JP2002531071A - 個体支持体上のポリヌクレオチドの連結アセンブリおよび検出 - Google Patents
個体支持体上のポリヌクレオチドの連結アセンブリおよび検出Info
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Abstract
Description
固体支持体におけるポリヌクレオチドのアセンブリ、分析、検出、および切断の
ための方法に関連する。
ta,N.、Khorana,H.、Kleppe,K.、Kumar,A.、
Ohtsuka,E.、Raj Bhandary U.、van de Sa
nde,J.、Sgaramella,V.、Weber,H.、Yamada
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18日、公開日:1992年9月18日。 Aono,T.、Takada,H.、Shibata,H.、日本国出願平3
(1991)−93260号、公開特許番号平4(1992)−304,900
号、「標的核酸配列の検出方法およびこの検出方法のための試薬キット」出願日
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妥当な値段で容易に入手できることは、遺伝子配列情報の遺伝子機能情報への変
換を促進する。慎重に設計された、独特な配列の合成遺伝子は、変異タンパク質
を研究のためにより入手しやすくすることによって、遺伝子発現研究に刺激を与
える。
ヌクレオチドを、一度に少しずつ、均一な水性溶液中で、連続的にアニーリング
(ハイブリダイゼーション)およびライゲーションすることを必要とする(Kh
orana、1979:Blackburn、1996)。この方法では、重複
する、相補的なオリゴヌクレオチドの混合物は、2本の鎖に沿った隣接する位置
に鎖の中断(ニック)を有する正しい二本鎖断片(二重鎖DNA)の形成に有利
である条件下でアニーリングされる。次いで、得られた構築物は単離され、そし
て続く一連のアニーリング、ライゲーション、および単離を受ける。この方法は
有効、迅速、かつ特異的なハイブリダイゼーション、遺伝子の全構成成分の化学
合成、ならびに多くの分析操作および精製操作を必要とする。
ば複雑であり、そして全ての調整不良の、先端の無い、および他の点で不完全な
構築物を除去するのに無効である。それに加えて、全ての二本鎖断片およびオリ
ゴヌクレオチドの最適なハイブリダイゼーションは、遺伝子内のオリゴヌクレオ
チドの巧妙な選択に依存する。得られる二本鎖ポリヌクレオチドは、数キロベー
スの長さまで調製され得るが、収率は典型的には1%未満であり、そして合成遺
伝子構築物は、タンパク質発現レベルで測定した場合、天然の遺伝子と比較して
生物学的活性が大きく減少している(Agarwal、1970)。
(ii)核酸塩基修飾配列、(iii)不完全に脱保護された配列、および(i
v)他のヌクレオチドおよび非ヌクレオチド副産物から得られる不純物を生じる
、化学的オリゴヌクレオチド、特に長いオリゴヌクレオチド合成における公知の
不完全さを含む。不純なオリゴヌクレオチド混合物のハイブリダイゼーションは
、ミスマッチおよびハイブリダイゼーションの障害およびライゲーションの効率
の減少を引き起こし得る。最終的な結果は、合成遺伝子アセンブリで使用するた
めの、低い収率の機能的な正しい配列のオリゴヌクレオチドである。ポリヌクレ
オチド、すなわち遺伝子または遺伝子フラグメントの迅速かつ経済的なアセンブ
リのためのの効率的な方法が望ましい。
ための新規の方法に関する。本方法は、例えば、組換えタンパク質発現のための
合成遺伝子として、診断的アッセイのためのプローブとして、またはアンチセン
ス治療薬剤としての使用のためのポリヌクレオチドの、迅速な、効率的な、安価
な、そして大規模な合成に関する。固体支持体上で得られるポリヌクレオチドは
、(i)ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅し得るか、(ii)蛍光
に基づいたハイブリダイゼーションおよびエキソヌクレアーゼアッセイによって
定量および検出し得るか、(iii)固体支持体に結合している間に有用な目的
のために操作し得るか、または(iv)固体支持体から切断し得る。
含む。ここでその方法は、オリゴヌクレオチドを固体支持体上に固定化されたオ
リゴヌクレオチドにアニーリングさせる工程、ニック部位をライゲーションする
工程、そしてポリヌクレオチドの部分を伸長して固体支持体上に二本鎖ポリヌク
レオチドを産生する工程を包含する。
ない末端はリン酸基を有する。1つ以上の架橋オリゴヌクレオチドおよび2つ以
上のアセンブリオリゴヌクレオチドを、固定化されたオリゴヌクレオチドにアニ
ーリングさせ、隣接するアセンブリオリゴヌクレオチド間に連結可能なニックが
形成されるようにする。
定化ライゲーション産物にプライマーをアニーリングさせ、そして伸長して二本
鎖ポリヌクレオチドを作製する。アニーリングおよびライゲーション工程を、設
計された固定化二本鎖ポリヌクレオチドをアセンブリするために十分な回数反復
し得る。ポリヌクレオチドのアセンブリのための、アセンブリオリゴヌクレオチ
ドおよび架橋オリゴヌクレオチドの様々な組み合せを、図1−6に図示する。
それによって架橋オリゴヌクレオチドは固定化オリゴヌクレオチドの固定化され
ていない末端に相補的であり、そして突出を有する第1の二本鎖断片を作製する
。典型的には、架橋オリゴヌクレオチドより長く、そして固定化されていない鎖
の突出に相補的なアセンブリオリゴヌクレオチドが、固定化オリゴヌクレオチド
の固定化されていない末端に隣接するヌクレオチドでアニーリングし、ニック部
位および突出を有する第2の二本鎖断片を産生する。さらなるアセンブリオリゴ
ヌクレオチドおよび架橋オリゴヌクレオチドを導入し、そしてアニーリングさせ
て固定化された鎖にニック、および固定化されていない鎖にギャップを形成する
。そのニック部位を、固定化された鎖において、DNAリガーゼまたは化学的ラ
イゲーション手法によってライゲーションする。固定化されていない鎖を、ポリ
メラーゼ、およびプライマー、およびヌクレオチド5’三リン酸によって伸長さ
せ、二本鎖ポリヌクレオチドを作製する。
チドを、蛍光ハイブリダイゼーションアッセイによって検出および定量する方法
を提供する。その方法はさらに、レポーターおよび消光分子を含み、そして当該
ポリヌクレオチドに相補的な、自己消光、蛍光プローブを、合成が完了した後ア
ニーリングする工程を含む。そのプローブは、実質的に、3’末端付近のヌクレ
オチドに相補的な、5’末端付近のヌクレオチドから構成され得、それによって
アニーリングしていないプローブは消光状態で存在する。プローブがポリヌクレ
オチドにアニーリングすると、消光効果は失われるか、または実質的に最小化さ
れ、そして蛍光を検出し得る。
ーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅する方法を提供する。
ソヌクレアーゼアッセイによって検出および定量する方法を提供する(Lee、
1993;Holland、1991)。
化一本鎖ポリヌクレオチドを固相から溶液中へ切断する方法を提供する。
