JPH09208595A

JPH09208595A - ３’−標識ポリヌクレオチドの直接合成用の固体支持体試薬

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Publication number: JPH09208595A
Application number: JP9027326A
Authority: JP
Inventors: Khairuzzaman Bashar Mullah; バシャルムラーカイルッツァマン; William A Andrus; エイ．アンドリューウイリアム
Original assignee: Perkin Elmer Corp
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 1996-01-29
Filing date: 1997-01-28
Publication date: 1997-08-12
Anticipated expiration: 2017-01-28
Also published as: DE69731132D1; US5736626A; DE69731132T2; JP2008247908A; CA2195256A1; EP0786468A2; EP0786468B1; AU1016997A; JP4127870B2; AU704180B2; CA2195256C; EP0786468A3

Abstract

(57)【要約】【課題】３’−末端に位置する標識を有するポリヌク
レオチドの直接合成に有用な合成支持体およびこのよう
な支持体試薬の利用方法を提供する。【解決手段】次式：【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は一般に官能化ポリヌクレ
オチドの合成に有用な固体支持体試薬に関するものであ
る。さらに特に、本発明は３’−末端に位置する標識を
有するポリヌクレオチドの直接合成に有用な合成支持体
およびこのような試薬の利用方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】同位体によらずに標識を付けたポリヌク
レオチドプローブ、ＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法、自動化ＤＮ
Ａ配列分析、およびバイオ活性アンチセンスおよびトリ
プレックス合成試薬を連続して迅速に開発することによ
り、化学的に修飾されたポリヌクレオチドに対する需要
を大いに増した。特に有用なポリヌクレオチド修飾のひ
とつはオリゴヌクレオチドの３’−末端での標識の導入
である。

【０００３】合成ポリヌクレオチドのこのような３’−
標識は２つの方法の一つで最も容易に行うことができ
る。第一の方法は、ここでは「２工程標識法」と呼ば
れ、第一脂肪族アミンがポリヌクレオチドの３’−末端
に導入され、続いてポリヌクレオチド合成が行われ、ア
ミノ基は親電子的部分、例えば、イソチオシアネートま
たは活性化エステル、例えば、ＮＨＳ−エステルを含む
標識と反応する。第二の代替法は、ここでは「直接標識
法」と呼ばれ、標識は合成中または前にポリヌクレオチ
ドに直接組み込まれる。

【０００４】合成ポリヌクレオチドの３’−末端に標識
を導入する最も有効で手軽な方法は適当に官能化した合
成支持体を使用する直接標識法を使用することである。
その理由は(i) 直接法は合成後の反応工程が不要であ
り、これにより３’−標識ポリヌクレオチドの合成を簡
単にする；そして (ii) 直接法はアミノ標識オリゴヌク
レオチドを標識、例えば、染料−ＮＨＳ−エステル標識
と反応させるとき一般に出合う低い反応収率（＜60％)
に関連した問題、即ち：(a) 過剰な標識物から標識オリ
ゴヌクレオチドを精製すること；(b) 非標識オリゴヌク
レオチドから標識オリゴヌクレオチドを精製すること；
(c) 大きい画分の非標識オリゴヌクレオチドを捨て去る
ことによる生成物の収率の減少に伴うコストの増加；お
よび(d) 合成中の３’−アミン機能性の不可逆キャッピ
ング、を避けるからである。

【０００５】しかし、ポリヌクレオチドの直接３’−標
識のために使用される現存の方法の重大な欠点は、支持
体からオリゴヌクレオチドを分解するために使用される
試薬がまた多くのタイプの標識、例えば、螢光染料、例
えば、ローダミン基剤染料を化学的に分解し、これによ
りそれらの螢光性を徹底的に変化させることである。こ
こに参考文献として組み込まれるP.E.NelsonらのNuclei
c Acids Research 20(23): 6253-6259 (1992),および米
国特許第5,401,837号および 5,141,813号を参照。従っ
て、ローダミンまたは他の同様の染料は現行の固相合成
プロトコルに使用されるときはいつも、あまり望ましく
ない２段階法を使用して結合しなければならない。

【０００６】それ故に、塩基に不安定な標識に不適合な
苛酷な分解条件を必要としない３’−標識ポリヌクレオ
チドの直接合成に有用な合成支持体を提供することが望
まれてきた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は３’−標識ポ
リヌクレオチドの直接合成に有用なジグリコレート基剤
合成支持体の発見に基づくものである。本発明の目的
は、ポリヌクレオチド生成物の開裂が水酸化アンモニウ
ムに関連した穏和な条件を使用して行われる合成支持体
を提供することである。

【０００８】本発明の目的はさらに、ポリヌクレオチド
生成物の開裂を、ローダミン染料に危害を加えない条件
を使用して行うことができる合成支持体を提供すること
である。本発明の他の目的は、３’−標識ポリヌクレオ
チドの直接合成を水酸化アンモニウムに不安定な標識、
例えば、テトラメチルローダミンを使用して行うことが
できる合成支持体を提供することである。

【０００９】さらに本発明の他の目的は、従来の合成支
持体を使用するときよりも開裂反応が非常に速い合成支
持体を提供することである。本発明の他の目的は、３’
−標識ポリヌクレオチドの収率が従来の支持体を使用し
た場合よりも非常に高い合成支持体を提供することであ
る。

【００１０】

【課題を解決するための手段】第一の局面では、本発明
の前記および他の目的は、式：

【００１１】

【化９】

【００１２】（式中、Ｔは酸開裂性の水酸基保護基、例
えば、4,4'−ジメトキシトリチルであり；Ｌ₁は3'−末
端窒素を炭素に結合するためのリンカーであり；Ｌ₂お
よびＬ₃は酸素および炭素を結合するためのリンカーで
あり；Ｗは固体支持体であり；Ｌ₄は固体支持体を窒素
に結合するためのリンカーであり；Ｒ₁およびＲ₂は水
素、低級アルキル、窒素保護基、または標識からなる群
からそれぞれ選ばれる窒素置換基であり；Ｒ₃からＲ₇
までは水素または低級アルキルからなる群からそれぞれ
選ばれる炭素置換基である。）の化合物からなる合成支
持体によって達成される。

【００１３】好適例において、ＷはＣＰＧであり、Ｌ₄
は

【００１４】

【化１０】

【００１５】の構造を有する。また別の好適例では、Ｗ
は非膨潤性ポリスチレンであり、Ｌ₄はメチレンであ
る。さらに他の好適例では、Ｌ₁は

【００１６】

【化１１】

【００１７】（式中、ｎは０から10のいずれかであり、
さらに好ましくはｎ＝５である。）の構造を有する。第
一の特に好適な例では、本発明の合成支持体は次の構造
を有する。

【００１８】

【化１２】

【００１９】（式中、ＤＭＴは4,4'−ジメトキシトリチ
ルであり、Ｗはポリスチレンである。）第二の特に好適な例では、本発明の合成支持体は次の構
造を有する。

【００２０】

【化１３】

【００２１】（式中のＤＭＴは4,4'−ジメトキシトリチ
ルであり、ＷはＣＰＧである。）第三の特に好適な例では、本発明の合成支持体は次の構
造を有する。

【００２２】

【化１４】

【００２３】（式中、ＤＭＴは4,4'−ジメトキシトリチ
ルであり、Ｗはポリスチレンである。）第四の特に好適な例では、本発明の合成支持体は次の構
造を有する。

【００２４】

【化１５】

【００２５】（式中のＤＭＴは4,4'−ジメトキシトリチ
ルであり、ＷはＣＰＧである。）第二の局面では、本発明は上記合成支持体と組み合わせ
て従来の合成技術を用いる３’−末端にて標識または窒
素を有するポリヌクレオチドを合成するための方法を含
む。特に、これらの方法は(i) 上記のように合成支持体
を提供し；(ii)合成支持体を酸で処理して酸開裂性水酸
基保護基を除去し；(iii) 保護ヌクレオシドモノマーお
よび弱酸を添加して結合体を形成し；(iv) 固体支持体
の未反応部位をキャッピングし；(v) 酸化剤を添加し；
そして(vi) ポリヌクレオチド鎖の伸長が完了するまで
上記工程を繰り返す、各工程を含む。３’−標識ポリヌ
クレオチドの合成後、開裂試薬を使用して固体支持体か
ら生成物を開裂し、ポリヌクレオチドを脱保護する。

