JP2007131642A - 固体支持体上での標識化オリゴヌクレオチドおよびアナログの合成のための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】オリゴヌクレオチドおよびアナログを、それらが合成される固体支持
体上に直接、迅速で、経済的、かつ化学的に不安定な官能基に適合する条件下で
標識化するための、方法および試薬を提供すること。
【解決手段】核酸化学の分野において、固体支持体上のオリゴヌクレオチドを標識するための方法であって、その標識試薬としては、ハイブリダイゼーション−安定化部分、蛍光色素、蛍光消光剤、エネルギー移動色素のセット、化学発光色素、金属ポルフィリン、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、酵素およびアフィニティーリガンドが挙げられる、方法。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、一般に核酸化学の分野、および特に固体支持体上のオリゴヌクレオ
チドを標識するための方法および組成物に関する。標識試薬としては、ハイブリ
ダイゼーション−安定化部分、蛍光色素、蛍光消光剤、エネルギー移動色素のセ
ット、化学発光色素、金属ポルフィリン、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、酵
素およびアフィニティーリガンドが挙げられる。

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ｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ３’−ｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」，米国特許第５，
５５２，４７１号、１９９６年９月３日発行。

（背景）
非同位体標識オリゴヌクレオチドは、多くの重要な分子生物学の適用（例えば
、ＰＣＲ増幅、ＤＮＡ配列決定、遺伝子発現のアンチセンス転写および翻訳制御
、遺伝分析ならびにＤＮＡプローブベースの診断試験（Ｋｅｌｌｅｒ，１９９３
；Ｋｒｉｃｋａ，１９９２）において不可欠の部分である。蛍光色素標識オリゴ
ヌクレオチドの蛍光検出は、核酸配列検出アッセイ（例えば、Ｔａｑｍａｎ^TM（
Ｌｉｖａｋ，１９９６）、分子標識（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）（Ｔ
ｙａｇｉ，１９９６）、遺伝的連鎖マッピング（Ｄｉｂ，１９９６）、およびオ
リゴヌクレオチド連結アッセイ（Ｇｒｏｓｓｍａｎ，１９９４））の基礎である
。

合成オリゴヌクレオチドを標識化するための２つの一般的な方法が、確立され
ている。第１の方法（本明細書中では「２段階溶液標識化法」といわれる）にお
いて、求核的官能基（例えば、１級脂肪族アミン）が、オリゴヌクレオチド上の
標識化結合部位（例えば、５’末端）に導入される。自動化固体支持体合成が完
了した後、このオリゴヌクレオチドは支持体から切断され、そして全ての保護基
は除去される。求核剤−オリゴヌクレオチドを、均一溶媒条件下で、求電子性部
分を含む過剰の標識試薬（例えば、イソチオシアネートまたは活性化エステル（
例えば、ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）））と反応させる（Ｈｅｒｍａｎ
ｓｏｎ，１９９６；Ａｎｄｒｕｓ，１９９５）。

第２の代替の方法（本明細書中では直接標識化法」といわれる）において、標
識は、合成の間、または前に、直接オリゴヌクレオチドに組み込まれる（Ｍｕｌ
ｌａｈ，１９９８；Ｎｅｌｓｏｎ，１９９２）。直接標識化法は、以下のような
理由で望ましい。（ｉ）合成後の反応工程を必要とせず、それにより標識化ポリ
ヌクレオチドの合成を簡単にし、そして（ｉｉ）２段階溶液標識化法で代表的に
遭遇する低反応収率（＜６０％）に関連する問題を避ける。この問題とは、すな
わち：（ａ）過剰の標識からの標識化オリゴヌクレオチドの精製；（ｂ）非標識
化オリゴヌクレオチドからの標識化オリゴヌクレオチドの精製；（ｃ）低生成物
収率ならびに面倒な分析および精製手順に起因する高い費用、ならびに；（ｄ）
合成の間の求核的官能基の付加逆的なキャッピングである。

特定の蛍光色素および他の標識は、５’標識化のためのホスホラミダイト試薬
として官能化されてきた（Ｔｈｅｉｓｅｎ，１９９２）。しかし、いくつかの標
識（例えば、ジゴキシゲニン、ローダミン色素、およびシアニン色素）は、不安
定過ぎて、過酷な条件ならびに試薬調製およびオリゴヌクレオチドの合成、切断
および脱保護において使用される試薬に、耐えることができない。従って、この
ような標識が現在の固相合成プロトコルにおいて使用される場合にはかならず、
あまり好ましくない２段階溶液標識化法を使用して結合されなければならない。

従って、オリゴヌクレオチドおよびアナログを、それらが合成される固体支持
体上に直接、迅速で、経済的、かつ化学的に不安定な官能基に適合する条件下で
標識化するための、方法および試薬を提供することが所望される。

（要旨）
本発明は、固体支持体上の標識化オリゴヌクレオチドの合成のための新規な方
法および組成物に関する。

第１の局面では、本発明は、以下の構造

を有する標識化固体支持体上の標識化オリゴヌクレオチドの合成のための方法を
包含し、
ここでＳは固体支持体であり、Ａは切断可能なリンカーであり、Ｘは３以上の結
合部位を有する部分であり、Ｌは標識であり、Ｙは求核剤（すなわち、Ｏ、ＮＨ
、ＮＲまたはＳ）そしてＰ₁は酸で切断可能な保護基である。標識化固体支持体
は、（１）ＹからＰ₁を除去するための試薬、（２）Ｙを５’−ホスホラミダイ
ト（３’保護ヌクレオシド）の５’位とカップリングさせるための試薬、（３）
支持体上の任意の未反応部位（例えば、Ｙ）を必要に応じてキャップするための
試薬、および（４）任意のホスファイト連結を酸化するための試薬を用いて、循
環様式で反応される。これらの４つの工程は、標識化されたオリゴヌクレオチド
全体が合成されるまで繰り返される。

合成が完了した後、標識化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間ホスフェート
および核酸塩基上の保護基は、このオリゴヌクレオチドを固体支持体上に残した
まま脱保護によって除去され得る。あるいは、合成が完了した後、標識化オリゴ
ヌクレオチドは、固体支持体から切断され得、次いで脱保護され得る。

第２の局面では、本発明は、以下の構造

を有する固体支持体に結合されるヌクレオシドを包含し、
ここでＳ、Ａ、Ｘ、ＬおよびＹは、上記に規定されるとおりであり、Ｒはホスフ
ェート保護基またはホスホトリエステル置換基であり；Ｂは核酸塩基であり；Ｐ
₂は環外窒素保護基であり；そしてＰ₃は酸に不安定な保護基である。

第３の局面において、本発明は、以下の構造

を有する固体支持体に結合されるオリゴヌクレオチドを含み、
ここで変更し得る置換基は上記で規定されるとおりであり、そしてｎは好ましく
は約０〜１００の整数である。

第４の局面において、本発明は、（ｉ）求電子剤に変換され得る官能基を有す
る標識試薬（例えば、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸またはリン酸）を反
応させる工程、（ｉｉ）固体支持体上のオリゴヌクレオチドを求核的官能基（例
えば、アルコール、アミン、またはチオール）と反応させる工程、および（ｉｉ
ｉ）カップリング試薬を反応させる工程であって、これによりエステル、アミド
、チオエステル、スルホンアミド、スルホネート、ホスホネート、ホスホラミデ
ート、ホスホロチオエート、またはリン酸結合が形成される工程により、標識化
オリゴヌクレオチドを合成するための方法を包含する。標識化法は、標識部位（
５’末端、３’末端、核酸塩基、ヌクレオチド間連結、糖、アミノ、スルフィド
、ヒドロキシル、およびカルボキシルを含む）においてオリゴヌクレオチドに対
して実施され得る。標識化反応は、１つ以上のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよび核
酸アナログモノマーユニットを含むオリゴヌクレオチドに対して行われ得る。核
酸アナログは、核酸塩基、糖、および／またはヌクレオチド間アナログであり得
る。

標識化オリゴヌクレオチドは、５’から３’の方向、または３’から５’の方
向のいずれかで合成され得る。
したがって、本発明によって以下が提供される：
（１）５’標識化オリゴヌクレオチドの５’から３’への合成のた
めの方法であって、以下：
ａ）以下の構造：

を有する標識した固体支持体を提供する工程であって、ここで
Ｓは、固体支持体であり；
Ａは、切断可能なリンカーであり；
Ｘは、３つ以上の結合部位を有する部分であり；
Ｌは、標識であり；
Ｙは、酸素、ＮＨ、ＮＲ（ここでＲは、メチル、低級アルキル、置換アルキル
、フェニル、アリールおよび置換アリールである）ならびにイオウからなる群か
ら選択され；そして
Ｐ₁は、酸により切断可能な保護基である、工程
ｂ）標識した固体支持体を酸と反応させ、該酸により切断可能な保護基である
Ｐ₁を除去する工程；および
ｃ）５’−ホスホラミダイト、３’保護ヌクレオシドおよび活性化剤を添加し
、これによりＹと該ヌクレオシドの５’末端との間で結合を形成する工程、
を包含する、方法。
（２）項目１に記載の方法であって、以下：
ｄ）前記固体支持体上の任意の未反応部位をキャップする工程；および
ｅ）酸化剤を添加する工程、
をさらに包含する、方法。
（３）項目１に記載の方法であって、以下：
ｄ）前記固体支持体上の任意の未反応部位をキャップする工程；
ｅ）酸化剤を添加する工程；および
ｆ）標識化オリゴヌクレオチドが完全に合成されるまで、前記工程ｂ）から工
程ｅ）を繰り返す工程、
をさらに包含する、方法。
（４）前記標識化オリゴヌクレオチドを脱保護する工程をさらに包
含する、項目３に記載の方法。
（５）前記固体支持体から標識化合物を切断する工程および前記標
識化オリゴヌクレオチドを脱保護する工程をさらに包含する、項目３に記載の
方法。
（６）前記固体支持体Ｓが、ポリスチレン、制御細孔ガラス、シリ
カゲル、シリカ、ポリアクリルアミド、磁気ビーズ、ポリアクリレート、ヒドロ
キシエチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシな
らびにこれらのコポリマーおよびグラフトからなる群から選択される、項目１
に記載の方法。
（７）前記固体支持体Ｓの形態が、小さな粒子、ビーズ、膜、フリ
ット、スライド、プレート、微細加工されたチップ、アルカンチオール−金層、
非多孔質表面、アドレス可能なアレイおよびポリヌクレオチドを固定した媒体か
らなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（８）前記切断可能なリンカーＡが、以下：

からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（９）項目１に記載の方法であって、前記リンカーＸが以下：

からなる群から選択され、ここで
ｎは、１〜１２である、
方法。
（１０）前記標識Ｌが、ハイブリダイゼーション−安定化部分、蛍
光色素、蛍光消光剤、エネルギー移動色素のセット、化学発光色素、アミノ酸、
タンパク質、ペプチド、酵素およびアフィニティーリガンドからなる群から選択
される、項目１に記載の方法。
（１１）前記蛍光色素および蛍光消光剤が、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥ
Ｘ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ｄ−ＴＡＭＲＡ、ＪＯＤＡ、ＲＯＸ、ＶＩＣ、ＮＥＤ
、ｄＪＯＮ、ｄＲ１３９、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、マラカイトグリーン、
４，７−ジクロロ−フルオレセイン、４，７−ジクロロ−ローダミン、ＮＴＢお
よびシアニンからなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（１２）前記ハイブリダイゼーション−安定化部分が、Ｈｏｅｃｈ
ｓｔ ３３２５８、ＣＤＰＩ_1-3、ＭＧＢ１、ネトロプシンおよびジスタマイシ
ンからなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（１３）前記酸により切断可能な保護基Ｐ₁が、ＤＭＴ、ＭＭＴ、
トリチル、置換トリチル、ピキシルおよびトリアルキルシリルからなる群から選
択される、項目１に記載の方法。
（１４）項目１に記載の方法であって、ここで前記５’−ホスホ
ラミダイト、３’保護したヌクレオシドモノマーが、以下の構造：

を有し、ここで、
Ｒは、シアノエチル、メチル、低級アルキル、置換アルキル、フェニル、アリ
ールおよび置換アリールからなる群から選択され；
Ｒ₁およびＲ₂は、イソプロピル、モルホリノ、メチル、エチル、低級アルキル
、シクロアルキルおよびアリールからなる群から独立して選択され；
Ｐ₂は、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、アリー
ルオキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジアルキルホルムアミジンおよび
ジアルキルアセトアミジンからなる群から選択される環外窒素保護基であり；そ
して
Ｐ₃は、ＤＭＴ、ＭＭＴ、ピキシル、トリチルおよびトリアルキルシリルから
なる群から選択される酸不安定な保護基である、
方法。
（１５）項目３に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、
１つ以上のＤＮＡ，ＲＮＡおよび核酸アナログモノマーユニットを含む、方法。
（１６）項目１５に記載の方法であって、前記核酸アナログが、核酸塩基アナログ、糖アナログ、および核酸塩基間アナログからなる群より選択される、方法。
（１７）前記核酸塩基アナログが、Ｃ−５−アルキルピリミジン、２，６−ジアミノプリン、２−チオピリミジン、Ｃ−５−プロピンピリミジン、フェノキサジン、７−デアザプリン、イソシチジン、偽イソシチジン、イソグア
ノシン、ヒポキサンチン、８−オキソプリンおよび普遍塩基からなる群から選択される、項目１５に記載の方法。
（１８）前記糖アナログが、２’−Ｏ−アルキル−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチド、２’−アリル−リボヌクレオチド、２’−ハロ−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシチル−リボヌクレオチド、２’−分枝基−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−分枝基−リボヌクレオチド、４’−α−アノマーヌクレオチドおよび１’−α−アノマーヌクレオチドからなる群から選択される、項目１５の方法。
（１９）前記ヌクレオチド間アナログが、２−アミノエチルグリシ
ン（ＰＮＡ）、２’−５’−結合、逆転３’−３’結合、逆転５’−５’結合、
ホスホロチオエート、メチルホスホネート、非架橋Ｎ−置換ホスホラミデート、
アルキル化ホスホトリエステル分枝構造および３’−Ｎ−ホスホラミデートか
らなる群から選択される、項目１５に記載の方法。
（２０）項目１に記載の方法であって、前記標識された固体支持
体が以下の式：

の化合物を含み、ここで
Ｓは、ポリスチレンまたは制御細孔ガラスであり；そして
Ｌは、標識である、
方法。
（２１）以下の式：

の化合物を含む固体支持体であって、ここで
Ｓは、固体支持体であり；
Ａは、切断可能なリンカーであり；
Ｘは、３つ以上の結合部位を有する部分であり；
Ｌは、標識であり；
Ｙは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲおよびＳからなる群から選択され；
Ｒは、シアノエチル、メチル、低級アルキル、置換アルキル、フェニル、アリ
ールおよび置換アリールからなる群から選択され；
Ｐ₂は、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、アリー
ルオキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジアルキルホルムアミジンおよび
ジアルキルアセトアミジンからなる群から選択される環外窒素保護基であり；そ
して
Ｐ₃は、ＤＭＴ、ＭＭＴ、トリチル、置換トリチル、ピキシルおよびトリアル
キルシリルからなる群から選択される酸不安定な保護基である、
固体支持体。
（２２）以下の式：

の化合物を含む固体支持体であって、ここで
ｎは、０〜１００の整数であり；
Ｓは、固体支持体であり；
Ａは，切断可能なリンカーであり；
Ｘは、３つ以上の結合部位を有する部分であり；
Ｌは、標識であり；
Ｙは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲおよびＳからなる群から選択され；
Ｒは、シアノエチル、メチル、低級アルキル、置換アルキル、フェニル、アリ
ールおよび置換アリールであり；
Ｐ₂は、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、アリー
ルオキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジアルキルホルムアミジンおよび
ジアルキルアセトアミジンからなる群から選択される環外窒素保護基である、
固体支持体。
（２３）標識化オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
以下
：
標識試薬を官能基とカップリングする工程であって、該官能基は、カルボン酸
、スルホン酸、ホスホン酸またはリン酸からなり；カップリング試薬を用いて該
固体支持体に該オリゴヌクレオチドを結合する、工程を包含し、
該工程により、エステル結合、アミド結合、チオエステル結合、スルホンアミ
ド結合、スルホネート結合、ホスホネート結合、ホスホラミデート結合、ホスホ
ロチオエート結合またはホスフェート結合が形成される、方法。
（２４）前記標識試薬が、ハイブリダイゼーション−安定化部分、
蛍光色素、蛍光消光剤、エネルギー移動色素のセット、化学発光色素、アミノ酸
、タンパク質、ペプチド、酵素およびアフィニティーリガンドからなる群から選
択される、項目２３に記載の方法。
（２５）前記蛍光色素および蛍光消光剤が、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥ
Ｘ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ｄ−ＴＡＭＲＡ、ＪＯＤＡ、ＲＯＸ、ＶＩＣ、ＮＥＤ
、ｄＪＯＮ、ｄＲ１３９、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、マラカイトグリーン、
４，７−ジクロロ−フルオレセイン、４，７−ジクロロ−ローダミン、ＮＴＢお
よびシアニンからなる群から選択される、項目２４に記載の方法。
（２６）前記ハイブリダイゼーション安定化部分が、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＣＤＰＩ_1-3、ＭＧＢ１、ネトロプシンおよびジスタマイシンからなる群から選択される、項目２３に記載の方法。
（２７）項目２３に記載の方法であって、前記標識が、標識部位において前記オリゴヌクレオチドに結合され、該標識部位は、５’末端、３’末端、核酸塩基、ヌクレオチド間結合、糖、アミノ、スルフィド、ヒドロキシル、
およびカルボキシルからなる、方法。
（２８）項目２３に記載の方法であって、前記固体支持体が、以下の構造：

を有する化合物を含み、ここで
Ｓは、固体支持体であり；
Ａは、切断可能なリンカーであり；
Ｘは、３つ以上の結合部位を有する部分であり；
Ｌは、標識であり；
Ｙは、酸素、ＮＨ、ＮＲ（ここでＲは、メチル、低級アルキル、置換アルキル
、フェニル、アリールおよび置換アリールである）ならびにイオウからなる群か
ら選択され；そして
Ｐ₁は、酸により切断可能な保護基である、方法。
（２９）前記固体支持体が、ポリスチレン、制御細孔ガラス、シリカゲル、シリカ、ポリアクリルアミド、磁気ビーズ、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシお
よびこれらのコポリマーまたはグラフトからなる群から選択される、項目２３に記載の方法。
（３０）前記固体支持体の形態が、小さな粒子、ビーズ、膜、フリット、非多孔質表面、スライド、プレート、微細加工されたチップ、アルカンチオール−金層、アドレス可能なアレイまたはポリヌクレオチドを固定した媒体か
らなる群から選択される、項目２９に記載の方法。
（３１）前記オリゴヌクレオチドが１つ以上のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよび核酸アナログモノマーユニットを含む、項目２２に記載の方法。
（３２）項目３１に記載の方法であって、、前記核酸アナログが、核酸塩基アナログ、糖アナログ、および核酸塩基間アナログからなる群より選択される、方法。
（３３）前記核酸塩基アナログが、Ｃ−５−アルキルピリミジン、２，６−ジアミノプリン、２−チオピリミジン、Ｃ−５−プロピンピリミジン、フェノキサジン、７−デアザプリン、イソシチジン、偽イソシチジン、イソグア
ノシン、ヒポキサンチン、８−オキソプリンおよび普遍塩基からなる群から選択される、項目３２に記載の方法。