で自動化することによって、固体支持体上でポリヌクレオチドを合成する装置を
構築し得る。液体試薬を、プログラムによるマイクロプロセッサーコントロール
下で容器から固体支持体へ送達し得る。
na、1979)の、多くの限界および不完全さを回避し、そして以下の利点の
いくつか、または全てを与える: 1)固体支持体は、過剰なオリゴヌクレオチドおよびアニーリングしなかったオ
リゴヌクレオチド、副産物、試薬、および混入物の効率的な洗浄および除去を可
能にするように働く。遺伝子アセンブリの完了前に精製は必要でない。 2)DNAリガーゼはライゲーションの間に絶対的な特異性を必要とし、そして
校正の利点、すなわち正しいライゲーション産物を提供する。 3)DNAポリメラーゼもまた、伸長の点で完全な相補性を必要とし、そして校
正の利点、すなわち正しい伸長産物を提供する。 4)固定化されていない鎖の伸長は、最終的な遺伝子の一部分のみが合成オリゴ
ヌクレオチドで構築されることを必要とする。 5)合成オリゴヌクレオチドは比較的短くあり得、従ってそれらは安価、高純度
、および容易に入手可能である。 6)固体支持体に固定化されている間に、アセンブリされたポリヌクレオチドに
対してさらなる実験を行い得る。
下の意味を有すると意図される: 「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、天然ヌクレオチド単
量体またはそのアナログの直鎖多量体をいい、二本鎖および一本鎖デオキシリボ
ヌクレオチド「DNA」、リボヌクレオチド「RNA」、それらのα−アノマー
形態などを含む。
るオリゴヌクレオチドの多量体アナログであり、そして核酸に関連する性質およ
び特性をいくらか有する。
る単量体単位であり、「nt」と省略される。1つのヌクレオチドは3つの部分
から構成される:糖、リン酸、および核酸塩基(Blackburn、1996
)。二重鎖の一部である場合、ヌクレオチドは「塩基」または「塩基対」ともい
われ、「bp」と省略される。最も一般に天然に存在する核酸塩基、アデニン(
A)、グアニン(G)、ウラシル(U)、シトシン(C)、およびチミン(T)
は、一方のポリヌクレオチド鎖を配列特異的な様式で他方へ結合させる水素結合
官能基を有する。「ヌクレオシド」は、リン酸を欠くヌクレオチドをいう。通常
、ヌクレオシド単量体は「ホスホジエステル結合」で結合される。ここで、本明
細書中で使用される場合、「ホスホジエステル結合」は、ホスホジエステル結合
またはそのリン酸アナログを含む結合をいい、関連する対イオン、例えばH+、
NH4 +、Na+などを含む。ポリヌクレオチドは、代表的には数個の単量体単位
、例えば8〜40ntから数千の単量体単位の大きさの範囲である。ポリヌクレ
オチドに関するほとんどの分子生物学的適用は、15〜30ntの独特の配列を
必要とする。「ATGCCTG」のように、DNAポリヌクレオチドが文字の配
列で示されるときはいつでも、ヌクレオチドは左から右へ5’→3’の順序であ
ることが理解される。一本鎖オリゴヌクレオチドの末端は、「5’末端」および
「3’末端」といわれる。
におけるヌクレオチドの特異的な対の相補的なパターンをいい、これは水素結合
によって共に結合し、例えばAはTおよびUと対になり、そしてGはCと対にな
る。
。
連結している1つ以上の原子をいう。
る、固相中の物質をいう。1つ以上の結合部位による共有結合または非共有結合
によって、固体支持体はオリゴヌクレオチドで誘導体化され得、それによってオ
リゴヌクレオチドを固体支持体へ「固定化」する。
、そして二重鎖内の2つのオリゴヌクレオチド鎖間におけるワトソン/クリック
塩基対合相互作用をいう。
いう。突出は長さが1つ以上の塩基であり得、そしてポリヌクレオチドアセンブ
リの間に、ライゲーションおよび伸長の前に相補的なオリゴヌクレオチドのアニ
ーリングを可能にする。
分離を引き起こす。変性条件および試薬としては、熱、塩基性pH、高塩濃度、
ならびにホルムアミドおよび水酸化アンモニウムのような特定の変性剤が挙げら
れる。「非変性」条件は、二重鎖構造中の塩基対合が持続することを可能にする
。非変性条件としては、代表的には、低温、中性pH、低塩濃度、中性水性緩衝
液、および核酸塩基間の水素結合を破壊しない試薬が挙げられる。
ヌクレオチドを、ヌクレオチド間結合の形成を介して共有結合的に結合させる反
応をいう。
するオリゴヌクレオチドにおけるホスホジエステル結合の形成における、酵素の
クラスおよびその機能をいう。特に有効なライゲーションは、1つのオリゴヌク
レオチドの末端リン酸および隣接する第2のオリゴヌクレオチドの末端ヒドロキ
シル基が、二重らせん内で相補的な配列の反対側に共にアニーリングする場合に
起こる。すなわち、ここでライゲーションプロセスは連結可能なニック部位で「
ニック」をライゲーションし、そして相補的な二重鎖を作製する(Blackb
urn、1996)。隣接するオリゴヌクレオチド間の部位は、「連結可能なニ
ック部位」、「ニック部位」、または「ニック」といわれ、そこではホスホジエ
ステル結合は存在しないか、または切断されている。
いわれ、1つ以上のヌクレオチドからなる。ギャップは、プライマーの3’末端
からの伸長によって消去、または「埋める」ことができる。
る(extending)」は、鋳型/プライマー二重鎖、5’ヌクレオチド三
リン酸(NTP)、およびポリメラーゼ間の反応をいう。これはプライマーの3
’末端へのヌクレオチドの付加を生じ、その結果、付加されたヌクレオチドは鋳
型核酸の対応するヌクレオチドに相補的である。
化学ルミネセンス、および電気化学ルミネセンスのような手段によって、分子を
検出するためのシグナルを与えるような機能を行うことができる(Herman
son、1996)。あるいは、標識は、特異的なまたは非特異的な捕獲方法に
よって、分子の分離または固定化を可能にする(Andrus、1995)。
そしてその後プライマー伸長反応の開始点として働く、オリゴヌクレオチドをい
う。ここでプライマーは5’→3’の方向へ伸長される。
を切断する酵素活性をいう。この活性はエンド(内部のホスホジエステル結合を
切断する)またはエキソ(核酸鎖の5’末端または3’末端のいずれかに最も近
いホスホジエステル結合を切断する)のいずれかであり得る。
レポーターおよび消光剤が、このレポーターから消光剤へのエネルギー移動を可
能にする配置で、オリゴヌクレオチドに結合している。
、添付の図面で説明される。本発明は好ましい実施形態とともに記載されるが、
本発明をそれらの実施形態に制限することを意図しないことが理解される。これ
に反して、本発明は、代替物、改変物、および同等物を含むよう意図され、これ
は添付の特許請求の範囲によって定義されるように本発明に含まれ得る。
成は、従来の教示に従う(Beaucage、1992;Caruthers、
1983)。オリゴヌクレオチド合成のホスホラミダイト法(Beaucage
、1983;Beaucage、1992)は、本発明で使用されるオリゴヌク
レオチドの一般的に好まれる調製方法である。ホスホラミダイト法は、ヌクレオ
チド単量体単位の、固体支持体上で成長するDNA鎖への周期的な付加の、高度
に洗練された化学的操作であり、そして通常、市販の自動化された合成機(これ
は、マイクロプロセッサーで制御された試薬送達ロボットとして機能する)(例