【００２６】以下、本発明をさらに詳細に説明する。

【００２７】

【発明の実施の形態】本発明は各図面および式を参照し
て以下に好適例を詳細に説明する。本発明は好適例につ
いて説明するが、これらの好適例に限定されるものでは
ない。本発明は３’−標識ポリヌクレオチドの合成に有
用な改良されたジグリコレート基剤合成支持体に関す
る。特に、本発明の合成支持体は次の一般式による構造
を有する。

【００２８】

【化１６】

【００２９】（式中のＴは酸開裂性水酸基保護基であ
り；Ｌ₁は３’−末端窒素を炭素に結合するためのリン
カーであり；Ｌ₂およびＬ₃は酸素および炭素を結合す
るためのリンカーであり；Ｗは固体支持体であり；Ｌ₄
は固体支持体を窒素に結合するためのリンカーであり；
Ｒ₁およびＲ₂は水素、低級アルキル、窒素保護基、ま
たは標識をそれぞれ含む窒素置換基であり；Ｒ₃からＲ
₇までは水素または低級アルキルをそれぞれ含む炭素置
換基である。）本発明の合成支持体はポリヌクレオチドの合成に使用さ
れる現在の琥珀酸塩基剤の合成支持体を超える幾つかの
重要な利点をもつ。この支持体の特に重要な利点は、一
旦合成されると、３’−標識ポリヌクレオチドが、比較
的穏和な開裂試薬、即ち、水酸化アンモニウムよりも弱
い求核剤である開裂試薬を使用して固体支持体から開裂
することができることである。例示的な穏和な開裂試薬
はエタノールアミン、メチルアミン／水酸化アンモニウ
ム混合物、およびｔ−ブチルアミン／水／メタノール
（１：２：１）の混合物を含む、例えばここにその全体
が参考文献として組み込まれる米国特許第5,231,191号
参照。このような穏和な開裂試薬を使用できることは、
水酸化アンモニウムに耐えられない標識、例えばテトラ
メチルローダミン（ＴＡＭＲＡ：時には「ＴＭＲ」とよ
ばれる）、例えば６−カルボキシテトラメチルローダミ
ンのようなローダミン染料を有する３’−標識ポリヌク
レオチドを直接合成することができるので、実際に重要
である。

【００３０】本発明の第二の重要な利点は、穏和な開裂
試薬を使用しても、開裂反応が実質的に従来の方法およ
び試薬、例えば水酸化アンモニウム基剤試薬を琥珀酸塩
基剤の合成支持体と組合せて使用して観察されるものよ
りも速いことである。本発明の支持体の第三の利点は手
の介入や苛酷な開裂条件なしで高い生成収率が得られる
ことである。現存する琥珀酸塩基剤の合成支持体を使用
して高収率、即ち、99％台の収率を得るには、合成後
に、ポリヌクレオチド含有合成支持体を反応カートリッ
ジから手で除き、ガラス瓶に移し、開裂試薬を添加し、
懸濁液を数時間約85℃で加熱する。この苛酷な開裂プロ
トコルを使用することによる好ましくない結果のため、
固体支持体中に存在する汚染物質を開裂溶液中に抽出
し、これによって生成物のオリゴヌクレオチドの精製を
妥協しなければならない。現在入手できる支持体を使用
するとき必要な厄介で苛酷なプロトコルに比べて、本発
明の合成支持体を使用すると、合成支持体をポリヌクレ
オチド合成器から除去することなく、あるいは開裂反応
を加熱することなく、完全に自動化した方法で99％の収
率を得ることができる。さらに、苛酷な開裂条件を必要
としないので、生成物は固体支持体から抽出される物質
で汚染されない。

【００３１】ここで使用される「オリゴヌクレオチド」
または「ポリヌクレオチド」の語は天然または改良され
たヌクレオシドのオリゴマー、またはホスホジエステル
結合によって結合した非ヌクレオシド類似体、または数
単量体単位、例えば２〜５から数百単量体単位の大きさ
の範囲の類似体のオリゴマーを意味する。ここに使用さ
れる語「標識（LABEL)」は一般に、(i) 検出を容易にす
る改質剤、例えば、染料、酵素、スピンラベル等；(ii)
固体支持体へのポリヌクレオチドの捕獲を容易にする
改質剤、例えば、ビオチン、ヘプテン等；(iii) 溶解性
に影響を与え或いは細胞の取込みを改良する改質剤、例
えば、ＰＥＧ、コレステリル、トリグリセリド等；およ
び(iv) 化学反応に関係する部分を導入する改質剤、例
えばプソラレン、ＥＤＴＡ、リン酸塩、核酸開裂試薬等
を含む任意のポリヌクレオチドの３’−改質剤を意味す
る。

【００３２】本発明では、Ｗはポリヌクレオチド合成が
行われる固体支持体である。Ｗは種々の形態および組成
を有することができるが、固体支持体は(i) ポリヌクレ
オチド合成試薬に殆ど溶解せず、(ii) ポリヌクレオチ
ド合成試薬に化学的に安定であり、(iii) 化学誘導がで
き、(iv) 望ましいオリゴヌクレオチドの装填ができ、
(v) 処理中に出合う高圧に耐える十分な圧縮力をもち、
そして(vi) 望ましい粒径範囲と分布で入手できる必要
がある。ここに使用されるように、「ポリヌクレオチド
合成試薬」の語は一般にポリヌクレオチド合成工程に使
用される溶媒および試薬を意味し、例えばヨウ素、塩化
メチレン、アセトニトリル、テトラゾール、ｎ−メチル
イミダゾール、ピリジン、無水酢酸、ルチジン、トリフ
ルオロ酢酸等である。

【００３３】好適例では、Ｗは無機ポリマーである。広
範囲の無機ポリマーを本発明で使用でき、これらは、例
えば、シリカ、有孔ガラス、アルミノシリケート、ボロ
シリケート、アルミナおよび酸化ニッケルのような金属
酸化物、種々のクレー等を含む。好ましくは、無機固体
支持体は制御有孔ガラス（ＣＰＧ）である。制御有孔ガ
ラスは、制御した寸法の孔がハチの巣状になった均一に
粉砕され殆どの純シリカ粒子をふるいわけした粒子から
なる。特に熱処理してシリケートからホウ酸塩を分離し
たボロシリケート材料から製造される。孔は酸性エッチ
ング工程によってホウ酸塩を除去して形成され、それら
の寸法は加熱工程の性質に依存する。さらに好ましく
は、ＣＰＧは 500Åの孔を有する直径が 150μm の粒子
の形である、例えば Users Manual Model 392 および39
4 Polynucleotide Synthesizers, 6-5から6-9頁、Appli
ed Biosystems, Ver.2.00, Doc. Rev. A, Part No. 902
351(1992), Applied Biosystems Division of The Perk
in-Elmer Corporation, フォスター市、CA (ABD)。

【００３４】本発明のＬ₄−ＮＨ部分のようなアミノ末
端リンカーでＣＰＧ支持体を誘導化することは、ポリヌ
クレオチド合成の分野では既知である、例えば、Gait,
Editor, Oligonucleotide Synthesis, 45-49頁 (IRL Pr
ess, 1984)、そして実際に、約100mmol/g の一次アミノ
装填量のアルキルアミンで誘導化したＣＰＧビーズは市
販品として入手できる（Pierce Chemical Company, Roc
kford, IL)。簡単には、アルキルアミノ基体の場合に
は、ＣＰＧはアミノアルキルトリメトキシシラン試薬と
ＣＰＧ粒子の懸濁液を反応させて、濾過し、乾燥させて
誘導化される。

