JP2002531071A - 個体支持体上のポリヌクレオチドの連結アセンブリおよび検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、固体支持体上のポリヌクレオチドの、アニーリング、連結、および伸張の工程を行うことによるアセンブリの方法に関する。この工程は、循環様式で繰り返されて、機能的な遺伝子特性を有する、固定化された二本鎖または一本鎖ポリヌクレオチドをアセンブリし得る。この固定化されたポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅され得、そして自己消光蛍光プローブを用いるエキソヌクレアーゼアッセイによって検出および定量され得る。このポリヌクレオチドは、化学的切断または酵素的切断により、固体支持体から切断され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は一般的に、アニーリング、ライゲーション、および伸長工程による、
固体支持体におけるポリヌクレオチドのアセンブリ、分析、検出、および切断の
ための方法に関連する。

【０００２】 （参考文献） Ａｇａｒｗａｌ，Ｋ．、Ｂｕｃｈｉ，Ｈ．、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．、Ｇｕｐ
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【０００３】 （背景） 機能的遺伝子配列の操作は、分子クローニングの基礎である。合成遺伝子を、
妥当な値段で容易に入手できることは、遺伝子配列情報の遺伝子機能情報への変
換を促進する。慎重に設計された、独特な配列の合成遺伝子は、変異タンパク質
を研究のためにより入手しやすくすることによって、遺伝子発現研究に刺激を与
える。

【０００４】 新規の（ｄｅ ｎｏｖｏ）遺伝子合成の古典的方法は、構成成分の合成オリゴ
ヌクレオチドを、一度に少しずつ、均一な水性溶液中で、連続的にアニーリング
（ハイブリダイゼーション）およびライゲーションすることを必要とする（Ｋｈ
ｏｒａｎａ、１９７９：Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、１９９６）。この方法では、重複
する、相補的なオリゴヌクレオチドの混合物は、２本の鎖に沿った隣接する位置
に鎖の中断（ニック）を有する正しい二本鎖断片（二重鎖ＤＮＡ）の形成に有利
である条件下でアニーリングされる。次いで、得られた構築物は単離され、そし
て続く一連のアニーリング、ライゲーション、および単離を受ける。この方法は
有効、迅速、かつ特異的なハイブリダイゼーション、遺伝子の全構成成分の化学
合成、ならびに多くの分析操作および精製操作を必要とする。

【０００５】 アニーリングおよびライゲーション後の、中間体二本鎖断片の精製は、しばし
ば複雑であり、そして全ての調整不良の、先端の無い、および他の点で不完全な
構築物を除去するのに無効である。それに加えて、全ての二本鎖断片およびオリ
ゴヌクレオチドの最適なハイブリダイゼーションは、遺伝子内のオリゴヌクレオ
チドの巧妙な選択に依存する。得られる二本鎖ポリヌクレオチドは、数キロベー
スの長さまで調製され得るが、収率は典型的には１％未満であり、そして合成遺
伝子構築物は、タンパク質発現レベルで測定した場合、天然の遺伝子と比較して
生物学的活性が大きく減少している（Ａｇａｒｗａｌ、１９７０）。

【０００６】 遺伝子合成の古典的方法の限界は、（ｉ）結合しなかった、先端の無い配列、
（ｉｉ）核酸塩基修飾配列、（ｉｉｉ）不完全に脱保護された配列、および（ｉ
ｖ）他のヌクレオチドおよび非ヌクレオチド副産物から得られる不純物を生じる
、化学的オリゴヌクレオチド、特に長いオリゴヌクレオチド合成における公知の
不完全さを含む。不純なオリゴヌクレオチド混合物のハイブリダイゼーションは
、ミスマッチおよびハイブリダイゼーションの障害およびライゲーションの効率
の減少を引き起こし得る。最終的な結果は、合成遺伝子アセンブリで使用するた
めの、低い収率の機能的な正しい配列のオリゴヌクレオチドである。ポリヌクレ
オチド、すなわち遺伝子または遺伝子フラグメントの迅速かつ経済的なアセンブ
リのためのの効率的な方法が望ましい。

【０００７】 （要旨） 本発明は、固体支持体上においてポリヌクレオチドのアセンブリおよび検出の
ための新規の方法に関する。本方法は、例えば、組換えタンパク質発現のための
合成遺伝子として、診断的アッセイのためのプローブとして、またはアンチセン
ス治療薬剤としての使用のためのポリヌクレオチドの、迅速な、効率的な、安価
な、そして大規模な合成に関する。固体支持体上で得られるポリヌクレオチドは
、（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し得るか、（ｉｉ）蛍光
に基づいたハイブリダイゼーションおよびエキソヌクレアーゼアッセイによって
定量および検出し得るか、（ｉｉｉ）固体支持体に結合している間に有用な目的
のために操作し得るか、または（ｉｖ）固体支持体から切断し得る。

【０００８】 第１の局面では、本発明は固体支持体におけるポリヌクレオチドの合成方法を
含む。ここでその方法は、オリゴヌクレオチドを固体支持体上に固定化されたオ
リゴヌクレオチドにアニーリングさせる工程、ニック部位をライゲーションする
工程、そしてポリヌクレオチドの部分を伸長して固体支持体上に二本鎖ポリヌク
レオチドを産生する工程を包含する。

【０００９】

【化１】

【００１０】 オリゴヌクレオチドの第１の末端を固体支持体に固定化する。固定化されてい
ない末端はリン酸基を有する。１つ以上の架橋オリゴヌクレオチドおよび２つ以
上のアセンブリオリゴヌクレオチドを、固定化されたオリゴヌクレオチドにアニ
ーリングさせ、隣接するアセンブリオリゴヌクレオチド間に連結可能なニックが
形成されるようにする。

【００１１】 ニック部位を連結し、それによって固定化ライゲーション産物を形成する。固
定化ライゲーション産物にプライマーをアニーリングさせ、そして伸長して二本
鎖ポリヌクレオチドを作製する。アニーリングおよびライゲーション工程を、設
計された固定化二本鎖ポリヌクレオチドをアセンブリするために十分な回数反復
し得る。ポリヌクレオチドのアセンブリのための、アセンブリオリゴヌクレオチ
ドおよび架橋オリゴヌクレオチドの様々な組み合せを、図１−６に図示する。

【００１２】 架橋オリゴヌクレオチドは、固定化オリゴヌクレオチドにアニーリングする。
それによって架橋オリゴヌクレオチドは固定化オリゴヌクレオチドの固定化され
ていない末端に相補的であり、そして突出を有する第１の二本鎖断片を作製する
。典型的には、架橋オリゴヌクレオチドより長く、そして固定化されていない鎖
の突出に相補的なアセンブリオリゴヌクレオチドが、固定化オリゴヌクレオチド
の固定化されていない末端に隣接するヌクレオチドでアニーリングし、ニック部
位および突出を有する第２の二本鎖断片を産生する。さらなるアセンブリオリゴ
ヌクレオチドおよび架橋オリゴヌクレオチドを導入し、そしてアニーリングさせ
て固定化された鎖にニック、および固定化されていない鎖にギャップを形成する
。そのニック部位を、固定化された鎖において、ＤＮＡリガーゼまたは化学的ラ
イゲーション手法によってライゲーションする。固定化されていない鎖を、ポリ
メラーゼ、およびプライマー、およびヌクレオチド５’三リン酸によって伸長さ
せ、二本鎖ポリヌクレオチドを作製する。

【００１３】 本発明の第２の局面は、固体支持体上にアセンブリされた二本鎖ポリヌクレオ
チドを、蛍光ハイブリダイゼーションアッセイによって検出および定量する方法
を提供する。その方法はさらに、レポーターおよび消光分子を含み、そして当該
ポリヌクレオチドに相補的な、自己消光、蛍光プローブを、合成が完了した後ア
ニーリングする工程を含む。そのプローブは、実質的に、３’末端付近のヌクレ
オチドに相補的な、５’末端付近のヌクレオチドから構成され得、それによって
アニーリングしていないプローブは消光状態で存在する。プローブがポリヌクレ
オチドにアニーリングすると、消光効果は失われるか、または実質的に最小化さ
れ、そして蛍光を検出し得る。

【００１４】 本発明の第３の局面は、固体支持体上の二本鎖ポリヌクレオチドを、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する方法を提供する。

【００１５】 本発明の第４の局面は、ポリメラーゼ連鎖反応産物を、蛍光に基づいた、エキ
ソヌクレアーゼアッセイによって検出および定量する方法を提供する（Ｌｅｅ、
１９９３；Ｈｏｌｌａｎｄ、１９９１）。

【００１６】 本発明の第５の局面は、化学的切断または制限酵素による切断によって、固定
化一本鎖ポリヌクレオチドを固相から溶液中へ切断する方法を提供する。

【００１７】 アニーリング、ライゲーション、およびプライマー伸長の工程を周期的な方法
で自動化することによって、固体支持体上でポリヌクレオチドを合成する装置を
構築し得る。液体試薬を、プログラムによるマイクロプロセッサーコントロール
下で容器から固体支持体へ送達し得る。