（３４）前記糖アナログが、２’−Ｏ−アルキル−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチド、２’−アリルリボヌクレオチド、２’−ハロ−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル−リボヌクレオチド、２’−分枝基−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−分枝基−リボヌクレオチド、４’−α−アノマーヌクレオチドおよび１’−α−アノマーヌクレオチドからなる群から選択される、項目３２の方法。
（３５）前記ヌクレオチド間アナログが、２−アミノエチルグリシン（ＰＮＡ）、２’−５’−結合、逆転３’−３’結合、逆転５’−５’結合、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、非架橋Ｎ−置換ホスホラミデート、
アルキル化ホスホトリエステル分枝構造および３’−Ｎ−ホスホラミデートか
らなる群から選択される、項目３２に記載の方法。
（３６）オリゴヌクレオチド合成の方向が５’から３’である、請求項２３に記載の方法。
（３７）オリゴヌクレオチド合成の方向が３’から５’である、請求項２３に記載の方法。

（好ましい実施形態の詳細な説明）
ここで本発明の好ましい実施形態を詳細に参照すると、これらの例は、添付の
図面に図示される。本発明は、好ましい実施形態と共に記載されるが、これらは
、その実施形態に本発明が限定されるということを意図されないことが理解され
る。対照的に、本発明は、上記の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲
内に含まれる代替物、改変物、および等価物を包含することを意図される。

（Ｉ．定義）
他に記載されないかぎり、本明細書中で使用される場合、以下の用語および句
は、以下の意味を有することが意図される。

用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、ヌク
レオチドモノマーまたはそれらのアナログのポリマーを意味し、それらの二重鎖
および一重鎖の、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、α−アノマー
形態などを含む。オリゴヌクレオチドは、１つ以上のＤＮＡ、ＲＮＡおよび核酸
アナログモノマーユニットを含み得る。モノマーは、ヌクレオチド間連結（ホス
ホジエステル結合またはそれらのホスフェートアナログを含む）により連結され
、対イオン（例えば、Ｈ⁺、ＮＨ⁴⁺、Ｎａ⁺）を伴う。オリゴヌクレオチドは、代
表的に少数のモノマーユニット（例えば、５〜４０）から数千のモノマーユニッ
トまでの範囲である。オリゴヌクレオチドが文字の配列（例えば、「ＡＴＧＣＣ
ＴＧ」）により表される場合は必ず、ヌクレオチドは、５’から３’の順に、左
から右であり、そして他に示されないかぎり、「Ａ」は、デオキシアデノシン、
「Ｃ」はデオキシシチジン、「Ｇ」はデオキシグアノシン、そして「Ｔ」はチミ
ジンを示す。

「ヌクレオシド」は、ペントースに１’位で連結したプリン核酸塩基、デアザ
プリン核酸塩基、またはピリミジン核酸塩基（例えば、アデニン、グアニン、シ
トシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなど）からなる
化合物をいう。核酸塩基がプリンまたは７−デアザプリンである場合、ペントー
スはこの核酸塩基にプリンまたはデアザプリンの９位で結合され、そして核酸塩
基がピリミジンである場合、ペントースは、この核酸塩基にピリミジンの１位で
結合される。

「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エ
ステル）をいい、ここで最も一般的なエステル化部位は、ペントースのＣ−５位
に結合されるヒドロキシル基である。

用語「ワトソン／クリック塩基対合」は、配列特異的水素結合により共に結合
する、ヌクレオチドおよびそのアナログの特定の対（例えば、ＡはＴおよびＵと
対になり、そしてＧはＣと対になる）のパターンをいう。

用語「アナログ」とは、モノマーヌクレオチドアナログ単位から作製され、そ
して核酸に関連するいくつかの性質および特性を有する核酸のアナログをいう。
核酸アナログは、改変された核酸塩基部分、改変された糖部分、および／または
改変されたヌクレオチド間連結を有し得る（Ｅｎｇｌｉｓｃｈ，１９９１）。糖
およびヌクレオチド間部分が、２−アミノエチルグリシンアミド骨格ポリマーで
置換された、好ましい核酸アナログのクラスは、ペプチド核酸ＰＮＡである（Ｎ
ｉｅｌｓｅｎ，１９９１）。

「結合部位」とは、リンカーが結合される部位をいう。

「リンカー」とは、オリゴヌクレオチドを標識または固体支持体に接続する鎖
を含む１つ以上の原子をいう。

「キメラ」とは、本明細書中で使用される場合、１つ以上のヌクレオチド単位
および１つ以上のヌクレオチドアナログ単位を含むオリゴヌクレオチドをいう。

「低級アルキル」、「低級アルキレン」および「低級置換アルキレン」とは、
１〜１２個の炭素原子からなる直鎖、分枝、または環式の基をいう。

「標識」とは、オリゴヌクレオチドに共有結合で結合される部分をいう。好ま
しい標識のクラスは、検出のためのシグナル（例えば、蛍光、化学ルミネセンス
、および電気化学ルミネセンス）を生じる（Ｋｒｉｃｋａ，１９９２）。別の好
ましい標識のクラスは、ハイブリダイゼーションを強化するか、安定化するか、
または影響を及ぼすように作用する（例えば、インターカレーター、小溝バイン
ダー（ｍｉｎｏｒ−ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）、および架橋官能基）（Ｂｌ
ａｃｋｂｕｒｎ，１９９６）。検出標識としては、蛍光色素（例えば、フルオレ
セインおよびローダミン誘導体）、シアニン色素（Ｋｕｂｉｓｔａ，１９９７）
、化学ルミネセンス色素（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ，１９９０；Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ
，１９９４）およびエネルギー移動色素（Ｃｌｅｇｇ，１９９２；Ｃａｒｄｕｌ
ｌｏ，１９８８）が挙げられるが、これらに限定されない。なお別の好ましい標
識のクラスは、特異的または非特異的捕獲手段によって分子の分離または固定化
をもたらすように作用する（Ａｎｄｒｕｓ，１９９５）。

「検出」とは、標識の特性に基づいてオリゴヌクレオチドを検出すること、観
察すること、または測定することをいう。

「カップリング試薬」は、固体支持体上の求核性オリゴヌクレオチドと標識と
の間に、エステル結合、アミド結合、チオエステル結合、スルホンアミド結合、
スルホネート結合、ホスホネート結合、ホスホラミデート結合、ホスホロチオエ
ート結合、またはホスフェート結合を形成し得る任意の試薬、活性化剤、または
添加剤を含む。

（ＩＩ．標識化支持体）
本発明の１つの局面は、標識化オリゴヌクレオチドの合成のための支持体を含
む。本発明のこの局面にしたがった標識化支持体は、以下の構造：

を有し、
ここでＳは一般にオリゴヌクレオチド合成に有用な固体支持体材料をいい、Ａは
切断可能なリンカーであり、Ｘは３以上の結合部位を有する部分であり、Ｌは標
識であり、Ｙは求核剤（すなわち、Ｏ、ＮＨ、ＮＲまたはＳ）であり、そしてＰ
₁は、酸で切断可能な保護基である。

固体支持体は、モノマーユニットの連続的な結合のための不溶性媒質を提供す
る。不均一合成法の有意な利点は、液相中の過剰の試薬が、濾過により容易に除
去され得、それにより各反応のまたは各サイクルの間の精製工程の必要性を排除
することである。固体支持体の特徴（例えば、細孔サイズ、架橋含有量（ｃｒｏ
ｓｓ−ｌｉｎｋ ｃｏｎｔｅｎｔ）、膨潤、粒子サイズ、および表面積）は、迅
速な動態および高収率反応を生じるために、試薬の効率的な拡散を可能にするよ
うに最適化されるべきである。好ましい支持体材料としては、高架橋非膨潤ポリ
スチレン（Ａｎｄｒｕｓ，１９９３）、制御細孔ガラス（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，
１９８４）、シリカ、シリカゲル、ポリアクリルアミド、磁気ビーズ（Ｓｔａｍ
ｍ，１９９５）、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリア
ミド，ポリエチレン，ポリエチレンオキシ、およびこのような物質のグラフトま
たはコポリマーが挙げられる。固体支持体の物理的構成としては、小粒子、ビー
ズ、膜、フリット、非多孔性表面、スライド、プレート、ミクロ機械加工チップ
、アルカンチオール−金層、アドレス可能アレイ、ベクター、プラスミド、また
はポリヌクレオチド−固定化媒質が挙げられる（Ｆｏｄｏｒ，１９９５）。いく
つかの実施形態では、例えば、ウエル、隆起した領域、窪み、ピン、溝、ロッド
、円筒の内壁または外壁などを伴った、支持体上で物理的に隔てられた合成領域
のアレイを作製することが望ましい。

切断可能なリンカーＡは、以下のような任意の官能基を含み得る：（ｉ）塩基
性試薬により切断されるエステルおよび他の塩基に不安定なリンカー、（ｉｉ）
フッ化物イオンのような求核剤により切断されるシリルエーテル、または（ｉｉ
ｉ）ジスルフィド基およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）のような試薬を用いて
酸化／還元条件下で切断される他の基。リンカーＡの上記の例において切断され
る結合は、以下に矢印で示される。

部分Ｘは、リンカーＡ、標識Ｌ、およびオリゴヌクレオチドを介する固体支持
体の結合のための結合部位を含む任意の基であり得る。

標識Ｌは、オリゴヌクレオチドに共有結合で結合される任意の基または部分で
ある。標識は、ハイブリダイゼーション安定化部分（例えば、小溝バインダー、
インターカレーター、および架橋剤）、蛍光色素、蛍光消光剤、エネルギー移動
色素セット、化学ルミネセンス色素、アミノ酸、タンパク質、ペプチド，酵素、
および親和性リガンドを含み得る。

