欠点は高価である
ことおよび利用される４つのタイプのＣＰＧをもつ必要
性を含む。反対に、３'−末端ヌクレオシドがホスホロ
アミダイトとして加えられる特許請求する方法の範囲内
では、修飾固相支持体はＯＤＮ配列の製造にとっても普
遍的な試薬として用いることができる。さらに、固定し
たヌクレオシドのＤＭＴrで保護した５'−水酸基とは対
照的に、固相支持体から突き出た結合手上のＤＭＴrで
保護した水酸基は阻害されていない。それ故、修飾固相
支持体のＤＭＴrで保護した水酸基は、嵩高いホスホロ
アミダイト試薬への接近が増大し、ＯＤＮ生成物の高収
量を得ることができる。

【００８２】本発明のこの態様の修飾固相支持体は、支
持体とＤＭＴrで保護した水酸基を接続するＲ基(すなわ
ち、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロア
ルキルまたはヘテロアリール)を特徴づける。好ましい
実施例では、Ｒは(ＣＨ₂)nでnは２〜１０である。特
に、好ましい実施例では、Ｒは(ＣＨ₂)₆である。代表的
な修飾固相支持体、ヘキサノール−ＣＰＧの製造が工程
ＶＩＩで示される。ヘキサノール−ＣＰＧの合成におけ
る重要な中間体、Ｏ−(４,４'−ジメトキシトリチル)−
１,６−ヘキサンジオール３７は、Ｆ．Ｓeelaおよび
Ｋ．Ｋaiser(Ｎucl．Ａcids Ｒes．１５, ３１１３(１
９８７))の変法を用いて、ヘキサンジオールをＤＭＴr
−Ｃlで処理することによって製造される。その中間体
のスクシニル化、続いて、長鎖状アルキルアミンで制御
された細孔ガラス支持体(ＬＣＡＡ−ＣＰＧ)に固定化す
るとヘキサノール−ＣＰＧを得る。

【００８３】３'−ヘキサノール−尾分子付"アンチセン
ス"オリゴデオキシヌクレオチドは、生物学系のモデル
で研究されてきた。これらのアンチセンスＯＤＮは、パ
ラメシウムテトラウレリア（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｒ ｔ
ｅｔｒａｕｒｅｌｉａ）の遊泳挙動に著しい作用を示し
た。野性株細胞およびランダムまたはセンスＯＤＮで処
理した細胞は何ら作用を示さなかった。

【００８４】以下に記載する実施例は、工程Ｉ〜ＶＩＩ
Ｉの反応系列に対応するものである。工程ＩおよびＩＩ
Ｉでは、同定"Ｃhol"なる記号コレステリル基を表わ
す。工程Ｉはコレステロール−ＣＰＧ６の合成を示し、
工程ＩＩはアクリジン−ＣＰＧ１０の合成を記述し、工
程ＩＩＩはコレステロール−ＣＰＧ１７の合成を説明
し、工程ＩＶはアクリジンＴＦＰエステル１９および２
０の合成を表わし、工程Ｖはアクリジン−ＣＰＧ１０お
よび２３の改良合成法を示し、工程ＶＩはアミノヘキシ
ル−ＣＰＧ３０の合成を記述し、工程ＶＩＩはヘキサノ
ール−ＣＰＧ３８の合成を説明し、工程ＶＩＩＩは３'
−アクリジン尾分子の構造を示している。

【００８５】実施例I (２Ｓ,４Ｒ)−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−４−ヒ
ドロキシ−２−ヒドロキシメチルピロリジン(１) ＣＢＺヒドロキシプロリン(４.７６g,１８mmol,Ｓigma
Ｃhemical Ｃo.)の無水テトラヒドロフラン(２０mＬ)
の氷冷した溶液中に、１Ｍボラン−テトラヒドロフラン
コンプレックスのテトラヒドロフラン溶液(４５mＬ,Ａl
drich)を加えた。アルゴン下に０〜５０℃で１５分間次
いで室温で４.５時間撹拌後、反応混合物にメタノール
(５０mＬ)を加え反応を止めた。３０分後、反応溶液を
濃縮し、残留する無色シロップ状物質をメタノール−塩
化メチレンによるグラジエント法（勾配溶離法)を用
い、フラッシュクロマトグラフィー(３.５×２３cm、シ
リカ)により精製した。生成物を１０％メタノールで溶
出した。純粋な生成物を含むフラクションから溶媒を除
去すると前記（１）(２.１８g,４６％収率)が無色シロ
ップとして得られた。 ＴＬＣ(９５:５／塩化メチレン:メタノール),Ｒf＝０.
１６. ＩＲ(ｎｅａｔ（ニート）)３６００−３１００(br),２
９４０,１６８０,１４２０,および１３５５cm^-1.¹ Ｈ−ＮＭＲ(ＣＤＣl₃)７.３６(s,５Ｈ),５.１７(s,２
Ｈ),４.５０(m,２Ｈ),３.６７(m,４Ｈ),２.０９(m,３
Ｈ). 分析値(Ｃ₁₃Ｈ₁₇ＮＯ₄・０.３Ｈ₂Ｏとして) 計算値:Ｃ,６０.８３;Ｈ,６.９１;Ｎ,５.４６. 実測値:Ｃ,６０.８５;Ｈ,６.８８;Ｎ,５.３６.

【００８６】実施例II (２Ｓ,４Ｒ)−４−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチル
ピロリジン(２) (トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリノール) ＣＢＺヒドロキシプロリノール（１）(１.９２g,７.６m
mol)のメタノール(５０ｍＬ)溶液を水素気球の下で１０
％パラジウム−炭素(３２０mg)と撹拌した。１６時間
後、薄層クロマトグラフィー(９:１塩化メチレン:メタ
ノール)により示したように、出発原料は残存しなかっ
た。反応混合物をセライト(メタノールで洗浄)で濾過
し、濾液を濃縮すると所望の生成物（２）が黄色シロッ
プとして定量的に得られた。このシロップをエタノール
に溶かすと０.５Ｍ貯蔵溶液(１５.２mＬ)が得られた。 ＩＲ(ニート)３６００−３１００(br),２９２０,１５３
０および１４１０cm^-１.¹ Ｈ ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ)４.４０(m,１Ｈ),３.６０(m,３Ｈ),
３.０２(d,of d,１Ｈ,Ｊ＝１２.４,４.８Ｈz),２.７７
(d of t,１Ｈ,Ｊ＝１２.４,１.８Ｈz),１.８４(m,１
Ｈ),１.６０(m,１ＨＯ).

【００８７】実施例III (２Ｓ,４Ｒ)−Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−４
−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチルピロリジン(３) ヒドロキシプロリノール（２）の０.５Ｍ貯蔵のエタノ
ール溶液(７.６mＬ,３.８mmol)にコレステロールクロロ
ホーメート(１.４８g,３.３mmol)の塩化メチレン(８m
Ｌ)溶液を加え、混合溶液を室温で１.５時間撹拌した。
濁った反応液を氷水(１００mＬ)に注ぎ、不均一混液を
熱酢酸エチル(３×１５０mＬ)で抽出した。集めた有機
層を食塩水で洗浄、硫酸マグネシウムで乾燥してから濃
縮した。固形の残留物をメタノール−ヘキサン:酢酸エ
チル(１:１)(グラジエント)を用い、フラッシュクロマ
トグラフィー(４×１５cmシリカ)により精製した。生成
物を１０％メタノールで溶出した。純粋な生成物を含む
フラクションから溶媒を除去すると(３)(１.４２g,８１
％収率)が白色固体として得られた。 ＴＬＣ(９５:５／塩化メチレン:メタノール),Ｒf＝０.
１０. １０％硫酸−メタノールでスプレーし加熱すると生成物
は黒色に着色した 分析値(Ｃ₃₃Ｈ₅₅ＮＯ₄として) 計算値:Ｃ,７４.８１;Ｈ,１０.４６;Ｎ,２.６４. 実測値:Ｃ,７４.７４;Ｈ,１０.３３;Ｎ,２.５０.

【００８８】実施例IV (２Ｓ,４Ｒ)−Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−４
−ヒドロキシ−２−ジメトキシトリチルオキシメチルピ
ロリジン(４) ジオール（３）(１.４２g,２.６８mmol)の乾燥ピリジン
(２７mＬ)溶液に、撹拌しながらトリエチルアミン(０.
５２４mＬ)、４−ジメチルアミノピリジン(１６.５m
g)、およびジメトキシトリチルクロリド(１.１０g,３.
２３mmol)を加えた。アルゴン気流下４.５時間撹拌の
後、反応混合物から溶媒を除去し、残余のピリジンをト
ルエンと共に溜去した。残留物をエーテル(１００mＬ)
−水(４０mＬ)の間に分配した。水層をエーテル(８０m
Ｌ)で抽出し、集めた有機層を食塩水で洗浄し、硫酸ナ
トリウムで乾燥し、濃縮した。残留物を酢酸エチル−ヘ
キサン(グラジエント)を用い、フラッシュクロマトグラ
フィー(４.５×２０cmシリカ)により精製した。黄色の
不純物を得た直後に生成物を２:１／ヘキサン:酢酸エチ
ルで溶出した。純粋な生成物を含むフラクションから溶
媒を除去すると、（４）(１.３３g,６０％収率)が淡黄
色泡状固体として得られた。 ＴＬＣ(９５:５／塩化メチレン:メタノール),Ｒf＝０.
４９. １０％硫酸−メタノールでスプレーすると生成物は橙色
に着色した。¹ Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣl₃)７.２６(m,９Ｈ),６.８１(d,４
Ｈ,Ｊ＝８.８Ｈz),５.３０(m,１Ｈ),４.５０(m,２Ｈ),
４.１５(m,１Ｈ),３.７８(s,６Ｈ),３.７−３.０(m,４
Ｈ),２.４−０.６(m,４６Ｈ). 分析値(Ｃ₅₄Ｈ₇₃ＮＯ₆として) 計算値:Ｃ,７７.９４;Ｈ,８.８４;Ｎ,１.６８. 実測値:Ｃ,７７.２６;Ｈ,８.８２;Ｎ,１.５６.