【００１８】 本発明の特定の局面および実施態様は、遺伝子合成の古典的方法（Ｋｈｏｒａ
ｎａ、１９７９）の、多くの限界および不完全さを回避し、そして以下の利点の
いくつか、または全てを与える： １）固体支持体は、過剰なオリゴヌクレオチドおよびアニーリングしなかったオ
リゴヌクレオチド、副産物、試薬、および混入物の効率的な洗浄および除去を可
能にするように働く。遺伝子アセンブリの完了前に精製は必要でない。 ２）ＤＮＡリガーゼはライゲーションの間に絶対的な特異性を必要とし、そして
校正の利点、すなわち正しいライゲーション産物を提供する。 ３）ＤＮＡポリメラーゼもまた、伸長の点で完全な相補性を必要とし、そして校
正の利点、すなわち正しい伸長産物を提供する。 ４）固定化されていない鎖の伸長は、最終的な遺伝子の一部分のみが合成オリゴ
ヌクレオチドで構築されることを必要とする。 ５）合成オリゴヌクレオチドは比較的短くあり得、従ってそれらは安価、高純度
、および容易に入手可能である。 ６）固体支持体に固定化されている間に、アセンブリされたポリヌクレオチドに
対してさらなる実験を行い得る。

【００１９】 （定義） 他に述べなければ、以下の用語および句は、本明細書中で使用される場合、以
下の意味を有すると意図される： 「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、天然ヌクレオチド単
量体またはそのアナログの直鎖多量体をいい、二本鎖および一本鎖デオキシリボ
ヌクレオチド「ＤＮＡ」、リボヌクレオチド「ＲＮＡ」、それらのα−アノマー
形態などを含む。

【００２０】 「オリゴヌクレオチドアナログ」は、単量体ヌクレオチドアナログ単位からな
るオリゴヌクレオチドの多量体アナログであり、そして核酸に関連する性質およ
び特性をいくらか有する。

【００２１】 「ヌクレオチド」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのような、生体高分子の核酸におけ
る単量体単位であり、「ｎｔ」と省略される。１つのヌクレオチドは３つの部分
から構成される：糖、リン酸、および核酸塩基（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、１９９６
）。二重鎖の一部である場合、ヌクレオチドは「塩基」または「塩基対」ともい
われ、「ｂｐ」と省略される。最も一般に天然に存在する核酸塩基、アデニン（
Ａ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）
は、一方のポリヌクレオチド鎖を配列特異的な様式で他方へ結合させる水素結合
官能基を有する。「ヌクレオシド」は、リン酸を欠くヌクレオチドをいう。通常
、ヌクレオシド単量体は「ホスホジエステル結合」で結合される。ここで、本明
細書中で使用される場合、「ホスホジエステル結合」は、ホスホジエステル結合
またはそのリン酸アナログを含む結合をいい、関連する対イオン、例えばＨ⁺、
ＮＨ₄ ⁺、Ｎａ⁺などを含む。ポリヌクレオチドは、代表的には数個の単量体単位
、例えば８〜４０ｎｔから数千の単量体単位の大きさの範囲である。ポリヌクレ
オチドに関するほとんどの分子生物学的適用は、１５〜３０ｎｔの独特の配列を
必要とする。「ＡＴＧＣＣＴＧ」のように、ＤＮＡポリヌクレオチドが文字の配
列で示されるときはいつでも、ヌクレオチドは左から右へ５’→３’の順序であ
ることが理解される。一本鎖オリゴヌクレオチドの末端は、「５’末端」および
「３’末端」といわれる。

【００２２】 「ワトソン／クリック塩基対合」は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらのアナログ
におけるヌクレオチドの特異的な対の相補的なパターンをいい、これは水素結合
によって共に結合し、例えばＡはＴおよびＵと対になり、そしてＧはＣと対にな
る。

【００２３】 「結合部位」は、リンカーが結合しているオリゴヌクレオチド上の原子をいう
。

【００２４】 「リンカー」は、オリゴヌクレオチドを固体支持体、標識、または他の部分に
連結している１つ以上の原子をいう。

【００２５】 「固体支持体」という用語は、不均一反応によって液相中の試薬と相互作用す
る、固相中の物質をいう。１つ以上の結合部位による共有結合または非共有結合
によって、固体支持体はオリゴヌクレオチドで誘導体化され得、それによってオ
リゴヌクレオチドを固体支持体へ「固定化」する。

【００２６】 「アニーリング」という用語は「ハイブリダイゼーション」と同義で使用され
、そして二重鎖内の２つのオリゴヌクレオチド鎖間におけるワトソン／クリック
塩基対合相互作用をいう。

【００２７】 「突出」という用語は、二重鎖の塩基対合オリゴヌクレオチドの一本鎖末端を
いう。突出は長さが１つ以上の塩基であり得、そしてポリヌクレオチドアセンブ
リの間に、ライゲーションおよび伸長の前に相補的なオリゴヌクレオチドのアニ
ーリングを可能にする。

【００２８】 「変性」条件または試薬は、塩基対合を崩壊させ、そして二重鎖の一本鎖への
分離を引き起こす。変性条件および試薬としては、熱、塩基性ｐＨ、高塩濃度、
ならびにホルムアミドおよび水酸化アンモニウムのような特定の変性剤が挙げら
れる。「非変性」条件は、二重鎖構造中の塩基対合が持続することを可能にする
。非変性条件としては、代表的には、低温、中性ｐＨ、低塩濃度、中性水性緩衝
液、および核酸塩基間の水素結合を破壊しない試薬が挙げられる。

【００２９】 「ライゲーション（する）（ｌｉｇａｔｅ）」という用語は、隣接するオリゴ
ヌクレオチドを、ヌクレオチド間結合の形成を介して共有結合的に結合させる反
応をいう。

【００３０】 「リガーゼ」という用語は、同じオリゴヌクレオチドにアニーリングした隣接
するオリゴヌクレオチドにおけるホスホジエステル結合の形成における、酵素の
クラスおよびその機能をいう。特に有効なライゲーションは、１つのオリゴヌク
レオチドの末端リン酸および隣接する第２のオリゴヌクレオチドの末端ヒドロキ
シル基が、二重らせん内で相補的な配列の反対側に共にアニーリングする場合に
起こる。すなわち、ここでライゲーションプロセスは連結可能なニック部位で「
ニック」をライゲーションし、そして相補的な二重鎖を作製する（Ｂｌａｃｋｂ
ｕｒｎ、１９９６）。隣接するオリゴヌクレオチド間の部位は、「連結可能なニ
ック部位」、「ニック部位」、または「ニック」といわれ、そこではホスホジエ
ステル結合は存在しないか、または切断されている。

【００３１】 二重鎖で２つのオリゴヌクレオチドの間にある一本鎖部分は、「ギャップ」と
いわれ、１つ以上のヌクレオチドからなる。ギャップは、プライマーの３’末端
からの伸長によって消去、または「埋める」ことができる。

【００３２】 「プライマー伸長反応」、「伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」、および「伸長す
る（ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ）」は、鋳型／プライマー二重鎖、５’ヌクレオチド三
リン酸（ＮＴＰ）、およびポリメラーゼ間の反応をいう。これはプライマーの３
’末端へのヌクレオチドの付加を生じ、その結果、付加されたヌクレオチドは鋳
型核酸の対応するヌクレオチドに相補的である。

【００３３】 「標識」は、オリゴヌクレオチドに結合したグループを指す。標識は、蛍光、
化学ルミネセンス、および電気化学ルミネセンスのような手段によって、分子を
検出するためのシグナルを与えるような機能を行うことができる（Ｈｅｒｍａｎ
ｓｏｎ、１９９６）。あるいは、標識は、特異的なまたは非特異的な捕獲方法に
よって、分子の分離または固定化を可能にする（Ａｎｄｒｕｓ、１９９５）。

【００３４】 「プライマー」は、特定の標的核酸に選択的にアニーリングすることができ、
そしてその後プライマー伸長反応の開始点として働く、オリゴヌクレオチドをい
う。ここでプライマーは５’→３’の方向へ伸長される。

【００３５】 「５’→３’ヌクレアーゼ活性」という用語は、ホスホジエステル結合で核酸
を切断する酵素活性をいう。この活性はエンド（内部のホスホジエステル結合を
切断する）またはエキソ（核酸鎖の５’末端または３’末端のいずれかに最も近
いホスホジエステル結合を切断する）のいずれかであり得る。

【００３６】 「自己消光」という用語は、分子内蛍光エネルギー移動効果をいう。例えば、
レポーターおよび消光剤が、このレポーターから消光剤へのエネルギー移動を可
能にする配置で、オリゴヌクレオチドに結合している。