【００３５】第二の好ましい固体支持体は非膨潤性有孔
ポリスチレン、例えばここにその全体が参考文献として
組み込まれる米国特許第5,047,524号がある。ここで使
用される「非膨潤性」は有孔ポリスチレン物質が実質的
に機械的に堅く、特に、ポリヌクレオチド合成試薬に曝
すとき、認められるほどは容量が増加しないことを意味
する。ここで使用される「有孔」は 100と4000Åの間の
範囲の実質的に均一の直径を有する孔を含む。

【００３６】ポリスチレン支持体は標準法によってアミ
ノ誘導化される、例えば、Wallaceら、 638-639頁、Sco
uten ed., Solid Phase Biochemistry (John Wiley & S
ons, 1980) ；Wright et al. Tet. Lett., 34: 3373-33
76 (1993)；ここに参考文献として組み込まれる、Bayer
et al, 米国特許第4,908,405号：Applied Biosystems
Research News, Model 390Z, 1994年２月。簡単に述べ
ると、好適な方法では、ヒドロキシメチルフタルイミド
は触媒量のメチルスルホン酸を用いてポリスチレン支持
体と反応させてフタルイミドメチルポリスチレンを形成
する。次にこの物質はヒドラジンで処理してフタルイミ
ド保護基を除き、アミノメチル化ポリスチレンを与え
る。一般に、アミノ装填量は、非膨潤性有孔ポリスチレ
ン１グラム当たり、アミノ官能基10ないし60μモルに変
化する。装填水準は試薬濃度と反応時間を調整すること
によって制御することができる。

【００３７】最近開発された代替のポリスチレン誘導化
学は、ポリヌクレオチドと結合するために入手できる遊
離水酸基をもつ幾つかのポリオキシエチレン残基または
鎖を結合して、末端アミノ基を遊離水酸基と置換してい
る、例えば、Bayer and Rapp, 米国特許第4,908,405
号；Gao et al.,Tetrahedron Lett., 32(40): 5477-548
0(1991) 。

【００３８】第三の好適例では、Ｗは非ポリスチレン有
機ポリマー支持体である。ポリマー支持体は合成により
改質される天然産材料、および／または合成材料から誘
導することができる。特に関係するものは多糖類、特に
架橋多糖類、例えば Sepharose（登録商標）として入手
できるアガロース、Sephadex（登録商標）として入手で
きるデキストラン、セルロース、澱粉等である。他の適
当な材料はポリアクリルアミド、ポリビニルアルコー
ル、シリコーン、Teflon（登録商標）等がある。Ｔは一
般に酸開裂性水酸基保護基を示す。好ましくは、Ｔはト
リフェニルメチル基およびその電子供与置換誘導体であ
り、ここでは、語「電子供与」は、一部である、即ち、
隣接原子に関して電子陽性である分子中の隣接原子に価
電子を放出する置換体の傾向を示す。好ましくは、電子
供与置換体はアミノ、１ないし８個の炭素原子を有する
低級アルキル、１ないし８個の炭素原子を有する低級ア
リール、１ないし８個の炭素原子を有する低級アルコキ
シ等を含む。さらに好ましくは、電子供与置換体はメト
キシである。例示的なトリチルは4,4'−ジメトキシトリ
チル（即ち、ビス（ｐ−アニシル）フェニルメチル）、
モノメトキシトリチル、α−ナフチルジフェニルメチ
ル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル等を含む。こ
れらおよび他のトリチルの結合と開裂の条件は Greene
and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis,
2nd Edition (John Wiley, New York, 1991)に見出すこ
とができる。

【００３９】リンカーＬ₁、Ｌ₂、Ｌ₃およびＬ₄は本発明
の化合物の種々の要素を結合するために役立つ結合部分
である。特に、Ｌ₁は合成ポリヌクレオチドの3'−末端
窒素をポリヌクレオチド自身に結合する働きをして、Ｌ
₂およびＬ₃は炭素と酸素を結合する働きをして、Ｌ₄は
固体支持体を窒素に結合する働きをする。リンカー
Ｌ₁、Ｌ₂、Ｌ₃およびＬ₄の追加の目的は、(i) 標識が相
補的標的へのポリヌクレオチドのハイブリッド形成を妨
げる範囲を減じ、(ii) 標識および／または固体支持体
がポリヌクレオチドの合成を妨げる範囲を減じ、そして
(iii) ポリヌクレオチド合成中に標識の結合性を保護す
るために、標識、固体支持体、およびオリゴヌクレオチ
ドの間に適当な空間を与えることである。好ましくは、
リンカーＬ₁、Ｌ₂、Ｌ₃およびＬ₄はそれぞれ、低級アル
キル、低級アルキレンオキシド、アミド、カルバメー
ト、スルホンアミド、尿素、琥珀酸または他のジカルボ
ン酸誘導体、またはそれらの任意の組合せであり、ここ
に使用されるアルキルアミドは次の部分構造を示す。

【００４０】

【化１７】

【００４１】（式中のｎは０ないし20のいずれかであ
る）。ジカルボン酸誘導体は次の部分構造を示す。

【００４２】

【化１８】

【００４３】（式中のｎは２ないし20のいずれかであ
る）。特に好適例では、ｎ＝２、即ち、リンカーは琥珀
酸である。ここで使用される語「低級アルキル」は直
鎖、分枝鎖、および１ないし10個の炭素原子を含む環状
アルキル基を示し、語「低級アルキレンオキシド」は２
ないし20個の炭素原子を含む直鎖、分枝鎖、および環状
アルキレンオキシド基、例えばポリエチレンオキシドを
示す。特に好適例では、Ｌ₁はｎ−ブチルまたはｎ−ヘ
キシルアミドであり；Ｌ₂およびＬ₃はそれぞれメチレン
であり；そしてＷがポリスチレンのとき、Ｌ₄はメチレ
ンであり、ＷがＣＰＧのとき、Ｌ₄はアミノプロピルス
クシニルヘキシルアミンである。

【００４４】上記の好ましい結合部分に加えて、特に好
適例において、リンカーＬ₃は開裂するとき、一旦支持
体から開裂されるとオリゴヌクレオチドを標識するため
の追加部位を与える内部開裂部位をもつ部分である。こ
の目的に有用な例示部分はジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）で開裂するとき−ＳＨ部分を形成するジスルフィド
結合を含む部分である。特に好ましいＬ₃部分は次の構
造を有する。

【００４５】−ＣＨ₂−Ｓ−Ｓ−ＣＨ₂− 置換体Ｒ₃−Ｒ₇は炭素置換体である。好ましくはＲ₃−
Ｒ₇は別々に低級アルキルまたは水素である。さらに好
ましくは、Ｒ₃−Ｒ₇は水素である。Ｒ₁およびＲ₂は所望
の最終生成物の性質によって大いに変わることができる
窒素置換体である。Ｒ₁およびＲ₂は本発明の中心的な特
徴ではなく、一般的な官能基を与えるので、Ｒ₁は広範
囲の形態を有することができる。Ｒ₁およびＲ₂は、合成
および次のオリゴヌクレオチド開裂の間に、結合した窒
素原子が化学的に安定であるように選択する。さらに、
Ｒ₁およびＲ₂はそれ自体標準のポリヌクレオチド合成試
薬に安定である。

【００４６】反応性アミノ基かポリヌクレオチド開裂に
つづいて望ましいならば、Ｒ₁およびＲ₂は実質的に窒素
の反応性を妨げない。この場合に、Ｒ₁およびＲ₂は好ま
しくは低級アルキル、水素、または窒素保護基、例え
ば、ＦＭＯＣ、ｔＢＯＣ、または他の類似の窒素保護基
である。最も好ましくは、Ｒ₁およびＲ₂の一つは水素で
ある。Ｒ₁またはＲ₂のいずれかまたは両方が、直接標識
法の一部としてポリヌクレオチド合成前に導入される標
識である場合に、標識がＤＮＡ合成試薬および穏和な開
裂試薬の存在で安定である必要がある。このような標識
は発螢光団、酵素、ビオチン、挿入剤、架橋剤、核酸開
裂試薬、細胞取込みの改質剤等を含む。好ましくは、標
識はローダミン染料、例えば、テトラメチルローダミン
である。