【００８９】実施例V (２Ｓ,４Ｒ)−Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−４
−スクシニルオキシ−２−ジメトキシトリチルオキシメ
チルピロリジノン(５) アルコール（４）(１.２２g,１.４７mmol)の乾燥ピリジ
ン(１２mＬ)溶液に撹拌下、無水コハク酸(４４３mg,４.
４３mmol)およびジメチルアミノピリジン(８９mg,０.７
３mmol)を加え、反応混合物をアルゴンの下で２６時間
撹拌した。溶媒除去し、残余のピリジンをトルエンと共
に留去した。残留物をクロロホルム(４０mＬ)に溶か
し、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮す
ると生成物（５）をベージュ色の泡状固体として定量的
に得られた。 ＴＬＣ(９５:５／塩化メチレン:メタノール),Ｒf＝０.
３２. １０％硫酸−メタノールでスプレーすると生成物は橙色
に着色した。

【００９０】実施例VI コレステロール−ＣＰＧ支持体(６) スクシニル化したコレステロール誘導体（５）を刊行物
記載の方法(Ｒ.Ｔ.ＰonらＢiotechn.６,７６８(１９８
８))で長鎖アルキルアミンで制御した細孔ガラス支持体
(ＬＣＡＡ−ＣＰＧ,Ｓigma)に固定した。ＬＣＡＡ−Ｃ
ＰＧ(５.０g)を３％ジクロロ酢酸−塩化メチレン(１０
０mＬ)と３時間撹拌した。そのＣＰＧを３０mＬ容量の
半融ガラス濾過器で濾過し、クロロホルム(１５０mＬ)
とエーテル(１５０mＬ)で洗浄した。得られた固形物を
減圧で乾燥し、２５０mＬ丸底フラスコ中に乾燥ピリジ
ン(５０mＬ)、スクシニル化コレステロール誘導体
（５）(９３２mg,１mmol)、トリエチルアミン(０.４m
Ｌ)、１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)
カルボジイミド(１.９２g,１０mmol)および４−ジメチ
ルアミノピリジン(６０mg)と混合した。混合物をオービ
タルミキサーにかけ、１００rpmで３８時間撹拌した。
そのＣＰＧを３０mＬ容量の半融ガラスフイルターで濾
過し、ピリジン(５０mＬ)、メタノール(１００mＬ)、ク
ロロホルム(５０mＬ)およびエーテル(５０mＬ)で洗浄し
次いで減圧乾燥した。ＣＰＧ上の残余のアミノ基を、乾
燥ピリジン(１５mＬ)と無水酢酸(２.０mＬ)中にその支
持体を撹拌することによってキャップした。２時間后、
そのＣＰＧを濾過し、上記と同様に洗浄し、減圧乾燥す
ると生成物（６）(５.０g)が得られた。このものは刊行
物記載の方法(Ｔ.ＡtkinsonおよびＭ.Ｓmith,Ｏligonuc
lcotide Ｓynthesis,a Ｐractical Ａpproach,Ｍ.
Ｊ.Ｇait,Ｍ,Ｊ.(ed.),ＩＲＬ press(１９８４),p４
８)に従ってジメトキシトリチル含量について分析さ
れ、ＣＰＧ支持体が１７.６μmol／gの充填度をもつこ
とが分かった。

【００９１】実施例VII コレステロール−ＣＰＧから３'コレステロール尾分子
付オリゴヌクレオチドの合成 ジメトキシトリチル含量(１micromol)に相当する量のコ
レステロール−ＣＰＧを空のカラム(例えば、Ａpplied
Ｂiosystem Ｉnc.またはＣruachemカラム)に充填し
た。塩基配列ＣＴＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴＣＡＣＡを有す
るオリゴヌクレオチドは標準のホスホルアミダイト化学
を駆使してＭilligenＤＮＡ合成機で製造した。５'−Ｄ
ＭＴr保護基は残した。オリゴヌクレオチドをＣＰＧか
ら切断し、濃アンモニア(２mＬ)と室温で３日間処理す
ることによって脱保護した。上澄液を直接ＰＲＰ−１逆
相高速液体クロマトグラフィーカラム(２０〜１００％
アセトニトリル−トリエチルアンモニウムアセテート(p
Ｈ７.５)のグラジエントで溶出)に注入した。生成物を
一部分に集め、凍結乾燥すると、５'−ＤＭＴrで保護し
た生成物が得られた。ＤＭＴr基を８０％酢酸と室温に
１６時間処理して除去し、ＨＰＬＣで再精製した。集め
た生成物をＵＶ２６０nmで分析すると生成物の０.５４m
gを含有することが分かった。本法を別に反復すると、
ＤＭＴr基は合成機にある間に３％ＤＣＡで除去され、
オリゴヌクレオチドの収率を増大した。

【００９２】実施例VIII (２Ｓ,４Ｒ)−Ｎ−(９−アクリジンプロパンアミジル)
−４−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチルピロリジン
(７) {１−[３−(９−アクリジニル)−１−オキソプロピル]
−５−ヒドロキシメチル−(３Ｒ−トランス)−３−ピロ
リジノール;工程II} 塩化メチレン(１.５mＬ)中の９−アクリジンプロピオン
酸(１２５.５mg,０.５mmol)(Ｈ.ＪensenおよびＬ.Ｊ.Ｈ
owlおよび,Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.４８,１９２６(１９８
９))、エチルジイソプロピルアミン(０.１０４mＬ,０.
６mmol)のスラリーに、撹拌下、２−フルオロ−１−メ
チルピリジニウムトシレート(ＦＭＰＴ)(０.６mmol)を
加えた。室温で１.５時間後、その濁った茶色の溶液を
氷−食塩浴で冷却したヒドロキシプロリノール（２）
(０.５mmol)のエタノール溶液に撹拌しながら加えた。
室温で１時間撹拌を続けた後、反応混合物にメタノール
(１０mＬ)を加え、反応を止めてから、濃縮した。残留
物をメタノール−塩化メチレン(グラジエント)を用い、
フラッシュクロマトグラフィー(１.５×２４cmシリカ)
で精製した。純粋な生成物を含んだフラクションから溶
媒を除去すると(７）(１１２mg,６４％収率)が黄色泡状
固体として得られた。 ＴＬＣ(９０:１０／塩化メチレン:メタノール),Ｒf＝
０.５０ 生成物は青色蛍光を発する黄色のスポットとして現われ
た。 ＩＲ(ＫＢr)３４００(br),１６２０,１４４０,１０７０
cm^-1.¹ Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣl₃)８.３０(d,４Ｈ,Ｊ＝９.４Ｈz),
７.８２(t,２Ｈ,Ｊ−６.６Ｈz),７.６２(m,２Ｈ),４.３
１(m,２Ｈ),４.０５(t,２Ｈ,Ｊ＝８.２Ｈz),３.７０(m,
１Ｈ),３.５０(m,２Ｈ),３.２２(d,２Ｈ,Ｊ＝１.４Ｈ
z),２.７８(m,２Ｈ),２.０３(m,１Ｈ),１.６４(m,１
Ｈ). 分析値(Ｃ₂₁Ｈ₂₂Ｎ₂Ｏ₃・０.５Ｈ₂Ｏとして) 計算値:Ｃ,７０.１８;Ｈ,６.４５;Ｎ,７.７９. 実測値:Ｃ,７０.４１;Ｈ,６.４５;Ｎ,７.６８.

【００９３】実施例IX (２Ｓ,４Ｒ)−Ｎ−(９−アクリジンプロパンアミジル)
−４−ヒドロキシ−２−ジメトキシトリチルオキシメチ
ルピロリジン(８) ジオール（７）(１００mg,０.２８５mmol)のピリジン
(２.５mＬ)溶液に、撹拌しながら４−ジメチルアミノピ
リジン(６.４mg)、トリエチルアミン(０.１３mＬ)、お
よびジメトキシトリチルクロリド(１５４mg)を加えた。
アルゴン気流下１６時間撹拌したのち、混合物から溶媒
を除去し、残余のピリジンはなお塩化メチレンと共に留
去した、残留物を塩化メチレン(５mＬ)に溶かし、水(２
×３mＬ)次いで食塩水(３mＬ)で洗浄し、硫酸ナトリウ
ムで乾燥してから溶媒を除去した。残留物をメタノール
−１:１／ヘキサン:酢酸エチル(グラジエント)を用い、
フラッシュクロマトグラフィーで精製した。純粋な生成
物を含むフラクションを集め溶媒を除去すると（８）
(１２３mg,６６％収率)が黄色泡状固体として得られ
た。 ＴＬＣ(４５:４５:１０／ヘキサン:酢酸エチル:メタノ
ール),Ｒf＝０.２６ 生成物は青色の蛍光を発する黄色のスポットとして現わ
れ、１０％硫酸−メタノールでスプレーすると橙色に着
色した。 ＩＲ(ＫＢr)３４００(br),１６２０,１４４０,１０７０
cm^-1.¹ Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣl₃)８.１７(m,４Ｈ),７.７５(t,２
Ｈ,Ｊ＝７.０Ｈz),７.５７−７.０９(m,９Ｈ),６.８２
(d,２Ｈ,Ｊ＝８.８Ｈz),６.６６(m,２Ｈ),４.５６(m,２
Ｈ),３.６５−２.９０(m,２Ｈ),２.６９(m,２Ｈ),２.１
５(m,１Ｈ),１.９５(m,１Ｈ). 分析値(Ｃ₄₂Ｈ₄₀Ｎ₂Ｏ₅・０.５Ｈ₂Ｏとして) 計算値:Ｃ,７６.２３;Ｈ,６.２４;Ｎ,４.２３. 実測値:Ｃ,７６.５３;Ｈ,６.６７;Ｎ,３.８０.