【００３７】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 参照は、いまや、本発明の好ましい実施形態に対して詳細になされ、その例は
、添付の図面で説明される。本発明は好ましい実施形態とともに記載されるが、
本発明をそれらの実施形態に制限することを意図しないことが理解される。これ
に反して、本発明は、代替物、改変物、および同等物を含むよう意図され、これ
は添付の特許請求の範囲によって定義されるように本発明に含まれ得る。

【００３８】 （Ｉ．アセンブリおよび架橋オリゴヌクレオチドの合成） 一般的に、本発明の架橋およびアセンブリオリゴヌクレオチドの設計および合
成は、従来の教示に従う（Ｂｅａｕｃａｇｅ、１９９２；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、
１９８３）。オリゴヌクレオチド合成のホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ
、１９８３；Ｂｅａｕｃａｇｅ、１９９２）は、本発明で使用されるオリゴヌク
レオチドの一般的に好まれる調製方法である。ホスホラミダイト法は、ヌクレオ
チド単量体単位の、固体支持体上で成長するＤＮＡ鎖への周期的な付加の、高度
に洗練された化学的操作であり、そして通常、市販の自動化された合成機（これ
は、マイクロプロセッサーで制御された試薬送達ロボットとして機能する）（例
えば、ＡＢＩ ３９１、３９２、３９４、および３９４８ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成
機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ））を用いて行われる（Ｃａｒｕｔｈ
ｅｒｓ、１９８４）。オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端は、ホスホ
ラミダイト試薬を用いて（Ｈｏｒｎ、１９８６）か、またはポリヌクレオチドキ
ナーゼおよびＡＴＰを用いて酵素的に（Ｂｅｒｇｅｒ、１９８７、４３８−３９
頁）リン酸化され得る。

【００３９】 オリゴヌクレオチドは、種々の周知の共有結合または非共有結合相互作用のい
ずれか１つを介して固体支持体上に固定化され得る。この支持体は不溶性の物質
から構成され、好ましくは、剛体または半剛体の特徴を有し、そして任意の形状
、例えばビーズのように球形、長方形、不規則な粒子、樹脂、ゲル、ミクロスフ
ェア、または実質的に平らであり得る。いくつかの実施形態では、例えばウェル
、一段高い領域、くぼみ、ピン、溝、棒、ピン、円柱の内壁または外壁などを有
する支持体上に、物理的に分離した合成領域のアレイを作成することが望ましく
あり得る。

【００４０】 好ましい支持体の材料は、アガロース、ポリアクリルアミド、磁気ビーズ（Ｓ
ｔａｍｍ、１９９５）、ポリスチレン（Ａｎｄｒｕｓ、１９９３）、制御された
細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ−ｇｒａｓｓ）（Ｃａｒｕｔｈｅ
ｒｓ、１９８４）、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ
アミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシ、またはそのコポリマーおよびグラ
フトを含む。ポリエチレンオキシ／ポリスチレンコポリマーが、低分子およびペ
プチド合成に広く使用され、そして本発明の特に好ましい固体支持体である（Ｔ
ｅｎｔａｇｅｌ、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）。ポリエチレンオキシ基の親水性の性質が、水性の溶媒を使用する場合、
迅速な反応速度および結合を促進する。固体支持体の他の実施形態は、小粒子、
膜、フリット、非多孔性表面、アドレス可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）アレ
イ、ベクター、プラスミド、またはポリヌクレオチド固定化媒体を含む。

【００４１】 本発明の方法において使用される場合、オリゴヌクレオチドは、共有結合、イ
オン結合、または他の親和性相互作用によって、固体支持体上の化学的に反応性
の官能基に結合する。オリゴヌクレオチドは、その３’、５’、糖、または核酸
塩基部位で固体支持体に結合し得る（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、１９９０；Ｂｅａｕ
ｃａｇｅ、１９９３）。オリゴヌクレオチド合成の容易さおよび効率のため、お
よび安定なまたは選択的に切断可能なリンカーの利用可能な多くの選択肢のため
に、３’部位がリンカーを介して支持体へ結合するのが好ましい（Ｂｅａｕｃａ
ｇｅ、１９９２）。この様式では、固定化オリゴヌクレオチドのグラムからキロ
グラム規模での調製物は、支持体１グラムあたり１〜２０００ｎｍｏｌｅのオリ
ゴヌクレオチドの充填範囲、および好ましくは支持体１グラムあたり５００〜１
０００ｎｍｏｌｅのオリゴヌクレオチドの範囲で得ることができる。

【００４２】 固定化は、好ましくは支持体およびオリゴヌクレオチド間の共有結合によって
達成される。結合ユニット、すなわちリンカーは、安定であり、そして相補配列
への固定化核酸の接近を容易にするように設計される。あるいは、ビオチンとア
ビジンまたはストレプトアビジン（ｓｔｅｐａｖｉｄｉｎ）との間のような非共
有結合が、有用である。オリゴヌクレオチドを結合するための代表的な方法は、
チオールを機能付与したポリスチレンビーズを、穏やかな酸化条件下で３’チオ
ール−オリゴヌクレオチドと結合させ、ジスルフィドリンカーを形成することで
ある。他の官能基リンカーの例は、エステル、アミド、カルバメート、尿素、ス
ルホネート、エーテルおよびチオエステルを含む。

【００４３】 ５’または３’ビオチン化オリゴヌクレオチドを、ガラスまたはＳＥＰＨＡＲ
ＯＳＥ^TM（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような支持体に結合したア
ビジンまたはストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）に固定化し得る。

【００４４】 あるいはオリゴヌクレオチドの５’末端を固体支持体に固定化し得る。従って
、アセンブルされたポリヌクレオチドおよび前述の実施形態の成分オリゴヌクレ
オチドの指向性は、逆になるが、同等に適応し、そして有効である。

【００４５】 （ＩＩ．アニーリング、ライゲーション、および伸長） （アニーリング） オリゴヌクレオチドは、好ましくはワトソン／クリック塩基対合を促進する水
性媒体中で、室温または室温付近で、アセンブリのためにアニーリングされる。
例示的なアニーリング条件は、３０〜６５℃の温度範囲および０．２〜１．０Ｍ
のＮａＣｌまたはＫＣｌ、１０〜５０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１００ｍＭのトリス−
ＨＣｌ、および０〜５０％のホルムアミド、ｐＨ＝７〜９のアセンブリ溶媒であ
る（Ｂｅｒｇｅｒ、１９８７、５４９頁）。例えば、１ｍｇの支持体（１ｎｍｏ
ｌｅ、１μｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド／ｇｍで充填）を、それぞれのアニー
リングおよびライゲーションサイクルの間に、総容量１０〜５０μｌの溶液中で
、５ｎｍｏｌｅのそれぞれのオリゴヌクレオチドとアニーリングさせる。

【００４６】 （ライゲーション） ライゲーション反応では、ライゲーション試薬が、２つのアセンブリオリゴヌ
クレオチド間に位置する連結可能なニック部位のライゲーションをもたらす。Ｄ
ＮＡリガーゼは、連結可能なニック部位で酵素的なライゲーションを行ってヌク
レオチド間にホスホジエステル結合を形成し、そして固定化ライゲーション産物
に連続的な鎖を形成する。ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーションは高度に特異
的であり、そして一般的にニック部位近くに完全な相補性がある場合にのみ起こ
る。ＡＴＰまたはＮＡＤ⁺とともに、ＤＮＡリガーゼは２つの二本鎖オリゴヌク
レオチドの５’ホスホリル末端と３’ヒドロキシル末端との間の、ホスホジエス
テル結合の形成を触媒する（Ｗｕ、１９８７；Ｈｅｌｆｍａｎ、１９８７；Ｇｒ
ｏｓｓｍａｎ、１９９４）。

【００４７】 本発明の好ましい実施形態では、アセンブリオリゴヌクレオチドの５’リン酸
基が、隣接するアセンブリオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシル基にライゲー
ションされる。代表的には、連結可能なニック部位の５’末端はリン酸化され、
そして３’末端はヒドロキシル基であるが、５’ヒドロキシルおよび３’リン酸
の逆向きの方向も、ＤＮＡリガーゼによる効果的なライゲーションを導く（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ、１９８９、５．６１頁）。固体支持体上にアセンブルされたポリ
ヌクレオチドの酵素的ライゲーションは、固体支持体上にアセンブルされたポリ
ヌクレオチド（例えば１ｃ、図１）を、例えば２０ｍＭのジチオスレイトール、
１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＡＴＰ、および５０ｍＭのトリス−ＨＣｌでの
処理、続いてＴ４ ＤＮＡリガーゼまたは他の形式のリガーゼの添加によって行
い得る。例えば、１ｎｍｏｌｅのアセンブルされたポリヌクレオチドは、総容量
１０〜５０μｌの溶液中で１ユニットのリガーゼによってライゲーションを受け
る（Ａｏｎｏ、１９９１）。３７℃で穏やかに攪拌しながら数分から数時間後、
次いで、支持体をろ過、遠心分離、または吸引して過剰な液体試薬を除去し、そ
して数ｍｌの０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７のような中性水性
緩衝液で洗浄する。