【００４７】ポリヌクレオチドを形成するために使用さ
れる化学の詳細な説明は他の場合にも提供されている、
例えば、Caruthers et al., 米国特許第4,458,066号；C
aruthers et al., 米国特許第4,415,732号；Caruthers
et al., Genetic Engineering, 4:1-17 (1982)；Users
Manual Model 392および394 Polynucleotide Synthesiz
ers, 6-1から6-22頁、Applied Biosystems, Part No. 9
01237 (1991)。従って、これらの各文献はここに全体を
参考文献として組み込まれる。

【００４８】ポリヌクレオチド合成のホスホルアミダイ
ト法は、その有効で迅速なカップリングおよび出発物質
の安定性のため好ましい方法である。合成は固体支持体
に結合した成長するポリヌクレオチド鎖を用いて行わ
れ、過剰の試薬は液相状態で、容易に濾過によって除去
することができ、これによりサイクル間の精製工程の必
要がない。

【００４９】次に、ホスホルアミダイト法を使用する代
表的なポリヌクレオチド合成サイクルの工程を簡単に記
載する。まず、固体支持体を酸、例えば、トリクロロ酢
酸で処理し、水酸基保護基Ｔを除去し、水酸基を次のカ
ップリング反応のためにフリーにする。次に同時に保護
ホスホルアミダイトヌクレオシドモノマーおよび弱酸、
例えば、テトラゾール等を反応物に添加して、活性化し
た中間体を生成する。弱酸は反応性の中間体を形成する
ホスホルアミダイトの窒素をプロトン化する。ヌクレオ
シドの添加は30秒以内で終了する。次に、キャッピング
工程を行い、ヌクレオシドの付加を受けなかった任意の
ポリヌクレオチド鎖を終端する。キャッピングは好まし
くは無水酢酸および１−メチルイミダゾールを用いて行
われる。次に、好ましい酸化剤としてヨウ素、酸素ドナ
ーとして水を使用して酸化によりインターヌクレオチド
結合をホスファイトからさらに安定なホスホトリエステ
ルに変換する。酸化後、水酸基保護基をプロトン性酸、
例えば、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸を用いて除
去し、サイクルを鎖伸長が終了するまで繰り返す。合成
後、ポリヌクレオチド鎖を塩基、例えば、水酸化アンモ
ニウムまたはｔ−ブチルアミンを使用して支持体から開
裂する。開裂反応はまた任意のホスフェート保護基、例
えば、シアノエチルを除去する。最後に、塩基の環外ア
ミンの保護基を高温、例えば55℃にて塩基中のポリヌク
レオチド溶液を処理して除去する。

【００５０】

【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明する
が、本発明はこれにより制限されるものではない。実施例１構造式１４ａのＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体の合成
（図１参照）化合物９の合成：セリノール（773mg, 8.50mmol)、１−
ヒドロキシベンゾトリアゾール（574mg, 4.25mmol)、
（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,
3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェー
ト（1.61g, 4.25mmol)、およびジイソプロピルエチルア
ミン（1.68g, 13mmol)を６−Ｎ−Fmoc−εーアミノカプ
ロン酸のＤＭＦ（20ml) 攪拌溶液に添加した。反応混合
物を２時間アルゴン雰囲気下に室温で攪拌した。DMFを
減圧下に蒸発させて除去した。残渣をCHCl₃(100ml) に
溶解し、５％HCl水溶液 (1 ×50ml)、H₂O (1×50ml) お
よび飽和塩水 (１×50ml) で洗浄した。有機層を乾燥
（MgSO₄)し、蒸発させて得られたオイルをEtOH (10ml)
に溶解し、冷却した。化合物９は無色の細かい針状に結
晶した（1.2g, 66％) 。

【００５１】¹H NMR (CDCl₃) d: 1.35 (m, 2H), 1.45
(m, 2H), 1.66 (m, 2H), 2.23 (t,J=7.2Hz, 2H), 3.18
(m, 2H), 3.74 (dd, J=11.1, 4.2Hz, 2H), 3.82 (dd, J
=11.1, 3.9Hz, 2H), 3.95 (m, 1H), 4.20 (t, J=6.6Hz,
1H), 4.39 (d, J=6.6Hz, 2H), 5.00 (bs, 1H), 6.40
(d, J=7.4Hz, 1H), 7.28-7.43 (m, 4H), 7.58 (d, J=7.
2Hz, 2H), 7.76 (d, J=7.2Hz, 2H).

【００５２】化合物１０の合成：ジメトキシトリチルク
ロライド（1.16g, 3.43mmol)の乾燥ピリジン（20ml) 溶
液を、化合物９（1.33g, 3.12mmol)のピリジン（20ml)
攪拌溶液に室温で窒素雰囲気下に一滴ずつ添加した。添
加は30分で完了した。フラスコに栓をして、室温で48時
間攪拌した。ＴＬＣは出発物質と生成物１０の存在を示
した。ピリジンを減圧下に蒸発させ残渣をCHCl₃(50ml)
に溶解し、H₂O (1×30ml) および飽和塩水 (１×30ml)
で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO₄)し、蒸発させて黄色
様オイルを得た。生成物をCHCl₃中１％MeOHで溶出する
シリカゲルカラムクロマトグラフィで単離した。適当な
画分を合わせて蒸発させ無色の泡を得た（1.31g, 57
％）。

【００５３】¹H NMR (CDCl₃) d: 1.26 (m, 2H), 1.45
(m, 2H), 1.62 (m, 2H), 2.16 (t,J=7.2Hz, 2H), 2.85
(bs, 1H), 3.16 (m, 2H), 3.28 (dd, J=9.9, 4.8Hz, 1
H),3.33 (dd, J=9.9, 4.5Hz, 1H), 3.68 (m, 1H), 3.74
(s, 6H), 3.81 (m, 1H), 4.09 (m, 1H), 4.19 (t, J=
6.6Hz, 1H), 4.39 (d, J=6.6Hz, 2H), 4.91 (bs, 1H),
5.95 (d, J=7.8Hz, 1H), 6.82 (d, J=8.7Hz, 4H), 7.20
-7.42 (m, 13H), 7.58(d, J=7.2Hz, 2H), 7.75 (d, J=
7.2Hz, 2H).

【００５４】化合物１１の合成：無水琥珀酸（82mg, 0.
82mmol) 、Et₃N (69mg, 0.68mmol)および４−ジメチル
アミノピリジン（42mg, 0.34mmol) を化合物１０（500m
g, 0.68mmol)のCH₂Cl₂（15ml) 溶液に添加した。反応混
合物を室温で３時間攪拌した。反応混合物をCH₂Cl₂（30
ml) で希釈し、５％クエン酸（１×30ml) 水溶液および
飽和塩水（２×30ml) で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO
₄)し、蒸発させて泡が得られた。生成物をCHCl₃-MeOHグ
ラジエント（0-5％MeOH) で溶出するシリカゲルカラム
クロマトグラフィで精製した。適当な画分を合わせて蒸
発させ無色の泡の化合物１１が得られた（439mg, 78
％）。

【００５５】¹H NMR (CDCl₃) d: 1.25 (m, 2H), 1.45
(m, 2H), 1.60 (m, 2H), 2.18 (t,J=7.5Hz, 2H), 2.52
(s, 4H), 3.13 (m, 3H), 3.25 (dd, J=8.7, 4.0Hz, 1
H), 3.78 (s, 6H), 4.22 (m, 2H), 4.41 (m, 4H), 5.00
(unresolved t, 1H), 6.10 (d, J=7.2Hz, 1H), 6.80
(d, J=8.5Hz, 4H), 7.19-7.41 (m, 13H), 7.56 (d, J=
7.5Hz, 2H), 7.75 (d, J=7.2Hz, 2H).