Ｙは、炭素と比較して求核性の基（例えば、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ、およびＳ）であ
り、そしてＸをオリゴヌクレオチドに結合する。Ｙは、酸で切断可能な保護基Ｐ
₁を有し、ＤＭＴ、ＭＭＴ、トリチル、置換トリチル、ピクシル（ｐｉｘｙｌ）
、またはトリアルキルシリルであり得る。この保護基Ｐ₁は、オリゴヌクレオチ
ド合成を開始するために求核剤Ｙから除去される。

（ＩＩＩ．標識化支持体の合成）
固体支持体Ｓは、リンカー単位（Ａ−Ｘ−Ｙ）が連結される反応性官能基を用
いて誘導体化される。好ましくは、反応性官能基は、好ましくは１グラムにつき
５〜１００個のＮＨ₂を添加された１級アミノ基である。次いで、リンカー単位
またはスペーサー（Ａ−Ｘ−Ｙ）は、固体支持体の反応性官能基に共有結合で結
合される。Ａ−Ｘ−Ｙ上の第２の連結部位は、標識に結合する。Ａ−Ｘ−Ｙ上の
第３の連結部位は、オリゴヌクレオチド鎖の合成を可能にする。代表的にＡは、
塩基性条件下（例えば、水酸化アンモニウム）で切断可能なエステル基を含み、
オリゴヌクレオチド、およびこのオリゴヌクレオチドに結合される任意の標識か
らの固体支持体の分離を可能にする。

以下の（ｉ）または（ｉｉ）ようにリンカーユニットＡ−Ｘ−Ｙは、固体支持
体に結合され得る：（ｉ）ラベルＬを有する１ユニット、または（ｉｉ）ラベル
Ｌを有さない１ユニット（ここで、ラベルＬは、次いで、以下の反応：

によってリンカーＸに結合する）。

図２は、標識化支持体への例示的ルート（ｉｉ）を示し、ここで、このリンカ
ー１（Ｘ−Ｙ−Ｐ₁）を、２（Ａ−Ｘ−Ｙ−Ｐ₁）に変換し、そしてアミノメチル
（高度に架橋されたポリスチレン）３に結合する。得られた生成物４を、５へと
脱保護する。予め活性化されたラベル（例えば、ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳ（５−カル
ボキシテトラメチルローダミンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル））を
、５に共有結合させ、オリゴヌクレオチドの合成のために用意した、標識化支持
体６を得る。

標識化固体支持体の好ましい群は、構造６として示される（図２および以下）
。

ここで、Ｓは、高度に架橋されたポリスチレンであるか、または制御細孔ガラス
であり、Ａは、以下：

であり、Ｘは、以下：

であり、Ｌは、小溝バインダー（ｍｉｎｏｒ−ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）（
シアニン、蛍光色素、またはエネルギー移動色素のセット）であり、Ｙは、酸素
であり、そしてＰ₁は、ＤＭＴである。

６のＸ中の不斉炭素を、標識化オリゴヌクレオチドのジアステレオ異性体に導
く。これらの特定の異性体は、ＨＰＬＣまたはキャピラリー電気泳動による分析
の間に、個々のピークに分割しないとう利点を有する。ラベルをオリゴヌクレオ
チドに結合するための他のジアステレオマーリンカーは、分析において２重のピ
ークとして例示される、ジアステレオマー分解を示し得る（Ｍｕｌｌａｈ，１９
９８；Ｗｏｏ，１９９６）。６から調製された標識化オリゴヌクレオチドが、Ｄ
ＮＡ配列（Ｌｅｅ，１９９７）、ＤＮＡフラグメント分析（Ｇｒｏｓｓｍａｎ，
１９９４）およびＰＣＲ（Ｌｉｖａｋ，１９９６）のようなプライマー伸長実験
において使用される場合、フラグメントおよび増幅生成物が、データ分析を妨害
するジアステレオマー群（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に分割しないことによる同様
な利点がある。

（ＩＶ．５’から３’方向での標識化支持体上での標識化オリゴヌクレオチド
の合成）
一般に、本発明の方法および組成物は、効率がよくかつ迅速なカップリングお
よび出発ヌクレオチドモノマーの安定性のために好ましい、ホスホラミダイト合
成法を利用する（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８３；Ｂｅａｕｃａｇｅ，１９８３
；Ｂｅａｕｃａｇｅ，１９９２）。ホスホラミダイト法は、固体支持体上で、最
も一般的には、３’から５’方向へ（３’末端ヌクレオチドは、合成の開始時点
で固体支持体に結合されている）、ヌクレオチドモノマーユニットのオリゴヌク
レオチド成長鎖への周期的添加（ｃｙｃｌｉｃａｌ ａｄｄｉｔｉｏｎ）を必要
とする。この方法は，通常オートメーション化した市販の合成機を利用して実施
される（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８４）。本発
明の５’から３’方向への実施形態では、以下の構造７：

を有する５’ホスホラミダイト，３’保護ヌクレオシドモノマー（Ｗａｇｎｅｒ
，１９９７）を、周期的に添加し、ここで、Ｒは、保護基または置換基（例えば
、シアノエチル、メチル、低級アルキル、置換アルキル、フェニル、アリール、
および置換アリール）であり；Ｒ₁およびＲ₂は、アミン置換基（例えば、イソプ
ロピル、モルホリノ、メチル、エチル、低級アルキル、シクロアルキル、および
アリールであり；Ｐ₂は、環外窒素保護基（例えば、ベンゾイル、イソブチリル
、アセチル、フェノキシアセチル、アリールオキシアセチル、ジメチルホルムア
ミジン、ジアルキルホルムアミジンおよびジアルキルアセトアミジン）であり；
ならびにＰ₃は、酸ラベル保護基（例えば、ＤＭＴ、ＭＭＴ、ピキシル（ｐｉｘ
ｙｌ）、トリチル、およびトリアルキルシリル）である。

固体支持体に結合した５’末端および遊離の結合していない３’末端を有する
オリゴヌクレオチドが、合成される。

以下では、本発明おけるホスホラミダイト法を使用して、合成サイクルの工程
を簡潔に記載する。第一に、固体支持体（例えば、６）は、プロトン酸（ｐｒｏ
ｔｉｃ ａｃｉｄ）（例えば、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸）を用いて処
理し、続くカップリング反応のために求核性（例えば、ヒドロキシル基）を有さ
ない酸ラベル保護基（例えば、ＤＭＴ）を除去する。次いで、活性化中間体は、
５’−ホスホラミダイト，３−保護ヌクレオシドモノマー７および弱酸（例えば
、テトラゾールなど）を、合成機の反応容器（合成カラム）に同時に添加するこ
とによって形成される。ヌクレオシドの付加は、典型的に、３０〜３００秒、好
ましくは、約９０秒内で完了する。次に、カップリング工程を実施し、この工程
は、３’ヒドロキシル基のアシル化によるヌクレオシドの付加を受けない任意の
オリゴヌクレオチド鎖で終結する。カップリングは、好ましくは、無水酢酸およ
び１−メチルイミダゾールを用いて実施されるが、他のアシル化剤を使用しても
よい。次いで、ヌクレオチド間の結合を、好ましい酸化剤としてヨウ素および酸
素供与体として水を使用する酸化によって、ホスファイト（ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ
）からより安定なホスホトリエステルに変換し、以下の構造：

を得る。

あるいは、ヌクレオチド間のホスファイトを酸化して、例えばホスホロチオエ
ート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）またはホスホラミダート（ｐｈｏｓ
ｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）のようなヌクレオチド間アナログにし得る。酸化の後
に、次の３’ヒドロキシル保護基（例えば、ＤＭＴ）を、プロトン酸（例えば、
トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸）を用いて除去し、そしてこのサイクルを鎖
の伸長が完了するまで繰り返す（図１）。

（Ｖ．固体支持体上でのオリゴヌクレオチドの合成後の標識化）
標識は、オリゴヌクレオチドおよび核酸アナログ上の種々の結合部位に結合さ
れ得、この標識としては、（ｉ）末端（例えば、プローブの５’および／または
３’末端）、（ｉｉ）ヌクレオチド間の結合、（ｉｉｉ）糖、あるいは（ｉｖ）
核酸塩基が挙げられる。標識は、最も好都合におよび効率的に５’末端で標識部
位が導入され、この標識部位は、最も少なくハイブリダイゼーションを不活性化
させ、そして最もすくなく３’プライマー伸長反応と相互作用する（Ｋｒｉｃｋ
ａ，１９９２；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６）。好ましい５’リンカー試薬は
、構造８：

を有する、アミノ保護ホスホラミダイトであり、ここで、Ｒは、酸素保護基また
は置換基（例えば、シアノエチル、メチル、低級アルキル、置換アルキル、フェ
ニル、アリール、または置換アリール）であり；そしてＲ₁およびＲ₂は、アミノ
置換基（例えば、イソプロピル、モルホリノ、メチル、エチル、低級アルキル、
シクロアルキル、またはアリールである。上記の試薬と、支持体に結合したオリ
ゴヌクレオチドおよび弱酸の活性剤（例えば、テトラゾール）とのカップリング
により、モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）保護オリゴヌクレオチドを得る。ホス
ファイトの酸化の後に、ＭＭＴ基は、同じ酸試薬（例えば、ＴＣＡまたはＤＣＡ
）を用いてアミン基から除去され得、標識試薬とのカップリング反応のための反
応性一級アミン求核性を示す。このヘキシルリンカーは、他のより短い不活性な
リンカー（例えば、エチル）、またはより長いリンカー（例えば、ドデシル）に
容易に置換され得、これらのリンカーはまた、アリール基および他の官能基を含
む。あるいは、チオールまたはヒドロキシル求核性は、固体支持体に結合したオ
リゴヌクレオチド上の５’末端または他の部位に導入され得る。好ましいチオー
ル保護ホスホラミダイト試薬は、９および１０：

である。このような試薬を５’ヒドロキシル基に結合し、ホスフェートを酸化し
、そしてチオール保護基を除去し、反応性チオール求核試薬を得る。得られた固
体支持体に結合した５’連結求核性オリゴヌクレオチドは、は、以下：