【００４８】 アセンブルされたポリヌクレオチドの連結可能なニック部位はまた、ブロモシ
アンおよびジシクロヘキシルカルボジイミドのような試薬を用いて化学的にライ
ゲーションされて、２つの隣接するアセンブルされたオリゴヌクレオチドの間に
ヌクレオチド間リン酸結合を形成する。このうちの１つは、架橋オリゴヌクレオ
チドにアニーリングされる５’または３’リン酸基を有する（Ｓｈａｂａｒｏｖ
ａ、１９９１）。

【００４９】 固体支持体を、固定化していない鎖を除去するために、それぞれのライゲーシ
ョン後、変性条件下で洗浄し得る。好ましい変性剤としては、水酸化ナトリウム
、水酸化アンモニウム、ホルムアミド、尿素、塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリ
ウムが挙げられる。

【００５０】 （伸長） 繰り返しアニーリングおよびライゲーションした固定化ライゲーション産物を
、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ヌクレオチド５’三リン酸、および伸長に
必要な他の試薬を用いて複製し、固体支持体上で二本鎖ポリヌクレオチドを作製
する（図６ｅ）。

【００５１】 プライマー伸長反応では、ポリヌクレオチドに相補的なプライマーがポリヌク
レオチドにアニーリングする。ＤＮＡポリメラーゼが、新しいヌクレオチド間リ
ン酸結合を形成することによって、ヌクレオチド５’三リン酸からプライマーの
３’末端への、相補的なヌクレオチドの連続的な結合を触媒する。従って、ＤＮ
Ａの新たな相補鎖は、このプライマーから伸長される。

【００５２】 アニーリングおよびライゲーションサイクルの完了後、アセンブルされたポリ
ヌクレオチドの固定化された鎖を、１つ以上の架橋オリゴヌクレオチドにアニー
リングし得、その反対側でニック部位がライゲーションされた。アセンブルされ
たポリヌクレオチドの一本鎖部分、すなわち「ギャップ」は、プライマー伸長、
続いてニックのライゲーションによって埋めることができる。二重鎖のギャップ
内の３’末端は、プライマーの３’末端から、ＤＮＡポリメラーゼ、および２’
−デオキシヌクレオチド−５’−三リン酸によって、公知の条件下で伸長され得
る（Ｂｅｒｇｅｒ、１９８７、９１−９８頁）。本発明の合成方法の伸長工程で
使用するのに、またはポリメラーゼ連鎖反応によるポリヌクレオチドの増幅で使
用するのに適切なポリメラーゼ酵素は、固体支持体に固定化されたポリヌクレオ
チドからヌクレオチド三リン酸を重合化され得るあらゆるものを含む。好ましい
ポリメラーゼ酵素は、高い忠実度および進化性を有する。適切な酵素としては、
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ７
ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、およびＡＭＶ（
またはＭｕＬＶ）逆転写酵素または近い相同性のある変異体が挙げられるがこれ
らに限定されない（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９、５．３５−５６頁）。より好
ましくは、伸長工程およびポリメラーゼ連鎖反応のための酵素は、Ｔａｑポリメ
ラーゼ、または近い相同性のある変異体である。

【００５３】 あるいは、固定化されていない鎖および固定化された鎖にアニーリングした架
橋オリゴヌクレオチドは、変性条件下で固定化ライゲーション産物から除去され
得る。ポリメラーゼ、プライマー、およびヌクレオチド５’三リン酸を用いたプ
ライマー伸長が、プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）部位から固定化された鎖を複
製し得る。プライマーは、固定化された鎖の３’末端へ向かって、その３’ヒド
ロキシルにおいて伸長する。

【００５４】 本発明の合成方法の伸長工程で使用するのに、またはポリメラーゼ連鎖反応に
よるポリヌクレオチドの増幅で使用するのに適切なヌクレオチド５’三リン酸（
ＮＴＰ）は、ポリメラーゼ酵素で重合化され得るあらゆるものを含む。適切なＮ
ＴＰとしては、天然に存在する、および合成ヌクレオチド三リン酸の両方を含み
、ＡＴＰ、ｄＡＴＰ、ＣＴＰ、ｄＣＴＰ、ＧＴＰ、ｄＧＴＰ、ＵＴＰ、ＴＴＰ、
ｄＵＴＰ、５−メチル−ＣＴＰ、５−メチル−ｄＣＴＰ、ＩＴＰ、ｄＩＴＰ、２
−アミノ−ＡＴＰ、２−アミノ−ｄＡＴＰ、および上記全てのα−チオ三リン酸
、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド５’−三リン酸、２’−フルオロ−ＮＴ
Ｐ、および２’−アミノ−ＮＴＰが挙げられるがこれらに限定されない。好まし
くは、本発明の方法で使用されるヌクレオチド三リン酸は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ
、ｄＧＴＰ、ＴＴＰおよびその混合物からなる群から選択される。５−Ｂｒ−Ｕ
ＴＰ、５−Ｂｒ−ｄＵＴＰ、５−Ｆ−ＵＴＰ、５−Ｆ−ｄＵＴＰ、５−プロピニ
ルｄＣＴＰ、および５−プロピニル−ｄＵＴＰを含むがこれらに限定されない修
飾核酸塩基もまた、使用され得る。これらヌクレオチド三リン酸のほとんどは、
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯのような市販
の供給源から広く入手可能である。ヌクレオチド三リン酸は、少なくともそれら
は一般的にオリゴヌクレオチドの化学的合成で使用されるホスホラミダイトヌク
レオシド単量体より安価であるために、本発明の方法で有利に使用される。

【００５５】 あるいは、二本鎖のアセンブルされたポリヌクレオチド産物に蛍光色素を組み
込むために、蛍光標識ｄＮＴＰ付加し得るか、またはＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、
ＴＴＰの１つ以上の代わりに用い得る。

【００５６】 プライマー伸長のための代表的な条件は、固体支持体（５０〜１０００ｐｍｏ
ｌｅ）上のアセンブルされたポリヌクレオチドに、以下を含む、以下の溶液（１
〜５０μｌ）を添加することを含み得る：プライマーオリゴヌクレオチド（もし
必要なら）、１ユニットのＤＮＡポリメラーゼ、８０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）、１０ｍＭのジチオスレイトール、４ｍＭのスペルミジン、８ｍＭの
ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭのＮａＣｌ、１６０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．０２％のＴ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、およびそれぞれ２ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、Ｔ
ＴＰ。例えば、３７℃で１０分から２時間後、過剰な液体試薬をこの支持体から
除去し、そしてこの支持体を０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウムのような、
０．５−５ｍｌの中性水性緩衝液で洗浄する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９、５
．３５−５．５０頁）。

【００５７】 （ＩＩＩ．ポリヌクレオチドのアセンブリ） 固体支持体上のポリヌクレオチドのアセンブリ方法を例証する、本発明のいく
つかの好ましい実施形態を、ここで記載する。

【００５８】 （１．連続アニーリング） 本発明のアセンブリ方法の第１の実施形態では、好ましくは５’リン酸基１１
を有するアセンブリオリゴヌクレオチド１０（例えば１〜１０ｍｇ、０．５〜２
０ｎｍｏｌ）を、リンカー１６を介して固体支持体１５へ固定化する（１ａ、図
１）。固定化されたアセンブリオリゴヌクレオチド２０を、アセンブリ溶液（例
えば、０．２ＭのＮａＣｌまたはＫＣｌ、および０〜５０％のホルムアミド）に
懸濁する。室温または室温付近でワトソン／クリック塩基対合を容易にする水性
アセンブリ溶液が好ましい。例えば２〜１０倍モル過剰（１〜２００ｎｍｏｌ）
の、固定化されたアセンブリオリゴヌクレオチド２０に少なくとも部分的に相補
的な配列を有する架橋オリゴヌクレオチド２５を、架橋オリゴヌクレオチドの固
定化アセンブリオリゴヌクレオチド２０へのアニーリングに有利な条件下で加え
、２重鎖領域３０、および最初の突出３５を有するハイブリッド２１を形成する
（１ｂ）。過剰なまたはアニーリングしない架橋オリゴヌクレオチド２５、およ
び他の不純物を、非変性条件下で固体支持体を洗浄することによって除去し得る
。例えば２〜１０倍モル過剰（１〜２００ｎｍｏｌ）の、第１の突出３５に少な
くとも部分的に相補的な配列を有するアセンブリオリゴヌクレオチド４０を加え
る。アセンブリオリゴヌクレオチド４０は、架橋オリゴヌクレオチド２５の突出
３５に、固定化オリゴヌクレオチド１０に隣接してアニーリングし、連結可能な
ニック部位４５および２番目の突出５０を生成する（１ｃ）。

