JP4634615B2 - 固体支持体上での標識化オリゴヌクレオチドおよびアナログの合成のための方法および組成物 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に核酸化学の分野、および特に固体支持体上のオリゴヌクレオチドを標識するための方法および組成物に関する。標識試薬としては、ハイブリダイゼーション−安定化部分、蛍光色素、蛍光消光剤、エネルギー移動色素のセット、化学発光色素、金属ポルフィリン、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、酵素およびアフィニティーリガンドが挙げられる。
【０００２】
（参考文献）
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【０００３】
（背景）
非同位体標識オリゴヌクレオチドは、多くの重要な分子生物学の適用（例えば、ＰＣＲ増幅、ＤＮＡ配列決定、遺伝子発現のアンチセンス転写および翻訳制御、遺伝分析ならびにＤＮＡプローブベースの診断試験（Ｋｅｌｌｅｒ，１９９３；Ｋｒｉｃｋａ，１９９２）において不可欠の部分である。蛍光色素標識オリゴヌクレオチドの蛍光検出は、核酸配列検出アッセイ（例えば、Ｔａｑｍａｎ^TM（Ｌｉｖａｋ，１９９６）、分子標識（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）（Ｔｙａｇｉ，１９９６）、遺伝的連鎖マッピング（Ｄｉｂ，１９９６）、およびオリゴヌクレオチド連結アッセイ（Ｇｒｏｓｓｍａｎ，１９９４））の基礎である。
【０００４】
合成オリゴヌクレオチドを標識化するための２つの一般的な方法が、確立されている。第１の方法（本明細書中では「２段階溶液標識化法」といわれる）において、求核的官能基（例えば、１級脂肪族アミン）が、オリゴヌクレオチド上の標識化結合部位（例えば、５’末端）に導入される。自動化固体支持体合成が完了した後、このオリゴヌクレオチドは支持体から切断され、そして全ての保護基は除去される。求核剤−オリゴヌクレオチドを、均一溶媒条件下で、求電子性部分を含む過剰の標識試薬（例えば、イソチオシアネートまたは活性化エステル（例えば、ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）））と反応させる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６；Ａｎｄｒｕｓ，１９９５）。
【０００５】
第２の代替の方法（本明細書中では直接標識化法」といわれる）において、標識は、合成の間、または前に、直接オリゴヌクレオチドに組み込まれる（Ｍｕｌｌａｈ，１９９８；Ｎｅｌｓｏｎ，１９９２）。直接標識化法は、以下のような理由で望ましい。（ｉ）合成後の反応工程を必要とせず、それにより標識化ポリヌクレオチドの合成を簡単にし、そして（ｉｉ）２段階溶液標識化法で代表的に遭遇する低反応収率（＜６０％）に関連する問題を避ける。この問題とは、すなわち：（ａ）過剰の標識からの標識化オリゴヌクレオチドの精製；（ｂ）非標識化オリゴヌクレオチドからの標識化オリゴヌクレオチドの精製；（ｃ）低生成物収率ならびに面倒な分析および精製手順に起因する高い費用、ならびに；（ｄ）合成の間の求核的官能基の付加逆的なキャッピングである。
【０００６】
特定の蛍光色素および他の標識は、５’標識化のためのホスホラミダイト試薬として官能化されてきた（Ｔｈｅｉｓｅｎ，１９９２）。しかし、いくつかの標識（例えば、ジゴキシゲニン、ローダミン色素、およびシアニン色素）は、不安定過ぎて、過酷な条件ならびに試薬調製およびオリゴヌクレオチドの合成、切断および脱保護において使用される試薬に、耐えることができない。従って、このような標識が現在の固相合成プロトコルにおいて使用される場合にはかならず、あまり好ましくない２段階溶液標識化法を使用して結合されなければならない。
【０００７】
従って、オリゴヌクレオチドおよびアナログを、それらが合成される固体支持体上に直接、迅速で、経済的、かつ化学的に不安定な官能基に適合する条件下で標識化するための、方法および試薬を提供することが所望される。
【０００８】
（要旨）
本発明は、固体支持体上の標識化オリゴヌクレオチドの合成のための新規な方法および組成物に関する。
【０００９】
第１の局面では、本発明は、以下の構造
【００１０】
【化８】

を有する標識化固体支持体上の標識化オリゴヌクレオチドの合成のための方法を包含し、
ここでＳは固体支持体であり、Ａは切断可能なリンカーであり、Ｘは３以上の結合部位を有する部分であり、Ｌは標識であり、Ｙは求核剤（すなわち、Ｏ、ＮＨ、ＮＲまたはＳ）そしてＰ₁は酸で切断可能な保護基である。標識化固体支持体は、（１）ＹからＰ₁を除去するための試薬、（２）Ｙを５’−ホスホラミダイト（３’保護ヌクレオシド）の５’位とカップリングさせるための試薬、（３）支持体上の任意の未反応部位（例えば、Ｙ）を必要に応じてキャップするための試薬、および（４）任意のホスファイト連結を酸化するための試薬を用いて、循環様式で反応される。これらの４つの工程は、標識化されたオリゴヌクレオチド全体が合成されるまで繰り返される。
【００１１】
合成が完了した後、標識化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間ホスフェートおよび核酸塩基上の保護基は、このオリゴヌクレオチドを固体支持体上に残したまま脱保護によって除去され得る。あるいは、合成が完了した後、標識化オリゴヌクレオチドは、固体支持体から切断され得、次いで脱保護され得る。
【００１２】
第２の局面では、本発明は、以下の構造
【００１３】
【化９】

を有する固体支持体に結合されるヌクレオシドを包含し、
ここでＳ、Ａ、Ｘ、ＬおよびＹは、上記に規定されるとおりであり、Ｒはホスフェート保護基またはホスホトリエステル置換基であり；Ｂは核酸塩基であり；Ｐ₂は環外窒素保護基であり；そしてＰ₃は酸に不安定な保護基である。
【００１４】
第３の局面において、本発明は、以下の構造
【００１５】
【化１０】