えば、ABI 391、392、394、および3948 DNA/RNA合成
機(Perkin−Elmer Corp))を用いて行われる(Caruth
ers、1984)。オリゴヌクレオチドの5’末端または3’末端は、ホスホ
ラミダイト試薬を用いて(Horn、1986)か、またはポリヌクレオチドキ
ナーゼおよびATPを用いて酵素的に(Berger、1987、438−39
頁)リン酸化され得る。
ずれか1つを介して固体支持体上に固定化され得る。この支持体は不溶性の物質
から構成され、好ましくは、剛体または半剛体の特徴を有し、そして任意の形状
、例えばビーズのように球形、長方形、不規則な粒子、樹脂、ゲル、ミクロスフ
ェア、または実質的に平らであり得る。いくつかの実施形態では、例えばウェル
、一段高い領域、くぼみ、ピン、溝、棒、ピン、円柱の内壁または外壁などを有
する支持体上に、物理的に分離した合成領域のアレイを作成することが望ましく
あり得る。
tamm、1995)、ポリスチレン(Andrus、1993)、制御された
細孔ガラス(controlled−pore−grass)(Caruthe
rs、1984)、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ
アミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシ、またはそのコポリマーおよびグラ
フトを含む。ポリエチレンオキシ/ポリスチレンコポリマーが、低分子およびペ
プチド合成に広く使用され、そして本発明の特に好ましい固体支持体である(T
entagel、Rapp Polymere、Tubingen、Germa
ny)。ポリエチレンオキシ基の親水性の性質が、水性の溶媒を使用する場合、
迅速な反応速度および結合を促進する。固体支持体の他の実施形態は、小粒子、
膜、フリット、非多孔性表面、アドレス可能な(addressable)アレ
イ、ベクター、プラスミド、またはポリヌクレオチド固定化媒体を含む。
オン結合、または他の親和性相互作用によって、固体支持体上の化学的に反応性
の官能基に結合する。オリゴヌクレオチドは、その3’、5’、糖、または核酸
塩基部位で固体支持体に結合し得る(Goodchild、1990;Beau
cage、1993)。オリゴヌクレオチド合成の容易さおよび効率のため、お
よび安定なまたは選択的に切断可能なリンカーの利用可能な多くの選択肢のため
に、3’部位がリンカーを介して支持体へ結合するのが好ましい(Beauca
ge、1992)。この様式では、固定化オリゴヌクレオチドのグラムからキロ
グラム規模での調製物は、支持体1グラムあたり1〜2000nmoleのオリ
ゴヌクレオチドの充填範囲、および好ましくは支持体1グラムあたり500〜1
000nmoleのオリゴヌクレオチドの範囲で得ることができる。
達成される。結合ユニット、すなわちリンカーは、安定であり、そして相補配列
への固定化核酸の接近を容易にするように設計される。あるいは、ビオチンとア
ビジンまたはストレプトアビジン(stepavidin)との間のような非共
有結合が、有用である。オリゴヌクレオチドを結合するための代表的な方法は、
チオールを機能付与したポリスチレンビーズを、穏やかな酸化条件下で3’チオ
ール−オリゴヌクレオチドと結合させ、ジスルフィドリンカーを形成することで
ある。他の官能基リンカーの例は、エステル、アミド、カルバメート、尿素、ス
ルホネート、エーテルおよびチオエステルを含む。
OSETM(Pharmacia Biotech)のような支持体に結合したア
ビジンまたはストレプトアビジン(strepavidin)に固定化し得る。
、アセンブルされたポリヌクレオチドおよび前述の実施形態の成分オリゴヌクレ
オチドの指向性は、逆になるが、同等に適応し、そして有効である。
性媒体中で、室温または室温付近で、アセンブリのためにアニーリングされる。
例示的なアニーリング条件は、30〜65℃の温度範囲および0.2〜1.0M
のNaClまたはKCl、10〜50mMのMgCl2、100mMのトリス−
HCl、および0〜50%のホルムアミド、pH=7〜9のアセンブリ溶媒であ
る(Berger、1987、549頁)。例えば、1mgの支持体(1nmo
le、1μmoleのオリゴヌクレオチド/gmで充填)を、それぞれのアニー
リングおよびライゲーションサイクルの間に、総容量10〜50μlの溶液中で
、5nmoleのそれぞれのオリゴヌクレオチドとアニーリングさせる。
クレオチド間に位置する連結可能なニック部位のライゲーションをもたらす。D
NAリガーゼは、連結可能なニック部位で酵素的なライゲーションを行ってヌク
レオチド間にホスホジエステル結合を形成し、そして固定化ライゲーション産物
に連続的な鎖を形成する。DNAリガーゼを用いたライゲーションは高度に特異
的であり、そして一般的にニック部位近くに完全な相補性がある場合にのみ起こ
る。ATPまたはNAD+とともに、DNAリガーゼは2つの二本鎖オリゴヌク
レオチドの5’ホスホリル末端と3’ヒドロキシル末端との間の、ホスホジエス
テル結合の形成を触媒する(Wu、1987;Helfman、1987;Gr
ossman、1994)。
基が、隣接するアセンブリオリゴヌクレオチドの3’ヒドロキシル基にライゲー
ションされる。代表的には、連結可能なニック部位の5’末端はリン酸化され、
そして3’末端はヒドロキシル基であるが、5’ヒドロキシルおよび3’リン酸
の逆向きの方向も、DNAリガーゼによる効果的なライゲーションを導く(Sa
mbrook、1989、5.61頁)。固体支持体上にアセンブルされたポリ
ヌクレオチドの酵素的ライゲーションは、固体支持体上にアセンブルされたポリ
ヌクレオチド(例えば1c、図1)を、例えば20mMのジチオスレイトール、
10mMのMgCl2、1mMのATP、および50mMのトリス−HClでの
処理、続いてT4 DNAリガーゼまたは他の形式のリガーゼの添加によって行
い得る。例えば、1nmoleのアセンブルされたポリヌクレオチドは、総容量
10〜50μlの溶液中で1ユニットのリガーゼによってライゲーションを受け
る(Aono、1991)。37℃で穏やかに攪拌しながら数分から数時間後、
次いで、支持体をろ過、遠心分離、または吸引して過剰な液体試薬を除去し、そ
して数mlの0.1Mの酢酸トリエチルアンモニウム、pH7のような中性水性
緩衝液で洗浄する。
アンおよびジシクロヘキシルカルボジイミドのような試薬を用いて化学的にライ
ゲーションされて、2つの隣接するアセンブルされたオリゴヌクレオチドの間に
ヌクレオチド間リン酸結合を形成する。このうちの1つは、架橋オリゴヌクレオ
チドにアニーリングされる5’または3’リン酸基を有する(Shabarov
a、1991)。
ョン後、変性条件下で洗浄し得る。好ましい変性剤としては、水酸化ナトリウム
、水酸化アンモニウム、ホルムアミド、尿素、塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリ
ウムが挙げられる。
、DNAポリメラーゼ、プライマー、ヌクレオチド5’三リン酸、および伸長に
必要な他の試薬を用いて複製し、固体支持体上で二本鎖ポリヌクレオチドを作製
する(図6e)。