【００５９】 ライゲーション試薬（例えば、ＤＮＡリガーゼ、ＡＴＰ、およびライゲーショ
ンに必要な他の試薬）を加え、固定化アセンブリオリゴヌクレオチド２０を隣接
するアセンブリオリゴヌクレオチド４０へライゲーションし、固定化ライゲーシ
ョン産物６０を形成する（１ｄ）。

【００６０】 次いで、固定化ライゲーション産物の相補鎖を、ＤＮＡポリメラーゼ、プライ
マー、ヌクレオチド５’三リン酸、およびプライマー伸長に必要な他の試薬を用
いて合成し、固体支持体上に洗浄を用いて散在させる工程ポリヌクレオチド６５
を生成する（１ｅ）。

【００６１】 （２．２つのオリゴヌクレオチドを用いた同時アニーリング） 本発明のアセンブリ方法の第２の実施形態では、固定化アセンブリオリゴヌク
レオチド２０（２ａ、図２）をアセンブリ溶液に懸濁する。固定化オリゴヌクレ
オチドに少なくとも部分的に相補的な配列を有する架橋オリゴヌクレオチド２５
、および架橋オリゴヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的な配列を有するア
センブリオリゴヌクレオチド４０を、混合物として加える。架橋オリゴヌクレオ
チド２５は、固定化アセンブリオリゴヌクレオチド２０にアニーリングし、そし
てアセンブリオリゴヌクレオチド４０は、固定化アセンブリオリゴヌクレオチド
２０に隣接してアニーリングして、連結可能なニック部位４５および突出５０を
産生する（２ｂ）。過剰なまたはアニーリングしなかったオリゴヌクレオチド２
５および４０、および他の不純物を、非変性条件下で洗浄することによって除去
し得る。

【００６２】 ライゲーション試薬（例えば、ＤＮＡリガーゼ、ＡＴＰ、およびライゲーショ
ンに必要な他の試薬）を加え、固定化アセンブリオリゴヌクレオチド２０を隣接
するアセンブリオリゴヌクレオチド４０にライゲーションし、固定化ライゲーシ
ョン産物６０を形成する（２ｃ）。

【００６３】 次いで固定化ライゲーション産物に対する相補鎖を、ＤＮＡポリメラーゼ、プ
ライマー、ヌクレオチド５’三リン酸、およびプライマー伸長に必要な他の試薬
を用いて合成し、固体支持体上に洗浄を用いて散在させる工程ポリヌクレオチド
６５を生成する（２ｄ）。

【００６４】 上記は、第ＩＩＩ．１節と類似の様式および類似の量で行われ得る。

【００６５】 （３．２つを超えるオリゴヌクレオチドを用いる同時アニーリング） 本発明のアセンブリ方法の第３の実施形態では、固定化アセンブリオリゴヌク
レオチド２０（３ａ、図３）をアセンブリ溶液に懸濁する。２つ以上のアニーリ
ングオリゴヌクレオチド（例えば４０ａ〜ｃ）を、混合物として加える。混合物
は、アニーリングしてギャップ７０ａ〜ｂを形成する１つ以上の架橋オリゴヌク
レオチド２５ａ〜ｃ、およびアニーリングして連結可能なニック部位４５ａ〜ｃ
を形成する１つ以上のアセンブリオリゴヌクレオチド４０ａ〜ｃを含む（３ｂ）
。過剰なまたはアニーリングしなかったオリゴヌクレオチド２５および４０、な
らびに他の不純物を、非変性条件下で洗浄することによって除去し得る。

【００６６】 ライゲーション試薬（例えばＤＮＡリガーゼ、ＡＴＰ、およびライゲーション
に必要な他の試薬）を加え、隣接するアセンブリオリゴヌクレオチドのニック部
位をライゲーションし、固定化ライゲーション産物６０を形成する（３ｃ）。

【００６７】 次いで、固定化ライゲーション産物の相補鎖を、ＤＮＡポリメラーゼ、プライ
マー、ヌクレオチド５’三リン酸、およびプライマー伸長に必要な他の試薬を用
いて合成し、固体支持体上に２重鎖ポリヌクレオチド６５を産生する（３ｄ）。

【００６８】 上記は、第ＩＩＩ．１節と類似の様式および類似の量で行われ得る。

【００６９】 （４．反復連続アニーリング） 第ＩＩＩ．１節で記載されたような架橋およびアセンブリオリゴヌクレオチド
の連続アニーリング工程、続くライゲーション、および洗浄を用いて散在させる
工程を１００回以上まで反復し得る（４ｅ）。反復アニーリングおよびライゲー
ションした固定化ライゲーション産物７５を、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー
、ヌクレオチド５’三リン酸、および伸長に必要な他の試薬を用いて複製し、固
体支持体上で固定化２重鎖ポリヌクレオチド６５を生成する（４ｆ）。

【００７０】 上記は、第ＩＩＩ．１節と類似の様式および類似の量で行われ得る。

【００７１】 （５．２つのオリゴヌクレオチドを用いる反復同時アニーリング） 第ＩＩＩ．２節で記載されたような、架橋およびアセンブリオリゴヌクレオチ
ドの同時アニーリング工程、続くライゲーション、および洗浄を用いて散在させ
る工程を１００回以上まで反復し得る（５ｄ）。反復アニーリングおよびライゲ
ーションした固定化ライゲーション産物７５を、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマ
ー、ヌクレオチド５’三リン酸、および伸長に必要な他の試薬を用いて複製し、
固体支持体上で固定化２重鎖ポリヌクレオチド６５を産生する（５ｅ）。

【００７２】 上記は、第ＩＩＩ．１節と類似の様式および類似の量で行われ得る。

【００７３】 （６．２つを超えるオリゴヌクレオチドを用いた反復同時アニーリング） 第ＩＩＩ．３節で記載されたような、１を超える架橋オリゴヌクレオチドおよ
び１つ以上のアセンブリオリゴヌクレオチドの同時アニーリング工程、続くライ
ゲーション、そして洗浄を用いて散在させる工程を、１００回以上まで反復し得
る（６ｄ）。繰り返しアニーリングおよびライゲーションした固定化ライゲーシ
ョン産物７５を、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ヌクレオチド５’三リン酸
、および伸長に必要な他の試薬を用いて複製し、固体支持体上で固定化洗浄を用
いて散在させる工程ポリヌクレオチド６５を産生する（６ｅ）。

【００７４】 上記は、第ＩＩＩ．１節と類似の様式および類似の量で行われ得る。

【００７５】 （ＩＶ．ポリヌクレオチドアセンブリの設計） 公知のＤＮＡ配列および特に関心のある遺伝子を、アセンブリのために選択す
る。遺伝子の大きさは、５０ｂｐから５０００ｂｐ以上の範囲であり得る。計画
において、合成されるポリヌクレオチド配列の１本の鎖は、２０〜２００ｎｔ、
好ましくは３０〜５０ｎｔの、アセンブリオリゴヌクレオチド配列の連続するセ
ットに分けられる。６〜４０ｎｔの架橋オリゴヌクレオチドを、アセンブリオリ
ゴヌクレオチドにアニーリングし、固定化された鎖にニック部位を形成するよう
に設計する。２重鎖領域を形成するオリゴヌクレオチドにおける相補的重複の程
度は、十分な特異性および親和性を提供する、任意の長さであり得る。好ましい
実施形態では、相補的重複は５〜１０ｎｔであり、そして５０ｎｔまでであり得
る。アセンブリされた遺伝子を含むアセンブリオリゴヌクレオチドおよび架橋オ
リゴヌクレオチドは、予想されるアニーリング性質、すなわち、熱融解温度、Ｔ _m によって選択される。オリゴヌクレオチドのアニーリングから生じる２重鎖領
域は、洗浄工程、および他の操作に耐え、そして有効なライゲーションを受ける
のに十分安定でなければならない。

【００７６】 アセンブリポリヌクレオチドは、（ｉ）Ａ、ｄＡ、Ｃ、ｄＣ、Ｇ、ｄＧ、Ｕ、
Ｔ、ｄＵ、５−メチル−Ｃ、５−メチルｄＣ、Ｉ、ｄＩ、２−アミノ−Ａ、２−
アミノ−ｄＡ、５−Ｂｒ−Ｕ、５−Ｂｒ−ｄＵ、５−Ｆ−Ｕ、５−Ｆ−ｄＵ、５
−プロピニルｄＣ、５−プロピニル−ｄＵのようなヌクレオチド単位、（ｉｉ）
ホスホジエステル、ホスホロチオエート、Ｎ−３−ホスホルアミダイトのような
ヌクレオチド間結合、および（ｉｉｉ）２’−デオキシリボース、２’−Ｏ−メ
チル−リボヌクレオチド、２’−フルオロ−リボヌクレオチド、および２’−ア
ミノ−リボヌクレオチドアナログのような糖を含み得る。