を有する固体支持体に結合されるオリゴヌクレオチドを含み、
ここで変更し得る置換基は上記で規定されるとおりであり、そしてｎは好ましくは約０〜１００の整数である。
【００１６】
第４の局面において、本発明は、
（ｉ）求電子剤に変換され得る官能基を有する標識試薬（例えば、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸またはリン酸）を反応させる工程、
（ｉｉ）固体支持体上のオリゴヌクレオチドを求核的官能基（例えば、アルコール、アミン、またはチオール）と反応させる工程、および
（ｉｉｉ）カップリング試薬を反応させる工程であって、これによりエステル、アミド、チオエステル、スルホンアミド、スルホネート、ホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロチオエート、またはリン酸結合が形成される工程により、標識化オリゴヌクレオチドを合成するための方法を包含する。標識化法は、標識部位（５’末端、３’末端、核酸塩基、ヌクレオチド間連結、糖、アミノ、スルフィド、ヒドロキシル、およびカルボキシルを含む）においてオリゴヌクレオチドに対して実施され得る。標識化反応は、１つ以上のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよび核酸アナログモノマーユニットを含むオリゴヌクレオチドに対して行われ得る。核酸アナログは、核酸塩基、糖、および／またはヌクレオチド間アナログであり得る。
【００１７】
標識化オリゴヌクレオチドは、５’から３’の方向、または３’から５’の方向のいずれかで合成され得る。
【００１８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
ここで本発明の好ましい実施形態を詳細に参照すると、これらの例は、添付の図面に図示される。本発明は、好ましい実施形態と共に記載されるが、これらは、その実施形態に本発明が限定されるということを意図されないことが理解される。対照的に、本発明は、上記の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲内に含まれる代替物、改変物、および等価物を包含することを意図される。
【００１９】
（Ｉ．定義）
他に記載されないかぎり、本明細書中で使用される場合、以下の用語および句は、以下の意味を有することが意図される。
【００２０】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドモノマーまたはそれらのアナログのポリマーを意味し、それらの二重鎖および一重鎖の、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、α−アノマー形態などを含む。オリゴヌクレオチドは、１つ以上のＤＮＡ、ＲＮＡおよび核酸アナログモノマーユニットを含み得る。モノマーは、ヌクレオチド間連結（ホスホジエステル結合またはそれらのホスフェートアナログを含む）により連結され、対イオン（例えば、Ｈ⁺、ＮＨ⁴⁺、Ｎａ⁺）を伴う。オリゴヌクレオチドは、代表的に少数のモノマーユニット（例えば、５〜４０）から数千のモノマーユニットまでの範囲である。オリゴヌクレオチドが文字の配列（例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」）により表される場合は必ず、ヌクレオチドは、５’から３’の順に、左から右であり、そして他に示されないかぎり、「Ａ」は、デオキシアデノシン、「Ｃ」はデオキシシチジン、「Ｇ」はデオキシグアノシン、そして「Ｔ」はチミジンを示す。
【００２１】
「ヌクレオシド」は、ペントースに１’位で連結したプリン核酸塩基、デアザプリン核酸塩基、またはピリミジン核酸塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなど）からなる化合物をいう。核酸塩基がプリンまたは７−デアザプリンである場合、ペントースはこの核酸塩基にプリンまたはデアザプリンの９位で結合され、そして核酸塩基がピリミジンである場合、ペントースは、この核酸塩基にピリミジンの１位で結合される。
【００２２】
「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステル）をいい、ここで最も一般的なエステル化部位は、ペントースのＣ−５位に結合されるヒドロキシル基である。
【００２３】
用語「ワトソン／クリック塩基対合」は、配列特異的水素結合により共に結合する、ヌクレオチドおよびそのアナログの特定の対（例えば、ＡはＴおよびＵと対になり、そしてＧはＣと対になる）のパターンをいう。
【００２４】
用語「アナログ」とは、モノマーヌクレオチドアナログ単位から作製され、そして核酸に関連するいくつかの性質および特性を有する核酸のアナログをいう。核酸アナログは、改変された核酸塩基部分、改変された糖部分、および／または改変されたヌクレオチド間連結を有し得る（Ｅｎｇｌｉｓｃｈ，１９９１）。糖およびヌクレオチド間部分が、２−アミノエチルグリシンアミド骨格ポリマーで置換された、好ましい核酸アナログのクラスは、ペプチド核酸ＰＮＡである（Ｎｉｅｌｓｅｎ，１９９１）。
【００２５】
「結合部位」とは、リンカーが結合される部位をいう。
【００２６】
「リンカー」とは、オリゴヌクレオチドを標識または固体支持体に接続する鎖を含む１つ以上の原子をいう。
【００２７】
「キメラ」とは、本明細書中で使用される場合、１つ以上のヌクレオチド単位および１つ以上のヌクレオチドアナログ単位を含むオリゴヌクレオチドをいう。
【００２８】
「低級アルキル」、「低級アルキレン」および「低級置換アルキレン」とは、１〜１２個の炭素原子からなる直鎖、分枝、または環式の基をいう。
【００２９】
「標識」とは、オリゴヌクレオチドに共有結合で結合される部分をいう。好ましい標識のクラスは、検出のためのシグナル（例えば、蛍光、化学ルミネセンス、および電気化学ルミネセンス）を生じる（Ｋｒｉｃｋａ，１９９２）。別の好ましい標識のクラスは、ハイブリダイゼーションを強化するか、安定化するか、または影響を及ぼすように作用する（例えば、インターカレーター、小溝バインダー（ｍｉｎｏｒ−ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）、および架橋官能基）（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，１９９６）。検出標識としては、蛍光色素（例えば、フルオレセインおよびローダミン誘導体）、シアニン色素（Ｋｕｂｉｓｔａ，１９９７）、化学ルミネセンス色素（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ，１９９０；Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ，１９９４）およびエネルギー移動色素（Ｃｌｅｇｇ，１９９２；Ｃａｒｄｕｌｌｏ，１９８８）が挙げられるが、これらに限定されない。なお別の好ましい標識のクラスは、特異的または非特異的捕獲手段によって分子の分離または固定化をもたらすように作用する（Ａｎｄｒｕｓ，１９９５）。
【００３０】
「検出」とは、標識の特性に基づいてオリゴヌクレオチドを検出すること、観察すること、または測定することをいう。
【００３１】
「カップリング試薬」は、固体支持体上の求核性オリゴヌクレオチドと標識との間に、エステル結合、アミド結合、チオエステル結合、スルホンアミド結合、スルホネート結合、ホスホネート結合、ホスホラミデート結合、ホスホロチオエート結合、またはホスフェート結合を形成し得る任意の試薬、活性化剤、または添加剤を含む。
【００３２】
（ＩＩ．標識化支持体）
本発明の１つの局面は、標識化オリゴヌクレオチドの合成のための支持体を含む。本発明のこの局面にしたがった標識化支持体は、以下の構造：
【００３３】
【化１１】

を有し、
ここでＳは一般にオリゴヌクレオチド合成に有用な固体支持体材料をいい、Ａは切断可能なリンカーであり、Ｘは３以上の結合部位を有する部分であり、Ｌは標識であり、Ｙは求核剤（すなわち、Ｏ、ＮＨ、ＮＲまたはＳ）であり、そしてＰ₁は、酸で切断可能な保護基である。
【００３４】
固体支持体は、モノマーユニットの連続的な結合のための不溶性媒質を提供する。不均一合成法の有意な利点は、液相中の過剰の試薬が、濾過により容易に除去され得、それにより各反応のまたは各サイクルの間の精製工程の必要性を排除することである。固体支持体の特徴（例えば、細孔サイズ、架橋含有量（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ ｃｏｎｔｅｎｔ）、膨潤、粒子サイズ、および表面積）は、迅速な動態および高収率反応を生じるために、試薬の効率的な拡散を可能にするように最適化されるべきである。好ましい支持体材料としては、高架橋非膨潤ポリスチレン（Ａｎｄｒｕｓ，１９９３）、制御細孔ガラス（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８４）、シリカ、シリカゲル、ポリアクリルアミド、磁気ビーズ（Ｓｔａｍｍ，１９９５）、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアミド，ポリエチレン，ポリエチレンオキシ、およびこのような物質のグラフトまたはコポリマーが挙げられる。固体支持体の物理的構成としては、小粒子、ビーズ、膜、フリット、非多孔性表面、スライド、プレート、ミクロ機械加工チップ、アルカンチオール−金層、アドレス可能アレイ、ベクター、プラスミド、またはポリヌクレオチド−固定化媒質が挙げられる（Ｆｏｄｏｒ，１９９５）。いくつかの実施形態では、例えば、ウエル、隆起した領域、窪み、ピン、溝、ロッド、円筒の内壁または外壁などを伴った、支持体上で物理的に隔てられた合成領域のアレイを作製することが望ましい。
【００３５】
切断可能なリンカーＡは、以下のような任意の官能基を含み得る：（ｉ）塩基性試薬により切断されるエステルおよび他の塩基に不安定なリンカー、（ｉｉ）フッ化物イオンのような求核剤により切断されるシリルエーテル、または（ｉｉｉ）ジスルフィド基およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）のような試薬を用いて酸化／還元条件下で切断される他の基。リンカーＡの上記の例において切断される結合は、以下に矢印で示される。
【００３６】
【化１２】

部分Ｘは、リンカーＡ、標識Ｌ、およびオリゴヌクレオチドを介する固体支持体の結合のための結合部位を含む任意の基であり得る。
【００３７】
標識Ｌは、オリゴヌクレオチドに共有結合で結合される任意の基または部分である。標識は、ハイブリダイゼーション安定化部分（例えば、小溝バインダー、インターカレーター、および架橋剤）、蛍光色素、蛍光消光剤、エネルギー移動色素セット、化学ルミネセンス色素、アミノ酸、タンパク質、ペプチド，酵素、および親和性リガンドを含み得る。
【００３８】
Ｙは、炭素と比較して求核性の基（例えば、Ｏ、ＮＨ、ＮＲ、およびＳ）であり、そしてＸをオリゴヌクレオチドに結合する。Ｙは、酸で切断可能な保護基Ｐ₁を有し、ＤＭＴ、ＭＭＴ、トリチル、置換トリチル、ピクシル（ｐｉｘｙｌ）、またはトリアルキルシリルであり得る。この保護基Ｐ₁は、オリゴヌクレオチド合成を開始するために求核剤Ｙから除去される。
【００３９】
（ＩＩＩ．標識化支持体の合成）
固体支持体Ｓは、リンカー単位（Ａ−Ｘ−Ｙ）が連結される反応性官能基を用いて誘導体化される。好ましくは、反応性官能基は、好ましくは１グラムにつき５〜１００個のＮＨ₂を添加された１級アミノ基である。次いで、リンカー単位またはスペーサー（Ａ−Ｘ−Ｙ）は、固体支持体の反応性官能基に共有結合で結合される。Ａ−Ｘ−Ｙ上の第２の連結部位は、標識に結合する。Ａ−Ｘ−Ｙ上の第３の連結部位は、オリゴヌクレオチド鎖の合成を可能にする。代表的にＡは、塩基性条件下（例えば、水酸化アンモニウム）で切断可能なエステル基を含み、オリゴヌクレオチド、およびこのオリゴヌクレオチドに結合される任意の標識からの固体支持体の分離を可能にする。
【００４０】
以下の（ｉ）または（ｉｉ）ようにリンカーユニットＡ−Ｘ−Ｙは、固体支持体に結合され得る：
（ｉ）ラベルＬを有する１ユニット、または（ｉｉ）ラベルＬを有さない１ユニット（ここで、ラベルＬは、次いで、以下の反応：
【００４１】
【化１３】