レオチドにアニーリングする。DNAポリメラーゼが、新しいヌクレオチド間リ
ン酸結合を形成することによって、ヌクレオチド5’三リン酸からプライマーの
3’末端への、相補的なヌクレオチドの連続的な結合を触媒する。従って、DN
Aの新たな相補鎖は、このプライマーから伸長される。
ヌクレオチドの固定化された鎖を、1つ以上の架橋オリゴヌクレオチドにアニー
リングし得、その反対側でニック部位がライゲーションされた。アセンブルされ
たポリヌクレオチドの一本鎖部分、すなわち「ギャップ」は、プライマー伸長、
続いてニックのライゲーションによって埋めることができる。二重鎖のギャップ
内の3’末端は、プライマーの3’末端から、DNAポリメラーゼ、および2’
−デオキシヌクレオチド−5’−三リン酸によって、公知の条件下で伸長され得
る(Berger、1987、91−98頁)。本発明の合成方法の伸長工程で
使用するのに、またはポリメラーゼ連鎖反応によるポリヌクレオチドの増幅で使
用するのに適切なポリメラーゼ酵素は、固体支持体に固定化されたポリヌクレオ
チドからヌクレオチド三リン酸を重合化され得るあらゆるものを含む。好ましい
ポリメラーゼ酵素は、高い忠実度および進化性を有する。適切な酵素としては、
DNAポリメラーゼI、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、T7
DNAポリメラーゼ、T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、およびAMV(
またはMuLV)逆転写酵素または近い相同性のある変異体が挙げられるがこれ
らに限定されない(Sambrook、1989、5.35−56頁)。より好
ましくは、伸長工程およびポリメラーゼ連鎖反応のための酵素は、Taqポリメ
ラーゼ、または近い相同性のある変異体である。
橋オリゴヌクレオチドは、変性条件下で固定化ライゲーション産物から除去され
得る。ポリメラーゼ、プライマー、およびヌクレオチド5’三リン酸を用いたプ
ライマー伸長が、プライミング(priming)部位から固定化された鎖を複
製し得る。プライマーは、固定化された鎖の3’末端へ向かって、その3’ヒド
ロキシルにおいて伸長する。
よるポリヌクレオチドの増幅で使用するのに適切なヌクレオチド5’三リン酸(
NTP)は、ポリメラーゼ酵素で重合化され得るあらゆるものを含む。適切なN
TPとしては、天然に存在する、および合成ヌクレオチド三リン酸の両方を含み
、ATP、dATP、CTP、dCTP、GTP、dGTP、UTP、TTP、
dUTP、5−メチル−CTP、5−メチル−dCTP、ITP、dITP、2
−アミノ−ATP、2−アミノ−dATP、および上記全てのα−チオ三リン酸
、2’−O−メチル−リボヌクレオチド5’−三リン酸、2’−フルオロ−NT
P、および2’−アミノ−NTPが挙げられるがこれらに限定されない。好まし
くは、本発明の方法で使用されるヌクレオチド三リン酸は、dATP、dCTP
、dGTP、TTPおよびその混合物からなる群から選択される。5−Br−U
TP、5−Br−dUTP、5−F−UTP、5−F−dUTP、5−プロピニ
ルdCTP、および5−プロピニル−dUTPを含むがこれらに限定されない修
飾核酸塩基もまた、使用され得る。これらヌクレオチド三リン酸のほとんどは、
Sigma Chemical Co.、St.Louis、MOのような市販
の供給源から広く入手可能である。ヌクレオチド三リン酸は、少なくともそれら
は一般的にオリゴヌクレオチドの化学的合成で使用されるホスホラミダイトヌク
レオシド単量体より安価であるために、本発明の方法で有利に使用される。
込むために、蛍光標識dNTP付加し得るか、またはATP、GTP、CTP、
TTPの1つ以上の代わりに用い得る。
le)上のアセンブルされたポリヌクレオチドに、以下を含む、以下の溶液(1
〜50μl)を添加することを含み得る:プライマーオリゴヌクレオチド(もし
必要なら)、1ユニットのDNAポリメラーゼ、80mMのトリス−HCl(p
H8.0)、10mMのジチオスレイトール、4mMのスペルミジン、8mMの
MgCl2、50mMのNaCl、160μg/mlのBSA、0.02%のT
riton X−100、およびそれぞれ2mMのATP、GTP、CTP、T
TP。例えば、37℃で10分から2時間後、過剰な液体試薬をこの支持体から
除去し、そしてこの支持体を0.1Mの酢酸トリエチルアンモニウムのような、
0.5−5mlの中性水性緩衝液で洗浄する(Sambrook、1989、5
.35−5.50頁)。
つかの好ましい実施形態を、ここで記載する。
を有するアセンブリオリゴヌクレオチド10(例えば1〜10mg、0.5〜2
0nmol)を、リンカー16を介して固体支持体15へ固定化する(1a、図
1)。固定化されたアセンブリオリゴヌクレオチド20を、アセンブリ溶液(例
えば、0.2MのNaClまたはKCl、および0〜50%のホルムアミド)に
懸濁する。室温または室温付近でワトソン/クリック塩基対合を容易にする水性
アセンブリ溶液が好ましい。例えば2〜10倍モル過剰(1〜200nmol)
の、固定化されたアセンブリオリゴヌクレオチド20に少なくとも部分的に相補
的な配列を有する架橋オリゴヌクレオチド25を、架橋オリゴヌクレオチドの固
定化アセンブリオリゴヌクレオチド20へのアニーリングに有利な条件下で加え
、2重鎖領域30、および最初の突出35を有するハイブリッド21を形成する
(1b)。過剰なまたはアニーリングしない架橋オリゴヌクレオチド25、およ
び他の不純物を、非変性条件下で固体支持体を洗浄することによって除去し得る
。例えば2〜10倍モル過剰(1〜200nmol)の、第1の突出35に少な
くとも部分的に相補的な配列を有するアセンブリオリゴヌクレオチド40を加え
る。アセンブリオリゴヌクレオチド40は、架橋オリゴヌクレオチド25の突出
35に、固定化オリゴヌクレオチド10に隣接してアニーリングし、連結可能な
ニック部位45および2番目の突出50を生成する(1c)。
ンに必要な他の試薬)を加え、固定化アセンブリオリゴヌクレオチド20を隣接
するアセンブリオリゴヌクレオチド40へライゲーションし、固定化ライゲーシ
ョン産物60を形成する(1d)。
マー、ヌクレオチド5’三リン酸、およびプライマー伸長に必要な他の試薬を用
いて合成し、固体支持体上に洗浄を用いて散在させる工程ポリヌクレオチド65
を生成する(1e)。
レオチド20(2a、図2)をアセンブリ溶液に懸濁する。固定化オリゴヌクレ
オチドに少なくとも部分的に相補的な配列を有する架橋オリゴヌクレオチド25
、および架橋オリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的な配列を有するア
センブリオリゴヌクレオチド40を、混合物として加える。架橋オリゴヌクレオ
チド25は、固定化アセンブリオリゴヌクレオチド20にアニーリングし、そし
てアセンブリオリゴヌクレオチド40は、固定化アセンブリオリゴヌクレオチド
20に隣接してアニーリングして、連結可能なニック部位45および突出50を
産生する(2b)。過剰なまたはアニーリングしなかったオリゴヌクレオチド2
5および40、および他の不純物を、非変性条件下で洗浄することによって除去
し得る。