【００９４】実施例X (２Ｓ,４Ｒ)−Ｎ−(９−アクリジンプロパンアミジル)
−４−スクシニルオキシ−２−ジメトキシトリチルオキ
シメチルピロリジン（９) アルコール(８)(１２０mg，０.１８４mmol)の乾燥ピリ
ジン(１.５mL)の撹拌溶液に４−ジメチルアミノピリジ
ン(１１.２mg)を加えた。混合物をアルゴン下で４０時
間撹拌してから溶媒を除去した。残余のピリジンはトル
エンと共に留去し、取り除かれた。残留物をクロロホル
ム(３mＬ)に溶かし、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム
で乾燥し、濃縮すると生成物（９）(１２８mg,９３％収
率)が黄色泡状固体として得られた。 ＴＬＣ(９５:５／塩化メチレン:メタノール),Ｒf＝０.
１３. 生成物は青色の蛍光を発する黄色のスポットとして現わ
れ、１０％硫酸−メタノールでスプレーすると橙色に着
色した。

【００９５】実施例XI アクリジン−ＣＰＧ支持体(10) コレステロール−ＣＰＧ支持体（６）に対して上述した
方法を用いて、スクシニル化したアクリジン誘導体
（９）を長鎖アルキルアミンで制御した細孔ガラス支持
体に固体した。丸底フラスコ中に酸洗浄のＬＣＡＡ−Ｃ
ＰＧ(０.８５g)を乾燥ピリジン(８.５mＬ)、トリエチル
アミン(０.０６８mＬ)、１−エチル−３−(３−ジメチ
ルアミノプロピル)カルボジイミド(３２５mg,１.７mmo
l)、および４−ジメチルアミノピリジン(１０.２mg)と
混合し、混合物をアルゴン気流下に１９時間撹拌した。
そのＣＰＧを濾過し、ピリジン、メタノール、クロロホ
ルムおよびエーテルで洗浄し、次いで減圧乾燥した。そ
のＣＰＧ上に残留するアミノ基を、乾燥ピリジン(２.５
mＬ)および無水酢酸(０.３４mＬ)中支持体を撹拌するこ
とによって、キャップした。２時間後、そのＣＰＧを濾
過し、上述のように洗浄し、減圧乾燥すると生成物（1
0）(０.８５g)が得られた。この物質はジメトキシトリ
チル含量について分析され、ＣＰＧ支持体が１８.５μm
ol／gの充填度をもつことが分かった。

【００９６】実施例XII アクリジン−ＣＰＧ（10）から３'−アクリジン−尾分
子付オリゴヌクレオチド(10')の合成 ジメトキシトリチル含量(１micromol)に相当する量のア
クリジン−ＣＰＧ(10)をオリゴヌクレオチド合成カラム
に充填した。塩基配列５’−ＣＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣ
ＧＴＣＡＣＡを有するオリゴヌクレオチドを標準のホス
ホルアミダイト化学を駆使して、ＭilligenＤＮＡ合成
機で製造した。得られたオリゴヌクレオチドをそのＣＰ
Ｇから切断し、濃縮アンモニア(２mＬ)で４０℃,２４時
間処理して脱保護した。上澄液を直接ＰＲＰ−１逆相高
速液体クロマトグラフィーカラム(２０％〜１００％ア
セトニトリル−トリエチルアンモニウムアセテート(pＨ
７.５グラジエントで溶出)に注入した。生成物(10')を
１つのフラクションに集め、凍結乾燥すると蛍光性のオ
リゴヌクレオチド生成物(10')(１.９９mg)(ＵＶ２６０n
mにより決定)が淡黄色固体として得られた。

【００９７】実施例XIII ４−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−３−ヒドロキシ酪
酸(11) ４−アミノ−３−ヒドロキシ酪酸(５.０g,４２.０mmol,
Ｓigma Ｃhemical Ｃo.)を水酸化ナトリウム(３.７g)
の水(３５mＬ)溶液に溶かし、この氷冷溶液にＣＢＺク
ロリド(７.８８g,４６.２mmol)を２０分間に滴加した。
混合物を氷中で２時間撹拌してからエーテル(５０mＬ)
で洗浄し、過剰のＣＢＺクロリドを除去した。水層を３
ＮＨＣl(２０mＬ)で酸性とし、酢酸エチル(４×５０m
Ｌ)で抽出した。抽出液を合わせ、硫酸マグネシウムで
乾燥し、溶媒を減圧留去すると無色シロップ状物質が得
られ、すぐに結晶化した。クロロホルムから再結晶化す
ると所望の生成物(11)(４.７０g,４４％収率)が白色結
晶(融点９４〜９５℃)として得られた。¹ Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣl₃)７.３５(s,５Ｈ),６.７０(s,２
Ｈ),５.７０(s,１Ｈ),５.１５(s,２Ｈ),４.３５−３.９
５(m,１Ｈ),３.２５−３.００(m,２Ｈ),２.５０(d,２
Ｈ,Ｊ＝６.５Ｈz).

【００９８】実施例XIV １−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−２,４−ブタンジ
オール(12) 酸(11)(４.５７g,１８.０mmol)の乾燥テトラヒドロフラ
ン(１８mＬ)溶液を氷冷した１Ｍボラン−テトラヒドロ
フラン(Ａldrch chemical Ｃo.)のテトラヒドロフラ
ン溶液にアルゴン雰囲気下撹拌しながら滴加した。滴加
え終了后、混合物を室温で３０分間撹拌を続け次いで１
０％酢酸−メタノール(３６mＬ)を加え反応を止めた。
減圧で溶媒を除去し、残留物を酢酸エチル(８０mＬ)に
より、１.５Ｎ塩酸、水および飽和炭酸水素ナトリウム
水溶液で洗浄した。炭酸カリウム上で乾燥後減圧で溶媒
留去すると白色固体を得た。ベンゼン−ヘキサンから再
結晶すると所望の生成物(12)(１.６９g,３８％収率)が
白色結晶(融点８０.５〜８２℃)として得られた。¹ Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣl₃)７.３５(s,５Ｈ),５.５０(t,１
Ｈ,Ｊ＝６.０Ｈz),５.１０(s,２Ｈ),３.７５(t,２ＨＪ
＝６.０),４.１０−２.６５(m,５Ｈ),１.６０(q,２Ｈ,
Ｊ＝６.０Ｈz).

【００９９】実施例XV １−アミノ−２,４−ブタンジオール(13) 工程III : ＣＢＺで保護したアミノジオール(12)(１.６
９g,７.０６mmol)を水酸化パラジウム−炭素(８００m
g)、エタノール(１００mＬ)、および１,４−シクロヘキ
サジエン(２０mＬ)と混ぜ、混合物を１６時間加熱還流
した。薄層クロマトグラフィー(１０％メタノール−塩
化メチレン)は出発原料の残存を示さなかった。混合物
を半融ガラスロート(エタノール洗浄)上セライトを通し
て濾過し次いで溶媒を減圧留去すると所望の生成物(13)
(０.８４g)が黄色シロップとして得られた。エタノール
で７mＬに希釈するとアミノジオール(13)の１Ｍ貯蔵溶
液が得られた。¹ Ｈ ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ)４.８０(s,４Ｈ),３.８０(t,２Ｈ,
Ｊ＝６.０Ｈz),４.００−３.６５(m,１Ｈ),３.４０−
２.５０(m,２Ｈ),１.９５−１.５５(m,２Ｈ).

【０１００】実施例XVI １−Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−２,４−ブタ
ンジオール(14) アミノジオール(13)(６.０mmol)のエタノール(６.０m
Ｌ)の氷冷溶液にコレステロールクロロホーメート(２.
２５g,５.００mmol)の塩化メチレン(５mＬ)溶液を加え
た。混合物を氷浴からはずし、アルゴン気流下１.５時
間撹拌し、次いで氷水(１５０g)中に注入した。混合物
を酢酸エチル(２×１５０mＬ)で抽出し、抽出液を水(２
×１００mＬ)、食塩水(１×１００mＬ)で洗浄し、硫酸
マグネシウムで乾燥した後溶媒を留去した。固形残留物
をテトラヒドロフラン(１０mＬ)に溶かし、シリカゲル
カラム(３.５×１５cm,１:１ヘキサン:酢酸エチルで充
填)でクロマトグラフィーにかけた。１:１ヘキサン:酢
酸エチル(３００mＬ)で溶出後４５:４５:１０ヘキサン:
酢酸エチル:メタノールを用いると生成物を溶出した。
溶媒除去すると粘着性の白色固体(14)(２.０４g,７９
％)が得られた。¹ Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣl₃)５.３８(d,１Ｈ),５.１４(t,１
Ｈ),４.５０(m,１Ｈ),４.００−３.７０(m,３Ｈ),３.６
０−３.００(m,２Ｈ),２.４０−２.２０(m,２Ｈ),２.１
０−０.６０(m,３Ｈ).

【０１０１】実施例ＸＸII １−Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−２−ヒドロキ
シ−４−ジメトキシトリチルオキシブタン(15) ジオール(14)(１.７４g,３.３５mmol)の乾燥ピリジン
(２５mＬ)の撹拌溶液にジメトキシトリチルクロリド
(１.３６g,４.０２mmol)、トリエチルアミン(０.６５５
mＬ)および４−ジメチルアミノピリジン(２０.５mg)を
加えた。反応混合物をアルゴン気流下１６時間撹拌した
後、水(２５mＬ)とエーテル(７５mＬ)の間に分配した。
水層を別にエーテル(７５mＬ)で抽出し、抽出液を合わ
せ水、食塩水で洗浄し次いで硫酸ナトリウムで乾燥し、
溶媒を留去した。残留物をシリカゲルカラム(３.５×１
３cm、４:１ヘキサン:酢酸エチルで充填)でクロマトグ
ラフィーにかけた。生成物(黄色の不純物で汚染した)を
含むフラクションをあつめ、溶媒を留去すると黄色泡状
固体(２.２２g)が得られた。５％メタノール−塩化メチ
レンおよび４:１ヘキサン:酢酸エチルを用いて繰返しク
ロマトグラフィーにかけると純粋な生成物(15)が淡黄色
泡状固体として得られた。¹ Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣl₃)７.４５−７.１０(m,９Ｈ),６.
８０(d,４Ｈ,Ｊ＝８.８Ｈz),５.３８(d,１Ｈ),５.０５
(br t,１Ｈ),４.５０(m,１Ｈ),３.９０−３.８０(m,２
Ｈ),３.８０(s,６Ｈ),３.５０−２.９５(m,４Ｈ),２.３
０(m,２Ｈ),２.１０−０.６０(m,４３Ｈ). 分析値(Ｃ₃₃Ｈ₇₃ＮＯ₆として) 計算値:Ｃ,７７.６２;Ｈ,８.９７;Ｎ,１.１７. 実測値:Ｃ,７７.４１;Ｈ,８.９７;Ｎ,１.６０.