【００５６】ＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体１４ａの
合成：CPG (500Å, 40μmol/g アミン装填、1g、40μmo
l, (ABD)) 、化合物１１（67mg, 80μmol)、１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール（11mg, 80μmol)、（２−（１
Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テトラ
メチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（30mg,
80μmol)、ジイソプロピルエチルアミン（16mg, 120μm
ol)の DMF（8ml) 溶液の混合物を手首で動かすシェーカ
ーで４時間室温で攪拌した。支持体を DMF (３×10ml)
、CH₃CN (2×10ml) およびCH₂Cl₂（１×10ml) で洗浄
し、高真空下に終夜乾燥した。ニンヒドリンアッセイは
支持体に６μmol/g のアミンの残留を示した。支持体を
無水酢酸／ルチジンの THF（10％溶液、５ml) 溶液およ
び１−メチルイミダゾールの THF（16％溶液、５ml) 溶
液で２時間室温にてキャッピングした。

【００５７】支持体１２ａをCH₃CN (3×10ml) およびCH
₂Cl₂（１×10ml) で洗浄し、次に DMF中20％ピペリジン
（３×10ml、10分各洗浄) で処理し、Fmoc保護基を除去
し支持体１３ａを与えた。Fmoc基の除去は302nmで溶液
のＵＶ吸収を測定してモニターした。支持体１３ａを D
MF (３×10ml) 、CH₃CN (2×10ml) およびCH₂Cl₂（１×
10ml) で洗浄し、真空下に終夜乾燥した。次に支持体
（500mg, 16μmol) をシェカーで42時間TAMRA-NHS エス
テル (ABD, p/n 400981) (26mg, 49μmol) およびEt₃N
(10.1mg, 100 μmol)の DMF (5ml)溶液で処理し、染料
標識支持体１４ａを得た。支持体を DMF (３×10ml) 、
CH₃CN (2×10ml) およびCH₂Cl₂（１×10ml) で洗浄し、
高真空下に24時間乾燥した。ニンヒドリンアッセイは１
μmol/g のアミンの残留を示した。次に支持体を無水酢
酸／ルチジン混合物の THF（10％溶液、５ml) 溶液およ
び１−メチルイミダゾールの THF（16％溶液、５ml) 溶
液で１時間キャッピングし、CH₃CN (3×10ml) およびCH
₂Cl₂（２×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥し
た。トリチルカチオンアッセイは30.3μmol/g の最終装
填量を示した。

【００５８】実施例２構造式１４ｂのＴＡＭＲＡ染料標識ポリスチレン支持体
の合成（図１参照）高架橋ポリスチレン（1000Å, 10μmol/g アミン装填、
2g, 20μmol, (ABD))を実施例１からの化合物１１（34m
g, 40μmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（5.5
mg, 40μmol)、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１
−イル）−1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフル
オロホスフェート（15mg, 40μmol)、およびジイソプロ
ピルエチルアミン（８mg, 60μmol)の DMF（10ml) 溶液
を手首で動かすシェーカーで４時間室温で反応させた。
支持体を DMF (３×10ml) 、CH₃CN (2×10ml) およびCH
₂Cl₂（１×10ml) で洗浄し、高真空下に終夜乾燥した。
ニンヒドリンアッセイは支持体に 0.6μmol/g のアミン
の残留を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンの THF
（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾール
の THF（16％溶液、５ml) 溶液で２時間室温にてキャッ
ピングした。支持体１２ｂをCH₃CN (3×10ml) およびCH
₂Cl₂（１×10ml) で洗浄した。トリチルカチオンアッセ
イはポリスチレン支持体に化合物１１が９μmol/g 装填
されていることを示した。次に支持体１２ｂを20％ピペ
リジンの DMF (３×10ml, 10分各洗浄) で処理してFmoc
保護基を除き支持体１３ｂが得られた。Fmoc基の除去は
302nm で溶液のＵＶ吸収を測定してモニターした。支持
体１３ｂを DMF (３×10ml) 、CH₃CN (2×10ml) および
CH₂Cl₂（１×10ml) で洗浄し、真空下に終夜乾燥した。
次に支持体（1g, 9μmol)をシェーカーで36時間 TAMRA-
NHSエステル (15mg, 28.5μmol) およびEt₃N (8.6mg, 8
5μmol) の DMF (10ml) 溶液で室温処理し、支持体１４
ｂが得られた。支持体を DMF (３×10ml) 、CH₃CN (2×
10ml) およびCH₂Cl₂（１×10ml) で洗浄し、高真空下に
24時間乾燥した。ニンヒドリンアッセイは0.5μmol/g
以下のアミンの残留を示した。次に支持体を無水酢酸／
ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、５ml) 溶液および１−メ
チルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、５ml) 溶液で１
時間キャッピングし、CH₃CN (3×10ml) およびCH₂Cl
₂（２×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。
トリチルカチオンアッセイは 8.8μmol/g の最終装填量
を示した。

【００５９】実施例３構造式１８ａのＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体の合成
（図２参照）１−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−（Ｎ−Fmoc−４−ア
ミノブチル）−1, 3−プロパンジオール化合物４の合
成：ネルソンらの Nucleic Acids Research 20:6253-62
59 (1992) に記載されている方法によって合成した。ジ
メトキシトリチルクロライド（3.66g, 10.82mmol) の乾
燥ピリジン (60ml) 溶液を窒素雰囲気下、室温にて２−
（Ｎ−Fmoc−４−アミノブチル）−1, 3−プロパンジオ
ール（4.0g, 10.82mmol)のピリジン（50ml) 攪拌溶液に
一滴ずつ添加した。添加を２時間で完了した。フラスコ
に栓をして、室温で48時間攪拌した。ＴＬＣは出発物質
と生成物４の存在を示した。ピリジンを減圧下に蒸発さ
せ残渣をCHCl₃(100ml) に溶解し、H₂O (1×100ml) お
よび飽和塩水 (１×100ml) で洗浄した。有機層を乾燥
（MgSO₄)し、蒸発させて黄色様オイルが得られた。生成
物をCHCl₃中１％MeOHで溶出するシリカゲルカラムクロ
マトグラフィで単離した。適当な画分を合わせて蒸発さ
せ無色の泡を得た（3.4g, 46％）。

【００６０】¹H NMR (CDCl₃) d: 1.15-1.45 (m, 6H),
1.88 (m, 1H), 2.44 (t, J=5.7Hz,1H), 3.07 (dd, J=9.
3, 7.5Hz, 1H), 3.12 (m, 2H), 3.29 (dd, J=9.3, 4.2H
z,1H), 3.64 (m, 2H), 3.78 (s, 6H), 4.20 (t, J=6.8H
z, 1H), 4.39 (d, J=6.8Hz, 2H), 4.72 (unresolved t,
1H), 6.82 (d, J=9.0Hz, 4H), 7.25-7.43 (m, 13H),
7.58 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.75 (d, J=7.2Hz, 2H).

【００６１】ジグリコレート１５の合成：無水ジグリコ
ール酸（81mg, 0.94mmol) のCH₂Cl₂（５ml) 溶液をEt₃N
(90mg, 0.89mmol)、４−ジメチルアミノピリジン（45m
g, 0.37mmol) 、および化合物４（500mg, 0.74mmol) の
CH₂Cl₂ (15ml) 溶液の混合物に０℃（氷浴）でアルゴン
雰囲気下に一滴ずつ添加した。添加を完了（10分) 後、
氷浴を除去し、反応混合物を室温で１時間攪拌した。反
応混合物をCHCl₃(30ml)で希釈し、５％クエン酸水（１
×50ml) および飽和塩水 (２×50ml) で洗浄した。有機
層を乾燥（MgSO₄)し、蒸発させて泡が得られた。生成物
をCHCl₃-EtOHグラジエント（2-10％EtOH) で溶出するシ
リカゲルカラムクロマトグラフィで精製した。適当な画
分を合わせて蒸発させ無色の泡の化合物１５を得た（35
4mg, 60％）。

【００６２】¹H NMR (CDCl₃) d: 1.00-1.25 (m, 6H),
1.75 (m, 1H), 2.88 (m, 4H), 3.70(s, 6H), 3.96 (s,
2H), 4.04 (s, 2H), 4.13 (m, 3H), 4.31 (d, J=6.9H
z), 5.18 (bs, 1H), 6.74 (d, J=8.7Hz, 4H), 7.18-7.3
4 (m, 13H), 7.53 (d, J=7.5Hz, 2H), 7.67 (d, J=7.5H
z, 2H).