によってリンカーＸに結合する）。
【００４２】
図２は、標識化支持体への例示的ルート（ｉｉ）を示し、ここで、このリンカー１（Ｘ−Ｙ−Ｐ₁）を、２（Ａ−Ｘ−Ｙ−Ｐ₁）に変換し、そしてアミノメチル（高度に架橋されたポリスチレン）３に結合する。得られた生成物４を、５へと脱保護する。予め活性化されたラベル（例えば、ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳ（５−カルボキシテトラメチルローダミンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル））を、５に共有結合させ、オリゴヌクレオチドの合成のために用意した、標識化支持体６を得る。
【００４３】
標識化固体支持体の好ましい群は、構造６として示される（図２および以下）。
【００４４】
【化１４】

ここで、Ｓは、高度に架橋されたポリスチレンであるか、または制御細孔ガラスであり、Ａは、以下：
【００４５】
【化１５】

であり、Ｘは、以下：
【００４６】
【化１６】

であり、Ｌは、小溝バインダー（ｍｉｎｏｒ−ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）（シアニン、蛍光色素、またはエネルギー移動色素のセット）であり、Ｙは、酸素であり、そしてＰ₁は、ＤＭＴである。
【００４７】
６のＸ中の不斉炭素を、標識化オリゴヌクレオチドのジアステレオ異性体に導く。これらの特定の異性体は、ＨＰＬＣまたはキャピラリー電気泳動による分析の間に、個々のピークに分割しないとう利点を有する。ラベルをオリゴヌクレオチドに結合するための他のジアステレオマーリンカーは、分析において２重のピークとして例示される、ジアステレオマー分解を示し得る（Ｍｕｌｌａｈ，１９９８；Ｗｏｏ，１９９６）。６から調製された標識化オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ配列（Ｌｅｅ，１９９７）、ＤＮＡフラグメント分析（Ｇｒｏｓｓｍａｎ，１９９４）およびＰＣＲ（Ｌｉｖａｋ，１９９６）のようなプライマー伸長実験において使用される場合、フラグメントおよび増幅生成物が、データ分析を妨害するジアステレオマー群（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に分割しないことによる同様な利点がある。
【００４８】
（ＩＶ．５’から３’方向での標識化支持体上での標識化オリゴヌクレオチドの合成）
一般に、本発明の方法および組成物は、効率がよくかつ迅速なカップリングおよび出発ヌクレオチドモノマーの安定性のために好ましい、ホスホラミダイト合成法を利用する（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８３；Ｂｅａｕｃａｇｅ，１９８３；Ｂｅａｕｃａｇｅ，１９９２）。ホスホラミダイト法は、固体支持体上で、最も一般的には、３’から５’方向へ（３’末端ヌクレオチドは、合成の開始時点で固体支持体に結合されている）、ヌクレオチドモノマーユニットのオリゴヌクレオチド成長鎖への周期的添加（ｃｙｃｌｉｃａｌ ａｄｄｉｔｉｏｎ）を必要とする。この方法は，通常オートメーション化した市販の合成機を利用して実施される（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８４）。本発明の５’から３’方向への実施形態では、以下の構造７：
【００４９】
【化１７】

を有する５’ホスホラミダイト，３’保護ヌクレオシドモノマー（Ｗａｇｎｅｒ，１９９７）を、周期的に添加し、ここで、Ｒは、保護基または置換基（例えば、シアノエチル、メチル、低級アルキル、置換アルキル、フェニル、アリール、および置換アリール）であり；Ｒ₁およびＲ₂は、アミン置換基（例えば、イソプロピル、モルホリノ、メチル、エチル、低級アルキル、シクロアルキル、およびアリールであり；Ｐ₂は、環外窒素保護基（例えば、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、アリールオキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジアルキルホルムアミジンおよびジアルキルアセトアミジン）であり；ならびにＰ₃は、酸ラベル保護基（例えば、ＤＭＴ、ＭＭＴ、ピキシル（ｐｉｘｙｌ）、トリチル、およびトリアルキルシリル）である。
【００５０】
固体支持体に結合した５’末端および遊離の結合していない３’末端を有するオリゴヌクレオチドが、合成される。
【００５１】
以下では、本発明おけるホスホラミダイト法を使用して、合成サイクルの工程を簡潔に記載する。第一に、固体支持体（例えば、６）は、プロトン酸（ｐｒｏｔｉｃ ａｃｉｄ）（例えば、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸）を用いて処理し、続くカップリング反応のために求核性（例えば、ヒドロキシル基）を有さない酸ラベル保護基（例えば、ＤＭＴ）を除去する。次いで、活性化中間体は、５’−ホスホラミダイト，３−保護ヌクレオシドモノマー７および弱酸（例えば、テトラゾールなど）を、合成機の反応容器（合成カラム）に同時に添加することによって形成される。ヌクレオシドの付加は、典型的に、３０〜３００秒、好ましくは、約９０秒内で完了する。次に、カップリング工程を実施し、この工程は、３’ヒドロキシル基のアシル化によるヌクレオシドの付加を受けない任意のオリゴヌクレオチド鎖で終結する。カップリングは、好ましくは、無水酢酸および１−メチルイミダゾールを用いて実施されるが、他のアシル化剤を使用してもよい。次いで、ヌクレオチド間の結合を、好ましい酸化剤としてヨウ素および酸素供与体として水を使用する酸化によって、ホスファイト（ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ）からより安定なホスホトリエステルに変換し、以下の構造：
【００５２】
【化１８】

を得る。
【００５３】
あるいは、ヌクレオチド間のホスファイトを酸化して、例えばホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）またはホスホラミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）のようなヌクレオチド間アナログにし得る。酸化の後に、次の３’ヒドロキシル保護基（例えば、ＤＭＴ）を、プロトン酸（例えば、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸）を用いて除去し、そしてこのサイクルを鎖の伸長が完了するまで繰り返す（図１）。
【００５４】
（Ｖ．固体支持体上でのオリゴヌクレオチドの合成後の標識化）
標識は、オリゴヌクレオチドおよび核酸アナログ上の種々の結合部位に結合され得、この標識としては、（ｉ）末端（例えば、プローブの５’および／または３’末端）、（ｉｉ）ヌクレオチド間の結合、（ｉｉｉ）糖、あるいは（ｉｖ）核酸塩基が挙げられる。標識は、最も好都合におよび効率的に５’末端で標識部位が導入され、この標識部位は、最も少なくハイブリダイゼーションを不活性化させ、そして最もすくなく３’プライマー伸長反応と相互作用する（Ｋｒｉｃｋａ，１９９２；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６）。好ましい５’リンカー試薬は、構造８：
【００５５】
【化１９】

を有する、アミノ保護ホスホラミダイトであり、ここで、Ｒは、酸素保護基または置換基（例えば、シアノエチル、メチル、低級アルキル、置換アルキル、フェニル、アリール、または置換アリール）であり；そしてＲ₁およびＲ₂は、アミノ置換基（例えば、イソプロピル、モルホリノ、メチル、エチル、低級アルキル、シクロアルキル、またはアリールである。上記の試薬と、支持体に結合したオリゴヌクレオチドおよび弱酸の活性剤（例えば、テトラゾール）とのカップリングにより、モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）保護オリゴヌクレオチドを得る。ホスファイトの酸化の後に、ＭＭＴ基は、同じ酸試薬（例えば、ＴＣＡまたはＤＣＡ）を用いてアミン基から除去され得、標識試薬とのカップリング反応のための反応性一級アミン求核性を示す。このヘキシルリンカーは、他のより短い不活性なリンカー（例えば、エチル）、またはより長いリンカー（例えば、ドデシル）に容易に置換され得、これらのリンカーはまた、アリール基および他の官能基を含む。あるいは、チオールまたはヒドロキシル求核性は、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチド上の５’末端または他の部位に導入され得る。好ましいチオール保護ホスホラミダイト試薬は、９および１０：
【００５６】
【化２０】

である。このような試薬を５’ヒドロキシル基に結合し、ホスフェートを酸化し、そしてチオール保護基を除去し、反応性チオール求核試薬を得る。得られた固体支持体に結合した５’連結求核性オリゴヌクレオチドは、は、以下：
【００５７】
【化２１】