【０１０２】実施例XVIII １−Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−２−スクシニ
ルオキシ−４−ジメトキシトリチルオキシブタン(16) アルコール(15)(４１５mg,０.５０６mmol)の乾燥ピリジ
ン(２mＬ)の撹拌溶液に４−ジメチルアミノピリジン(３
０mg)および無水コハク酸(４８mg,０.４８mmol)を加
え、混合物をアルゴン気流下に２４時間撹拌した。薄層
クロマトグラフィー(５％メタノール−塩化メチレン)は
未反応の出発原料の痕跡量を示した。溶媒を除去し、残
余のピリジンをトルエン(２×１０mＬ)と共に溜去し
た。残留の黄色泡状固体(16)をp−ニトロフエニルエス
テルへの変換およびＣＰＧへの固定に用いた。

【０１０３】実施例XIX コレステロール−ＣＰＧ支持体(17) スクシニル化したコレステロール誘導体(16)をＡtkinso
nおよびＳmith(Ｏligonuclcotide Ｓynthesis,a Ｐra
ctical Ａpproach,Ｍ.Ｊ.Ｇait,(ed.)ＩＲＬpress,pp
４７〜４９(１９８４))の方法を用いて、長鎖アルキル
アミンで制御した細孔ガラス支持体(ＬＣＡＡ−ＣＰＧ,
Ｓigma)に固定した。粗製のスクシネート(16)(１０５m
g)をp−ニトロフェノール(１６mg)および乾燥ピリジン
(０.０５mＬ)と一緒に乾燥ジオキサン(１.０mＬ)に溶解
した。ジシクロヘキシルカルボジイミド(５２mg,０.２
５mmol)を加え、混合物を室温で１５分間撹拌してか
ら、冷蔵庫に１６時間冷却した。粗製のp−ニトロフエ
ニルエステル溶液を少量のセライトを通して濾過し、Ｄ
ＣＵを除去し、次いで濾液を直接ジメチルホルムアミド
(ＤＭＦ)(１.５mＬ)中ＬＣＡＡ−ＣＰＧ(０.５０g)に加
えた。エチルジイソプロピルアミン(０.１mＬ)を加えて
から、混合物をアルゴン気流中で１８時間撹拌した。そ
のＣＰＧを半融ガラスロートで濾過し、ジメチルホルム
アミド(３×１０mＬ)、メタノール(３×１０mＬ)および
エーテル(３×１０mＬ)で洗浄した。誘導化したＣＰＧ
を真空ポンプで乾燥し、次に乾燥ピリジン(１.５mＬ)と
無水物酢酸(０.２mＬ)で処理してキャップした。アルゴ
ン下に３時間撹拌した後、そのＣＰＧを濾過し、メタノ
ール(３×１０mＬ)およびエーテル(３×１０mＬ)で洗浄
し、真空ポンプで乾燥するとコレステロール−ＣＰＧ(1
7)(０.４６g)を得た。このＣＰＧをＧaitの記述したプ
ロトコールに従って、ＤＭＴr含量について分析したと
ころ、ＣＰＧ支持体の充填度が２４μmol／gであること
が分かった。

【０１０４】実施例XX コレステロール−ＣＰＧ(17)から３'−コレステロール
−尾分子付５'ＤＭＴr−チミジンの合成 オリゴヌクレオチド合成のためのコレステロール−ＣＰ
Ｇ(17)の安定性を試験するために、単一なチミジン残基
を固相支持体(４１.６mg,１micromol)に加えた。標準の
ホスホルアミダイトカップリング化学と共にＭilligen
ＤＮＡ合成機を駆使した。そのチミジン上の５'−ジメ
トキシトリチル保護基は生成物の単離や確認を助けるた
めに、除去されなかった。そのＣＰＧをアセトニトリル
(８mＬ)でよく洗浄し、痕跡量の未反応のＤＭＴr−チミ
ジンホスホルアミダイトおよび他の非共有結合的に結合
した不純物を取り除いた。そのＣＰＧを真空ポンプで乾
燥し、上述のようにＤＭＴr含量を分析した結果充填度
が２７micromol／gであることが分かった。３'−コレス
テロール尾分子付チミジンは支持体(２０mg)を５mＬ反
応瓶(テフロン（登録商標）ライナー)中に濃縮アンモニ
ア(１０mＬ)と４４℃で２４時間処理することによって
切り離した。上澄液(パスツールピペット)を除き、支持
体をメタノール(３×２mＬ)で洗浄し、３'−コレステロ
ール尾分子付チミジンを単離した。洗液を合わせ、溶媒
除去(ロータリーエバポレーター／真空ポンプ)し、７:
１:１:１:１酢酸エチル:アセトン:メタノール:水:酢酸
を用い、シリカゲルプレート上薄層クロマトグラフィー
により分析した。ＤＭＴrを含む一つの主要なスポット
(Ｒf＝０.６３)が１０％硫酸−メタノールでスプレーす
ると、橙色に着色した。ほんの痕跡量のＤＭＴr−チミ
ジン(Ｒf＝０.８４)しか検出されず、従って、このこと
はコレステロール結合の安定性を示した。２４時間アン
モニア処理後のそのＣＰＧ支持体は１.４μmol／gのＤ
ＭＴr含量を示した。ＤＭＴr−チミジン誘導化コレステ
ロール−ＣＰＧを４４℃で５時間アンモニア処理すると
２４時間処理と同様の薄層クロマトグラフィー結果を与
えた。５時間アンモニア処理後のＣＰＧ支持体は３.２
μmol／gのＤＭＴr含量を示した。

【０１０５】アクリジン３'−尾分子をもつ、実施例XII
から得られたオリゴヌクレオチド(10')を相補的オリゴ
ヌクレオチド鎖の存在においてその溶融温度の特性につ
いて研究した。そのアクリジンインターカレーティング
剤の存在は３'−尾分子アクリジンをもたない同様のオ
リゴヌクレオチドと比較して、Ｔm(溶融温度)を約４℃
上昇した。

【０１０６】適当なオリゴヌクレオチドの３'尾分子に
結合した適当なレポーター基は、オリゴヌクレオチドの
存在を確認(同定)するのに有用である。このようなレポ
ーター基の蛍光、化学発光、または他の性質はこれらの
ヌクレオチドを非放射能的にラベルするのに役立つ。そ
こで、例えば生体試料のような問題とする試料の中のヌ
クレオチドを蛍光または他の同様な性質の存在によって
同定することができる。例えば、コレステロール尾分子
付３'オリゴヌクレオチドのような親油性尾分子基はオ
リゴヌクレオチドの細胞膜の透過性を助ける、このよう
にして、オリゴヌクレオチドの細胞内濃度の増加または
細胞膜の透過性の促進が達成される。オリゴヌクレオチ
ドの３'末端の切断基は、オリゴヌクレオチドをこのよ
うな相補的配列に結合して後オリゴヌクレオチドの相補
的配列をもつＤＮＡの部位特異性の切断を助けることが
できる。このような利用は遺伝子の同定や単離などに関
係しうる。

【０１０７】他の尾分子またはコンジュゲート(抱合体)
は他の生物的および物理的性質の双方に基いて選ばれよ
う。このような他の生体尾分子は、適当にブロックした
合成ペプチド、ピューロマイシンやジゴキシゲニンなど
を包含しうる。有用な物理的性質を有する他の尾分子
は、スピン−ラベルの化合物、ＤＴＰＡキレート化剤、
燐脂質、ジーおよびトリニトロフエニル基、架橋試薬、
たとえばアルキル剤、アジドベンゼン、ソラーレン、ヨ
ードアセトアミド、アジドプロフラビンおよびアジドウ
ラシルを含む。

【０１０８】実施例XXI ２,３,５,６−テトラフルオロフエニルトリフルオロア
セテート(18) 無水トリフルオロ酢酸(２８mＬ,０.２mol)を、２,３,
５,６−テトラフルオロフエノール(２７.１g,０.１６３
mmol)に撹拌しながら滴加した。三フッ化硼素エーテル
付加物(０.２ml)を加え、混合物を一晩中加熱還流し
た。残留溶液を常圧で蒸留し、無水トリフルオロ酢酸お
よびトリフルオロ酢酸を除去した。所望の生成物(18)
(３２.２g,７５％収率)は、４５℃（１８ｍｍ）にて無
色液体として捕集した。 d＝１.５２g／mＬ ＩＲ(ＣＨＣl₃)３０１０,１８１５,１５２５,１４８５,
１２３５,１１８０,１１１０,９５５cm^-1. 分析値(Ｃ₈ＨＯ₂Ｆ₇として) 計算値:Ｃ,３６.６６;Ｈ,０.３８;Ｆ,５０.７４. 実測値:Ｃ,３６.３１;Ｈ,０.４３;Ｆ,５０.９５.

【０１０９】実施例ＸＸII ２,３,５,６−テトラフルオロフエニル３−(９−アクリ
ジニル)プロ ピオネート(19) 方法a : ３−(９−アクリジニル)プロピオン酸(４００m
g,１.５９mmol)およびトリエチルアミン(０.２２mＬ)の
塩化メチレン(２０mＬ)溶液に２−フルオロメチルピリ
ジニウムトシレート(ＦＭＰＴ)(４９６mg,１.７５mmol)
を加え、混合物を室温で１５分間撹拌した。２,３,５,
６−テトラフルオロフエノール(３１７mg,１.９１mmol)
およびトリエチルアミン(０.２２mＬ)を加えてから混合
物を１５分間撹拌した。その不均一混合物を溶媒除去
し、残留物を１:１ヘキサン:酢酸エチルを用いて、フラ
ッシュクロマトグラフィー(２×２９cmシリカ)により精
製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、蒸
発乾固すると所望の生成物(19)(２５０mg,３９％収率)
が淡黄色固体として得られた。 融点１８３−１８５℃; ＴＬＣ(１:１ヘキサン:酢酸エチル),Ｒf＝０.７０, 長波長紫外線(ＵＶ)の下で青色蛍光 ＩＲ(ＫＢr) ３０７５,１７９０,１５２０ および １０
９５cm^-1;¹ Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣＬ₃) ８.２９(d,４Ｈ,Ｊ＝８.０Ｈ
z),７.８２(t,２Ｈ,Ｊ＝７.２Ｈz),７.６４(t,２Ｈ,Ｊ
＝８.６Ｈz),７.０４(m,１Ｈ),４.１３(t,２Ｈ,Ｊ＝８.
７Ｈz),３.１６(t,２Ｈ,Ｊ＝８.７Ｈz)。 分析値(Ｃ₂₂Ｈ₁₃ＮＯ₂Ｆ₄として) 計算値: Ｃ,６６.１７; Ｈ,３.２８; Ｎ,３.５１; Ｆ,
１９.０３ 実測値: Ｃ,６６.０１; Ｈ,３.１１; Ｎ,３.３３; Ｆ,
１９.１３。