【００６３】ＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体１８ａの
合成：ＣＰＧ（500Å, 40μmol/gアミン装填、2g, 80μ
mol)、化合物１５（126mg, 160μmol)、１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール（22mg, 160μmol)、（２−（１Ｈ
−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テトラメ
チルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（61mg, 16
0μmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（35mg, 2
70μmol)のＤＭＦ（10ml) 溶液の混合物を手首で動かす
シェーカーで４時間室温で攪拌した。支持体を DMF (３
×10ml) 、CH₃CN (2×10ml) およびCH₂Cl₂（１×10ml)
で洗浄し、高真空下に終夜乾燥した。ニンヒドリンアッ
セイは支持体に３μmol/g のアミンの残留を示した。ト
リチルカチオンアッセイはＣＰＧ支持体上に37.5μmol/
g の装填量の化合物１５を示した。支持体を無水酢酸／
ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、５ml) 溶液および１−メ
チルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、５ml) 溶液で２
時間室温にてキャッピングした。

【００６４】支持体１６ａをCH₃CN (3×10ml) およびCH
₂Cl₂（１×10ml) で洗浄し、次に20％のピペリジンの D
MF (３×10ml, 10分各洗浄) 溶液で処理し、Fmoc保護基
を除去し遊離アミノ基を含む支持体１７ａを与えた。Fm
oc基の除去は302nmで溶液のＵＶ吸収を測定してモニタ
ーした。支持体１７ａを DMF (３×10ml) 、CH₃CN (2×
10ml) およびCH₂Cl₂（１×10ml) で洗浄し、真空下に終
夜乾燥した。次に支持体１７ａ（500mg, 19μmol) をシ
ェカーで42時間 TAMRA-NHSエステル (30mg, 57μmol)お
よびEt₃N (13.1mg, 130μmol)の DMF (５ml) 溶液で処
理し、染料標識支持体１８ａが得られた。支持体を DMF
(３×10ml) 、CH₃CN (2×10ml) およびCH₂Cl₂（１×10
ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。ニンヒドリ
ンアッセイは支持体に１μmol/g のアミンの存在を示し
た。支持体を次に無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶
液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ
（16％溶液、５ml) 溶液で１時間キャッピングし、CH₃C
N (3×10ml) 、CH₂Cl₂（２×10ml) で洗浄し、高真空下
に24時間乾燥した。トリチルカチオンアッセイは36μmo
l/g の最終装填量を示した。

【００６５】実施例４構造式１８ｂのＴＡＭＲＡ染料標識ポリスチレン支持体
の合成（図２参照）高架橋ポリスチレン（1000Å, 10μmol/g アミン装填、
2g, 20μmol)を化合物１５（32mg, 40μmol)、１−ヒド
ロキシベンゾトリアゾール（5.5mg, 40μmol)、（２−
（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テ
トラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（15
mg, 40μmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（8m
g, 60μmol)のＤＭＦ（10ml) 溶液を手首で動かすシェ
ーカーで４時間室温で処理した。支持体を DMF (３×10
ml) 、CH₃CN (2×10ml) およびCH₂Cl₂（１×10ml) で洗
浄し、高真空下に終夜乾燥した。ニンヒドリンアッセイ
は支持体に0.5μmol/g のアミンの存在を示した。支持
体を無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、５ml) 溶
液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、
５ml) 溶液で２時間室温にてキャッピングした。

【００６６】支持体１６ｂをCH₃CN (3×10ml) およびCH
₂Cl₂（１×10ml) で洗浄した。トリチルカチオンアッセ
イはポリスチレン支持体上に９μmol/g の装填量の化合
物１５を与えた。支持体１６ｂを20％のピペリジンの D
MF (３×10ml, 10分各洗浄)溶液で処理し、Fmoc保護基
を除去し支持体１７ｂを与えた。支持体１７ｂを DMF
(３×10ml) 、CH₃CN (2×10ml) およびCH₂Cl₂（１×10m
l) で洗浄し、真空下に終夜乾燥した。次に支持体１７
ｂ（1g, 9μmol) をシェーカーで36時間室温にてTAMRA-
NHSエステル (15mg, 28.5μmol)およびEt₃N (8.6mg, 85
μmol)の DMF (10ml) 溶液で処理し、支持体１８ｂを得
た。支持体を DMF (３×10ml) 、CH₃CN (2×10ml) およ
びCH₂Cl₂（１×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥
した。ニンヒドリンアッセイは0.5μmol/g 以下のアミ
ンの残留を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンのＴＨ
Ｆ（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾー
ルのＴＨＦ（16％溶液、５ml) 溶液で１時間キャッピン
グし、CH₃CN (3×10ml) 、CH₂Cl₂（２×10ml) で洗浄
し、高真空下に24時間乾燥した。トリチルカチオンアッ
セイは8.7μmol/g の最終装填量を示した。

【００６７】実施例５構造式２２ａのＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体の合成
（図３参照）ジグリコレート１９の合成：無水ジグリコール酸（64m
g, 0.55mmol) のCH₂Cl₂（５ml) 溶液をEt₃N (67mg, 0.6
6mmol) 、４−ジメチルアミノピリジン（34mg,0.28mmo
l) および化合物１０（400mg, 0.55mmol)のCH₂Cl₂ (15m
l) 溶液の混合物にアルゴン雰囲気下０℃で添加した。
添加を完了（10分) 後、氷浴を除去し、反応混合物を室
温で１時間攪拌した。反応混合物をCH₂Cl₂ (30ml) で希
釈し、５％クエン酸水溶液（１×50ml) および飽和塩水
(２×50ml) で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO₄)し、蒸
発させて泡が得られた。生成物をCHCl₃-EtOHグラジエン
ト（2-10％EtOH) で溶出するシリカゲルカラムクロマト
グラフィで精製した。適当な画分を合わせて蒸発させ無
色の泡の化合物１９を得た（260mg, 56％）。

【００６８】¹H NMR (CDCl₃) d: 1.20 (m, 2H), 1.39
(m, 2H), 1.58 (m, 2H), 2.18 (t,J=7.5Hz, 2H), 2.90-
3.25 (m, 4H), 3.80 (s, 6H), 3.86 (s, 4H), 4.00-4.4
0 (m, 6H), 4.85 (unresolved t, 1H), 5.92 (d, J=7.2
Hz, 1H), 6.75 (d, J=8.1Hz, 4H), 7.20-7.40 (m, 13
H), 7.52 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.69 (d, J=7.2Hz, 2H).

【００６９】ＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体２２ａの
合成：ＣＰＧ（500Å, 33μmol/gアミン装填、1g, 33μ
mol)、化合物１９（56mg, 66μmol)、１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール（9mg, 66μmol)、（２−（１Ｈ−ベ
ンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テトラメチル
ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（25mg, 66μmo
l)、およびジイソプロピルエチルアミン（13mg, 100μm
ol)のＤＭＦ（6ml)溶液の混合物を手首で動かすシェー
カーで４時間室温で攪拌した。支持体を DMF(３×８ml)
、CH₃CN (2×８ml) およびCH₂Cl₂（１×８ml) で洗浄
し、高真空下に終夜乾燥した。ニンヒドリンアッセイは
支持体に３μmol/g のアミンの残留を示した。トリチル
カチオンアッセイはＣＰＧ支持体に29μmol/g の装填量
の化合物１９を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンの
THF（10％溶液、３ml) 溶液および１−メチルイミダゾ
ールのＴＨＦ（16％溶液、３ml) 溶液で２時間室温にて
キャッピングした。

【００７０】支持体２０ａをCH₃CN (3×８ml) およびCH
₂Cl₂（１×８ml) で洗浄し、20％のピペリジンの DMF
(3 ×５ml, 10分各洗浄) 溶液で処理し、Fmoc保護基を
除去し遊離アミノ基を含む支持体２１ａを得た。支持体
２１ａを DMF (３×８ml) 、CH₃CN (2×８ml) およびCH
₂Cl₂（１×８ml) で洗浄し、真空下に終夜乾燥した。次
に支持体２１ａ（500mg, 15μmol)をシェーカーで42時
間TAMRA-NHS エステル (24mg, 45μmol)およびEt₃N (11
mg, 110μmol)の DMF (５ml) 溶液で処理し、染料標識
支持体２２ａを得た。支持体２２ａを DMF (３×８ml)
、CH₃CN (2×８ml)およびCH₂Cl₂（１×８ml) で洗浄
し、高真空下に24時間乾燥した。ニンヒドリンアッセイ
は支持体に1.2μmol/g のアミンの残留を示した。支持
体を無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、３ml) 溶
液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、
３ml) 溶液で１時間キャッピングし、CH₃CN (3×８ml)
、CH₂Cl₂（２×８ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾
燥した。トリチルカチオンアッセイは28μmol/g の最終
装填量を示した。