にように示され得る。
【００５８】
標識化反応は、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）の間で処理される：（ｉ）固体支持体に結合したオリゴヌクレオチド（ここで、オリゴヌクレオチドは、反応性求核性官能基（例えば、ＨＯ、ＨＮＲ、Ｈ₂Ｎ、またはＨＳ）を有する）、（ｉｉ）ＣＯ₂Ｈ（カルボキシル）、ＳＯ₃Ｈ（スルホネート）、ＲＰＯ₃Ｈ（ホスホネート）、またはＯＰＯ₃Ｈ（ホスフェート）官能基を有するラベル、（ｉｉｉ）カップリング試薬、および（ｉｖ）溶媒または溶媒の混合物。この反応は、０〜１００℃の間、好ましくは約２０℃の周囲温度で処理され得る。
【００５９】
好ましいカップリング試薬としては、以下が挙げられる：ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＢＴＵ（２（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１−１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＦＦＨ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’ −テトラメチルウロニウム２−フルオロ−ヘキサフルオロホスフェート）、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＥＥＤＱ（２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロ−キノリン）、ＤＣＣ（ジクロロヘキシルカルボジイミド）；ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＭＳＮＴ（１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール、およびアリールスルホニルハライド（例えば、トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド）。
【００６０】
これによって、標識官能性の先の活性化または個々の活性化（「プレ（ｐｒｅ）活性化」）は、本発明の実施に必要ではない。例えば、本発明は、求核性オリゴヌクレオチドとの反応のために、カルボキシル基のＮＨＳエステルの先の変換を必要としない。
【００６１】
（ＶＩ．標識）
標識Ｌは、オリゴヌクレオチドまたは核酸アナログに共有結合した任意の部分であり得る。
【００６２】
ラベルの好ましいクラスは、蛍光、化学発光、および電気化学発光（Ｋｒｉｃｋａ，１９９２）によって標識されたオリゴヌクレオチドの検出のためのシグナルを提供し得る、検出ラベルである。オリゴヌクレオチドをラベルするために有用である蛍光色素としては、フルオレセイン（Ｍｅｎｃｈｅｎ，１９９３）、ローダミン（Ｂｅｒｇｏｔ，１９９４）、シアニン（Ｋｕｂｉｓｔａ，１９９７）、およびポルフィリン金属錯体（Ｓｔａｎｔｏｎ，１９８８）が挙げられる。
【００６３】
フルオレセイン色素の例としては、以下が挙げられる：６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−融合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）、２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）、および（ＪＯＤＡ）（図３および４）。５−カルボキシル、および他の位置異性体は、有用な検出特性を有し得る。１，４−ジクロロ置換基を有するフルオレセイン色素およびローダミン色素が、特に好ましい。
【００６４】
標識の別の好ましいクラスは、消光部分を含む。消光部分の発光スペクトルは、近接した分子内または分子間蛍光色素と重なり、その結果、蛍光色素の蛍光は、実質的に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって減少するか、または消光する。蛍光色素と消光部分の両方で分子内で標識されるオリゴヌクレオチドは、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、「Ｔａｑｍａｎ^TM」エキソヌクレアーゼ切断ＰＣＲアッセイ（Ｌｉｖａｋ，１９９８；Ｌｉｖａｋ，１９９６））において有用である。
【００６５】
特に好ましい消光物質としては、以下の（ｉ）および（ｉｉ）が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラプロパノ−６−カルボキシローダミン（ＲＯＸ）からなる群から選択されるローダミン色素、および（ｉｉ）ＤＡＢＳＹＬ、ＤＡＢＣＹＬ、ニトロチアゾールブルーを含むシアニン色素、アントラキノン、マラカイトグリーン、ニトロチアゾール、およびニトロイミダゾールなど（図５）。
【００６６】
本発明のフルオレセイン（左）およびローダミン（右）誘導体は、以下の一般構造および番号付け方式（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）：
【００６７】
【化２２】

を有し得、ここでＸは、リンカーであり、そして１以上の番号付けされた位置で置換され得る。
【００６８】
シアニン標識は、以下の構造：
【００６９】
【化２３】

を有し得、ここで、Ｒ₁またはＲ₂は、Ｈ、低級アルキル、低級アルキレン、低級置換アルキレン、フェニル、またはアリールであり；Ｚは、ＣＲ₁Ｒ₂、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、またはＮ−Ｒ₁であり、Ｒ₃は、ニトロ、ハロ、スルホネート、ヒドロキシ、アミノ、低級アルキル、またはチオハロメチルであり、そしてｎ＝０〜２である（Ｋｕｂｉｓｔａ，１９９７）。オリゴヌクレオチドを標識化するための結合部位Ｘは、Ｒ₁、Ｒ₂、またはＲ₃であり得る。
【００７０】
エネルギー移動色素は、オリゴヌクレオチドラベルの好ましいクラスである。エネルギー移動色素標識は、アクセプター色素に連結されるドナー色素を含む（Ｌｅｅ，１９９８）。例えば、レーザーからの第一波長の光が、ドナー色素（例えばＦＡＭ）によって吸収される。ドナー色素は、アクセプター色素によって吸収された励起エネルギーを発光する。アクセプター色素は、ドナー色素の吸収最大波長よりも約１００ｎｍ大きい発光最大波長の第二波長で蛍光を発する。
【００７１】
エネルギー移動ラベルのドナー色素およびアクセプター色素の部分は、ドナー色素（例えば、ＦＡＭ）の４’または５’位置と、アクセプター色素の５−または６−カルボキシル基とを連結する、以下：
【００７２】
【化２４】

のようなリンカーによって結合され得る。
【００７３】
ポルフィリン金属錯体はまた、オリゴヌクレオチドラベルの好ましいクラスである（Ｓｔａｎｔｏｎ、１９８８）。一例としては、以下：
【００７４】
【化２５】

に示される構造の、アルミニウムフタロシアニンテトラスルホネートである。
【００７５】
別の好ましい標識のクラスは、化学発光化合物を含む。特に好ましくは、以下の構造：
【００７６】
【化２６】

を有する、１，２−ジオキサン化学発光部分（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ，１９９４；Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ，１９９０）であり、ここで、Ｒ₁は、水素またはハロゲンであり；Ｒ₂は、ホスフェート、ガラクトシド、グルコシド、グルクロニド、トリアルキルシリルオキシ、アシルオキシ、または水素であり；Ｒ₃は、メチル、エチル、および低級アルキルであり、そしてＸは、オリゴヌクレオチドへのリンカーである。親和性リガンドとしては、ビオチン、２，４−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、コレステロール、ポリエチレンオキシ、およびペプチドが挙げられる。
【００７７】
本明細書中で、ハイブリダイゼーション安定化部分として言及される、別の好ましい標識のクラスとしては、小溝バインダー、挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、ポリカチオン（例えば、ポリリジンおよびスペルミン）、ならびに架橋官能基が挙げられるが、これらに限定されない。ハイブリダイゼーション安定化部分は、塩基対の安定性（すなわち、親和性）、またはハイブリダイゼーションの速度を増加させ、このことは、二重鎖の高温融解温度Ｔ_mによって例示される。ハイブリダイゼーション安定化部分は、塩基対の特異性を増加させるのに役に立ち、このことは、完全に相補的なオリゴヌクレオチドと標的配列との間の大きなＴ_mの違いによって例示され、得られた二重鎖は、一以上のワトソン／クリック塩基対の不整合を含む（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，１９９６）。好ましい小溝バインダーとしては、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＣＤＰＩ_1-3、ＭＧＢ１、ネトロプシン（ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ）、およびジスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ）（図６）が挙げられる。小溝バインダーの例は、ＣＤＰＩ₃（Ｋｕｔｙａｖｉｎ，１９９６；Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ，１９９５）であり、これは、以下の構造：
【００７８】
【化２７】

を有し、ここで、Ｘは、リンカーまたはオリゴヌクレオチドの標識化のための結合部位である。オリゴヌクレオチドに標識化された場合、小溝バインダーは、いくつかのまたは実質的にほとんどの標的配列に対するハイブリダイゼーションの親和性および特異性を増加させ得る（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，１９９６，３３７〜４６頁）。
【００７９】
（ＶＩＩ．核酸アナログ）
オリゴヌクレオチドは、核酸塩基、糖、および／またはヌクレオチド間の部分に対する改変体を有する、種々の核酸アナログを含み得る。
【００８０】
好ましい核酸塩基アナログ改変体としては、以下が上げられるが、これらに限定されない：Ｃ−５−アルキルピリミジン、２−チオピリミジン、２，６−ジアミノプリン、Ｃ−５−プロピンピリミジン、フェノキサジン（Ｆｌａｎａｇａｎ，１９９９）、７−デアザプリン、イソシチジン、偽イソシチジン、イソグアノシン、４（３Ｈ）−ピリミドン、ヒポキサンチン、８−オキソプリンおよび普遍塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）（Ｍｅｙｅｒ，１９９４）。
【００８１】
１以上のヌクレオシドにおいて、好ましい糖アナログ改変体としては、２’−または３’−改変体が挙げられるが、これらに限定されない。ここで、２’−または３’−位置は、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アルキルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロ、およびブロモである。
【００８２】
他の好ましい糖アナログ改変としては、４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド、２’−分枝基−リボヌクレオチド、および２’−Ｏ−分枝基−リボヌクレオチドが挙げられる。以下の構造は、いくつかの好ましい２’−糖改変を示す。
【００８３】
【化２８】