【０１１０】方法b: ３−(９−アクリジニル)プロピオ
ン酸(２５１mg,１mmol)の塩化メチレン(１０mＬ)の撹拌
スラリーにトリエチルアミン(２００μＬ,１.４mmol)お
よびＴＦＰトリフルオロアセテート１８(２００μＬ)を
加えた。アルゴン下に２日間撹拌した後、その不均一混
合物をセライトを通して濾過、濾液を蒸発乾固した。残
留物を１:１ヘキサン:酢酸エチルを用いてフラッシュク
ロマトグラフィー(２×２５cmシリカ)によって精製し
た。生成物を含むフラクションを集め、蒸発乾固した。
残留物を塩化メチレンを用いてフラッシュクロマトグラ
フィー(２×２５cmシリカ)により再精製した。純粋な生
成物は５％酢酸エチル−塩化メチレンで黄色帯として溶
出した。純粋な生成物を含むフラクションを合せ、蒸発
乾固すると、１９(６７mg,１７％収率)が淡黄色固体と
して得られた。

【０１１１】実施例XXIII ２,３,５,６−テトラフルオロフェニル５−(９−アクリ
ジニル)ペンタノエート(２０) 実施例XIIと同様の方法a(上述)を２０の製造に用いた。
５−(９−アクリジニル)ペンタン酸(２６２mg,１mmol)
から２０(１８０mg,４２％収率)が淡黄色固体として得
られた。 融点１２２〜１２４℃ ＴＬＣ(１:１ヘキサン:酢酸エチル),Ｒf＝０.６３, 長波長ＵＶで青色蛍光。 ＩＲ (ＫＢr) ３０７５,２９６０,１７９０,１５１５,
１１０５,９５５ および ７５０cm^-1;¹ Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣＬ₃) ８.２６(d,４Ｈ,Ｊ＝９.２Ｈ
z),７.９２(t,２Ｈ,Ｊ＝６.８Ｈz),７.５８(t,２Ｈ,Ｊ
＝８.８Ｈz),７.００(m,１Ｈ),３.７１(t,２Ｈ,Ｊ＝７.
８Ｈz),２.７８(t,２Ｈ,Ｊ＝６.４Ｈz),２.０５(m,４
Ｈ)。 分析値(Ｃ₂₄Ｈ₁₇ＮＯ₂Ｆ₄として) 計算値: Ｃ,６７.４５; Ｈ,４.０１; Ｎ,３.２８; Ｆ,
１７.７８ 実測値: Ｃ,６７.１８; Ｈ,３.８７; Ｎ,３.０２; Ｆ,
１７.６７。

【０１１２】実施例XXIV １−[３−(９−アクリジニル)−１−オキソプロピル]−
５−ヒドロキシメチル−(３Ｒ−トランス)−３−ピロリ
ジノール(７) 工程V : アクリジンＴＦＰエステル１９(２０６mg,０.
５２mmol)の塩化メチレン(８mＬ)溶液を、アミノジオー
ル２(０.５７mmol)およびトリエチルアミン(８６μＬ)
のエタノール(１.１４mＬ)氷冷溶液に滴加した。混合物
を室温で１８時間撹拌し、濃縮した。残留物を５％メタ
ノール塩化メチレンを用い、フラッシュクロマトグラフ
ィーで精製して、所望の生成物７(１８１mg,１００％収
率)が黄色泡状固体として得られた。 ＴＬＣ(９:１塩化メチレン:メタノール),Ｒf＝０.５０, 長波長ＵＶで青色蛍光を発する黄色スポット ＩＲ (ＫＢr) ３４００(br),１６２０,１４４０ および
１０７０cm^-1;¹ Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣl₃) ８.３０(d,４Ｈ,Ｊ＝９.４Ｈ
z),７.８２(t,２Ｈ,Ｊ＝６.６Ｈz),７.６２(m,２Ｈ),
４.３１(m,２Ｈ),４.０５(t,２Ｈ,Ｊ＝８.２Ｈz),３.７
０(m,１Ｈ),３.５０(m,２Ｈ),３.２２(d,２Ｈ,Ｊ＝１.
４Ｈz),２.７８(m,２Ｈ),２.０３(m,１Ｈ),１.６４(m,
１Ｈ)。 分析値(Ｃ₂₁Ｈ₂₂Ｎ₂Ｏ₃・０.５Ｈ₂Ｏとして) 計算値: Ｃ,７０.１８; Ｈ,６.４５; Ｎ,７.７９ 実測値: Ｃ,７０.４１; Ｈ,６.４５; Ｎ,７.６８。 ＵＶ(pＨ７.２) λmax＝２５２nm(ε１０１,０００),
２６０nm(ε６４００),３５６nm(ε６２００)。 蛍光(pＨ７.２)３５５nmで励起、４６０nmで発光

【０１１３】実施例XXV １−[５−(９−アクリジニル)−１−オキソペンチル]−
５−ヒドロキシメチル−(３Ｒ−トランス)−３−ピロリ
ジノール(２１) 実施例XXIVに記載したと同様の方法を２１の製造に用い
た。アクリジンＴＦＰエステル２０(１.２８g,３.００m
mol)から２１(１.０４g,９２％収率)が淡黄色泡状固体
として得られた。 ＴＬＣ(４５:４５:１０ヘキサン:酢酸エチル:メタノー
ル),Ｒf＝０.１４ 長波長ＵＶで青色蛍光を発する黄色スポット, ＩＲ (ＣＨＣl₃) ３３５０(br),３０１０,２９３０,１
６１０ および １４３５cm^-1;¹ Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣl₃) ８.２２(d,４Ｈ,Ｊ＝９.０Ｈ
z),７.７７(t,２Ｈ,Ｊ＝６.６Ｈz),７.５６(t,２Ｈ,Ｊ
＝７.８Ｈz),４.２７(m,２Ｈ),３.７−３.４(m,６Ｈ),
２.３−１.６(m,１０Ｈ)。 分析値(Ｃ₂₃Ｈ₂₆Ｎ₂Ｏ₃・０.７５Ｈ₂Ｏとして) 計算値: Ｃ,７０.４８; Ｈ,７.０７; Ｎ,７.１５ 実測値: Ｃ,７０.３３; Ｈ,６.８９; Ｎ,７.１５。

【０１１４】実施例XXVI １−[５−(９−アクリジニル)−１−オキソペンチル]−
５−[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メ
チル−(３Ｒ−トランス)−ピロリジノール(２２) ２２ の製造に実施例IXに記載したと同様の方法を用い
た。ジオール２１(１０３mg,０.２７２mmol)から２２
(７８mg,４２％収率)が淡黄色泡状固体として得られ
た。 ＴＬＣ(４５:４５:１０ヘキサン:酢酸エチル:メタノー
ル),Ｒf＝０.４１ 青色蛍光を発する黄色スポットで、１０％硫酸／メタノ
ールでスプレーすると橙色に着色した。 ＩＲ (ＫＢr) ３３５０(br),２９３０,１６１０,１５１
０ および １２５０cm ^-1; ¹Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣl₃) ８.
２４(d,４Ｈ,Ｊ＝８.８Ｈz),７.７６(m,２Ｈ),７.５３
(m,２Ｈ),７.３５−７.１０(m,９Ｈ),６.７９(m,４Ｈ),
４.７−４.３(m,２Ｈ),４.０８(m,１Ｈ),３.９−３.３
(m,１１Ｈ),３.１０(m,２Ｈ),２.３２−１.７１(m,６
Ｈ)。

【０１１５】実施例XXVII アクリジン−ＣＰＧ支持体(２３) ２３ の製造に実施例XおよびXIに記載したと同様の方法
を用いた。アルコール２２(５８mg,８０μmol)およびＬ
ＣＡＡ−ＣＰＧ(０.３９g)からＣＰＧ支持体のＤＭTr充
填度が２０.６μmol／gの２３が得られた。

【０１１６】実施例XXVIII ＣＰＧ支持体６,１０および２３を用いる３'−尾分子付
オリゴヌクレオチド(２４〜２６)の直接合成 肝炎Ｂ表面抗原蛋白質(５'−ＴＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴ)
に対応するmＲＮＡの開始コドン領域に相補的な配列を
有する３'−尾分子付オリゴヌクレオチドをＣＰＧ支持
体６,１０および２３を用いて合成した。かかる改善し
た結合性をもつ３'−尾分子(tailed)ＯＤＮはアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドとして有利に使用することがで
きる。

【０１１７】配列５'−ＴＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴを有す
る３'−尾分子付オリゴヌクレオチドの合成を実施例VII
およびXIIに記載したように、固相支持体６および１０
を夫々用いて行った。固相支持体２３を用いる同じ３'
−尾分子付オリゴヌクレオチドの合成は固相支持体２３
を固相支持体１０に代用した以外は、実施例XIIに記載
の方法と同様であった。

【０１１８】実施例XXIX ３'−アミノヘキシル−ＣＰＧ(ＡＨ−ＣＰＧ)の製造 a.１,３−ジオキソ−２−(６−ヒドロキシヘキス−１−
イル)−イソインドール−５−カルボン酸(２７) ６−アミノヘキサン−１−オール(１１.７g,１０mmol)
および無水１,２,４−ベンゼントリカルボン酸(７.６８
g,４mmol)の混合物を１５分間または水蒸気の発生が止
むまで１７５〜２２５℃に加熱した。溶融物を水にあけ
ると白色結晶性固体を与えた。この固体を減圧濾過して
捕集し、一夜真空(減圧)乾燥すると分析純度の２７(９.
１g,７８％)が得られた。 融点１２７〜１３５℃¹ Ｈ ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−d₆): δ８.３４４(１Ｈ,d,Ｈ−
７[６]); ８.２０８(１Ｈ,s,Ｈ−４); ７.９６７(１Ｈ,
d,Ｈ−６[７]); ３.５７８(２Ｈ,t,Ｈ−１'[６']; ３.
３６５(２Ｈ,t,Ｈ−６'[１']); １.７−１.２(８Ｈ,m,
Ｈ−２',３',４',５'); 分析値(Ｃ₁₅Ｈ₁₇Ｎ₁Ｏ₅として) 計算値: Ｃ,６１.８５; Ｈ,５.８８; Ｎ,４.８１; 実測値: Ｃ,６１.５６; Ｈ,６.１２; Ｎ,４.９８。