ンに必要な他の試薬)を加え、固定化アセンブリオリゴヌクレオチド20を隣接
するアセンブリオリゴヌクレオチド40にライゲーションし、固定化ライゲーシ
ョン産物60を形成する(2c)。
ライマー、ヌクレオチド5’三リン酸、およびプライマー伸長に必要な他の試薬
を用いて合成し、固体支持体上に洗浄を用いて散在させる工程ポリヌクレオチド
65を生成する(2d)。
レオチド20(3a、図3)をアセンブリ溶液に懸濁する。2つ以上のアニーリ
ングオリゴヌクレオチド(例えば40a〜c)を、混合物として加える。混合物
は、アニーリングしてギャップ70a〜bを形成する1つ以上の架橋オリゴヌク
レオチド25a〜c、およびアニーリングして連結可能なニック部位45a〜c
を形成する1つ以上のアセンブリオリゴヌクレオチド40a〜cを含む(3b)
。過剰なまたはアニーリングしなかったオリゴヌクレオチド25および40、な
らびに他の不純物を、非変性条件下で洗浄することによって除去し得る。
に必要な他の試薬)を加え、隣接するアセンブリオリゴヌクレオチドのニック部
位をライゲーションし、固定化ライゲーション産物60を形成する(3c)。
マー、ヌクレオチド5’三リン酸、およびプライマー伸長に必要な他の試薬を用
いて合成し、固体支持体上に2重鎖ポリヌクレオチド65を産生する(3d)。
の連続アニーリング工程、続くライゲーション、および洗浄を用いて散在させる
工程を100回以上まで反復し得る(4e)。反復アニーリングおよびライゲー
ションした固定化ライゲーション産物75を、DNAポリメラーゼ、プライマー
、ヌクレオチド5’三リン酸、および伸長に必要な他の試薬を用いて複製し、固
体支持体上で固定化2重鎖ポリヌクレオチド65を生成する(4f)。
ドの同時アニーリング工程、続くライゲーション、および洗浄を用いて散在させ
る工程を100回以上まで反復し得る(5d)。反復アニーリングおよびライゲ
ーションした固定化ライゲーション産物75を、DNAポリメラーゼ、プライマ
ー、ヌクレオチド5’三リン酸、および伸長に必要な他の試薬を用いて複製し、
固体支持体上で固定化2重鎖ポリヌクレオチド65を産生する(5e)。
び1つ以上のアセンブリオリゴヌクレオチドの同時アニーリング工程、続くライ
ゲーション、そして洗浄を用いて散在させる工程を、100回以上まで反復し得
る(6d)。繰り返しアニーリングおよびライゲーションした固定化ライゲーシ
ョン産物75を、DNAポリメラーゼ、プライマー、ヌクレオチド5’三リン酸
、および伸長に必要な他の試薬を用いて複製し、固体支持体上で固定化洗浄を用
いて散在させる工程ポリヌクレオチド65を産生する(6e)。
る。遺伝子の大きさは、50bpから5000bp以上の範囲であり得る。計画
において、合成されるポリヌクレオチド配列の1本の鎖は、20〜200nt、
好ましくは30〜50ntの、アセンブリオリゴヌクレオチド配列の連続するセ
ットに分けられる。6〜40ntの架橋オリゴヌクレオチドを、アセンブリオリ
ゴヌクレオチドにアニーリングし、固定化された鎖にニック部位を形成するよう
に設計する。2重鎖領域を形成するオリゴヌクレオチドにおける相補的重複の程
度は、十分な特異性および親和性を提供する、任意の長さであり得る。好ましい
実施形態では、相補的重複は5〜10ntであり、そして50ntまでであり得
る。アセンブリされた遺伝子を含むアセンブリオリゴヌクレオチドおよび架橋オ
リゴヌクレオチドは、予想されるアニーリング性質、すなわち、熱融解温度、T m によって選択される。オリゴヌクレオチドのアニーリングから生じる2重鎖領
域は、洗浄工程、および他の操作に耐え、そして有効なライゲーションを受ける
のに十分安定でなければならない。
T、dU、5−メチル−C、5−メチルdC、I、dI、2−アミノ−A、2−
アミノ−dA、5−Br−U、5−Br−dU、5−F−U、5−F−dU、5
−プロピニルdC、5−プロピニル−dUのようなヌクレオチド単位、(ii)
ホスホジエステル、ホスホロチオエート、N−3−ホスホルアミダイトのような
ヌクレオチド間結合、および(iii)2’−デオキシリボース、2’−O−メ
チル−リボヌクレオチド、2’−フルオロ−リボヌクレオチド、および2’−ア
ミノ−リボヌクレオチドアナログのような糖を含み得る。
ーションエネルギーの計算に基づいて、最適なオリゴヌクレオチドのセットを設
計するのに使用し得る(Sambrook、1989、11.46頁)。オリゴ
ヌクレオチド配列設計でさらに考慮することは、(i)自己相補的ヘアピン領域
を避ける、(ii)低合成効率領域、例えば4つ以上の連続的なG単量体を避け
る、(iii)まれな、または少ししか発現しないコドン(を避ける)、および
(iv)切断およびさらなるクローニング操作のための制限部位の設置である。
本発明のアセンブリ方法の実施に必要なオリゴヌクレオチドの全セットを、この
ように設計および合成し得る。
り得、そして機能的遺伝子の部分ではない。固定化断片の配列は、制限酵素によ
って切断可能な制限部位を含み得る。固定化オリゴヌクレオチドは、プラスミド
またはベクターのような、より大きなポリヌクレオチド断片に連結し得る。本発
明のために適当なプラスミドの例は、M13由来のベクター、pUC、およびp
GEM(Sambrook、1989、第1章)が挙げられる。これは、大規模
細菌培養から増殖および回収され(Berger,1987、145−70頁)
、そしてポリヌクレオチドのアセンブリのために公知の制限部位で切断され得る
。
し得る(Stamm、1995)。例えば、50〜1000pmolの固定化ラ
イゲーション産物のアセンブリが完了後、DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド5
’三リン酸、および(i)固定化ライゲーション産物および(ii)その相補鎖
に相補的な2つのプライマーを含む、PCR試薬を溶液として加え得る。温度を
アニーリング/伸長温度と変性温度との間で循環させて、固定化ライゲーション
産物の2本鎖ポリヌクレオチド複製を溶液中で生成し得る。蛍光標識プライマー
として、または蛍光ヌクレオチドとして蛍光色素を組み込むことは、蛍光標識お
よび検出可能なポリヌクレオチドを生成し得る。異なったまたは同じ大きさの、
複数のPCR産物は、固定化ライゲーション産物の異なる部分にそれぞれ相補的
でありかつ反対の鎖における対として選択される、複数のプライマーを用いて、
単一のアセンブリされたポリヌクレオチドから得られ得る。特定のPCR産物を
規定するプライマーが、異なる蛍光色素で標識される場合、複数のPCR産物を
スペクトルで区別し、それによって検出および定量し得る。固体支持体における
マルチプレックス(multiplex)PCRもまた、固体支持体におけるP
CRの鋳型を扱う簡便で有効な方法であり、偶発的な鋳型の分散および誤まった
増幅からの汚染を少なくする。
法によって分析し得る。
アッセイによって検出および定量し得る。このアッセイは、固定化ライゲーショ
ン産物の一部分に相補的である自己消光オリゴヌクレオチドプローブを含む。こ
のプローブは、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)効果を介して相互作用する
ように配置された、蛍光レポーター色素および消光剤を含む(Clegg,R.