【００７７】 市販のソフトウェアプログラムを、狭い範囲のＴ_m値を生じるハイブリダイゼ
ーションエネルギーの計算に基づいて、最適なオリゴヌクレオチドのセットを設
計するのに使用し得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９、１１．４６頁）。オリゴ
ヌクレオチド配列設計でさらに考慮することは、（ｉ）自己相補的ヘアピン領域
を避ける、（ｉｉ）低合成効率領域、例えば４つ以上の連続的なＧ単量体を避け
る、（ｉｉｉ）まれな、または少ししか発現しないコドン（を避ける）、および
（ｉｖ）切断およびさらなるクローニング操作のための制限部位の設置である。
本発明のアセンブリ方法の実施に必要なオリゴヌクレオチドの全セットを、この
ように設計および合成し得る。

【００７８】 固定化２重鎖ポリヌクレオチド配列は、保存された、または普遍的な配列であ
り得、そして機能的遺伝子の部分ではない。固定化断片の配列は、制限酵素によ
って切断可能な制限部位を含み得る。固定化オリゴヌクレオチドは、プラスミド
またはベクターのような、より大きなポリヌクレオチド断片に連結し得る。本発
明のために適当なプラスミドの例は、Ｍ１３由来のベクター、ｐＵＣ、およびｐ
ＧＥＭ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９、第１章）が挙げられる。これは、大規模
細菌培養から増殖および回収され（Ｂｅｒｇｅｒ，１９８７、１４５−７０頁）
、そしてポリヌクレオチドのアセンブリのために公知の制限部位で切断され得る
。

【００７９】 （Ｖ．固体支持体上の固定化ポリヌクレオチドの増幅） 固定化ライゲーション産物を、鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応によって増幅
し得る（Ｓｔａｍｍ、１９９５）。例えば、５０〜１０００ｐｍｏｌの固定化ラ
イゲーション産物のアセンブリが完了後、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド５
’三リン酸、および（ｉ）固定化ライゲーション産物および（ｉｉ）その相補鎖
に相補的な２つのプライマーを含む、ＰＣＲ試薬を溶液として加え得る。温度を
アニーリング／伸長温度と変性温度との間で循環させて、固定化ライゲーション
産物の２本鎖ポリヌクレオチド複製を溶液中で生成し得る。蛍光標識プライマー
として、または蛍光ヌクレオチドとして蛍光色素を組み込むことは、蛍光標識お
よび検出可能なポリヌクレオチドを生成し得る。異なったまたは同じ大きさの、
複数のＰＣＲ産物は、固定化ライゲーション産物の異なる部分にそれぞれ相補的
でありかつ反対の鎖における対として選択される、複数のプライマーを用いて、
単一のアセンブリされたポリヌクレオチドから得られ得る。特定のＰＣＲ産物を
規定するプライマーが、異なる蛍光色素で標識される場合、複数のＰＣＲ産物を
スペクトルで区別し、それによって検出および定量し得る。固体支持体における
マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲもまた、固体支持体におけるＰ
ＣＲの鋳型を扱う簡便で有効な方法であり、偶発的な鋳型の分散および誤まった
増幅からの汚染を少なくする。

【００８０】 固定化ライゲーション産物の配列を、固相サンガージデオキシＤＮＡ配列決定
法によって分析し得る。

【００８１】 （ＶＩ．蛍光による固定化ポリヌクレオチドの検出および定量） 本発明の固体支持体上にアセンブリされたポリヌクレオチドを、蛍光プローブ
アッセイによって検出および定量し得る。このアッセイは、固定化ライゲーショ
ン産物の一部分に相補的である自己消光オリゴヌクレオチドプローブを含む。こ
のプローブは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）効果を介して相互作用する
ように配置された、蛍光レポーター色素および消光剤を含む（Ｃｌｅｇｇ，Ｒ．
、１９９２）。この消光剤は、レポーターと相互作用して、その発光を変化させ
、通常レポーターの発光効果を減少させる。消光の効果は、レポーターから消光
剤までの距離とともに減少する。

【００８２】 本発明では、プローブは、３’末端付近のヌクレオチドに本質的に相補的な５
’末端付近のヌクレオチドから成り得、それによってアニーリングされないプロ
ーブは消光状態で存在する。プローブの固定化ライゲーション産物へのアニーリ
ング際に、消光効果は減少し、そして蛍光を検出し得る。標的ポリヌクレオチド
へのハイブリダイゼーションの際の、自己相補的、自己消光プローブ（「分子標
識（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）」）の蛍光の増加は、感度の高いアッ
セイ結果に十分である（Ｔｙａｇｉ、１９９６；Ｔｙａｇｉ、１９９７）。

【００８３】 蛍光に基づいたエキソヌクレアーゼアッセイ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））は
、ＰＣＲ中の増幅産物の実時間測定を提供する（Ｌｅｅ、１９９３；Ｈｏｌｌａ
ｎｄ、１９９１）。固定化ライゲーション産物の部位に相補的な自己消光蛍光プ
ローブは、ＰＣＲ混合物に含まれる。増幅の間、プローブは標的にアニーリング
し、そしてポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって置換およ
び切断される（図９）。存在するアセンブリされたポリヌクレオチドの量に比例
した蛍光シグナルが放出される（Ｌｉｖａｋ、１９９６；Ｌｅｅ、１９９３）。
エキソヌクレアーゼアッセイは、さらなる試料のプロセシング無しに、固体支持
体上のアセンブリされたポリヌクレオチドの増幅から誘導されるＰＣＲ産物の直
接検出を与える。ＰＣＲが進行すると、ポリメラーゼが、アニーリングしたプロ
ーブを切断し、レポーターおよび消光剤を分離、蛍光の増加を引き起こす。

【００８４】 本発明の特定の好ましい実施形態は、固定化ポリヌクレオチドから形成された
増幅産物の、終点および実時間測定方法を含む。終点方式では、蛍光測定をアセ
ンブリされたポリヌクレオチドの増幅が完了した後に行う。実時間方式では、蛍
光測定を増幅反応の間に複数回、例えばＰＣＲプロセスのそれぞれの熱サイクル
の後に行う。アセンブリされたポリヌクレオチドの定量的測定（固体支持体１グ
ラムあたりのポリヌクレオチドの装填量）が必要な場合、同時方式が好ましい。

【００８５】 （ＶＩＩ．自己消光プローブ） 自己消光蛍光プローブの好ましい実施形態では、レポーター色素を、消光色素
から少なくとも１２ヌクレオチド離し、レポーター色素を、自己消光蛍光プロー
ブの５’末端または３’末端に結合し、そして消光色素を５’末端または３’末
端に結合する（Ｌｉｖａｋ、１９９８）。自己消光プローブは、レポーターを消
光剤の近くに連れて行き、レポーターから消光剤への有効なエネルギー転移を可
能にするように設計される（Ｃｌｅｇｇ、１９９２；Ｃａｒｄｕｌｌｏ、１９８
８；Ｌｉｖａｋ、１９９５）。レポーターおよび消光剤をまた、３’末端ヌクレ
オチドに結合し得る。本発明の他の実施形態では、蛍光剤および消光剤を、ポリ
ヌクレオチドの内部の部位に結合する。本発明はまた、２つの蛍光団の１つが、
内部の部位に位置し、そして他方の蛍光団を、ポリヌクレオチドの末端に結合す
る実施形態を含む。

【００８６】 レポーターとして適当な色素はまた、消光剤としても適当であり得る。同様に
、消光剤として適当な色素は、レポーターとしても適当であり得る。自己消光プ
ローブの１つの実施形態では、６−カルボキシ−フルオレセイン（６−ＦＡＭ）
を、プローブの５’末端にレポーターとして標識し、そして６−カルボキシテト
ラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）を３’末端に消光剤として標識し、その結果
ＴＡＭＲＡ色素は、ポリメラーゼによって切断されるまで、６−ＦＡＭによる任
意の蛍光発光を実質的に消光する。

【００８７】 レポーター部分の好ましい実施形態は、以下の一般構造および付番方式を用い
るフルオレセイン色素である。ここでＬはリンカーである。

【００８８】

【化２】

【００８９】 フルオレセインレポーター色素の好ましい実施形態は、５−カルボキシフルオレ
セイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，
４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，
７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、および２’，７’−ジ
メトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）で
ある（図７）。レポーター部分の他の実施形態は、シアニン色素、ダンシル誘導
体等である。