【０１１９】b.１,３−ジオキソ−２−(６−ジメトキシ
トリチルオキシヘキス−１−イル)イソインドール−５
−カルボン酸(２８) ２７ (２.９１g,１０mmol)をピリジン(５０mＬ)およびト
リエチルアミン(１.９mＬ)に溶かした溶液にジメトキシ
トリチルクロリド(７.１１g,２０mmol)および４−ジメ
チルアミノピリジン(６３mg)を加えた。混合溶液を一夜
撹拌した後蒸発乾固した。残留物を塩化メチレン(１０
０mＬ)に溶かし、得られた溶液を氷冷した１Ｍクエン酸
(１００mＬ)次いで水(１００mＬ)で洗浄してから硫酸ナ
トリウムで乾燥し、溶媒を留去した。得られた硬質のシ
ロップ２７を再度精製することなく使用した。

【０１２０】c.p−ニトロフェニル１,３−ジオキソ−２
−(６−ジメトキシトリチルオキヘキス−１−イル)イソ
インドール−５−カルボン酸(２９) ２８ (２.４g,４mmol)の塩化メチレン混液にトリエチル
アミンを加えた。溶液を氷水浴で冷却後、p−ニトロフ
ェニルクロロホルメートを加え、４℃で５時間撹拌し
た。４−ジメチルアミノピリジンを冷却溶液に加えて
後、その溶液を室温で上昇させた。室温で一夜撹拌後、
溶液を繰返し飽和炭酸水素ナトリウム液(５×１０mＬ)
次いで氷冷１Ｍクエン酸で１回抽出した。有機層を硫酸
ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固した。残留物を、溶出剤
としてトルエン−酢酸エチル(５:１)を用い、シリカゲ
ルカラム(２９×１５０mm)でフラッシュクロマトグラフ
ィーにかけた。純粋な物質を含むフラクションを溜め、
蒸発乾固すると分析純度の２９(１.７g,６０％)が得ら
れた。 分析値(Ｃ₄₂Ｈ₃₈Ｎ₂Ｏ₉として) 計算値: Ｃ,７０.５８; Ｈ,５.３６; Ｎ,３.９２; 実測値: Ｃ,７０.５７; Ｈ,５.２２; Ｎ,３.８４。

【０１２１】d.３'−アミンＣＰＧ支持体(ＡＨ−ＣＰ
Ｇ)(３０) 長鎖アルキルアミンＣＰＧを３％ジクロロ酢酸−塩化メ
チレンで活性化した。その活性ＣＰＧ(１g)を２９(１４
３mg,０.２mmol)をピリジン(１０mＬ)とトリエチルアミ
ン(１mＬ)の溶液で処理し、反応混合物をゆるやかに２
４時間かきまぜた。残存するアミンを無水酢酸(０.５m
Ｌ)を処理し、ゆるやかに２４時間かきまぜることによ
ってキャップした。そのＣＰＧを濾過し、ピリジン(１
×５mＬ)次いでアセトニトリル(３×５mＬ)で洗浄して
から風乾した。得られたＡＨ−ＣＰＧ３０を室温で２日
間真空乾燥した。過塩素酸との処理によるＡＨ−ＣＰＧ
の分析は充填度２０μmmol／gを示した。そのＡＨ−Ｃ
ＰＧ支持体(５０mg,１μmol)を標準の１μmol合成機カ
ラムに充填した。

【０１２２】実施例XXX アミン−修飾オリゴヌクレオチド(３２,３３)の合成 ＯＤＮは、標準のβ−シアノエチルホスホルアミダイト
カップリング化学(Ａtkinson ＆ Ｓmith,上記)を駆使
し、１マイクロモル規模で、二つの異なるＣＰＧ支持体
から製造した。実施例XXIXで上述したように製造したＡ
Ｈ−ＣＰＧ３０は３２を合成するのに用いた。Ｃlon
Ｔech Ｌab,Ｉnc( Ａlto,ＣＡ)から入手される"Ａmin
e−ＯＮ"ＣＰＧは３３を合成するのに用いられた。

【０１２３】配列５'−ＴＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴを有す
るアミン−修飾ＯＤＮ３２および３３は製造業者により
供給したプロトコールと共にＭilligen７５００または
Ａpplied Ｂiosystems Ｍodel ３８０Ｂのいずれかを
用いて製造した。アンモニアによる脱保護後、トリチル
化したＯＤＮを、そのアンモニア溶液をＨamiltonＰＲ
Ｐ−１カラム(３０５×７.０mm)に直接注入によりＨＰ
ＬＣ精製し、アミン修飾ＯＤＮ生成物３２または３３を
２０〜４５％アセトニトリル−０.１Ｍ ＴＥＡＡ(pＨ
７.５)(一次グラジエント)を用いて２０分(流出速度＝
４mＬ／分)で溶出した。適当なフラクションを合わせ、
savant speed−vac.で濃縮乾固した。残留物を８０％
酢酸(５００μＬ,２８℃,７０分)で脱トリチル化し、３
Ｍ酢酸ナトリウム(１００μＬ)と１−ブタノール(４m
Ｌ)で沈澱し、遠心分離し、エタノール(１mＬ)で洗浄
し、遠心分離し、蒸発乾固し、滅菌蒸留水(１mＬ)で再
構成した。ＯＤＮ３２または３３の濃度は２６０nmのＵ
Ｖ吸収から決定した。すべてのＯＤＮ濃度はpＨ７.２Ｐ
ＢＳ(９.２mＭ燐酸ジナトリウム、０.８mＭ燐酸モノナ
トリウム、０.１３１Ｍ食塩)中で測定した。各ＯＤＮの
吸光係数は最も近いモデル（Ｃ.Ｒ.Ｃantorら、Ｂiopol
ymers ９,１０５９(１９７０))を用いて決定され、Ａ
₂₆₀の理論的濃度(μg／mＬ)比を計算するのに用いられ
た。精製したＯＤＮ３２または３３は５〜４５％アセト
ニトリル−ＴＥＡＡ(一次グラジエント)を用いてＤyama
x Ｃ−１８カラムでＨＰＬＣ(流出速度＝１mＬ／分)に
より分析した。ＯＤＮ純度は変性ＰＡＧＥ分析によって
確かめられた。

【０１２４】実施例XXXI ３'−アクリジン−尾分子付ＯＤＮ(３２a)の合成 分析用Ｃ−１８ＨＰＬＣにより分析した３'−アミン−
尾分子付ＯＤＮ３２は１本のピークを示し、ＰＡＧＥは
唯一本の帯を示した。単離した３'−アミン−修飾ＯＤ
Ｎ３２[１００μg(２９nmol)]を水(１００μＬ)および
１.０Ｍ硼酸塩緩衝液(５０μＭ,pＨ８.３)に溶かした。
新しく製造したアクリジンＴＦＰエステル１９の１:１
Ｍ−ピロール:アセトニトリルの５.０mg／mＬ溶液(２
２０μＬ,１.１mg,３.０μmol)を加え、その不均一混合
物を室温で振とうした。反応の進行をＨＰＬＣでモニタ
ーした。アミン−尾分子付ＯＤＮ３２とアクリジンＴＦ
Ｐエステル１９との反応は１時間以内に完結した。１３
分の生成物を１４分の不純物からより容易に分離するた
めに、粗製の反応混合物を、水(１.５mＬ)を加え、３０
００ＭＷで切断の限外濾過膜(Ｃentricon−３ミクロ濃
縮機;Ａmicon)を通して最終容量〜１００μＬまで遠心
分離することによって予め精製した。この溶液を、５％
〜４５％アセトニトリル−０.１Ｍ ＴＥＡＡ(一次グラ
ジエント)を用い、２０分(流出速度＝１mＬ／分)間にＤ
yanamax Ｃ−１８カラム(０.７５×２５cm)でＨＰＬＣ
にかけて精製した。生成物を一つのフラクションに集め
Ｓpeed−Ｖacで濃縮した。残留物に無菌蒸留水(１００
μＬ)を加え、再生してからアクリジン−修飾ＯＤＮ３
２aの濃度をＡ₂₆₀測定から求めた。２９nmolに対する理
論収量は１０８μgで、実際の収量は３９μgであった。
そのＯＤＮ生成物３２aの純度はＨＰＬＣおよびＰＡＧ
Ｅによって定量した。

【０１２５】限外濾過の間にＯＤＮ３２aのいくらかの
損失が起こったので、アクリジン−修飾ＯＤＮ３２aを
精製するのに別な方法を用いた。すべての出発の３'−
ヘキシルアミン−尾分子付ＯＤＮ３２は反応したので、
アクリジン−修飾ODＮ３２aの精製をＳephadex（商標
名）Ｇ−２５(ＮＡＰ−２５カラム,pharmacia,Ｐiscata
way,ＮＪ）含有の予め充填したカラムを通し、ゲル濾過
によって達成した。水(２５mＬ)でカラムを平衡に戻し
てから、粗製混合物を適用し、アクリジン−修飾ＯＤＮ
を水(０.５mＬフラクション)で溶出した。純粋な生成物
(Ｃ−１８ＨＰＬＣによって明らかなように)を含むフラ
クションを合わせ、Ｓpeed−Ｖacで濃縮した。淡黄色固
体残渣３２aを水(２００μＬ)で再生し、２６０nmのＵ
Ｖ光で分析した。濃度は１０８μg／２００μＬと測定
した。理論収率は１０８μgである。

【０１２６】実施例XXXII アミン−ＯnＣＰＧを用いる３'−アクリジン−尾分子付
ＯＤＮ(３３a,３３b)の合成 実施例XXXIで上に記載したと同じ反応条件を用い、ＨＰ
ＬＣ精製の３'−アミン−尾分子付ＯＤＮ３３をpＨ８.
３硼酸緩衝液中アクリジンＴＦＰエステル(１９または
２０)で処理した。数時間振とう後に、ＨＰＬＣ分析
は、約７０％の３'−アミン尾分子付ＯＤＮ３３が未反
応で残存していることを示した。粗製反応混合物のＰＡ
ＧＡ分析はもっとも可動性の低い帯だけが完全に反応し
たことを示した。１９をさらに硼酸緩衝液で処理しても
反応の程度は増さなかった。２２時間後の混合物を濃縮
し、低分子量の不純物を３,０００ＭＷカットオフ限外
濾過膜を通して、遠心分離によって除去した。貯留物を
Ｃ−１８ＨＰＬＣで精製し、濃縮するとＯＤＮ３３aま
たは３３bがＣ−１８ＨＰＬＣによれば単一ピークとし
て、ＰＡＧＥによれば単一バンドとして得られた。