、1992)。この消光剤は、レポーターと相互作用して、その発光を変化させ
、通常レポーターの発光効果を減少させる。消光の効果は、レポーターから消光
剤までの距離とともに減少する。
’末端付近のヌクレオチドから成り得、それによってアニーリングされないプロ
ーブは消光状態で存在する。プローブの固定化ライゲーション産物へのアニーリ
ング際に、消光効果は減少し、そして蛍光を検出し得る。標的ポリヌクレオチド
へのハイブリダイゼーションの際の、自己相補的、自己消光プローブ(「分子標
識(Molecular Beacon)」)の蛍光の増加は、感度の高いアッ
セイ結果に十分である(Tyagi、1996;Tyagi、1997)。
、PCR中の増幅産物の実時間測定を提供する(Lee、1993;Holla
nd、1991)。固定化ライゲーション産物の部位に相補的な自己消光蛍光プ
ローブは、PCR混合物に含まれる。増幅の間、プローブは標的にアニーリング
し、そしてポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性によって置換およ
び切断される(図9)。存在するアセンブリされたポリヌクレオチドの量に比例
した蛍光シグナルが放出される(Livak、1996;Lee、1993)。
エキソヌクレアーゼアッセイは、さらなる試料のプロセシング無しに、固体支持
体上のアセンブリされたポリヌクレオチドの増幅から誘導されるPCR産物の直
接検出を与える。PCRが進行すると、ポリメラーゼが、アニーリングしたプロ
ーブを切断し、レポーターおよび消光剤を分離、蛍光の増加を引き起こす。
増幅産物の、終点および実時間測定方法を含む。終点方式では、蛍光測定をアセ
ンブリされたポリヌクレオチドの増幅が完了した後に行う。実時間方式では、蛍
光測定を増幅反応の間に複数回、例えばPCRプロセスのそれぞれの熱サイクル
の後に行う。アセンブリされたポリヌクレオチドの定量的測定(固体支持体1グ
ラムあたりのポリヌクレオチドの装填量)が必要な場合、同時方式が好ましい。
から少なくとも12ヌクレオチド離し、レポーター色素を、自己消光蛍光プロー
ブの5’末端または3’末端に結合し、そして消光色素を5’末端または3’末
端に結合する(Livak、1998)。自己消光プローブは、レポーターを消
光剤の近くに連れて行き、レポーターから消光剤への有効なエネルギー転移を可
能にするように設計される(Clegg、1992;Cardullo、198
8;Livak、1995)。レポーターおよび消光剤をまた、3’末端ヌクレ
オチドに結合し得る。本発明の他の実施形態では、蛍光剤および消光剤を、ポリ
ヌクレオチドの内部の部位に結合する。本発明はまた、2つの蛍光団の1つが、
内部の部位に位置し、そして他方の蛍光団を、ポリヌクレオチドの末端に結合す
る実施形態を含む。
、消光剤として適当な色素は、レポーターとしても適当であり得る。自己消光プ
ローブの1つの実施形態では、6−カルボキシ−フルオレセイン(6−FAM)
を、プローブの5’末端にレポーターとして標識し、そして6−カルボキシテト
ラメチルローダミン(TAMRA)を3’末端に消光剤として標識し、その結果
TAMRA色素は、ポリメラーゼによって切断されるまで、6−FAMによる任
意の蛍光発光を実質的に消光する。
るフルオレセイン色素である。ここでLはリンカーである。
セイン(5−FAM)、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、2’,
4’,1,4,−テトラクロロフルオレセイン(TET)、2’,4’,5’,
7’,1,4−ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、および2’,7’−ジ
メトキシ−4’,5’−ジクロロ−6−カルボキシフルオレセイン(JOE)で
ある(図7)。レポーター部分の他の実施形態は、シアニン色素、ダンシル誘導
体等である。
トラメチル−6−カルボキシローダミン(TAMRA)、およびテトラプロパノ
−6−カルボキシローダミン(ROX)からなる群から選択される)、および(
ii)DABSYL、DABCYL、シアニン、アントラキノン、ニトロチアゾ
ール、およびニトロイミダゾール化合物等である(図8)。ローダミン色素は、
下記の一般構造および付番方式を保有する。ここでLはリンカーである。
位置で置換され得る。
その両方の組み合せによってリンカーを切断することによって、固体支持体から
放出し得る。酵素的切断によって、アセンブリおよび架橋オリゴヌクレオチドは
、代表的には4〜8塩基対の長さの制限酵素認識配列を含むように選択され得、
次いで、アセンブリされたポリヌクレオチドの固体支持体からの切断が、適当な
制限酵素によって起こり得る。例えば、50pmolのアセンブリされたポリヌ
クレオチドにおける、下記の例で示される配列の切断は、1ユニットのHind
III制限酵素、10mMのTris−HCl、10mMのMgCl2、50m
MのNaCl、1mMのジチオトレイトール、pH7.9の混合物中で、25℃
、総容積25μlで行い得る。
またはより長いオリゴヌクレオチドを、ポリヌクレオチドの制限部位にハイブリ
ダイズすることにより、続いて対応する制限酵素で処理することによって、制限
酵素で切断し得る。切断は2本鎖制限部位で起こり、ポリヌクレオチドの固体支
持体からの分離を引き起こす。次いで、切断されたポリヌクレオチドの結合末端
を、ライゲーションおよびクローニング工程のために準備する。
て切断可能な不安定な官能基を含み得る。例えば、上記の図のLは、酢酸を用い
る室温での短い処理のような、弱酸によって切断されるトリチル基であり得る。
あるいは、Lは水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、または他の水性試薬で
、約pH12でまたはその付近で切断されるエステルまたはカルバミン酸のよう
な、塩基不安定な基であり得る。リンカーLは、ジチオトレイトール(クリーラ
ンド試薬)のような穏やかな還元剤で切断可能なジスルフィド官能基であり得る
。リンカーLは、テトラメチルアンモニウムフッ化物のような試薬でフッ化物イ
オンによって切断可能なシリルエーテル官能基であり得る。固体支持体上におけ
るアセンブリされたポリヌクレオチドのエステル結合の代表的な条件は、約1m
gの支持体を100μlの濃縮水酸化アンモニウムを用いて25℃で6時間処理
すること、および減圧下でアンモニアおよび水を除去するために、上清を別々の
容器に取ることを含む。
周期的な様式で自動化することによって、固体支持体上でポリヌクレオチドを合