【００７１】実施例６構造式２２ｂのＴＡＭＲＡ染料標識ポリスチレン支持体
の合成（図３参照）高架橋ポリスチレン（1000Å, 10μmol/g アミン装填、
1g, 10μmol)を化合物１９（17mg, 20μmol)、１−ヒド
ロキシベンゾトリアゾール（3mg, 20μmol)、（２−
（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テ
トラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（８
mg, 20μmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（8m
g, 60μmol)のＤＭＦ（10ml) 溶液を手首で動かすシェ
ーカーで４時間室温で処理し２０ｂを得た。支持体を D
MF (３×10ml) 、CH₃CN (2×10ml)およびCH₂Cl₂（１×1
0ml) で洗浄し、高真空下に終夜乾燥した。ニンヒドリ
ンアッセイは支持体に0.5μmol/g のアミンの残留を示
した。支持体を無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶
液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ
（16％溶液、５ml) 溶液で２時間室温にてキャッピング
した。

【００７２】支持体２０ｂをCH₃CN (3×10ml) およびCH
₂Cl₂（１×10ml) で洗浄した。トリチルカチオンアッセ
イはポリスチレン支持体に9.2μmol/g の装填量の化合
物１９を与えた。支持体２０ｂを20％のピペリジンの D
MF (3 ×10ml, 10分各洗浄)溶液で処理し、Fmoc保護基
を除去し支持体２１ｂを得た。支持体２１ｂを DMF (３
×10ml) 、CH₃CN (2×10ml) およびCH₂Cl₂（１×10ml)
で洗浄し、真空下に終夜乾燥した。支持体２１ｂ（1g,
9.2μmol) をシェーカーで36時間 TAMRA-NHSエステル
(15mg, 28.5μmol) およびEt₃N (8.6mg, 85μmol) の D
MF (10ml) 溶液で処理し、支持体２２ｂを得た。支持体
を DMF (３×10ml) 、CH₃CN (2×10ml)およびCH₂Cl
₂（１×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。
ニンヒドリンアッセイは支持体に0.5μmol/g 以下のア
ミンの残留を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンの T
HF（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾー
ルの THF（16％溶液、５ml) 溶液で１時間キャッピング
し、CH₃CN (3×10ml) 、CH₂Cl₂（２×10ml) で洗浄し、
高真空下に24時間乾燥した。トリチルカチオンアッセイ
は8.8μmol/g の最終装填量を示した。

【００７３】実施例７本発明の支持体を使用する二重染料標識オリゴヌクレオ
チドの合成二重染料標識オリゴヌクレオチドを、TAMRA 標識支持体
１４ａ、１４ｂ、１８ａ、１８ｂおよび２２ａ、ＤＮＡ
ファーストホスホルアミダイトおよび螢光染料アミダイ
ト FAM-, TET-, HEX- を40-1000nmol のスケールで使用
して合成した。ここで「FAM」は6-カルボキシフルオレ
セイン、「TET」は6-カルボキシ-4,7,2',7'-テトラクロ
ロフルオレセイン、および「HEX」は6-カルボキシ-4,7,
2',4',5',7'-ヘキサクロロフルオレセインを示す。自動
化オリゴヌクレオチド合成は操作者マニュアルに記載さ
れた一般法に従ってアプライドバイオシステムズのモデ
ル394 DNA/RNA合成器（ＡＢＤ）で行った。

【００７４】オリゴヌクレオチド配列 5'＞FAM-TCA CA
G TCT GAT CTC GAT-TAMRA＜3'は0.2μmol スケールで T
AMRA標識支持体１８ａおよび２２ａ、ＤＮＡファースト
ホスホルアミダイト（ユーザーブレタン番号85, 1994,
Applied Biosystems Division) およびＦＡＭアミダイ
ト（ユーザーブレタン番号78, 1994, Applied Biosyste
ms Division) を使用して合成された。標準0.2μmol 合
成サイクルは追加の120 s（ユーザーブレタン番号78, 1
994, Applied Biosystems Division) によってFAM-アミ
ダイトのカップリング時間を延長して僅かに改良した。
合成完了後、オリゴヌクレオチドは、MeOH:t-BuNH₂:H₂O
(1:1:2) の混合物で支持体を処理して支持体から自動開
裂させた、例えば、その全体をここに参考文献として組
み込む米国特許第5,231,191号は、アプライドバイオシ
ステムズのモデル 394 DNA/RNA合成器のための操作マニ
ュアルに記載されるような１時間自動開裂法（「END CE
法」) を使用している。塩基保護基は85℃で１時間また
は65℃で３時間混合物を加熱して除去した。99％以上の
オリゴヌクレオチドを各支持体から開裂した。

【００７５】上記の同じオリゴヌクレオチド配列はまた
TAMRA 標識支持体１８ｂ、ＤＮＡファーストホスホルア
ミダイト（ユーザーブレタン番号85, 1994, Applied Bi
osystems Division) およびＦＡＭアミダイト（ユーザ
ーブレタン番号78, 1994, Applied Biosystems Divisio
n) を使用して40ナノモルのスケールで 394 DNA/RNA合
成器で合成した。同様に標準40ナノモル合成サイクルを
さらに 120秒ＦＡＭのカップリング時間を延長して僅か
に改変した（ユーザーブレタン番号78, 1994, Applied
Biosystems Division)。99％以上のオリゴヌクレオチド
を各支持体から開裂した。

【００７６】TAMRA 標識支持体１４ａおよび１４ｂはま
た上記のように0.2μmol スケールで上記オリゴヌクレ
オチドを合成するために使用した。オリゴヌクレオチド
はMeOH:t-BuNH₂:H₂O(1:1:2) を使用して 394 DNA/RNAの
ための操作者マニュアルに記載されている２時間自動開
裂プロトコル（END RNA) によって支持体から開裂し
た。92％以上のオリゴヌクレオチドを支持体から２時間
で開裂した。しかしながらオリゴヌクレオチドは１mlの
MeOH:t-BuNH₂:H₂O(1:1:2) 中、85℃で１時間オリゴヌク
レオチドを結合した支持体を処理することにより支持体
から開裂し塩基を脱保護した。99％以上のオリゴヌクレ
オチドを各支持体から開裂した。固体支持体マトリック
ス、ＣＰＧまたはポリスチレンは支持体からオリゴヌク
レオチドを開裂する割合に差異がなかった。上記オリゴ
ヌクレオチドの粗収率は 0.2μモルスケールで 25-30 O
DU、40ナノモルスケールで 7-10 ODU であった。粗オリ
ゴヌクレオチドを逆相およびアニオン交換 HPLC で分析
した。

【００７７】オリゴヌクレオチド生成物を分析するため
に使用した逆相 HPLC システムは次の通りである：ABI
783Aプログラム可能検出器を備えたパーキンエルマーシ
リーズ200 溶媒供給システム、パーキンエルマー ISS20
0 オートサンプラーおよびＰＥネルソン 900シリーズデ
ーターシステム、RP-18 逆相カラム（220 ×4.6mm, App
lied Biosystems Division) 、溶媒Ａ： 0.1M トリエチ
ルアンモニウムアセテート、溶媒Ｂ：CH₃CN 、グラジエ
ント：24分で8-20％Ｂ、10分で20-40 ％Ｂ、２分で40-8
％Ｂ、７分間８％Ｂ、流速：１ml/min、検出器：260n
m。オリゴヌクレオチド生成物を分析するために使用し
たアニオン交換 HPLC は次の通りである：ABI 783Aプロ
グラム可能検出器を備えたパーキンエルマーシリーズ20
0 溶媒供給システム、パーキンエルマー ISS200 オート
サンプラーおよびＰＥネルソン 900シリーズデーターシ
ステム、Nucleopac PA-100カラム（250 ×4mm, Dionex
Corporation)；溶媒Ａ：20mM LiClO₄および20mM NaOAc
in H₂O:CH₃CN (9:1, pH6.5)；溶媒Ｂ：600 mM LiClO₄
および20mM NaOAc in H₂O:CH₃CN (9:1, pH6.5)；流速１
ml/min；グラジエント：40分で0-60％Ｂ；検出器、260n
m 。