【０１２７】表Ｉは修飾および未修飾のオリゴヌクレオ
チド５'−ＴＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴの性質を示す。

【表１】 表Ｉ.オリゴデオキシヌクレオチドの性質 ＯＤＮ(a) ＭＷ Ａ₂₆₀＝1(b) 収率％(c) ＨＰＬＣ, PAGE, Ｔm(j) 修飾 (μg/mL) min^f Ｒm^h ℃ 標的 6199 29.6 21 8.7 0.60 − なし コントロール 3298 33.6 53 8.0 0.79 45.4-45.9 なし 33 3451 35.2 42 9.0 0.80¹ 45.9 3'-アミン (アミン-ON) 34 3477 35.4 27 9.2 0.75 46.3 3'-アミン (ヘキシルアミン) 24 3890 3.97 48 19.0^g 0.74 52.4 3'-CHOL 25 3710 36.4 43 11.1 0.75 52.7 3'-ACR(3C) 26 3738 36.7 64 12.8 0.74 52.7 3'-ACR(5C) 33a 3684 36.2 14 11.9 0.75 51.3 3'-ACR(3C) 33b 3712 36.4 27 13.0 0.74 52.8 3'-ACR(5C) 32a 3710 36.4 36^d,100^e 13.3 − 50.8 3'-ACR(3C) ^a ２０単位ＯＤＮ(標的)の配列は５'−ＧＴＧＡＣＧＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡ ＣＡＴ。１１単位ＯＤＮ(コントロール)は５'−ＴＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴ。 ^b ２６０nmで１.００吸収単位が得られるＯＤＮの濃度の計算値 ^c ＣＰＧ１μmolから単離のＯＤＮの％収率、３２a,３３aおよび３３bの収率 は出発アミン尾分子付ＯＤＮのμmolに基づく。 ^d Ｃ−１８ＨＰＬＣにより精製 ^e ゲル濾過により精製 ^f 溶出時間;Ｆig１に記載のＨＰＬＣ系 ^g ３５〜８０％アセトニトリル(３０分)のグラジエントを用いた ^h Ｒmはブロモフェノールブルーに対する移動距離の相対比 ⁱ 主生成物のＲmを掲載 ^j ＴmはＡ₂₆₀対温度の最大勾配の中点の温度 工程VIIIはＯＤＮ２５,２６,３２a,３３a,３３bに組み
入れられる３'−アクリジン尾分子の構造を示す。ＡＨ
−ＣＰＧはアミン−ＯＮＣＰＧで得られた収率に比し、
３'−アクリジン−尾分子付ＯＤＮの改善した収率を得
られた。

【０１２８】実施例XXXIII 内部的アミン−修飾ＯＤＮ(３４〜３６)の合成 内部的アミン修飾は、Ｋ.Ｊ.ＧibsonおよびＳ.Ｊ.Ｂenk
ovic.(Ｎucl、ＡcidoＲes.１５,６４５５(１９８７))に
よって記載したように、５−フタルイミドプロピル−
２'−デオキシウリジンの５'−ＤＭＴr−３'−０−シア
ノエチルジイソプロピルホスホルアミダイト誘導体と共
に、実施例XXXに記述したプロトコールによって導入し
た。要約すれば、ＯＤＮ５'−ＴＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴ
を、以下に示したように、a,b,およびまたはcで内部的
に修飾した。 位置a（３４）、位置a＋b（３５）または位置a＋c（３
６）においてアミン修飾によって三つの異なるＯＤＮを
製造した。

【０１２９】実施例XXXIV 内部的修飾アクリジンＯＤＮ(３４a,３４b,３５a,３５
b,３６a,３６b)の合成 内部的にアミン−修飾のＯＤＮ３４,３５,３６を、実施
例XXXIに記載した方法に従って、アクリジンＴＦＰエス
テル１９と反応させて夫々ＯＤＮ生成物３４a,３５aお
よび３６aを生成し、またはアクリジンＴＦＰエステル
２０と反応させて夫々ＯＤＮ生成物３４b,３５bおよび
３６bを生成した。

【０１３０】実施例XXXＶ 熱変性実験 ３'−尾分子の結合親和性への影響をしらべるために、
上記の種々の３'−修飾ＯＤＮを用い、Ｔm実験を行っ
た。熱解離曲線は選択した３'−尾分子付ＯＤＮと適当
な相補的な未修飾２０単位ＯＤＮ標的(５'−ＧＴＧＡＣ
ＧＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴ)の等モル量を含む水
溶液のＡ₂₆₀の変化を追跡することによって得られる。
２０単位ＯＤＮ標的はヌクレオチドの突出部分を与え、
これがＯＤＮの３'−修飾との相互作用に影響しうる。
かかる相互作用は、実際の生体標的において同様に重要
となろう。これらの実験に対しては、標的はＤＮＡであ
って、類似の生体標的であるＲＮＡではなかった。アク
リジンを、標的鎖でのハイブリッド形成によるミニ二本
鎖の塩基対の間においてここで効率的に挿入するなら
ば、アクリジン−修飾のＯＤＮ標的２本鎖のＴmを増大
させることができる。未修飾の１１単位ＯＤＮを各Ｔm
研究にコントロールとして使用した。

【０１３１】ＯＤＮをpＨ７.２ＰＢＳの２μＭ溶液とし
て製造した。Ｇilford２５２７サーモプログラマーを備
えたＧilford Ｓystem２６００ＵＶ−ＶＩＳ分光光度
計を使用した。温度制御クヴェット(cuvette)を用い、
０.５℃／分の温度上昇をはかりながら、試料を１５℃
から８５℃まで加熱した。Ｔmは極限の誘導体を用いて
測定した。複製実験では０.５℃以内でＴmsを与えた。
一つの代表的な実験データを実施例XXXII中の表Iに掲げ
られている。

【０１３２】未修飾ＯＤＮと比べて、３'−コレステロ
ール−尾分子付ＯＤＮ２４の溶融温度に著しい増大を観
察したが、これは先に報告(Ｒ.Ｌ.ＬetsingenらＰroc.
Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ８６,６５５３(１９８９))
した３'−コレステロール−尾分子付ＯＤＮの類似研究
とは著しく違っていた。本明細書に記載のＴm研究で
は、相補的標的の突出部分は、標的核酸と親油性尾分子
との相互作用同様に、Ｔmに影響を及ぼしうる。

【０１３３】ＯＤＮ２５および２６は標的ＯＤＮに対し
て同等な結合親和性を示した(すなわち、比較可能なＴ
m)。ＯＤＮ２５と２６(すなわち、３−および５−炭素
の結合手の長さ)のＴmの間にさして驚くべき差異は観察
されなかったが、ＯＤＮ３３aおよび３２aは、ＯＤＮ２
５,２６,および３３bのΔＴmに比較して、Ｔmにおける
ほんの小さな増大を生じたに過ぎなかった。これらのデ
ータは、結合手の強さ、立体化学の信頼性、および／ま
たは配列に依存のインターカレーション効果がＴmに影
響を及ぼしうることを示唆する。

【表２】 表II 内部的修飾のアクリジン−ＯＤＮのＴmデータ 標的配列:３’− ＴＡＣ ＡＡＧ ＡＧＧ ＴＡＣ ＡＡＧ ＣＡＧ ＴＧ -5' Ｕの位置 a b c アンチセンス11単位: 5'- ＴＣＣ ＡＵＧ ＵＵＣ ＧＴ -3' Ｕ＝５−アミノプロピル−２'−デオキシウリジン

【０１３４】表IIは、未修飾のＯＤＮと内部的修飾ＯＤ
Ｎ(１および２個所の双方の内部的修飾)で得られたＴm
データを提供する。未修飾および内部的修飾のＯＤＮの
Ｔmを求め、未修飾ＯＤＮＴmと各内部的修飾のＯＤＮに
対するＴmの間の差を計算した(△Ｔm(℃))。計算したＴ
mの差は−２.１℃〜＋１０.７℃に及んだ。５−炭素の
結合手の長さは大きなＴm増大を生じた(すなわち、３４
b,３５b,３６b)が、かかる大きなＴmの増加は容易には
予測しがたい。二番目のインターカレーティングアクリ
ジン基の包含はＴm増大に付加的効果を生じた。これら
のデータは、結合手の長さ、配列に依存するインターカ
レーション効果および／またはアミド結合の水素結合
(アクリジンＴＦＰエステルとのアミン修飾反応を通じ
て生じたもの)がＴmに影響を及ぼしうることが示され
た。

【０１３５】実施例XXXVI Ｏ−(４,４'−ジメトキシトリチル)−１,６−ヘキサン
ジオール(３７) ＤＭＴr−cl(３.３８g,１０mmol)およびジイソプロピル
エチルアミン(３.４５mＬ,２０mmol)の乾燥ピリジン(５
０mＬ)中の溶液に１,６−ヘキサンジオール(５.９１g,
５０mmol)を加えた。４時間撹拌後、５％炭酸水素ナト
リウム(８５mＬ)を加え反応を止め、混合物を塩化メチ
レン(２×１００mＬ)で抽出した。有機層を水(２×１０
０mＬ)、次いで食塩水(１００ｍＬ)で洗浄し、硫酸ナト
リウムで乾燥、濾過し、濃縮した。残留物を塩化メチレ
ンを用いて、フラッシュクロマトグラフィー(３.５×１
７cmシリカ)により精製した。純粋な生成物を含むフラ
クションを合わせ、濃縮すると３７(１.４０g)が黄色シ
ロップとして得られた。ＴＬＣ(９５:５塩化メチレン:
メタノール),Ｒf＝０.４０, 黄色スポット：これは１０％硫酸−メタノールでスプレ
ーすると橙色に変化した。¹ Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣl₃) ７.５−７.１(m,９Ｈ),６.８１
(m,４Ｈ),３.８０(s,３Ｈ),３.７７(s,３Ｈ),３.６４
(q,２Ｈ,Ｊ＝６.６Ｈz),３.０２(q,２Ｈ,Ｊ＝６.０Ｈ
z),１.７−１.２(m,８Ｈ)。 分析値(Ｃ₂₇Ｈ₃₂Ｏ₄・０.７Ｈ₂Ｏとして) 計算値: Ｃ,７４.８７; Ｈ,７.７７ 実測値: Ｃ,７４.６１; Ｈ,７.３６。