１つ以上のヌクレオチドの間の好ましいヌクレオチド間アナログとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）ヌクレオチド間連結の酸素の、硫黄、炭素、または窒素による置換、および（ｉｉ）硫黄、カルボキシレート、およびアミンの、ヌクレオチド間ホスホジエステル連結。他の好ましいヌクレオチド間アナログとしては：２−アミノエチルグリシン（ＰＮＡ）、２’−５’−連結、逆転した３’−３’連結、逆転した５’−５’連結、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、非架橋Ｎ−置換ホスホラミデート、アルキル化ホスホチオエステルの分枝構造、および３’−Ｎ−ホスホラミデートが挙げられる。
【００８４】
本発明の特に好ましいアナログは、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）オリゴマーであり、ここで、天然のホスホジエステル−デオキシリボース骨格は、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン（ペプチド様ユニット）で置換されている（Ｎｉｅｌｓｅｎ、１９９１）。ＰＮＡオリゴマーは、Ｗａｔｓｏｎ／Ｃｒｉｃｋ塩基対形成によって、プローブのクランプ特異的部分の相補的配列と、塩基対形成し得る。ＰＮＡおよびＰＮＡ／ＤＮＡキメラは、市販の自動化合成機で、市販の試薬を用いて、従来の方法を使用して合成され得る（Ｄｕｅｈｏｌｍ、１９９４；Ｖｉｎａｙａｋ、１９９７；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｌａａｎ、１９９７）。
【００８５】
（ＶＩＩＩ．支持体からの標識オリゴ体の切断および脱保護）
合成後に、オリゴヌクレオチドは、固体支持体から除かれ得るか、または切断反応によって固体支持体から除去もしくは分離され得る。固体支持体からオリゴヌクレオチドを除くことが望ましい。なぜなら、いくつかの核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、固体支持体（例えば、非多孔質表面、平坦な表面のアレイ、埋包またはカプセル化された粒子、あるいは水性媒体中に懸濁した粗い粒子の構成のもの）に共有結合したオリゴヌクレオチドを使用するからである。
【００８６】
オリゴヌクレオチドは、塩基（例えば、水酸化アンモニウム、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、メチルアミン、エチルアミン、炭酸カリウム、または水酸化ナトリウム）を使用して、支持体から切断され得る。切断および脱保護に適した溶液は、メタノール：ｔｅｒｔ−ブチルアミン：水（１：１：２、ｖ：ｖ：ｖ）の混合物である（Ｗｏｏ、１９９３）。切断溶液はまた、オリゴヌクレオチド含有溶液を高温（例えば、５５〜８５℃）で１〜１６時間の間加熱する際に、リン酸保護基（例えば、シアノエチル）、および核酸塩基の環外アミン上の保護基を除去する。
【００８７】
別の好ましい切断方法は、ジスルフィドリンカーＡの、還元的切断または酸化的切断であり、ここでＡは、以下：
−（ＣＨ₂）_n−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）_n−
であり、ここでｎは、１〜１２である。好ましい切断試薬は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）である。
【００８８】
別の好ましい切断方法は、シリルエーテル連結Ａのフッ化物イオン切断であり、ここでＡは、以下：
【００８９】
【化２９】