にように示され得る。

標識化反応は、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の間で処理される：（ｉ）固体支持体
に結合したオリゴヌクレオチド（ここで、オリゴヌクレオチドは、反応性求核性
官能基（例えば、ＨＯ、ＨＮＲ、Ｈ₂Ｎ、またはＨＳ）を有する）、（ｉｉ）Ｃ
Ｏ₂Ｈ（カルボキシル）、ＳＯ₃Ｈ（スルホネート）、ＲＰＯ₃Ｈ（ホスホネート
）、またはＯＰＯ₃Ｈ（ホスフェート）官能基を有するラベル、（ｉｉｉ）カッ
プリング試薬、および（ｉｖ）溶媒または溶媒の混合物。この反応は、０〜１０
０℃の間、好ましくは約２０℃の周囲温度で処理され得る。

好ましいカップリング試薬としては、以下が挙げられる：ＨＡＴＵ（Ｏ−（７
−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウ
ロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−
１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホス
フェート）、ＴＢＴＵ（２（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１−１，
３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＦＦＨ（Ｎ
，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’ −テトラメチルウロニウム２−フルオロ−ヘキサフ
ルオロホスフェート）、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（
ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＢＯＰ（ベ
ンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキ
サフルオロホスフェート）、ＥＥＤＱ（２−エトキシ−１−エトキシカルボニル
−１，２−ジヒドロ−キノリン）、ＤＣＣ（ジクロロヘキシルカルボジイミド）
；ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＭＳＮＴ（１−（メシ
チレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール、お
よびアリールスルホニルハライド（例えば、トリイソプロピルベンゼンスルホニ
ルクロリド）。

これによって、標識官能性の先の活性化または個々の活性化（「プレ（ｐｒｅ
）活性化」）は、本発明の実施に必要ではない。例えば、本発明は、求核性オリ
ゴヌクレオチドとの反応のために、カルボキシル基のＮＨＳエステルの先の変換
を必要としない。

（ＶＩ．標識）
標識Ｌは、オリゴヌクレオチドまたは核酸アナログに共有結合した任意の部分
であり得る。

ラベルの好ましいクラスは、蛍光、化学発光、および電気化学発光（Ｋｒｉｃ
ｋａ，１９９２）によって標識されたオリゴヌクレオチドの検出のためのシグナ
ルを提供し得る、検出ラベルである。オリゴヌクレオチドをラベルするために有
用である蛍光色素としては、フルオレセイン（Ｍｅｎｃｈｅｎ，１９９３）、ロ
ーダミン（Ｂｅｒｇｏｔ，１９９４）、シアニン（Ｋｕｂｉｓｔａ，１９９７）
、およびポルフィリン金属錯体（Ｓｔａｎｔｏｎ，１９８８）が挙げられる。

フルオレセイン色素の例としては、以下が挙げられる：６−カルボキシフルオ
レセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン
（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（
ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシロ
ーダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−融合フェニ
ル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）、２’−クロ
ロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩ
Ｃ）、および（ＪＯＤＡ）（図３および４）。５−カルボキシル、および他の位
置異性体は、有用な検出特性を有し得る。１，４−ジクロロ置換基を有するフル
オレセイン色素およびローダミン色素が、特に好ましい。

標識の別の好ましいクラスは、消光部分を含む。消光部分の発光スペクトルは
、近接した分子内または分子間蛍光色素と重なり、その結果、蛍光色素の蛍光は
、実質的に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって減少するか、または
消光する。蛍光色素と消光部分の両方で分子内で標識されるオリゴヌクレオチド
は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、「Ｔａｑｍａｎ^TM」エキソ
ヌクレアーゼ切断ＰＣＲアッセイ（Ｌｉｖａｋ，１９９８；Ｌｉｖａｋ，１９９
６））において有用である。

特に好ましい消光物質としては、以下の（ｉ）および（ｉｉ）が挙げられるが
、これらに限定されない：（ｉ）テトラメチル−６−カルボキシローダミン（Ｔ
ＡＭＲＡ）、テトラプロパノ−６−カルボキシローダミン（ＲＯＸ）からなる群
から選択されるローダミン色素、および（ｉｉ）ＤＡＢＳＹＬ、ＤＡＢＣＹＬ、
ニトロチアゾールブルーを含むシアニン色素、アントラキノン、マラカイトグリ
ーン、ニトロチアゾール、およびニトロイミダゾールなど（図５）。

本発明のフルオレセイン（左）およびローダミン（右）誘導体は、以下の一般
構造および番号付け方式（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）：

を有し得、ここでＸは、リンカーであり、そして１以上の番号付けされた位置で
置換され得る。

シアニン標識は、以下の構造：

を有し得、ここで、Ｒ₁またはＲ₂は、Ｈ、低級アルキル、低級アルキレン、低級
置換アルキレン、フェニル、またはアリールであり；Ｚは、ＣＲ₁Ｒ₂、Ｓ、Ｏ、
ＮＨ、またはＮ−Ｒ₁であり、Ｒ₃は、ニトロ、ハロ、スルホネート、ヒドロキシ
、アミノ、低級アルキル、またはチオハロメチルであり、そしてｎ＝０〜２であ
る（Ｋｕｂｉｓｔａ，１９９７）。オリゴヌクレオチドを標識化するための結合
部位Ｘは、Ｒ₁、Ｒ₂、またはＲ₃であり得る。

エネルギー移動色素は、オリゴヌクレオチドラベルの好ましいクラスである。
エネルギー移動色素標識は、アクセプター色素に連結されるドナー色素を含む（
Ｌｅｅ，１９９８）。例えば、レーザーからの第一波長の光が、ドナー色素（例
えばＦＡＭ）によって吸収される。ドナー色素は、アクセプター色素によって吸
収された励起エネルギーを発光する。アクセプター色素は、ドナー色素の吸収最
大波長よりも約１００ｎｍ大きい発光最大波長の第二波長で蛍光を発する。

エネルギー移動ラベルのドナー色素およびアクセプター色素の部分は、ドナー
色素（例えば、ＦＡＭ）の４’または５’位置と、アクセプター色素の５−また
は６−カルボキシル基とを連結する、以下：

のようなリンカーによって結合され得る。

ポルフィリン金属錯体はまた、オリゴヌクレオチドラベルの好ましいクラスで
ある（Ｓｔａｎｔｏｎ、１９８８）。一例としては、以下：

に示される構造の、アルミニウムフタロシアニンテトラスルホネートである。

別の好ましい標識のクラスは、化学発光化合物を含む。特に好ましくは、以下
の構造：

を有する、１，２−ジオキサン化学発光部分（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ，１９９４；
Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ，１９９０）であり、ここで、Ｒ₁は、水素またはハロゲン
であり；Ｒ₂は、ホスフェート、ガラクトシド、グルコシド、グルクロニド、ト
リアルキルシリルオキシ、アシルオキシ、または水素であり；Ｒ₃は、メチル、
エチル、および低級アルキルであり、そしてＸは、オリゴヌクレオチドへのリン
カーである。親和性リガンドとしては、ビオチン、２，４−ジニトロフェニル、
ジゴキシゲニン、コレステロール、ポリエチレンオキシ、およびペプチドが挙げ
られる。

本明細書中で、ハイブリダイゼーション安定化部分として言及される、別の好
ましい標識のクラスとしては、小溝バインダー、挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔ
ｏｒ）、ポリカチオン（例えば、ポリリジンおよびスペルミン）、ならびに架橋
官能基が挙げられるが、これらに限定されない。ハイブリダイゼーション安定化
部分は、塩基対の安定性（すなわち、親和性）、またはハイブリダイゼーション
の速度を増加させ、このことは、二重鎖の高温融解温度Ｔ_mによって例示される
。ハイブリダイゼーション安定化部分は、塩基対の特異性を増加させるのに役に
立ち、このことは、完全に相補的なオリゴヌクレオチドと標的配列との間の大き
なＴ_mの違いによって例示され、得られた二重鎖は、一以上のワトソン／クリッ
ク塩基対の不整合を含む（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，１９９６）。好ましい小溝バイ
ンダーとしては、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＣＤＰＩ_1-3、ＭＧＢ１、ネト
ロプシン（ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ）、およびジスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｃｉ
ｎ）（図６）が挙げられる。小溝バインダーの例は、ＣＤＰＩ₃（Ｋｕｔｙａｖ
ｉｎ，１９９６；Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ，１９９５）であり、これは、以下の構造
：

を有し、ここで、Ｘは、リンカーまたはオリゴヌクレオチドの標識化のための結
合部位である。オリゴヌクレオチドに標識化された場合、小溝バインダーは、い
くつかのまたは実質的にほとんどの標的配列に対するハイブリダイゼーションの
親和性および特異性を増加させ得る（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，１９９６，３３７〜
４６頁）。

（ＶＩＩ．核酸アナログ）
オリゴヌクレオチドは、核酸塩基、糖、および／またはヌクレオチド間の部分
に対する改変体を有する、種々の核酸アナログを含み得る。

好ましい核酸塩基アナログ改変体としては、以下が上げられるが、これらに限
定されない：Ｃ−５−アルキルピリミジン、２−チオピリミジン、２，６−ジア
ミノプリン、Ｃ−５−プロピンピリミジン、フェノキサジン（Ｆｌａｎａｇａｎ
，１９９９）、７−デアザプリン、イソシチジン、偽イソシチジン、イソグアノ
シン、４（３Ｈ）−ピリミドン、ヒポキサンチン、８−オキソプリンおよび普遍
塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）（Ｍｅｙｅｒ，１９９４）。

１以上のヌクレオシドにおいて、好ましい糖アナログ改変体としては、２’−
または３’−改変体が挙げられるが、これらに限定されない。ここで、２’−ま
たは３’−位置は、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アルキルオキシ、
イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェ
ノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロ、およびブロモで
ある。