【０１３６】実施例XXXVIII ヘキサノール−ＣＰＧ(３８) アルコール３７(５３０mg,１.２６mmol)の乾燥ピリジン
(１０mＬ)中の撹拌溶液に無水コハク酸(３８０mg,３.８
０mmol)およびＤＭＡＰ(７６mg)を加えた。混合物をア
ルゴン下に２３時間撹拌し、蒸発乾固した。残余のピリ
ジンをトルエンで共沸蒸留した。残留物をクロロホルム
(３０mＬ)に溶かし、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム
で乾燥し、濃縮すると、定量的収量のコハク酸エステル
が黄色泡状固体として得られた。 ＴＬＣ(９５:５塩化メチレン:メタノール),Ｒf＝０.１
９, 生成物は黄色スポットとして現れ、１０％硫酸−メタノ
ールでスプレーすると橙色に着色した。

【０１３７】粗製のスクシニル化誘導体(１０４mg,０.
２００mmol)に酸洗浄したＬＣＡＡ−ＣＰＧ(１.０g)、
乾燥ピリジン(１０mＬ)、トリエチルアミン(０.０８０m
Ｌ)、ＥＤＣ(３８０mg,２.０mmol)およびＤＭＡＰ(１２
mg)を加え、混合物とアルゴン下に４６時間撹拌した。
そのＣＰＧを濾過し、ピリジン、メタノール、クロロホ
ルムおよびエーテルで洗浄し、次いで真空乾燥した。Ｃ
ＰＧ上の残余のアミノ基を、その支持体を乾燥ピリジン
(３.５mＬ)と無水酢酸(０.４６mＬ)中で撹拌することに
よってキャップした。３時間後、そのＣＰＧを濾過し、
メタノール、クロロホルムおよびエーテルで洗浄し、次
いで真空乾燥すると生成物３８(１.０g)が得られた。こ
のＣＰＧは、ＤＭＴr含量について分析したところ、２
６.２μmol／gの充填度をもつことが分かった。

【０１３８】実施例XXXVIII ３'−ヘキサノール−尾分子付カルモジュリンアンチセ
ンスＯＤＮ(３９)の合成 ＤＭＴr含量(３８mg,１μmol)に相当するヘキサノール
−ＣＰＧ３８を空のＯＤＮ合成カラム(Ａmerican Ｂis
netecs,Ｉnc.)に充填した。パラメシウム（Ｐａｒａｍ
ｅｃｉｕｍ）のカルモジュリンmＲＮＡの開始コドン領
域(−１２〜＋１２)に相補的な配列を有する２４単位
(５'ＴＡＡＴＴＡＴＴＣＡＧＣＣＡＴＴＴＡＴＴＡＧＴ
Ｔ)を、ヘキサノール−ＣＰＧ３８、標準のホスホルア
ミダイト化学を駆使したＡＢＩ３８０ＢＤＮＡ合成機、
および製造業者によって供給したプロトコールを用いて
製造した。５'−ＤＭＴr保護基は除去しなかった。ＯＤ
Ｎを支持体から切り離し、次いで３０％アンモニア水
(２ml)で４０〜４４℃にて２４時間処理して脱保護し
た。その上澄液を直接、ＰＲＰ−１逆相ＨＰＬＣカラム
(３０５×７.０mm)に注入し、２０〜４５％アセトニト
リル／０.１Ｍ ＴＥＡＡ(pＨ７.５)(一次グラジエント)
を用い２０分間流出速度１mＬ／分で溶出した。生成物
を１つのフラクションに集め、Ｓpeed−Ｖacで濃縮する
と５'−ＤＭＴrで保護した生成物を得た。ＤＭＴr基を
８０％酢酸(３００μＬ)で２８℃にて８０分処理して除
去し、２.４Ｍ塩化ナトリウム(１００μＬ)と１−ブタ
ノール(４mＬ)で３'−ヘキサノール−尾分子付ＯＤＮを
析出させた。混合物を遠心分離し、エタノール(１mＬ)
で洗浄し、さらに遠心分離し、蒸発乾固した。残留する
白色固体を無菌蒸留水(１mＬ)で再生し、０.２μmフィ
ルターで濾過した。ＯＤＮ３９の濃度は、２６０nmのＵ
Ｖ吸収から定量したように、３.７５mg／mＬであった。
１μmolに対する理論収量は７.４９mgである。精製した
ＯＤＮ３９を、５〜４５％アセトニトリル／ＴＥＡＡ
(一次グラジエント)を用い、２０分間(流出速度＝１mＬ
／min)溶出しながら、ＤynamaxＣ−１８カラム(０.７５
×２５cm)でＨＰＬＣにかけ分析した。一本の主要なピ
ークは９.９分(９５％以上の純度)で溶出した。ＯＤＮ
３９純度はＰＡＧＥ変性分析によって確認した(１バン
ド)。

【０１３９】実施例XXXIX ヘキサノール−尾分子付ＯＤＮ３９の生物学的作用 パラメシウム・テトラウリア(paramecium tetraureli
a)の遊泳挙動が、注入したＯＤＮ３９のアンチセンス効
果を研究するための生物学的モデル系として使われて来
た。パラメシウム・テトラウリア(paramecium tetraur
elia)の遊泳挙動は、細胞膜の中の一連のイオンチャン
ネル(電圧依存性のＣa²+およびＫ+チャンネル並びにＣa
²+依存性のＮa+およびＫ+チャンネル)の作用によって制
御される。これらのイオンチャンネルは連動して働き、
繊毛運動が逆転をもたらす活動電位を生ずる。かかる逆
転はパラメシウム・テトラウリアのうしろ向きの遊泳を
ひきおこす。調節蛋白質、カルモジュリンはパラメシウム
・テトラウリアにおける膜電位と遊泳挙動の制御に中枢
的な役割を演じている。

【０１４０】３'−ヘキサノール−尾分子アンチセンス
ＯＤＮ３９はパラメシウム・テトラウリアにおけるカル
モジュリン遺伝子の発現を抑制するのに用いられた。こ
のアンチセンスＯＤＮ３９を細胞質(細胞の原形質)にマ
イクロシリンジで注入し、細胞の挙動を時間を追ってモ
ニターした。Ｎa+チャンネルの機能を試験する溶液中に
インキュベートすることによってその注入した細胞を分
析した。野性株の細胞はかかる溶液中では約１５秒間後
方遊泳する; アンチセンスＯＤＮ３９を注入した個々
の細胞は、非常に低下した挙動の応答を示した。１５〜
２０時間後、注入した細胞の後方遊泳時間は約２秒間の
極小値に低下した(図１)。時間０でＯＤＮ３９をミクロ
注入した細胞にその後、１５時間の後カルモジュリンを
注入した時に、正常な後方遊泳挙動が回復した。ランダ
ムまたはセンスのいずれかの配列を示した２４単位−
３'−ヘキサノール−尾分子付ＯＤＮを注入すると後方
遊泳に何ら変化を生じなかった(図２)。

【０１４１】３'−ヘキサノール−尾分子カルモジュリ
ンアンチセンスＯＤＮ３９は０.４２mg／mＬ(５６μＭ)
程度の低い濃度でも有効であった(図３)。反対に、３'
−修飾をもたないカルモジュリンアンチセンスＯＤＮは
６.１mg／mＬ(８３５μＭ)の高い濃度でも効果を示さな
かった。このように、３'−尾分子アンチセンスＯＤＮ
３９は、類似の未修飾ＯＤＮよりも少なくとも１５倍も
大きい効力(力価)を示した。この効力の増大は３'−エ
キソヌクレアーゼ分解に対し３'−尾分子付ＯＤＮの改
善した安定性に起因する。注入容積１０pＬおよびパラ
メシウム・テトラウリア容積２００pＬと仮定すれば、
観察し得る生物学的効果に対するＯＤＮ３９の最小細胞
質濃度は２.８μＭと算出された。

【０１４２】以上、発明の好ましい実施例について説明
したが、これは説明の目的のみで記載したもので、他の
具体例、変形例、改良例などは当業者には明白である。
本発明は、好ましい実施例に限定されるものでなく、以
下の請求の範囲に示されるものである。

【０１４３】

【化１４】

【０１４４】

【化１５】

【０１４５】

【化１６】

【０１４６】

【化１７】

【０１４７】

【化１８】

【０１４８】

【化１９】 工程 VI （a）溶融、175-225℃；（b）ピリジン、Et₃N、DMTrCl； （c）１：P−ニトロフェニルクロロホーメ−ト、Et₃N、CH₂Cl₂； ２：DMAP;（e）１：ピリジン、Et₃N；２：Ac₃O.

【０１４９】

【化２０】

【課題を解決するための手段】 【発明の実施の形態】 【実施例】 【発明の効果】 【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、アンチセンスＯＤＮ３９のマイクロ
シリジン注入後のパラメシウメ（Paramecium)の遊泳挙
動の時間的経過を示す。

【図２】 図２は、アンチセンスＯＤＮ３９の生物学的
効果−ランダムまたはセンスＯＤＮを示す。

【図３】 図３は、パラメシウムの遊泳挙動のアッセイ
におけるアンチセンスＯＤＮ３９の投与応答曲線であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リッチ・ビイ・メイヤー・ジュニア アメリカ合衆国、98072ワシントン州、 ウッドインヴィル、エヌイー・ワンハン ドレッドアンドセブンティシックスス・ プレイス、15411番 (72)発明者 チャールズ・アール・ピートリー アメリカ合衆国、98072ワシントン州、 ウッドインヴィル、エヌイー・ワンハン ドレッドアンドナインティシックスス・ プレイス、18459番 (72)発明者 ジョン・シー・ターボン アメリカ合衆国、98011ワシントン州、 ボゼル、エヌイー・ワンハンドレッドア ンドシックスティシックスス・プレイ ス、12117番 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07D 209/48 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式： 【化１】 ［式中、Ｒはアルキル、アリール、アリールアルキル、
   ヘテロアルキルまたはヘテロアリールであり、ＤＭＴｒ
   はジメトキシトリチルであり、波線はスペーサーであ
   る］ で示されるオリゴヌクレオチド合成用の固相支持体。
2. 【請求項２】Ｒがアルキルであり、波線が長鎖アルキル
   である、請求項１の固相支持体。