【００７８】実施例８実施例７で調製した二重染料標識オリゴヌクレオチドの
酵素分析ヘビ毒ホスホジエステラーゼおよびアルカリ性ホスファ
ターゼを用いた酵素消化：ヘビ毒ホスホジエステラーゼ
（crotalus adamanteus) およびアルカリ性ホスホジエ
ステラーゼ（E. coli) をファーマシア、ニュージャー
ジイ州ピスカタウェイから購入した。ヘビ毒ホスホジエ
ステラーゼは１mg/ml で水に溶解する粉末として得た。
各試料の消化混合物（55μl)を次の試薬を混合して調製
した：水（44μl)、１M MgCl₂ (0.8μl)、0.5Mトリス緩
衝液、pH7.5 (3.5μl)、アルカリ性ホスファターゼ (4.
0μl) およびヘビ毒ホスホジエステラーゼ（2.4μl)。
一般に、0.2 ないし0.4 Ａ₂₆₀のオリゴヌクレオチドを
消化混合物に溶解し、37℃で８時間加熱した。インキュ
ベーション後、３Ｍ酢酸ナトリウム（７μl) およびエ
タノール（155μl) を各試料に添加した。各試料を渦巻
攪拌し、ドライアイスで10分間冷却し、次に10分間遠心
分離した。上澄みを注意深く一組の新しいチューブに移
しエタノール（452μl) を各試料に添加した。試料を渦
巻攪拌しドライアイスで10分間冷却し10分間遠心分離し
た。上澄みを注意深く一組の新しいチューブに移した。
試料を乾燥するまで減圧蒸発させた。各試料を水（60μ
l) に溶解し、下記のように逆相HPLCによって分析し
た。

【００７９】酵素消化物の逆相HPLC分析：HPLC分析はAB
I 783Aプログラム可能検出器、パーキンエルマー ISS20
0 オートサンプラーおよびＰＥネルソン900 シリーズデ
ーターシステムを備えたアプライドバイオシステムズ40
0 溶媒供給システムで行った。アプライドバイオシステ
ムズ RP-18逆相カラム（220×4.6mm)を使用した。検出
器は260nm でセットした。溶媒Ａは３％アセトニトリル
の 0.1M トリチルアンモニウムアセテート溶液、溶媒Ｂ
は90％アセトニトリル水溶液であった。グラジエントは
５分間100％Ａ、30分で100-90％Ａ、30分で90-0％Ａ、
５分間 100％Ｂ、２分で0-100％Ａ、15分間100％Ａ、流
速 0.5ml/minであった。流出の順番はdC、dG、Ｔ、dA、
６−カルボキシフルオレセイン−（６−ヒドロキシヘキ
シルアミド）、チミジン−TAMRA リンカー共役体であっ
た。酵素消化の研究は期待されたヌクレオシド組成物を
与え、塩基修飾を何も示さなかった。

【００８０】数例のみを上記のように詳細に述べたが、
ポリヌクレオチド合成の当業者にはこの教示から離れる
ことなく多くの変更が好適例において可能であることが
明らかであろう。このような変更は本発明の範囲内にあ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の好ましい合成支持体の合成を
示す概略図である。

【図２】図２は、本発明の好ましい合成支持体の合成を
示す概略図である。

【図３】図３は、本発明の好ましい合成支持体の合成を
示す概略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ウイリアムエイ．アンドリューアメリカ合衆国カリフォルニア州 94122 サンフランシスコ，セカンドアベニュ 1257

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次式：【化１】（式中、Ｔは酸開裂性の水酸基保護基であり；Ｌ₁は3'
−末端窒素を炭素に結合するためのリンカーであり；Ｌ
₂およびＬ₃は酸素および炭素を結合するためのリンカ
ーであり；Ｗは固体支持体であり；Ｌ₄は固体支持体を
窒素に結合するためのリンカーであり；Ｒ₁およびＲ₂
は水素、低級アルキル、窒素保護基、または標識からな
る群からそれぞれ選ばれる窒素置換基であり；そしてＲ
₃からＲ₇までは水素または低級アルキルからなる群か
らそれぞれ選ばれる炭素置換基である。）の化合物から
なる３’−標識ポリヌクレオチドの合成用合成支持体。
【請求項２】ＷがＣＰＧである請求項１記載の支持体。
【請求項３】Ｌ₄が次の構造式：【化２】を有する請求項２記載の支持体。
【請求項４】Ｗが非膨潤性ポリスチレンである請求項１
記載の支持体。
【請求項５】Ｌ₄がメチレンである請求項４記載の支持
体。
【請求項６】Ｔが4,4'−ジメトキシトリチルである請求
項１記載の支持体。
【請求項７】Ｌ₁が次の構造式：【化３】（式中、ｎは０から10のいずれかである。)を有する請
求項１記載の支持体。
【請求項８】ｎは４から６のいずれかである請求項７記
載の支持体。
【請求項９】Ｌ₂およびＬ₃がそれぞれメチレンである
請求項１記載の支持体。
【請求項１０】Ｒ₂が、テトラリメチルローダミンであ
る請求項１記載の支持体。
【請求項１１】Ｌ₃がジスルフィド結合を含む請求項１
記載の支持体。
【請求項１２】次式：【化４】（式中、ＤＭＴは4,4'−ジメトキシトリチルであり、Ｗ
は非膨潤性ポリスチレンである）の化合物からなる３’
−標識ポリヌクレオチドの合成用合成支持体。
【請求項１３】次式：【化５】（式中、ＤＭＴは4,4'−ジメトキシトリチルであり、Ｗ
はＣＰＧである）の化合物からなる３’−標識ポリヌク
レオチドの合成用合成支持体。
【請求項１４】次式：【化６】（式中、ＤＭＴは4,4'−ジメトキシトリチルであり、Ｗ
は非膨潤性ポリスチレンである）の化合物からなる３’
−標識ポリヌクレオチドの合成用合成支持体。
【請求項１５】次式：【化７】（式中、ＤＭＴは4,4'−ジメトキシトリチルであり、Ｗ
はＣＰＧである）の化合物からなる３’−標識ポリヌク
レオチドの合成用合成支持体。
【請求項１６】(a) 次式：【化８】（式中、Ｔは酸開裂性の水酸基保護基であり；Ｌ₁は3'
−末端窒素を炭素に結合するためのリンカーであり；Ｌ
₂およびＬ₃は酸素および炭素を結合するためのリンカ
ーであり；Ｗは固体支持体であり；Ｌ₄は固体支持体を
窒素に結合するためのリンカーであり；Ｒ₁およびＲ₂
は水素、低級アルキル、窒素保護基、または標識からな
る群からそれぞれ選ばれる窒素置換基であり；そしてＲ
₃からＲ₇までは水素または低級アルキルからなる群か
らそれぞれ選ばれる炭素置換基である。）の化合物から
なる合成支持体を提供し； (b) 固体支持体を酸で処理して酸開裂性水酸基保護基を
除去し； (c) 保護ヌクレオシドモノマーおよび弱酸を添加して結
合体を形成し； (d) 固体支持体上の未反応部位をキャッピングし； (e) 酸化剤を添加し； (f) ポリヌクレオチド鎖の伸長が完了するまで工程(b)
−(e)を繰り返し； (g) 固体支持体からポリヌクレオチドを開裂し；そして (h) ポリヌクレオチドを脱保護する各工程からなる３’
−標識ポリヌクレオチドの合成方法。