他の好ましい糖アナログ改変としては、４’−α−アノマーヌクレオチド、１
’−α−アノマーヌクレオチド、２’−分枝基−リボヌクレオチド、および２’
−Ｏ−分枝基−リボヌクレオチドが挙げられる。以下の構造は、いくつかの好ま
しい２’−糖改変を示す。

１つ以上のヌクレオチドの間の好ましいヌクレオチド間アナログとしては、以
下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）ヌクレオチド間連結の酸素の
、硫黄、炭素、または窒素による置換、および（ｉｉ）硫黄、カルボキシレート
、およびアミンの、ヌクレオチド間ホスホジエステル連結。他の好ましいヌクレ
オチド間アナログとしては：２−アミノエチルグリシン（ＰＮＡ）、２’−５’
−連結、逆転した３’−３’連結、逆転した５’−５’連結、ホスホロチオエー
ト、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、非架橋Ｎ−置換ホスホラミデ
ート、アルキル化ホスホチオエステルの分枝構造、および３’−Ｎ−ホスホラミ
デートが挙げられる。

本発明の特に好ましいアナログは、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）オリゴマーであ
り、ここで、天然のホスホジエステル−デオキシリボース骨格は、Ｎ−（２−ア
ミノエチル）−グリシン（ペプチド様ユニット）で置換されている（Ｎｉｅｌｓ
ｅｎ、１９９１）。ＰＮＡオリゴマーは、Ｗａｔｓｏｎ／Ｃｒｉｃｋ塩基対形成
によって、プローブのクランプ特異的部分の相補的配列と、塩基対形成し得る。
ＰＮＡおよびＰＮＡ／ＤＮＡキメラは、市販の自動化合成機で、市販の試薬を用
いて、従来の方法を使用して合成され得る（Ｄｕｅｈｏｌｍ、１９９４；Ｖｉｎ
ａｙａｋ、１９９７；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｌａａｎ、１９９７）。

（ＶＩＩＩ．支持体からの標識オリゴ体の切断および脱保護）
合成後に、オリゴヌクレオチドは、固体支持体から除かれ得るか、または切断
反応によって固体支持体から除去もしくは分離され得る。固体支持体からオリゴ
ヌクレオチドを除くことが望ましい。なぜなら、いくつかの核酸ハイブリダイゼ
ーションアッセイは、固体支持体（例えば、非多孔質表面、平坦な表面のアレイ
、埋包またはカプセル化された粒子、あるいは水性媒体中に懸濁した粗い粒子の
構成のもの）に共有結合したオリゴヌクレオチドを使用するからである。

オリゴヌクレオチドは、塩基（例えば、水酸化アンモニウム、ｔｅｒｔ−ブチ
ルアミン、メチルアミン、エチルアミン、炭酸カリウム、または水酸化ナトリウ
ム）を使用して、支持体から切断され得る。切断および脱保護に適した溶液は、
メタノール：ｔｅｒｔ−ブチルアミン：水（１：１：２、ｖ：ｖ：ｖ）の混合物
である（Ｗｏｏ、１９９３）。切断溶液はまた、オリゴヌクレオチド含有溶液を
高温（例えば、５５〜８５℃）で１〜１６時間の間加熱する際に、リン酸保護基
（例えば、シアノエチル）、および核酸塩基の環外アミン上の保護基を除去する
。

別の好ましい切断方法は、ジスルフィドリンカーＡの、還元的切断または酸化
的切断であり、ここでＡは、以下：
−（ＣＨ₂）_n−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）_n−
であり、ここでｎは、１〜１２である。好ましい切断試薬は、ジチオトレイトー
ル（ＤＴＴ）である。

別の好ましい切断方法は、シリルエーテル連結Ａのフッ化物イオン切断であり
、ここでＡは、以下：

であり、ここでＲは、１〜２０個の炭素原子の低級アルキルである。好ましい切
断試薬としては、テトラブチルアンモニウムフルオリドおよびフッ化水素／トリ
エチルアミンが挙げられる。

（ＩＸ．実施例）
本発明は、以下の実施例を考慮することによって、さらに明らかとなる。この
実施例は、本発明の純粋な例示であることを意図され、そして本発明の範囲をい
かなる様式においても限定しないことを意図される。

（実施例１． ポリスチレン支持体−リンカー−ＴＡＭＲＡ６の合成）
無水ジグリコール酸（６４ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）の、ＣＨ₂Ｃｌ₂（５ｍｌ
）中の溶液を、Ｅｔ₃Ｎ（６７ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノ
ピリジン（３４ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）および化合物１（４００ｍｇ、０．５
５ｍｍｏｌ）のＣＨ₂Ｃｌ₂（１５ｍｌ）中の混合物に、０℃、アルゴン下で添加
した（図２）。この添加の終了後（１０分）に、氷浴を取り除き、そして反応混
合物を室温で１時間撹拌した。この反応混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂（３０ｍｌ）で希釈
し、そして５％水性クエン酸（１×５０ｍｌ）および飽和ブライン（２×５０ｍ
ｌ）で洗浄した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、そしてエバポレートして、泡
状物を得た。この生成物を、ＣＨＣｌ₃−ＥｔＯＨグラジエント（２〜１０％Ｅ
ｔＯＨ）で溶出してシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで精製した。適切な
画分を合わせ、そしてエバポレートして、化合物２を無色の泡状物として得た（
２６０ｍｇ、５６％）。¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）ｄ：１．２０（ｍ，２Ｈ）、
１．３９（ｍ，２Ｈ）、１．５８（ｍ，２Ｈ）、２．１８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ
，２Ｈ）、２．９０〜３．２５（ｍ，４Ｈ）、３．８０（ｓ，６Ｈ）、３．８６
（ｓ，４Ｈ）、４．００〜４．４０（ｍ，６Ｈ）、４．８５（分離されないｔ，
１Ｈ）、５．９２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）、６．７５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈ
ｚ，４Ｈ）、７．２０〜７．４０（ｍ，１３Ｈ）、７．５２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈ
ｚ，２Ｈ）、７．６９（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）。

高度に架橋したポリスチレン３（１０００Å、１０μｍｏｌ／ｇアミン負荷、
１ｇ、１０μｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の化合物２（１７ｍｇ、２０μ
ｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３ｍｇ、２０μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（８ｍｇ、２０μｍｏ
ｌ）、およびジイソプロピルエチルアミン（８ｍｇ、６０μｍｏｌ）で、ｗｉｒ
ｓｔ作動振盪機で４時間、室温で処理し、４を得た。支持体を、ＤＭＦ（３×１
０ｍｌ）、ＣＨ₃ＣＮ（２×１０ｍｌ）およびＣＨ₂Ｃｌ₂（１×１０ｍｌ）で洗
浄し、そして高減圧下で一晩乾燥した。ニンヒドリンアッセイは、支持体に残っ
た０．５μｍｏｌ／ｇのアミンを示した。支持体を、ＴＨＦ（１０％溶液、５ｍ
ｌ）中の無水酢酸／ルチジンおよびＴＨＦ（１６％溶液、５ｍＬ）中の１−メチ
ルイミダゾールで２時間室温でキャップした。支持体４をＣＨ₃ＣＮ（３×１０
ｍｌ）およびＣＨ₂Ｃｌ₂（１×１０ｍｌ）で洗浄した。トリチルカチオンアッセ
イは、ポリスチレン支持体上の化合物２の９．２μｍｏｌ／ｇ負荷を与えた。支
持体４を、ＤＭＦ（３×１０ｍｌ、各洗浄１０分）中の２０％ピペリジンで処理
して、Ｆｍｏｃ保護基を除去して支持体５を与え、これをＤＭＦ（３×１０ｍｌ
）、ＣＨ₃ＣＮ（２×１０ｍｌ）、およびＣＨ₂Ｃｌ₂（１×１０ｍｌ）で洗浄し
、そして減圧下で一晩乾燥した。支持体５（１ｇ、９．２μｍｏｌ）を、ＤＭＦ
（１０ｍＬ）中のＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステル（１５ｍｇ、２８．５μｍｏｌ）
およびＥｔ₃Ｎ（８．６ｍｇ、８５μｍｏｌ）で、室温で３６時間、振盪機上で
処理し、支持体６（Ｌ＝ＴＡＭＲＡ）を得た。この支持体を、ＤＭＦ（３×１０
ｍｌ）、ＣＨ₃ＣＮ（２×１０ｍｌ）およびＣＨ₂Ｃｌ₂（１×１０ｍｌ）で洗浄
し、そして高減圧下で２４時間乾燥した。ニンヒドリン試験は、支持体上に残っ
た０．５μｍｏｌ／ｇ未満のアミンを示した。この支持体を、ＴＨＦ（１０％溶
液、５ｍｌ）中の無水酢酸／ルチジンおよびＴＨＦ（１６％溶液、５ｍｌ）中の
１−メチルイミダゾールで１時間キャップし、次いでＣＨ₃ＣＮ（３×１０ｍｌ
）、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２×１０ｍｌ）で洗浄し、そして高減圧下で２４時間乾燥した
。トリチルカーボンアッセイは、ポリスチレン支持体−リンカー−ＴＡＭＲＡ６
について、８．８μｍｏｌ／ｇの最終負荷を示した。

（実施例２． 標識支持体６上のＦＡＭ−Ｍ１３−２１プライマーの合成）
（ＦＡＭ−Ｍ１３−２１プライマーの合成）
５’ＦＡＭ−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’ 配列番号１
を、ＡＢＩ ３９６ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ
．）で、０．２μモルスケールで、ＦＡＭ標識したポリスチレン支持体６（図２
、Ｌ＝６−カルボキシフルオレセインＦＡＭ、Ｓ＝ポリスチレン）を用いて構築
した。標準的な０．２μｍｏｌ ＣＥサイクルを、全ての５’−ホスホラミダイ
ト、３’−ＤＭＴホスホラミダイトヌクレオシド７（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ）のカップリングについて２５秒から９０秒へとカップリング時間を増加させ
ることによって、改変した。５’→３’の方向の合成が完了した後に、ＦＡＭ−
Ｍ１３−２１プライマーを切断し、そしてＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ₂：Ｈ₂Ｏ（１
：１：２）中６５℃で３時間脱保護した。このプライマーを、従来の手段（すな
わち、アニオン交換ＨＰＬＣ）によって分析し、そしてＤＮＡ配列決定において
使用した。