であり、ここでＲは、１〜２０個の炭素原子の低級アルキルである。好ましい切断試薬としては、テトラブチルアンモニウムフルオリドおよびフッ化水素／トリエチルアミンが挙げられる。
【００９０】
（ＩＸ．実施例）
本発明は、以下の実施例を考慮することによって、さらに明らかとなる。この実施例は、本発明の純粋な例示であることを意図され、そして本発明の範囲をいかなる様式においても限定しないことを意図される。
【００９１】
（実施例１． ポリスチレン支持体−リンカー−ＴＡＭＲＡ６の合成）
無水ジグリコール酸（６４ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）の、ＣＨ₂Ｃｌ₂（５ｍｌ）中の溶液を、Ｅｔ₃Ｎ（６７ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（３４ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）および化合物１（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）のＣＨ₂Ｃｌ₂（１５ｍｌ）中の混合物に、０℃、アルゴン下で添加した（図２）。この添加の終了後（１０分）に、氷浴を取り除き、そして反応混合物を室温で１時間撹拌した。この反応混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂（３０ｍｌ）で希釈し、そして５％水性クエン酸（１×５０ｍｌ）および飽和ブライン（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、そしてエバポレートして、泡状物を得た。この生成物を、ＣＨＣｌ₃−ＥｔＯＨグラジエント（２〜１０％ＥｔＯＨ）で溶出してシリカゲルのカラムクロマトグラフィーで精製した。適切な画分を合わせ、そしてエバポレートして、化合物２を無色の泡状物として得た（２６０ｍｇ、５６％）。¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）ｄ：１．２０（ｍ，２Ｈ）、１．３９（ｍ，２Ｈ）、１．５８（ｍ，２Ｈ）、２．１８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）、２．９０〜３．２５（ｍ，４Ｈ）、３．８０（ｓ，６Ｈ）、３．８６（ｓ，４Ｈ）、４．００〜４．４０（ｍ，６Ｈ）、４．８５（分離されないｔ，１Ｈ）、５．９２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）、６．７５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，４Ｈ）、７．２０〜７．４０（ｍ，１３Ｈ）、７．５２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、７．６９（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）。
【００９２】
高度に架橋したポリスチレン３（１０００Å、１０μｍｏｌ／ｇアミン負荷、１ｇ、１０μｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の化合物２（１７ｍｇ、２０μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３ｍｇ、２０μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（８ｍｇ、２０μｍｏｌ）、およびジイソプロピルエチルアミン（８ｍｇ、６０μｍｏｌ）で、ｗｉｒｓｔ作動振盪機で４時間、室温で処理し、４を得た。支持体を、ＤＭＦ（３×１０ｍｌ）、ＣＨ₃ＣＮ（２×１０ｍｌ）およびＣＨ₂Ｃｌ₂（１×１０ｍｌ）で洗浄し、そして高減圧下で一晩乾燥した。ニンヒドリンアッセイは、支持体に残った０．５μｍｏｌ／ｇのアミンを示した。支持体を、ＴＨＦ（１０％溶液、５ｍｌ）中の無水酢酸／ルチジンおよびＴＨＦ（１６％溶液、５ｍＬ）中の１−メチルイミダゾールで２時間室温でキャップした。支持体４をＣＨ₃ＣＮ（３×１０ｍｌ）およびＣＨ₂Ｃｌ₂（１×１０ｍｌ）で洗浄した。トリチルカチオンアッセイは、ポリスチレン支持体上の化合物２の９．２μｍｏｌ／ｇ負荷を与えた。支持体４を、ＤＭＦ（３×１０ｍｌ、各洗浄１０分）中の２０％ピペリジンで処理して、Ｆｍｏｃ保護基を除去して支持体５を与え、これをＤＭＦ（３×１０ｍｌ）、ＣＨ₃ＣＮ（２×１０ｍｌ）、およびＣＨ₂Ｃｌ₂（１×１０ｍｌ）で洗浄し、そして減圧下で一晩乾燥した。支持体５（１ｇ、９．２μｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステル（１５ｍｇ、２８．５μｍｏｌ）およびＥｔ₃Ｎ（８．６ｍｇ、８５μｍｏｌ）で、室温で３６時間、振盪機上で処理し、支持体６（Ｌ＝ＴＡＭＲＡ）を得た。この支持体を、ＤＭＦ（３×１０ｍｌ）、ＣＨ₃ＣＮ（２×１０ｍｌ）およびＣＨ₂Ｃｌ₂（１×１０ｍｌ）で洗浄し、そして高減圧下で２４時間乾燥した。ニンヒドリン試験は、支持体上に残った０．５μｍｏｌ／ｇ未満のアミンを示した。この支持体を、ＴＨＦ（１０％溶液、５ｍｌ）中の無水酢酸／ルチジンおよびＴＨＦ（１６％溶液、５ｍｌ）中の１−メチルイミダゾールで１時間キャップし、次いでＣＨ₃ＣＮ（３×１０ｍｌ）、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２×１０ｍｌ）で洗浄し、そして高減圧下で２４時間乾燥した。トリチルカーボンアッセイは、ポリスチレン支持体−リンカー−ＴＡＭＲＡ６について、８．８μｍｏｌ／ｇの最終負荷を示した。
【００９３】
（実施例２． 標識支持体６上のＦＡＭ−Ｍ１３−２１プライマーの合成）
（ＦＡＭ−Ｍ１３−２１プライマーの合成）
５’ＦＡＭ−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’ 配列番号１
を、ＡＢＩ ３９６ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ．）で、０．２μモルスケールで、ＦＡＭ標識したポリスチレン支持体６（図２、Ｌ＝６−カルボキシフルオレセインＦＡＭ、Ｓ＝ポリスチレン）を用いて構築した。標準的な０．２μｍｏｌ ＣＥサイクルを、全ての５’−ホスホラミダイト、３’−ＤＭＴホスホラミダイトヌクレオシド７（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のカップリングについて２５秒から９０秒へとカップリング時間を増加させることによって、改変した。５’→３’の方向の合成が完了した後に、ＦＡＭ−Ｍ１３−２１プライマーを切断し、そしてＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ₂：Ｈ₂Ｏ（１：１：２）中６５℃で３時間脱保護した。このプライマーを、従来の手段（すなわち、アニオン交換ＨＰＬＣ）によって分析し、そしてＤＮＡ配列決定において使用した。
【００９４】
（実施例３． 固体支持体上のアミノ−２０７ａｖ １８マーオリゴヌクレオチドの、ＴＡＭＲＡ−ＣＯ₂Ｈでの標識）
５’ＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＡＴＣＴＣＧＡＴ３’の合成を、ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ．）で、０．２μモルスケールで、非標識ポリスチレン支持体を用いて３’→５’の方向で、５’−ＤＭＴ、３’−ホスホラミダイトヌクレオシド（Ａ^bz、Ｇ^dmf、Ｃ^bz、Ｔ）を用いて実施した。アミノリンカーホスホラミダイト試薬８（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、最終モノマーとしてカップリングし、そしてＣＨ₂Ｃｌ₂中の３％トリクロロ酢酸で脱トリチル化した。５’−アミノ−２０７ａｖオリゴヌクレオチドを保有する合成カラムを、合成機から取り外した。２つのルアーチップ型１ｍｌシリンジを、この合成カラムの各端部に取り付けた。１つのシリンジを、５００μｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１０．７ｍｇ（２５μモル）のＴＡＭＲＡ−ＣＯ₂Ｈで満たした。第二のシリンジを、２５０μｌの１：１のＤＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ中の９．２５ｍｇ（２５μモル）のＨＢＴＵおよび９μｌ（５０μモル）のジイソプロピルエチルアミンで満たした。これらのシリンジ内のカップリング剤を、各プランジャーを連続的に押下することによって、カラムを通過させた。約１分間、徹底的に混合した後に、このアセンブリを約１５分間静置し、カップリング反応を進行させた。試薬を１つのシリンジに引き込み、そして処分した。この合成カラムを５ｍｌの１：１のＤＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ、５ｍｌのＣＨ₃ＣＮで洗浄し、そして１ｍｌのＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ₂：Ｈ₂Ｏ（１：１：２）で処理して、ＴＡＭＲＡ−Ｎ−２０７ａｖ：
５’ＴＡＭＲＡ−Ｎ−ＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＡＴＣＴＣＧＡＴ３’ 配列番号２
を支持体から切断した。ＴＡＭＲＡ−Ｎ−２０７ａｖを含有する上清を加熱し、そして６５℃で３時間脱保護して、全ての保護基を除去した。ＴＡＭＲＡ−Ｎ−２０７ａｖを、逆相ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析し、これらで均一な純度および同一性を確認した。
【００９５】
（実施例４． チオール−オリゴヌクレオチドのＣＤＰＩ３−ＣＯ₂Ｈでの標識化）
５’ＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＡＴＣＴＣＧＡＴ３’の合成を、ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ．）で、０．２μモルスケールで、非標識ポリスチレンを用いて３’→５’の方向で、５’−ＤＭＴ、３’−ホスホラミダイトヌクレオシド（Ａ^bz、Ｇ^dmf、Ｃ^bz、Ｔ）を用いて実施する。チオールリンカーホスホラミダイト試薬１０を、最終モノマーとしてカップリングし、そしてＤＭＦ中の硝酸銀で脱トリチル化する。５’−チオール−２０７ａｖオリゴヌクレオチドを保有する合成カラムを、合成機から取り外す。２つのルアーチップ型１ｍｌシリンジを、この合成カラムの各端部に取り付ける。１つのシリンジを、５００μｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１５ｍｇ（２５μモル）のＣＤＰＩ₃−ＣＯ₂Ｈ（図６、Ｘ＝ＯＨ）で満たす。第二のシリンジを、２５０μｌの１：１のＤＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ中の９．２５ｍｇ（２５μモル）のＨＢＴＵおよび９μｌ（５０μモル）のジイソプロピルエチルアミンで満たす。これらのシリンジ内のカップリング剤を、各プランジャーを連続的に押下することによって、カラムを通過させる。約１分間、徹底的に混合した後に、このアセンブリを約１５分間静置し、カップリング反応を進行させる。試薬を１つのシリンジに引き込み、そして処分する。この合成カラムを５ｍｌの１：１のＤＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ、５ｍｌのＣＨ₃ＣＮで洗浄し、そして１ｍｌのＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ₂：Ｈ₂Ｏ（１：１：２）で処理して、ＣＤＰＩ₃−Ｓ−２０７ａｖ：
５’ＣＤＰＩ₃−Ｓ−ＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＡＴＣＴＣＧＡＴ３’ 配列番号３
を支持体から切断する。ＣＤＰＩ₃−Ｎ−２０７ａｖを含有する上清を加熱し、そして６５℃で３時間脱保護して、全ての保護基を除去した。ＣＤＰＩ₃−Ｓ−２０７ａｖを、逆相ＨＰＬＣによって分析し、均一な純度を確認した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による分析は、同一性を確認した。
【００９６】
（実施例５． 固体支持体上の５’アミノ−ＳＧ１オリゴヌクレオチドの、ＮＴＢ−ＣＯ₂Ｈでの標識）
５’ＡＴＧＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧＴ３’の合成を、ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ．）で、０．２μモルスケールで、非標識ポリスチレン支持体を用いて３’→５’の方向で、５’−ＤＭＴ、３’−ホスホラミダイトヌクレオシド（Ａ^bz、Ｇ^dmf、Ｃ^bz、Ｔ）を用いて実施した。アミノ−リンカーホスホラミダイト試薬８（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、最終モノマーとしてカップリングし、そしてＣＨ₂Ｃｌ₂中の３％トリクロロ酢酸で脱トリチル化した。５’−アミノ−ＳＧ１オリゴヌクレオチドを保有する合成カラムを、合成機から取り外した。２つのルアーチップ型１ｍｌシリンジを、この合成カラムの各端部に取り付けた。１つのシリンジを、５００μｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１１ｍｇ（２５μモル）のＮＴＢ−ＣＯ₂Ｈで満たした。第二のシリンジを、２５０μｌの１：１のＤＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ中の９．２５ｍｇ（２５μモル）のＨＢＴＵおよび９μｌ（５０μモル）のジイソプロピルエチルアミンで満たした。これらのシリンジ内のカップリング剤を、各プランジャーを連続的に押下することによって、カラムを通過させた。約１分間、徹底的に混合した後に、このアセンブリを約１５分間静置し、カップリング反応を進行させた。試薬を１つのシリンジに引き込み、そして処分した。この合成カラムを５ｍｌの１：１のＤＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ、５ｍｌのＣＨ₃ＣＮで洗浄し、そして１ｍｌのＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ₂：Ｈ₂Ｏ（１：１：２）で処理して、ＮＴＢ−Ｎ−ＳＧ１：