成する装置を構築し得る。プログラムによるマイクロプロセッサー制御下で、液
体試薬を容器から固体支持体へ送達し得る。本発明の方法の適用は、特に固体支
持体化学へのポリヌクレオチドアセンブリの酵素的手段は、他の化学的、固相生
体高分子および低分子合成方法によって現実化された簡便性および有効性を利用
する。温度制御は、反応容器を冷却液または加熱液に浸すこと、または冷却/加
熱領域(例えば加熱ブロック、オーブン、冷蔵室)に置くことによって現実化さ
れ得る。アセンブリプロセスおよびPCR中の熱サイクルの全工程は、0〜10
0℃で行われ得る。液体試薬が静止した固相の固定化された反応物へ送達される
、本発明の不均一反応は、産物のワークアップ(work−up)、単離、およ
び精製の必要性を回避しながら、速い反応速度および高い収率を示し得る。従っ
て、アセンブリする生体高分子におけるモノマーの添加のような反復過程は、手
動および自動化手段による固体支持体合成によく適している。本発明は、遺伝子
の高処理能剛性、並行合成の自動化に役立つ。
可能な(addressable)位置)を、本発明で利用し得る。代表的には
アレイは、装置内の形式で固定された位置を有する平面表面である。それによっ
て自動化手段は、(i)化学的または酵素的反応を行う、(ii)変化または相
互作用を検出する、または(iii)多数の試料を表示するために固定または取
り付ける目的で、繰り返しアクセスする(visit)ことができる。合成アレ
イの空間的な配列は、プログラムされた、ロボットの自動化液体送達装置によっ
てアドレス可能な(addressable)ニ次元の表面であり得る。
参考として援用されることを明確かつ個々に示されるように、同じ程度に本明細
書中で参考文として援用される。
当業者は、それらの教示から逸脱することなく、好ましい実施形態において多く
の改変が可能であることを明確に理解する。そのような改変の全ては、添付の特
許請求の範囲に含まれることが意図される。
20(1a)への、架橋オリゴヌクレオチド25(1b)、続くアセンブリオリ
ゴヌクレオチド40の連続的なアニーリング、固定化された鎖におけるニック4
5の作製(1c)、固定化ライゲーション産物60を形成するためのニックのラ
イゲーション(1d)、および固定化二本鎖ポリヌクレオチド65を合成するた
めのポリメラーゼを用いた伸長(1e)を示す。
20(2a)への、2つのオリゴヌクレオチド、1つは架橋25および1つはア
センブリ40を混合物とした同時アニーリング、固定化された鎖におけるニック
45の作製(2b)、固定化ライゲーション産物60を形成するためのニックの
ライゲーション(2c)、ならびに固定化二本鎖ポリヌクレオチド65を合成す
るためのポリメラーゼを用いた伸長(2d)を示す。
20(3a)への、1つ以上の架橋オリゴヌクレオチド25および2つ以上のア
センブリオリゴヌクレオチド40の同時アニーリング、固定化された鎖における
ニック45、および固定化されていない鎖におけるギャップ70の作製(3b)
、固定化ライゲーション産物60を形成するためのニックのライゲーション(3
c)、ならびに固定化二本鎖ポリヌクレオチド65を合成するためのポリメラー
ゼを用いた伸長(3d)を示す。
20(4a)への、架橋オリゴヌクレオチド25(4b)、続くアセンブリオリ
ゴヌクレオチド40の連続的なアニーリング、固定化された鎖におけるニック4
5の作製(4c)、固定化ライゲーション産物60を形成するためのニックのラ
イゲーション(4d)、アニーリングおよびライゲーションの工程のn回反復(
4e)、ならびに固定化二本鎖ポリヌクレオチド65を合成するためのポリメラ
ーゼを用いた伸長(4f)を示す。
20(5a)への、2つのオリゴヌクレオチド、1つは架橋25および1つはア
センブリ40を混合物とした同時アニーリング、固定化された鎖におけるニック
45の作製(5b)、固定化ライゲーション産物60を形成するためのニックの
ライゲーション(5c)、アニーリングおよびライゲーションの工程のn回反復
(5d)、ならびに固定化二本鎖ポリヌクレオチド65を合成するためのポリメ
ラーゼを用いた伸長(5e)を示す。
20(6a)への、1つ以上の架橋オリゴヌクレオチド25および2つ以上のア
センブリオリゴヌクレオチド40の同時アニーリング、固定化された鎖における
ニック45、および固定化されていない鎖におけるギャップ70の作製(6b)
、固定化ライゲーション産物60を形成するためのニックのライゲーション(6
c)、アニーリングおよびライゲーションの工程のm回反復(6d)、ならびに
固定化二本鎖ポリヌクレオチド65を合成するためのポリメラーゼを用いた伸長
(6e)を示す。
オレセイン(6−FAM)、2’,4’,1,4,−テトラクロロフルオレセイ
ン(TET)、2’,4’,5’,7’,1,4−ヘキサクロロフルオレセイン
(HEX)、および2’,7’−ジメトキシ−4’,5’−ジクロロ−6−カル
ボキシローダミン(JOE)の構造を示す。ここで、Lはリンカーであり、そし
てそれらの置換された形態を含む。
およびテトラプロパノ−6−カルボキシローダミン(ROX)、DABSYLお
よびDABCYLの構造を示す。ここでLはリンカーであり、そしてそれらの置
換された形態を含む。
によってレポーター標識、F、および消光標識、Qをどちらも含む自己消光プロ
ーブ1、ならびに標的プライマー3aおよび3bが標的ポリヌクレオチド2にハ
イブリダイズする。増幅の重合段階の間に、プライマー3aおよび3bはポリメ
ラーゼ酵素、例えばDNAポリメラーゼを用いて伸長され、それによって伸長し
たプライマー4aおよび4bを形成する。プライマー伸長反応の間に、ポリメラ
ーゼの5’→3’ヌクレアーゼ活性が、プローブ1を切断するように働き、レポ
ーター保有フラグメント5および消光剤保有フラグメント6を含むプローブフラ
グメントを形成する。従って、レポーターおよび消光標識は分離され、それによ
ってこの2つの間でのエネルギー移動を阻止し、そしてプローブの消化の際にレ
ポーターの発光は消光されなくなり、蛍光の増加を引き起こす。
Claims (22)
- 【請求項1】 固体支持体上のポリヌクレオチドを合成する方法であって、
該方法は、以下の工程: a.1つ以上の架橋オリゴヌクレオチドと2つ以上のアセンブリオリゴヌクレオ
チドをアニーリングして、その結果、連結可能なニック部位を、隣接するアセン
ブリオリゴヌクレオチドの間に形成する工程であって、ここで、アセンブリオリ
ゴヌクレオチドの1つが、固体支持体上に固定化される、工程; b.連結可能なニック部位を連結して、それにより固定化された連結産物を形成