【００９０】 消光剤部分の好ましい実施形態は；（ｉ）ローダミン色素（Ｂｅｒｇｏｔ、テ
トラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、およびテトラプロパノ
−６−カルボキシローダミン（ＲＯＸ）からなる群から選択される）、および（
ｉｉ）ＤＡＢＳＹＬ、ＤＡＢＣＹＬ、シアニン、アントラキノン、ニトロチアゾ
ール、およびニトロイミダゾール化合物等である（図８）。ローダミン色素は、
下記の一般構造および付番方式を保有する。ここでＬはリンカーである。

【００９１】

【化３】

【００９２】 本発明のフルオレセインおよびローダミン誘導体は、上記で１つ以上の番号の
位置で置換され得る。

【００９３】 （ＶＩＩＩ．ポリヌクレオチドの切断） アセンブリされたポリヌクレオチドを、化学的手段または酵素的手段、または
その両方の組み合せによってリンカーを切断することによって、固体支持体から
放出し得る。酵素的切断によって、アセンブリおよび架橋オリゴヌクレオチドは
、代表的には４〜８塩基対の長さの制限酵素認識配列を含むように選択され得、
次いで、アセンブリされたポリヌクレオチドの固体支持体からの切断が、適当な
制限酵素によって起こり得る。例えば、５０ｐｍｏｌのアセンブリされたポリヌ
クレオチドにおける、下記の例で示される配列の切断は、１ユニットのＨｉｎｄ
ＩＩＩ制限酵素、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０ｍ
ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジチオトレイトール、ｐＨ７．９の混合物中で、２５℃
、総容積２５μｌで行い得る。

【００９４】

【化４】

【００９５】 固体支持体上の１本鎖のアセンブリされたポリヌクレオチドは、６〜４０ｎｔ
またはより長いオリゴヌクレオチドを、ポリヌクレオチドの制限部位にハイブリ
ダイズすることにより、続いて対応する制限酵素で処理することによって、制限
酵素で切断し得る。切断は２本鎖制限部位で起こり、ポリヌクレオチドの固体支
持体からの分離を引き起こす。次いで、切断されたポリヌクレオチドの結合末端
を、ライゲーションおよびクローニング工程のために準備する。

【００９６】 化学的切断によって、アセンブリされたポリヌクレオチドは、化学試薬によっ
て切断可能な不安定な官能基を含み得る。例えば、上記の図のＬは、酢酸を用い
る室温での短い処理のような、弱酸によって切断されるトリチル基であり得る。
あるいは、Ｌは水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、または他の水性試薬で
、約ｐＨ１２でまたはその付近で切断されるエステルまたはカルバミン酸のよう
な、塩基不安定な基であり得る。リンカーＬは、ジチオトレイトール（クリーラ
ンド試薬）のような穏やかな還元剤で切断可能なジスルフィド官能基であり得る
。リンカーＬは、テトラメチルアンモニウムフッ化物のような試薬でフッ化物イ
オンによって切断可能なシリルエーテル官能基であり得る。固体支持体上におけ
るアセンブリされたポリヌクレオチドのエステル結合の代表的な条件は、約１ｍ
ｇの支持体を１００μｌの濃縮水酸化アンモニウムを用いて２５℃で６時間処理
すること、および減圧下でアンモニアおよび水を除去するために、上清を別々の
容器に取ることを含む。

【００９７】 （Ｘ．アセンブリの自動化） アニーリング、ライゲーション、およびプライマー伸長工程を、本発明による
周期的な様式で自動化することによって、固体支持体上でポリヌクレオチドを合
成する装置を構築し得る。プログラムによるマイクロプロセッサー制御下で、液
体試薬を容器から固体支持体へ送達し得る。本発明の方法の適用は、特に固体支
持体化学へのポリヌクレオチドアセンブリの酵素的手段は、他の化学的、固相生
体高分子および低分子合成方法によって現実化された簡便性および有効性を利用
する。温度制御は、反応容器を冷却液または加熱液に浸すこと、または冷却／加
熱領域（例えば加熱ブロック、オーブン、冷蔵室）に置くことによって現実化さ
れ得る。アセンブリプロセスおよびＰＣＲ中の熱サイクルの全工程は、０〜１０
０℃で行われ得る。液体試薬が静止した固相の固定化された反応物へ送達される
、本発明の不均一反応は、産物のワークアップ（ｗｏｒｋ−ｕｐ）、単離、およ
び精製の必要性を回避しながら、速い反応速度および高い収率を示し得る。従っ
て、アセンブリする生体高分子におけるモノマーの添加のような反復過程は、手
動および自動化手段による固体支持体合成によく適している。本発明は、遺伝子
の高処理能剛性、並行合成の自動化に役立つ。

【００９８】 アレイ（試薬、検出エレメント、または装置を配置し得る、表面上のアドレス
可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）位置）を、本発明で利用し得る。代表的には
アレイは、装置内の形式で固定された位置を有する平面表面である。それによっ
て自動化手段は、（ｉ）化学的または酵素的反応を行う、（ｉｉ）変化または相
互作用を検出する、または（ｉｉｉ）多数の試料を表示するために固定または取
り付ける目的で、繰り返しアクセスする（ｖｉｓｉｔ）ことができる。合成アレ
イの空間的な配列は、プログラムされた、ロボットの自動化液体送達装置によっ
てアドレス可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）ニ次元の表面であり得る。

【００９９】 全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願のそれぞれが、
参考として援用されることを明確かつ個々に示されるように、同じ程度に本明細
書中で参考文として援用される。

【０１００】 少数の実施形態のみを上記で詳細に記載してきたが、分子生物学分野における
当業者は、それらの教示から逸脱することなく、好ましい実施形態において多く
の改変が可能であることを明確に理解する。そのような改変の全ては、添付の特
許請求の範囲に含まれることが意図される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、固定化された、末端がリン酸化されたアセンブリオリゴヌクレオチド
２０（１ａ）への、架橋オリゴヌクレオチド２５（１ｂ）、続くアセンブリオリ
ゴヌクレオチド４０の連続的なアニーリング、固定化された鎖におけるニック４
５の作製（１ｃ）、固定化ライゲーション産物６０を形成するためのニックのラ
イゲーション（１ｄ）、および固定化二本鎖ポリヌクレオチド６５を合成するた
めのポリメラーゼを用いた伸長（１ｅ）を示す。

【図２】 図２は、固定化された、末端がリン酸化されたアセンブリオリゴヌクレオチド
２０（２ａ）への、２つのオリゴヌクレオチド、１つは架橋２５および１つはア
センブリ４０を混合物とした同時アニーリング、固定化された鎖におけるニック
４５の作製（２ｂ）、固定化ライゲーション産物６０を形成するためのニックの
ライゲーション（２ｃ）、ならびに固定化二本鎖ポリヌクレオチド６５を合成す
るためのポリメラーゼを用いた伸長（２ｄ）を示す。

【図３】 図３は、固定化された、末端がリン酸化されたアセンブリオリゴヌクレオチド
２０（３ａ）への、１つ以上の架橋オリゴヌクレオチド２５および２つ以上のア
センブリオリゴヌクレオチド４０の同時アニーリング、固定化された鎖における
ニック４５、および固定化されていない鎖におけるギャップ７０の作製（３ｂ）
、固定化ライゲーション産物６０を形成するためのニックのライゲーション（３
ｃ）、ならびに固定化二本鎖ポリヌクレオチド６５を合成するためのポリメラー
ゼを用いた伸長（３ｄ）を示す。

【図４】 図４は、固定化された、末端がリン酸化されたアセンブリオリゴヌクレオチド
２０（４ａ）への、架橋オリゴヌクレオチド２５（４ｂ）、続くアセンブリオリ
ゴヌクレオチド４０の連続的なアニーリング、固定化された鎖におけるニック４
５の作製（４ｃ）、固定化ライゲーション産物６０を形成するためのニックのラ
イゲーション（４ｄ）、アニーリングおよびライゲーションの工程のｎ回反復（
４ｅ）、ならびに固定化二本鎖ポリヌクレオチド６５を合成するためのポリメラ
ーゼを用いた伸長（４ｆ）を示す。

【図５】 図５は、固定化された、末端がリン酸化されたアセンブリオリゴヌクレオチド
２０（５ａ）への、２つのオリゴヌクレオチド、１つは架橋２５および１つはア
センブリ４０を混合物とした同時アニーリング、固定化された鎖におけるニック
４５の作製（５ｂ）、固定化ライゲーション産物６０を形成するためのニックの
ライゲーション（５ｃ）、アニーリングおよびライゲーションの工程のｎ回反復
（５ｄ）、ならびに固定化二本鎖ポリヌクレオチド６５を合成するためのポリメ
ラーゼを用いた伸長（５ｅ）を示す。