（実施例３． 固体支持体上のアミノ−２０７ａｖ １８マーオリゴヌクレオ
チドの、ＴＡＭＲＡ−ＣＯ₂Ｈでの標識）
５’ＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＡＴＣＴＣＧＡＴ３’の合成を、ＡＢＩ ３９４
ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ．）で、０．２μモル
スケールで、非標識ポリスチレン支持体を用いて３’→５’の方向で、５’−Ｄ
ＭＴ、３’−ホスホラミダイトヌクレオシド（Ａ^bz、Ｇ^dmf、Ｃ^bz、Ｔ）を用い
て実施した。アミノリンカーホスホラミダイト試薬８（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ）を、最終モノマーとしてカップリングし、そしてＣＨ₂Ｃｌ₂中の３％トリ
クロロ酢酸で脱トリチル化した。５’−アミノ−２０７ａｖオリゴヌクレオチド
を保有する合成カラムを、合成機から取り外した。２つのルアーチップ型１ｍｌ
シリンジを、この合成カラムの各端部に取り付けた。１つのシリンジを、５００
μｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１０．７ｍｇ（２５μモル）の
ＴＡＭＲＡ−ＣＯ₂Ｈで満たした。第二のシリンジを、２５０μｌの１：１のＤ
ＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ中の９．２５ｍｇ（２５μモル）のＨＢＴＵおよび９μｌ（５
０μモル）のジイソプロピルエチルアミンで満たした。これらのシリンジ内のカ
ップリング剤を、各プランジャーを連続的に押下することによって、カラムを通
過させた。約１分間、徹底的に混合した後に、このアセンブリを約１５分間静置
し、カップリング反応を進行させた。試薬を１つのシリンジに引き込み、そして
処分した。この合成カラムを５ｍｌの１：１のＤＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ、５ｍｌのＣ
Ｈ₃ＣＮで洗浄し、そして１ｍｌのＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ₂：Ｈ₂Ｏ（１：１：
２）で処理して、ＴＡＭＲＡ−Ｎ−２０７ａｖ：
５’ＴＡＭＲＡ−Ｎ−ＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＡＴＣＴＣＧＡＴ３’ 配列
番号２
を支持体から切断した。ＴＡＭＲＡ−Ｎ−２０７ａｖを含有する上清を加熱し、
そして６５℃で３時間脱保護して、全ての保護基を除去した。ＴＡＭＲＡ−Ｎ−
２０７ａｖを、逆相ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析し
、これらで均一な純度および同一性を確認した。

（実施例４． チオール−オリゴヌクレオチドのＣＤＰＩ３−ＣＯ₂Ｈでの標
識化）
５’ＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＡＴＣＴＣＧＡＴ３’の合成を、ＡＢＩ ３９４
ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ．）で、０．２μモル
スケールで、非標識ポリスチレンを用いて３’→５’の方向で、５’−ＤＭＴ、
３’−ホスホラミダイトヌクレオシド（Ａ^bz、Ｇ^dmf、Ｃ^bz、Ｔ）を用いて実施
する。チオールリンカーホスホラミダイト試薬１０を、最終モノマーとしてカッ
プリングし、そしてＤＭＦ中の硝酸銀で脱トリチル化する。５’−チオール−２
０７ａｖオリゴヌクレオチドを保有する合成カラムを、合成機から取り外す。２
つのルアーチップ型１ｍｌシリンジを、この合成カラムの各端部に取り付ける。
１つのシリンジを、５００μｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１５
ｍｇ（２５μモル）のＣＤＰＩ₃−ＣＯ₂Ｈ（図６、Ｘ＝ＯＨ）で満たす。第二の
シリンジを、２５０μｌの１：１のＤＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ中の９．２５ｍｇ（２５
μモル）のＨＢＴＵおよび９μｌ（５０μモル）のジイソプロピルエチルアミン
で満たす。これらのシリンジ内のカップリング剤を、各プランジャーを連続的に
押下することによって、カラムを通過させる。約１分間、徹底的に混合した後に
、このアセンブリを約１５分間静置し、カップリング反応を進行させる。試薬を
１つのシリンジに引き込み、そして処分する。この合成カラムを５ｍｌの１：１
のＤＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ、５ｍｌのＣＨ₃ＣＮで洗浄し、そして１ｍｌのＭｅＯＨ：
ｔ−ＢｕＮＨ₂：Ｈ₂Ｏ（１：１：２）で処理して、ＣＤＰＩ₃−Ｓ−２０７ａｖ
：
５’ＣＤＰＩ₃−Ｓ−ＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＡＴＣＴＣＧＡＴ３’ 配列
番号３
を支持体から切断する。ＣＤＰＩ₃−Ｎ−２０７ａｖを含有する上清を加熱し、
そして６５℃で３時間脱保護して、全ての保護基を除去した。ＣＤＰＩ₃−Ｓ−
２０７ａｖを、逆相ＨＰＬＣによって分析し、均一な純度を確認した。ＭＡＬＤ
Ｉ−ＴＯＦ質量分析による分析は、同一性を確認した。

（実施例５． 固体支持体上の５’アミノ−ＳＧ１オリゴヌクレオチドの、Ｎ
ＴＢ−ＣＯ₂Ｈでの標識）
５’ＡＴＧＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧＴ３’の合成を、
ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ．）
で、０．２μモルスケールで、非標識ポリスチレン支持体を用いて３’→５’の
方向で、５’−ＤＭＴ、３’−ホスホラミダイトヌクレオシド（Ａ^bz、Ｇ^dmf、
Ｃ^bz、Ｔ）を用いて実施した。アミノ−リンカーホスホラミダイト試薬８（Ｇｌ
ｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、最終モノマーとしてカップリングし、そしてＣＨ
₂Ｃｌ₂中の３％トリクロロ酢酸で脱トリチル化した。５’−アミノ−ＳＧ１オリ
ゴヌクレオチドを保有する合成カラムを、合成機から取り外した。２つのルアー
チップ型１ｍｌシリンジを、この合成カラムの各端部に取り付けた。１つのシリ
ンジを、５００μｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１１ｍｇ（２５
μモル）のＮＴＢ−ＣＯ₂Ｈで満たした。第二のシリンジを、２５０μｌの１：
１のＤＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ中の９．２５ｍｇ（２５μモル）のＨＢＴＵおよび９μ
ｌ（５０μモル）のジイソプロピルエチルアミンで満たした。これらのシリンジ
内のカップリング剤を、各プランジャーを連続的に押下することによって、カラ
ムを通過させた。約１分間、徹底的に混合した後に、このアセンブリを約１５分
間静置し、カップリング反応を進行させた。試薬を１つのシリンジに引き込み、
そして処分した。この合成カラムを５ｍｌの１：１のＤＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ、５ｍ
ｌのＣＨ₃ＣＮで洗浄し、そして１ｍｌのＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ₂：Ｈ₂Ｏ（１
：１：２）で処理して、ＮＴＢ−Ｎ−ＳＧ１：
５’ＮＴＢ−Ｎ−ＡＴＧＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧＴ
３’ 配列番号４
を支持体から切断した。ＮＴＢ−ＳＧ１を含有する上清を加熱し、そして６５℃
で３時間脱保護して、全ての保護基を除去した。ＮＴＢ−ＳＧ１を、逆相ＨＰＬ
Ｃによって分析し、均一な純度を確認した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による
分析は、８３９０．２７の分子量を与え、これは同一性を確認した。

（実施例６． 固体支持体上のＳＧ１の、ＮＴＢ−ホスフェートおよびＭＳＮ
Ｔでの標識）
５’ＡＴＧＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧＴ３’の合成を、
ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ．）
で、０．２μモルスケールで、非標識ポリスチレンを用いて３’→５’の方向で
、５’−ＤＭＴ、３’−ホスホラミダイトヌクレオシド（Ａ^bz、Ｇ^dmf、Ｃ^bz、
Ｔ）を用いて実施した。５’末端ヒドロキシル基を、ＣＨ₂Ｃｌ₂中の３％トリク
ロロ酢酸で脱トリチル化した。５’−ヒドロキシル−ＳＧ１オリゴヌクレオチド
を保有する合成カラムを、合成機から取り外した。２つのルアーチップ型１ｍｌ
シリンジを、この合成カラムの各端部に取り付けた。１つのシリンジを、５００
μｌの乾燥ＤＭＦ中の１２ｍｇ（２５μモル）のＮＴＢ−リン酸で満たした。第
二のシリンジを、２５０μｌのＤＭＦ中の７．５ｍｇ（２５μモル）のＭＳＮＴ
および９μｌ（５０μモル）のジイソプロピルエチルアミンで満たした。これら
のシリンジ内のカップリング剤を、各プランジャーを連続的に押下することによ
って、カラムを通過させた。約１分間、徹底的に混合した後に、このアセンブリ
を約６０分間静置し、カップリング反応を進行させた。試薬を１つのシリンジに
引き込み、そして処分した。この合成カラムを５ｍｌの１：１のＤＭＦ：ＣＨ₃
ＣＮ、５ｍｌのＣＨ₃ＣＮで洗浄し、そして１ｍｌのＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ₂：
Ｈ₂Ｏ（１：１：２）で処理して、ＮＴＢ−Ｐ−ＳＧ１：
５’ＮＴＢ−Ｐ−ＡＴＧＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧＴ
３’ 配列番号５
を支持体から切断した。ＮＴＢ−Ｐ−ＳＧ１を含有する上清を加熱し、そして６
５℃で３時間脱保護して、全ての保護基を除去した。ＮＴＢ−Ｐ−ＳＧ１を、逆
相ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析し、これらで均一な
純度および同一性を確認した。