する工程; c. 固定化された連結産物に対して、プライマーをアニーリングする工程;お
よび d.プライマーを伸張して、固定化された、二本鎖ポリヌクレオチドを生成させ
る工程、 を包含する、方法。 - 【請求項2】 前記工程a.およびb.が、複数のサイクル繰り返される、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記工程a.およびb.が、1〜100のサイクル繰り返さ
れる、請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 前記固体支持体が、小粒子、ビーズ、膜、フリット、非孔性
表面、アドレスで呼び出せるアレイ、ベクター、プラスミド、またはポリヌクレ
オチド固定化媒体から構成される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項5】 50〜5000ヌクレオチド塩基対の長さのポリヌクレオチ
ドを合成するための、請求項1に記載の方法。 - 【請求項6】 前記アセンブリオリゴヌクレオチドは、20〜200の長さ
であり、そして架橋オリゴヌクレオチドが6〜40ヌクレオチドの長さである、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】 請求項1に記載の方法であって、前記固定化された連結産物
に対してアニーリングされた前記プライマーを伸張する前記工程d.が、以下:
ATP、dATP、CTP、dCTP、GTP、dGTP、UTP、TTP、d
UTP、5−メチル−CTP、5−メチル−dCTP、ITP、d−ITP、2
−アミノ−ATP、2−アミノ−dATP、5−Br−UTP、5−Br−dU
TP、5−F−UTP、5−F−dUTP、5−プロピニルdCTP、5−プロ
ピニル−dUTP、ならびに; 対応する、α−チオ三リン酸、2’−O−メチル−リボヌクレオチド三リン酸、
2’−フルオロ−NTP、2’−アミノ−NTPアナログ、および蛍光標識化N
TP、 からなる群から選択される、ヌクレオチド5’三リン酸を含む、方法。 - 【請求項8】 請求項7に記載の方法であって、前記蛍光標識が、プリンま
たはデアザプリンのN−9位またはC−8位、およびピリミジンのC−5位に結
合され、そして該蛍光標識は、FAM、TET、HEX、またはJOEからなる
群から選択される、方法。 - 【請求項9】 請求項1に記載の方法であって、前記アセンブリオリゴヌク
レオチドおよび架橋オリゴヌクレオチドが、以下: A、dA、C、dC、G、dG、U、T、dU、5−メチル−C、5−メチル−
dC、I、dI、2−アミノ−A、2−アミノ−dA、5−Br−U、5−Br
−dU、5−F−U、5−F−dU、5−プロピニルdC、5−プロピニル−d
U、ならびに; 対応する、ホスホロチオエート、N−3−ホスホルアミダイト、2’−O−メチ
ル−リボヌクレオチド、2’−フルオロ−リボヌクレオチド、および2’−アミ
ノ−リボヌクレオチドアナログ、 からなる群から選択される、方法。 - 【請求項10】 前記工程a.およびb.の後の非変性条件下で、周期的に
洗浄する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項11】 各前記連結工程b.の後の変性条件下で、支持体を洗浄す
る工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項12】 変性剤が、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、ホル
ムアミド、尿素、塩化ナトリウム、および酢酸ナトリウム、からなる群から選択
される、請求項11に記載の方法。 - 【請求項13】 前記ポリヌクレオチドが、化学的切断により前記支持体か
ら切断される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項14】 前記ポリヌクレオチドが、酵素的切断により前記支持体か
ら切断される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項15】 前記固定化されたポリヌクレオチドに相補的な、前記自己
消光蛍光プローブをアニーリングする工程を、さらに包含する、請求項1に記載
の方法。 - 【請求項16】 前記自己消光蛍光プローブが、3’末端付近のヌクレオチ
ドに、実質的に相補的な5’末端付近のヌクレオチドから構成され、それによっ
てアニーリングしないプローブが消光した状態で存在する、請求項15に記載の
方法。 - 【請求項17】 前記固定化された二本鎖ポリヌクレオチドに対する、前記
自己消光蛍光プローブのアニーリングの工程が、蛍光検出により測定される、請
求項15に記載の方法。 - 【請求項18】 前記固定化された連結産物に対してアニーリングされた前
記プライマーの伸張する工程d.が、以下: 5’→3’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性核酸ポリメラーゼ、該固定化され
た連結産物に対して相補的な該プライマー、該固定化された連結産物の相補体に
相補的な第2のプライマー、5’ヌクレオチド三リン酸;および自己消光蛍光プ
ローブであって、ここで、 該プローブは、ポリヌクレオチドに対してアニーリングされない場合に少なくと
も1つの一本鎖立体配座(ここで消光剤が、レポーターの蛍光を消光する)、お
よび該固定化された連結産物にアニーリングされる場合に少なくとも1つの立体
配座(ここで該レポーターの蛍光が消光されない)に存在する、プローブ;およ
び以下の工程: 該プライマーを、該固定化された連結産物にアニーリングする工程; 該固定化された連結産物をPCRにより増幅して、それにより標的ポリヌクレオ
チド増幅産物を生成させる工程; から構成される、ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項19】 前記核酸ポリメラーゼが、前記自己消光蛍光プローブを、
前記消光剤から前記レポーターを分離するための増幅の間に、消化する、請求項
18に記載の方法。 - 【請求項20】 前記標的ポリヌクレオチド増幅産物が、蛍光検出により測
定される、請求項18に記載の方法。 - 【請求項21】 前記標的ポリヌクレオチド増幅産物が、終点分析により測
定および定量される、請求項18に記載の方法。 - 【請求項22】 前記標的ポリヌクレオチド増幅産物が、実時間分析 により測定および定量される、請求項18に記載の方法。
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