５’ＮＴＢ−Ｎ−ＡＴＧＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧＴ３’ 配列番号４
を支持体から切断した。ＮＴＢ−ＳＧ１を含有する上清を加熱し、そして６５℃で３時間脱保護して、全ての保護基を除去した。ＮＴＢ−ＳＧ１を、逆相ＨＰＬＣによって分析し、均一な純度を確認した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による分析は、８３９０．２７の分子量を与え、これは同一性を確認した。
【００９７】
（実施例６． 固体支持体上のＳＧ１の、ＮＴＢ−ホスフェートおよびＭＳＮＴでの標識）
５’ＡＴＧＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧＴ３’の合成を、ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ．）で、０．２μモルスケールで、非標識ポリスチレンを用いて３’→５’の方向で、５’−ＤＭＴ、３’−ホスホラミダイトヌクレオシド（Ａ^bz、Ｇ^dmf、Ｃ^bz、Ｔ）を用いて実施した。５’末端ヒドロキシル基を、ＣＨ₂Ｃｌ₂中の３％トリクロロ酢酸で脱トリチル化した。５’−ヒドロキシル−ＳＧ１オリゴヌクレオチドを保有する合成カラムを、合成機から取り外した。２つのルアーチップ型１ｍｌシリンジを、この合成カラムの各端部に取り付けた。１つのシリンジを、５００μｌの乾燥ＤＭＦ中の１２ｍｇ（２５μモル）のＮＴＢ−リン酸で満たした。第二のシリンジを、２５０μｌのＤＭＦ中の７．５ｍｇ（２５μモル）のＭＳＮＴおよび９μｌ（５０μモル）のジイソプロピルエチルアミンで満たした。これらのシリンジ内のカップリング剤を、各プランジャーを連続的に押下することによって、カラムを通過させた。約１分間、徹底的に混合した後に、このアセンブリを約６０分間静置し、カップリング反応を進行させた。試薬を１つのシリンジに引き込み、そして処分した。この合成カラムを５ｍｌの１：１のＤＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ、５ｍｌのＣＨ₃ＣＮで洗浄し、そして１ｍｌのＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ₂：Ｈ₂Ｏ（１：１：２）で処理して、ＮＴＢ−Ｐ−ＳＧ１：
５’ＮＴＢ−Ｐ−ＡＴＧＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧＴ３’ 配列番号５
を支持体から切断した。ＮＴＢ−Ｐ−ＳＧ１を含有する上清を加熱し、そして６５℃で３時間脱保護して、全ての保護基を除去した。ＮＴＢ−Ｐ−ＳＧ１を、逆相ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析し、これらで均一な純度および同一性を確認した。
【００９８】
（実施例７． 固体支持体上のＰＮＡの、ＭＧＢ１での標識化）
ＰＮＡおよびＰＮＡ／ＤＮＡキメラの自動化合成を、ＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機または４３３Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ．）を使用して、合成機の製造業者の使用者の手引き、ならびにＥｇｈｏｌｍ、１９９３に記載される一般的手順に従って、実施した。
【００９９】
ＰＮＡを、２〜５μモルスケールで、ＭＢＨＡ（メチルベンズヒドリルアミン）リンカー、高負荷ポリスチレン支持体上で、そして標準的な合成技術ならびに核酸塩基（Ａ^bz、Ｇ^bz、Ｃ^ibu、Ｔ）および第一級アミノ（ＭＭＴ、ＦｍｏｃまたはＢｏｃ）保護基を用いて、本質的に以前に報告されたように（Ｄｕｅｈｏｌｍ、１９９４）、合成した。５μモルスケールにおいて３ｍｌの反応容器を使用し、全反応容量は４４０ｍｌである。
【０１００】
ＰＮＡを、ＭＢＨＡ固体支持体上のカルボキシ末端リジンで、ｔ−Ｂｏｃ−ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）で予備付加することにより、調製した。カルボキシ末端アミドを有するＰＮＡを、ＭＢＨＡ支持体上で直接か、またはｔ−Ｂｏｃ Ｔ ＰＮＡモノマーで予備負荷されたＭＢＨＡ支持体上でのいずれかで、合成した。全ての樹脂を、０．１〜０．２５ｍモル／ｇに負荷した。スペーサーであるＯ，２−（２−アミノエトキシ）酢酸が、Ｆｍｏｃでアミノ保護されたシントンとして、カップリングされ得る。１つ以上のスペーサーＯユニットが、ＰＮＡ配列における可撓性の非塩基対形成ヒンジ領域として働く。
【０１０１】
ＰＮＡ／ＤＮＡキメラ合成のために使用する支持体は、ヒドロキシメチル安息香酸リンカーを有する、非膨潤性の高架橋ポリスチレンビーズである（Ｖｉｎａｙａｋ、１９９７）。キメラ合成のためのＰＮＡモノマーは、第一級アミノ保護のためにＭＭＴ基を使用する。第一工程において、各々ＤＭＦ／ＣＨ₃ＣＮ、１／１に溶解したモノマーＨＡＴＵおよびＤＩＰＥＡを、反応カートリッジに連続的に送達する、１６分後、キャッピング試薬を送達する。ＰＮＡの第一級アミノ官能基が移動または環化する傾向を最小化するために、最後のＭＭＴ基の除去の後に、そのアミノ末端をアセチル化する。ＤＮＡ部分およびＰＮＡ部分を連結するための試薬、ならびにキメラ合成、切断、脱保護、および精製のための他の手順は、記載された（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｌａａｎ、１９９７）。このアプローチにおいて、キメラを単一のカートリッジ内および単一の合成機において、連続的に作製し得る。
【０１０２】
固体支持体上のＰＮＡオリゴマーＨ₂Ｎ−ＴＣＣＴＣＣＴＴ（１μモル）を、上記手順により合成した。ポリスチレン支持体上のＰＮＡを、ＭＧＢ１−ＣＯ₂Ｈ（５ｍｇ、１０μモル、図６、Ｇｏｎｇ、１９９７）、ＨＡＴＵ（１０μモル）、５μｌ ＤＩＥＡおよび１００μｌ ＤＭＦの混合物と反応させ、そして室温で１時間静置した。次いで、この支持体をＤＭＦおよびＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄し、室温で１時間ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）で切断し、そしてエーテル中で沈殿させて、ＭＧＢ１−ＰＮＡを得た：
ＭＧＢ１−ＴＣＣＴＣＣＴＴ 配列番号６
ＭＧＢ１−ＰＮＡを、逆相ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析し、均一な純度および同一性を確認した。
【０１０３】
（実施例８． 固体支持体上のＰＮＡの、ＣＤＰＩ₃での標識化）
実施例９と同じ手順および試薬によって、Ｆｍｏｃ−ＣＤＰＩの３つの連続的なカップリング（図６、Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ、１９９５）で、ＣＤＰＩ₃をＰＮＡ Ｈ₂Ｎ−ＴＣＣＴＣＣＴＴに結合させ、ＣＤＰＩ₃標識化ＰＮＡを得た。Ｆｍｏｃで保護したＣＤＰＩモノマーユニット１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレート（５ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌｅ）を、１００μｌ ＮＭＰに溶解し、そして０．９５当量のＨＡＴＵ（ＤＭＦ中０．２Ｍ）および２当量のＤＩＥＡ（ＤＭＦ中０．４ｍ）で活性化した。室温で１時間後、活性化したＦｍｏｃ−ＣＤＰＩ溶液を、支持体に結合したＰＮＡに添加し、そして室温でさらに１時間、カップリングさせた。このカップリングに続いて、この支持体を２０ｍｌのＤＭＦで洗浄した。この樹脂支持体を１：４のピペリジン：ＤＭＦで室温で１０分間処理することによって、Ｆｍｏｃを除去した。このカップリングおよび脱保護のサイクルを、さらに２回繰り返し、合計で３つの手動カップリングとした。次いで、この支持体をＤＭＦおよびＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄し、続いてＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）を用いて室温で１時間切断し、続いて粗製ＣＤＰＩ₃−ＰＮＡをエーテルで沈殿させた：
ＣＤＰＩ₃−ＴＣＣＴＣＣＴＴ 配列番号７
ＣＤＰＩ₃−ＰＮＡを、逆相ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析し、均一な純度および同一性を確認した。
【０１０４】
（実施例９． Ｔａｑｍａｎ自己クエンチプローブの標識化支持体６上への標識化）
オリゴヌクレオチド５’ＦＡＭ−ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＧＴ３’を、ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機で、０．２μモルスケールで、ＦＡＭ標識したポリスチレン支持体６（図２、Ｌ＝６−カルボキシフルオレセインＦＡＭ、Ｓ＝ポリスチレン）を用いて合成した。標準的な０．２μｍｏｌ ＣＥサイクルを、全ての５’−ホスホラミダイト、３’−ＤＭＴホスホラミダイトヌクレオシド（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のカップリングについて２５秒から９０秒へとカップリング時間を増加させることによって、改変した。５’→３’の方向の合成の完了後に、アミノ−リンカーホスホラミダイト試薬８（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、最終モノマーとして３’末端にカップリングし、そしてＣＨ₂Ｃｌ₂中３％トリクロロ酢酸で脱トリチル化した。固体支持体上に３’−アミノ，５’−ＦＡＭオリゴヌクレオチドを保有する合成カラムを、合成機から取り外した。２つのルアーチップ型１ｍｌシリンジを、この合成カラムの各端部に取り付けた。１つのシリンジを、５００μｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１０．７ｍｇ（２５μモル）のＴＡＭＲＡ−ＣＯ₂Ｈで満たした。第二のシリンジを、２５０μｌの１：１のＤＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ中の９．２５ｍｇ（２５μモル）のＨＢＴＵおよび９μｌ（５０μモル）のジイソプロピルエチルアミンで満たした。これらのシリンジ内のカップリング剤を、各プランジャーを連続的に押下することによって、カラムを通過させた。約１分間、徹底的に混合した後に、このアセンブリを約１５分間静置し、カップリング反応を進行させた。試薬を１つのシリンジに引き込み、そして処分した。この合成カラムを５ｍｌの１：１のＤＭＦ：ＣＨ₃ＣＮ、５ｍｌのＣＨ₃ＣＮで洗浄し、そして１ｍｌのＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ₂：Ｈ₂Ｏ（１：１：２）で処理して、５’−ＦＡＭ，３’−Ｎ−ＴＡＭＲＡ Ｔａｑｍａｎ自己クエンチプローブ：
５’ＦＡＭ−ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＧＴ−Ｎ−ＴＡＭＲＡ３’ 配列番号８
を支持体から切断した。このプローブを含有する上清を加熱し、そして６５℃で３時間脱保護して、全ての保護基を除去した。このプローブを、逆相ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析し、均一な純度および同一性を確認した。
【０１０５】
全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が、具体的かつ個々に本明細書中に参考として援用されることが示されたと同程度まで、本明細書中に参考として援用される。
【０１０６】
ほんの数個の実施形態が上に詳細に記載されたが、分子生物学および化学の分野の当業者は、本開示の教示から逸脱することなく、好ましい実施形態において多数の変更が可能であることを、明白に理解する。全てのこのような変更は、上記の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、５’末端において標識化支持体に結合されるオリゴヌクレオチドを示す。
【図２】 図２は、支持体−リンカー−標識試薬への合成経路１〜６を示す。
【図３】 図３は、蛍光色素標識：ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＮＥＤ、ＶＩＣを示す。
【図４】 図４は、蛍光色素標識：ｄＪＯＮ、ｄＲ１３９、ＪＯＤＡおよびエネルギー移動ドナーＦＡＭを示す。
【図５】 図５は、蛍光消光剤標識：ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、ＮＴＢを示す。
【図６】 図６は、小溝バインダー標識：ＭＧＢ１、ＣＤＰＩモノマー、ＣＤＰＩ₃を示す。
【図７】 図７は、支持体上の５’−アミノヘキシルオリゴヌクレオチドへのＨＢＴＵカップリング試薬を用いるＴＡＭＲＡ標識化試薬のカップリングを示す。