【図６】 図６は、固定化された、末端がリン酸化されたアセンブリオリゴヌクレオチド
２０（６ａ）への、１つ以上の架橋オリゴヌクレオチド２５および２つ以上のア
センブリオリゴヌクレオチド４０の同時アニーリング、固定化された鎖における
ニック４５、および固定化されていない鎖におけるギャップ７０の作製（６ｂ）
、固定化ライゲーション産物６０を形成するためのニックのライゲーション（６
ｃ）、アニーリングおよびライゲーションの工程のｍ回反復（６ｄ）、ならびに
固定化二本鎖ポリヌクレオチド６５を合成するためのポリメラーゼを用いた伸長
（６ｅ）を示す。

【図７】 図７は、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフル
オレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイ
ン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン
（ＨＥＸ）、および２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カル
ボキシローダミン（ＪＯＥ）の構造を示す。ここで、Ｌはリンカーであり、そし
てそれらの置換された形態を含む。

【図８】 図８は、消光部分テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、
およびテトラプロパノ−６−カルボキシローダミン（ＲＯＸ）、ＤＡＢＳＹＬお
よびＤＡＢＣＹＬの構造を示す。ここでＬはリンカーであり、そしてそれらの置
換された形態を含む。

【図９】 図９は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）エキソヌクレアーゼアッセイを示す。これ
によってレポーター標識、Ｆ、および消光標識、Ｑをどちらも含む自己消光プロ
ーブ１、ならびに標的プライマー３ａおよび３ｂが標的ポリヌクレオチド２にハ
イブリダイズする。増幅の重合段階の間に、プライマー３ａおよび３ｂはポリメ
ラーゼ酵素、例えばＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長され、それによって伸長し
たプライマー４ａおよび４ｂを形成する。プライマー伸長反応の間に、ポリメラ
ーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性が、プローブ１を切断するように働き、レポ
ーター保有フラグメント５および消光剤保有フラグメント６を含むプローブフラ
グメントを形成する。従って、レポーターおよび消光標識は分離され、それによ
ってこの２つの間でのエネルギー移動を阻止し、そしてプローブの消化の際にレ
ポーターの発光は消光されなくなり、蛍光の増加を引き起こす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハイアット， アンドリュー シー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92103， サン ディエゴ， トランス ストリー ト 660 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA80 CA01 CA11 HA20 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QQ52 QR08 QR55 QR62 QS02

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 固体支持体上のポリヌクレオチドを合成する方法であって、
   該方法は、以下の工程： ａ．１つ以上の架橋オリゴヌクレオチドと２つ以上のアセンブリオリゴヌクレオ
   チドをアニーリングして、その結果、連結可能なニック部位を、隣接するアセン
   ブリオリゴヌクレオチドの間に形成する工程であって、ここで、アセンブリオリ
   ゴヌクレオチドの１つが、固体支持体上に固定化される、工程； ｂ．連結可能なニック部位を連結して、それにより固定化された連結産物を形成
   する工程； ｃ． 固定化された連結産物に対して、プライマーをアニーリングする工程；お
   よび ｄ．プライマーを伸張して、固定化された、二本鎖ポリヌクレオチドを生成させ
   る工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記工程ａ．およびｂ．が、複数のサイクル繰り返される、
   請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記工程ａ．およびｂ．が、１〜１００のサイクル繰り返さ
   れる、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記固体支持体が、小粒子、ビーズ、膜、フリット、非孔性
   表面、アドレスで呼び出せるアレイ、ベクター、プラスミド、またはポリヌクレ
   オチド固定化媒体から構成される、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 ５０〜５０００ヌクレオチド塩基対の長さのポリヌクレオチ
   ドを合成するための、請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記アセンブリオリゴヌクレオチドは、２０〜２００の長さ
   であり、そして架橋オリゴヌクレオチドが６〜４０ヌクレオチドの長さである、
   請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 請求項１に記載の方法であって、前記固定化された連結産物
   に対してアニーリングされた前記プライマーを伸張する前記工程ｄ．が、以下：
   ＡＴＰ、ｄＡＴＰ、ＣＴＰ、ｄＣＴＰ、ＧＴＰ、ｄＧＴＰ、ＵＴＰ、ＴＴＰ、ｄ
   ＵＴＰ、５−メチル−ＣＴＰ、５−メチル−ｄＣＴＰ、ＩＴＰ、ｄ−ＩＴＰ、２
   −アミノ−ＡＴＰ、２−アミノ−ｄＡＴＰ、５−Ｂｒ−ＵＴＰ、５−Ｂｒ−ｄＵ
   ＴＰ、５−Ｆ−ＵＴＰ、５−Ｆ−ｄＵＴＰ、５−プロピニルｄＣＴＰ、５−プロ
   ピニル−ｄＵＴＰ、ならびに； 対応する、α−チオ三リン酸、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド三リン酸、
   ２’−フルオロ−ＮＴＰ、２’−アミノ−ＮＴＰアナログ、および蛍光標識化Ｎ
   ＴＰ、 からなる群から選択される、ヌクレオチド５’三リン酸を含む、方法。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の方法であって、前記蛍光標識が、プリンま
   たはデアザプリンのＮ−９位またはＣ−８位、およびピリミジンのＣ−５位に結
   合され、そして該蛍光標識は、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、またはＪＯＥからなる
   群から選択される、方法。
9. 【請求項９】 請求項１に記載の方法であって、前記アセンブリオリゴヌク
   レオチドおよび架橋オリゴヌクレオチドが、以下： Ａ、ｄＡ、Ｃ、ｄＣ、Ｇ、ｄＧ、Ｕ、Ｔ、ｄＵ、５−メチル−Ｃ、５−メチル−
   ｄＣ、Ｉ、ｄＩ、２−アミノ−Ａ、２−アミノ−ｄＡ、５−Ｂｒ−Ｕ、５−Ｂｒ
   −ｄＵ、５−Ｆ−Ｕ、５−Ｆ−ｄＵ、５−プロピニルｄＣ、５−プロピニル−ｄ
   Ｕ、ならびに； 対応する、ホスホロチオエート、Ｎ−３−ホスホルアミダイト、２’−Ｏ−メチ
   ル−リボヌクレオチド、２’−フルオロ−リボヌクレオチド、および２’−アミ
   ノ−リボヌクレオチドアナログ、 からなる群から選択される、方法。
10. 【請求項１０】 前記工程ａ．およびｂ．の後の非変性条件下で、周期的に
    洗浄する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】 各前記連結工程ｂ．の後の変性条件下で、支持体を洗浄す
    る工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 変性剤が、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、ホル
    ムアミド、尿素、塩化ナトリウム、および酢酸ナトリウム、からなる群から選択
    される、請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記ポリヌクレオチドが、化学的切断により前記支持体か
    ら切断される、請求項１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記ポリヌクレオチドが、酵素的切断により前記支持体か
    ら切断される、請求項１に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記固定化されたポリヌクレオチドに相補的な、前記自己
    消光蛍光プローブをアニーリングする工程を、さらに包含する、請求項１に記載
    の方法。
16. 【請求項１６】 前記自己消光蛍光プローブが、３’末端付近のヌクレオチ
    ドに、実質的に相補的な５’末端付近のヌクレオチドから構成され、それによっ
    てアニーリングしないプローブが消光した状態で存在する、請求項１５に記載の
    方法。
17. 【請求項１７】 前記固定化された二本鎖ポリヌクレオチドに対する、前記
    自己消光蛍光プローブのアニーリングの工程が、蛍光検出により測定される、請
    求項１５に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記固定化された連結産物に対してアニーリングされた前
    記プライマーの伸張する工程ｄ．が、以下： ５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性核酸ポリメラーゼ、該固定化され
    た連結産物に対して相補的な該プライマー、該固定化された連結産物の相補体に
    相補的な第２のプライマー、５’ヌクレオチド三リン酸；および自己消光蛍光プ
    ローブであって、ここで、 該プローブは、ポリヌクレオチドに対してアニーリングされない場合に少なくと
    も１つの一本鎖立体配座（ここで消光剤が、レポーターの蛍光を消光する）、お
    よび該固定化された連結産物にアニーリングされる場合に少なくとも１つの立体
    配座（ここで該レポーターの蛍光が消光されない）に存在する、プローブ；およ
    び以下の工程： 該プライマーを、該固定化された連結産物にアニーリングする工程； 該固定化された連結産物をＰＣＲにより増幅して、それにより標的ポリヌクレオ
    チド増幅産物を生成させる工程； から構成される、ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記核酸ポリメラーゼが、前記自己消光蛍光プローブを、
    前記消光剤から前記レポーターを分離するための増幅の間に、消化する、請求項
    １８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記標的ポリヌクレオチド増幅産物が、蛍光検出により測
    定される、請求項１８に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記標的ポリヌクレオチド増幅産物が、終点分析により測
    定および定量される、請求項１８に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記標的ポリヌクレオチド増幅産物が、実時間分析 により測定および定量される、請求項１８に記載の方法。