（実施例７． 固体支持体上のＰＮＡの、ＭＧＢ１での標識化）
ＰＮＡおよびＰＮＡ／ＤＮＡキメラの自動化合成を、ＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ３
９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機または４３３Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ Ｃｏ．）を使用して、合成機の製造業者の使用者の手引き、ならびに
Ｅｇｈｏｌｍ、１９９３に記載される一般的手順に従って、実施した。

ＰＮＡを、２〜５μモルスケールで、ＭＢＨＡ（メチルベンズヒドリルアミン
）リンカー、高負荷ポリスチレン支持体上で、そして標準的な合成技術ならびに
核酸塩基（Ａ^bz、Ｇ^bz、Ｃ^ibu、Ｔ）および第一級アミノ（ＭＭＴ、Ｆｍｏｃま
たはＢｏｃ）保護基を用いて、本質的に以前に報告されたように（Ｄｕｅｈｏｌ
ｍ、１９９４）、合成した。５μモルスケールにおいて３ｍｌの反応容器を使用
し、全反応容量は４４０ｍｌである。

ＰＮＡを、ＭＢＨＡ固体支持体上のカルボキシ末端リジンで、ｔ−Ｂｏｃ−ｌ
ｙｓ（Ｆｍｏｃ）で予備付加することにより、調製した。カルボキシ末端アミド
を有するＰＮＡを、ＭＢＨＡ支持体上で直接か、またはｔ−Ｂｏｃ Ｔ ＰＮＡ
モノマーで予備負荷されたＭＢＨＡ支持体上でのいずれかで、合成した。全ての
樹脂を、０．１〜０．２５ｍモル／ｇに負荷した。スペーサーであるＯ，２−（
２−アミノエトキシ）酢酸が、Ｆｍｏｃでアミノ保護されたシントンとして、カ
ップリングされ得る。１つ以上のスペーサーＯユニットが、ＰＮＡ配列における
可撓性の非塩基対形成ヒンジ領域として働く。

ＰＮＡ／ＤＮＡキメラ合成のために使用する支持体は、ヒドロキシメチル安息
香酸リンカーを有する、非膨潤性の高架橋ポリスチレンビーズである（Ｖｉｎａ
ｙａｋ、１９９７）。キメラ合成のためのＰＮＡモノマーは、第一級アミノ保護
のためにＭＭＴ基を使用する。第一工程において、各々ＤＭＦ／ＣＨ₃ＣＮ、１
／１に溶解したモノマーＨＡＴＵおよびＤＩＰＥＡを、反応カートリッジに連続
的に送達する、１６分後、キャッピング試薬を送達する。ＰＮＡの第一級アミノ
官能基が移動または環化する傾向を最小化するために、最後のＭＭＴ基の除去の
後に、そのアミノ末端をアセチル化する。ＤＮＡ部分およびＰＮＡ部分を連結す
るための試薬、ならびにキメラ合成、切断、脱保護、および精製のための他の手
順は、記載された（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｌａａｎ、１９９７）。このアプローチに
おいて、キメラを単一のカートリッジ内および単一の合成機において、連続的に
作製し得る。

固体支持体上のＰＮＡオリゴマーＨ₂Ｎ−ＴＣＣＴＣＣＴＴ（１μモル）を、
上記手順により合成した。ポリスチレン支持体上のＰＮＡを、ＭＧＢ１−ＣＯ₂
Ｈ（５ｍｇ、１０μモル、図６、Ｇｏｎｇ、１９９７）、ＨＡＴＵ（１０μモル
）、５μｌ ＤＩＥＡおよび１００μｌ ＤＭＦの混合物と反応させ、そして室
温で１時間静置した。次いで、この支持体をＤＭＦおよびＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄し、
室温で１時間ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）で切断し、そしてエ
ーテル中で沈殿させて、ＭＧＢ１−ＰＮＡを得た：
ＭＧＢ１−ＴＣＣＴＣＣＴＴ 配列番号６
ＭＧＢ１−ＰＮＡを、逆相ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分
析し、均一な純度および同一性を確認した。

（実施例８． 固体支持体上のＰＮＡの、ＣＤＰＩ₃での標識化）
実施例９と同じ手順および試薬によって、Ｆｍｏｃ−ＣＤＰＩの３つの連続的
なカップリング（図６、Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ、１９９５）で、ＣＤＰＩ₃をＰＮ
Ａ Ｈ₂Ｎ−ＴＣＣＴＣＣＴＴに結合させ、ＣＤＰＩ₃標識化ＰＮＡを得た。Ｆｍ
ｏｃで保護したＣＤＰＩモノマーユニット１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ
［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレート（５ｍｇ、０．０１２ｍｍｏ
ｌｅ）を、１００μｌ ＮＭＰに溶解し、そして０．９５当量のＨＡＴＵ（ＤＭ
Ｆ中０．２Ｍ）および２当量のＤＩＥＡ（ＤＭＦ中０．４ｍ）で活性化した。室
温で１時間後、活性化したＦｍｏｃ−ＣＤＰＩ溶液を、支持体に結合したＰＮＡ
に添加し、そして室温でさらに１時間、カップリングさせた。このカップリング
に続いて、この支持体を２０ｍｌのＤＭＦで洗浄した。この樹脂支持体を１：４
のピペリジン：ＤＭＦで室温で１０分間処理することによって、Ｆｍｏｃを除去
した。このカップリングおよび脱保護のサイクルを、さらに２回繰り返し、合計
で３つの手動カップリングとした。次いで、この支持体をＤＭＦおよびＣＨ₂Ｃ
ｌ₂で洗浄し、続いてＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）を用いて室
温で１時間切断し、続いて粗製ＣＤＰＩ₃−ＰＮＡをエーテルで沈殿させた：
ＣＤＰＩ₃−ＴＣＣＴＣＣＴＴ 配列番号７
ＣＤＰＩ₃−ＰＮＡを、逆相ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により
分析し、均一な純度および同一性を確認した。

（実施例９． Ｔａｑｍａｎ自己クエンチプローブの標識化支持体６上への標
識化）
オリゴヌクレオチド５’ＦＡＭ−ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＧＴ３
’を、ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機で、０．２μモルスケールで、Ｆ
ＡＭ標識したポリスチレン支持体６（図２、Ｌ＝６−カルボキシフルオレセイン
ＦＡＭ、Ｓ＝ポリスチレン）を用いて合成した。標準的な０．２μｍｏｌ ＣＥ
サイクルを、全ての５’−ホスホラミダイト、３’−ＤＭＴホスホラミダイトヌ
クレオシド（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のカップリングについて２５秒から
９０秒へとカップリング時間を増加させることによって、改変した。５’→３’
の方向の合成の完了後に、アミノ−リンカーホスホラミダイト試薬８（Ｇｌｅｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、最終モノマーとして３’末端にカップリングし、そし
てＣＨ₂Ｃｌ₂中３％トリクロロ酢酸で脱トリチル化した。固体支持体上に３’−
アミノ，５’−ＦＡＭオリゴヌクレオチドを保有する合成カラムを、合成機から
取り外した。２つのルアーチップ型１ｍｌシリンジを、この合成カラムの各端部
に取り付けた。１つのシリンジを、５００μｌの乾燥ジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）中の１０．７ｍｇ（２５μモル）のＴＡＭＲＡ−ＣＯ₂Ｈで満たした。第
二のシリンジを、２５０μｌの１：１のＤＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ中の９．２５ｍｇ（
２５μモル）のＨＢＴＵおよび９μｌ（５０μモル）のジイソプロピルエチルア
ミンで満たした。これらのシリンジ内のカップリング剤を、各プランジャーを連
続的に押下することによって、カラムを通過させた。約１分間、徹底的に混合し
た後に、このアセンブリを約１５分間静置し、カップリング反応を進行させた。
試薬を１つのシリンジに引き込み、そして処分した。この合成カラムを５ｍｌの
１：１のＤＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ、５ｍｌのＣＨ₃ＣＮで洗浄し、そして１ｍｌのＭｅ
ＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ₂：Ｈ₂Ｏ（１：１：２）で処理して、５’−ＦＡＭ，３’−
Ｎ−ＴＡＭＲＡ Ｔａｑｍａｎ自己クエンチプローブ：
５’ＦＡＭ−ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＧＴ−Ｎ−ＴＡＭＲＡ３
’ 配列番号８
を支持体から切断した。このプローブを含有する上清を加熱し、そして６５℃で
３時間脱保護して、全ての保護基を除去した。このプローブを、逆相ＨＰＬＣお
よびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析し、均一な純度および同一性を確
認した。

全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が、具体的か
つ個々に本明細書中に参考として援用されることが示されたと同程度まで、本明
細書中に参考として援用される。

ほんの数個の実施形態が上に詳細に記載されたが、分子生物学および化学の分
野の当業者は、本開示の教示から逸脱することなく、好ましい実施形態において
多数の変更が可能であることを、明白に理解する。全てのこのような変更は、上
記の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

図１は、５’末端において標識化支持体に結合されるオリゴヌクレオチドを示す。 図２は、支持体−リンカー−標識試薬への合成経路１〜６を示す。 図３は、蛍光色素標識：ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＮＥＤ、ＶＩＣを示す。 図４は、蛍光色素標識：ｄＪＯＮ、ｄＲ１３９、ＪＯＤＡおよびエネルギー移動ドナーＦＡＭを示す。 図５は、蛍光消光剤標識：ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、ＮＴＢを示す。 図６は、小溝バインダー標識：ＭＧＢ１、ＣＤＰＩモノマー、ＣＤＰＩ₃を示す。 図７は、支持体上の５’−アミノヘキシルオリゴヌクレオチドへのＨＢＴＵカップリング試薬を用いるＴＡＭＲＡ標識化試薬のカップリングを示す。

Claims (1)

1. 本願明細書等に記載されるような、固体支持体上での標識化オリゴヌクレオチドおよびアナログ合成のための方法。

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