Claims (18)

1. 標識された固体支持体上の５’標識化オリゴヌクレオチドの５’から３’への合成のための方法であって、以下：
   ａ）以下の構造：
   

   

   を有する標識した固体支持体を提供する工程であって、ここで
   Ｓは、固体支持体であり；
   Ａは、シリルエーテル、およびジスルフィド基からなる群より選択されるか、または切断可能なリンカーであるか、または
   ＡとＸとは一緒になってエステル部分を形成し；
   Ｘは、３つ以上の結合部位を有する部分であり；
   Ｌは、標識であり；
   Ｙは、酸素、ＮＨ、ＮＲ（ここでＲは、１〜１２炭素原子からなる直鎖、分枝または環式のアルキル基、置換アルキル、アリールおよび置換アリールからなる群から選択される）ならびにイオウからなる群から選択され；そして
   Ｐ_１は、ＤＭＴ、ＭＭＴ、トリチル、置換トリチル、ピキシルおよびトリアルキルシリルからなる群から選択される、酸により切断可能な保護基である、工程
   ｂ）標識した固体支持体を酸と反応させ、ＤＭＴ、ＭＭＴ、トリチル、置換トリチル、ピキシルおよびトリアルキルシリルからなる群から選択される、該酸により切断可能な保護基であるＰ_１を除去する工程；および
   ｃ）５’−ホスホロアミダイト、３’保護ヌクレオシドおよび活性化剤を添加し、これによりＹと該ヌクレオシドの５’末端との間で結合を形成する工程、
   を包含する、方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、以下：
   ｄ）前記固体支持体上の任意の未反応部位をキャップする工程；および
   ｅ）酸化剤を添加する工程、
   をさらに包含する、方法。
3. 請求項１に記載の方法であって、以下：
   ｄ）前記固体支持体上の任意の未反応部位をキャップする工程；
   ｅ）酸化剤を添加する工程；および
   ｆ）標識化オリゴヌクレオチドが完全に合成されるまで、前記工程ｂ）から工程ｅ）を繰り返す工程、
   をさらに包含する、方法。
4. 前記標識化オリゴヌクレオチドを脱保護する工程をさらに包含する、請求項３に記載の方法。
5. 前記固体支持体から前記標識化オリゴヌクレオチドを切断する工程および該標識化オリゴヌクレオチドを脱保護する工程をさらに包含する、請求項３に記載の方法。
6. 前記固体支持体Ｓが、ポリスチレン、制御細孔ガラス、シリカゲル、シリカ、ポリアクリルアミド、磁気ビーズ、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシならびにこれらのコポリマーおよびグラフトからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
7. 前記固体支持体Ｓの形態が、小さな粒子、ビーズ、膜、フリット、スライド、プレート、微細加工されたチップ、アルカンチオール−金層、非多孔質表面、アドレス可能なアレイおよびポリヌクレオチドを固定した媒体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
8. 前記Ａが、以下：
   

   

   からなる群から選択され、ここで、ｎは、１〜１２である、請求項１に記載の方法。
9. 請求項１に記載の方法であって、前記Ｘが以下：
   

   

   からなる群から選択され、ここで
   ｎは、１〜１２である、
   方法。
10. 前記標識Ｌが、ハイブリダイゼーション−安定化部分、蛍光色素、蛍光消光剤、エネルギー移動色素のセット、化学発光色素、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、酵素およびアフィニティーリガンドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
11. 請求項１に記載の方法であって、ここで前記５’−ホスホロアミダイト、３’保護したヌクレオシドモノマーが、以下の構造：
    

    

    を有し、ここで、
    Ｒは、シアノエチル、１〜１２炭素原子からなる直鎖、分枝または環式のアルキル基、置換アルキル、アリールおよび置換アリールからなる群から選択され；
    Ｒ_１およびＲ_２は、イソプロピル、モルホリノ、低級アルキル、シクロアルキルおよびアリールからなる群から独立して選択され；
    Ｐ_２は、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、およびジメチルホルムアミジンからなる群から選択される環外窒素保護基であり；そして
    Ｐ_３は、ＤＭＴ、ＭＭＴ、ピキシル、トリチルおよびトリアルキルシリルからなる群から選択される酸不安定な保護基である、
    方法。
12. 請求項３に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上のＤＮＡ，ＲＮＡおよび核酸アナログモノマーユニットを含み、ここで、該核酸アナログは、核酸塩基アナログ、糖アナログおよびヌクレオチド間アナログからなる群から選択される、方法。
13. 前記核酸塩基アナログが、Ｃ−５−アルキルピリミジン、２，６−ジアミノプリン、２−チオピリミジン、Ｃ−５−プロピンピリミジン、フェノキサジン、７−デアザプリン、イソシチジン、偽イソシチジン、イソグアノシン、ヒポキサンチン、８−オキソプリンおよび普遍塩基からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記糖アナログが、２’−Ｏ−アルキル−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチド、２’−アリル−リボヌクレオチド、２’−ハロ−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシチル−リボヌクレオチド、２’−分枝基−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−分枝基−リボヌクレオチド、４’−α−アノマーヌクレオチドおよび１’−α−アノマーヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
15. 前記ヌクレオチド間アナログが、２−アミノエチルグリシン（ＰＮＡ）、２’−５’−結合、逆転３’−３’結合、逆転５’−５’結合、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、非架橋Ｎ−置換ホスホラミデート、アルキル化ホスホトリエステル分枝構造および３’−Ｎ−ホスホラミデートからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
16. 請求項１に記載の方法であって、前記標識された固体支持体が以下の式：
    

    

    の化合物を含み、ここで
    Ｓは、ポリスチレンまたは制御細孔ガラスであり；そして
    Ｌは、標識である、
    方法。
17. 以下の式：
    

    

    の化合物を含む固体支持体であって、ここで
    Ｓは、固体支持体であり；
    Ａは、シリルエーテル、およびジスルフィド基からなる群より選択される、切断可能なリンカーであるか、または
    ＡとＸとは一緒になってエステル部分を形成し；
    Ｘは、３つ以上の結合部位を有する部分であり；
    Ｌは、標識であり；
    Ｙは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲおよびＳからなる群から選択され；
    Ｒは、シアノエチル、１〜１２炭素原子からなる直鎖、分枝または環式のアルキル基、置換アルキル、アリールおよび置換アリールからなる群から選択され；
    Ｐ_２は、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、およびジメチルホルムアミジンからなる群から選択される環外窒素保護基であり；そして
    Ｐ_３は、ＤＭＴ、ＭＭＴ、トリチル、置換トリチル、ピキシルおよびトリアルキルシリルからなる群から選択される酸不安定な保護基である、
    固体支持体。
18. 以下の式：
    

    

    の化合物を含む固体支持体であって、ここで
    ｎは、０〜１００の整数であり；
    Ｓは、固体支持体であり；
    Ａは、シリルエーテル、およびジスルフィド基からなる群より選択される、切断可能なリンカーであるか、または
    ＡとＸとは一緒になってエステル部分を形成し；
    Ｘは、３つ以上の結合部位を有する部分であり；
    Ｌは、標識であり；
    Ｙは、Ｏ、ＮＨ、ＮＲおよびＳからなる群から選択され；
    Ｒは、シアノエチル、１〜１２炭素原子からなる直鎖、分枝または環式のアルキル基、置換アルキル、アリールおよび置換アリールからなる群から選択され；
    Ｐ_２は、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、およびジメチルホルムアミジンからなる群から選択される環外窒素保護基である、
    固体支持体。

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