BRPI0114575B1 - Dual filamental nucleic acid hybridization probe, real-time amplification and detection reaction, and, test to detect a nucleic acid target sequence - Google Patents

Description

“SONDA DE HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO DE FILAMENTO DUPLO, REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO E DETECÇÃO EM TEMPO REAL, E, ENSAIO PARA DETECTAR UMA SEQÜÊNCIA ALVO DE ÁCIDO NUCLÉICO”.

Esta invenção diz respeito a novas sondas para detecção homogênea e específica, incluindo detecção em tempo real, de ácidos nucléicos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os métodos tradicionais de detecção heterogênea para o ácido nucléico requerem a separação das sondas hibridizadas e não hibridizadas, enquanto os novos métodos homogêneos eliminam as etapas de separação e são mais rápidos, simples e quantitativos. Uma variedade de técnicas de amplificação de ácidos nucléicos foi desenvolvida e pode amplificar uma seqüência específica de ácido nucléico para vários milhões de cópias dentro de 2 a 3 horas. Entretanto, a análise de eletroforese em gel dominante impediram sua ampla aplicação em diagnósticos clínicos. Recentemente, a combinação da detecção homogênea com estas técnicas de amplificação, especialmente a reação em cadeia da polimerase (PCR), melhorou muito os diagnósticos com base nos ácidos nucléicos. Os ensaios quantitativos de PCR em tempo real resultantes estão se tomando crescentemente populares.

Os ensaios de PCR de fluorescência em tempo real correntes podem ser classificados no formado de sonda e no formato sem sonda. Os ensaios de formato de sonda utiliza sondas fluorogênicas, por exemplo as sondas 5’-exonuclease (TaqMan®), sinais moleculares, sondas de transferência de energia de fluorescência, sondas Scorpion, sondas de iluminação, etc. Os ensaios de formato sem sonda utilizam corantes fluorogênicos, por exemplo o SYBR Green I, para indicar a reação. O formato sem sonda, embora simples, encontra aplicação bem limitada devido à sua incapacidade de discriminar a amplificação não específica. Em comparação, o formato de sonda com uma segunda etapa de reconhecimento é muito mais confiável. No entanto, as sondas correntes mencionadas acima são todas difíceis de se projetar e sintetizar, e elas são caras. Outra desvantagem das sondas correntes é sua limitada especificidade. Mesmo os sinais moleculares que são reivindicados como sendo aquelas mais específicos, têm de ser modificados para discriminar combinações ruins de nucleotídeos únicos em alguns casos.

Esta invenção diz respeito a uma nova sonda que pode ser uma sonda homogênea e específica para a detecção de ácidos nucléicos. Esta sonda se baseia em um conceito diferente das sondas correntes. Ela é simples de se projetar, fácil de se preparar, barata, extremamente específica, e pode ser combinada com qualquer técnica corrente de amplificação de ácidos nucléicos.

Os ensaios com sondas de filamento duplo de acordo com esta invenção se baseiam na reação competitiva entre os oligonucleotídeos, em vez da hibridização direta conforme utilizado nas sondas correntes. Esta nova sonda não apenas pode alcançar de uma maneira muito mais simples o que as sondas correntes podem, mas também possuem muitas vantagens sobre as sondas correntes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção diz respeito a sondas especialmente projetadas para a detecção de ácidos nucléicos e suas aplicações. As sondas podem especificamente detectar ácido nucléico em um formato homogêneo. As sondas são compostas de dois oligonucleotídeos complementares de diferentes comprimentos, que são rotulados: um com um fluoróforo e o outro com um extintor ou receptor de fluorescência. Sob condições adequadas, as sondas são de filamento duplo. Quando um filamento da sonda hibridiza com o alvo, o fluoróforo gera mudança de fluorescência. Certas modalidades podem especificamente reconhecer seus alvos perfeitamente combinados em temperatura ambiente, mas não podem reagir com um “alvo” contendo uma má combinação única. As sondas de acordo com esta invenção podem ser usadas para ensaios de detecção da amplificação de ácidos nucléicos em tempo real.

As sondas de acordo com esta invenção podem compreender DNA, RNA ou misturas das duas. Elas podem compreender nucleotídeos não naturais e articulações de nucleotídeos não naturais. Suas extremidades 3’ podem ser bloqueadas para impedir a extensão. Quando nós nos referimos a “oligonucleotídeos” das sondas, pretendemos incluir os acima.

Esta invenção também diz respeito a ensaios que empregam sondas de filamento duplo. Os ensaios de hibridização desta invenção, em que apenas alvo de filamento único está presente, incluem sondas como descrito acima. Os ensaios em que alvo de filamento duplo está presente, tais como a amplificação típica de PCR, podem incluir também as sondas de filamento duplo que possuem oligonucleotídeos complementares de igual comprimento.

BREVE DESCRICÂO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra o desenho esquemático de uma sonda de filamento duplo e seu princípio de trabalho. A Figura 2 mostra uma ilustração esquemática do princípio de trabalho da sonda de filamento duplo na detecção de PCR durante os estágios de desnaturação e de recozimento. A Figura 3 mostra a cinética de reação da sonda de filamento duplo com seu alvo perfeitamente combinado e mal combinado de nucleotídeo único. A Figura 4 mostra a detecção de PCR em tempo real com sonda de filamento duplo. De cima até embaixo, os modelos são diluídos em série por 10 vezes até o último, isto é, água. A Figura 5 mostra a detecção da mutação de nucleotídeos únicos com sondas de filamento duplo em PCR em tempo real, utilizando, no mesmo vaso de reação, uma sonda de filamento duplo complementar ao alvo do tipo selvagem, e uma segunda sonda de filamento duplo complementar ao alvo com a mutação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Composição da sonda de filamento duplo As sondas de filamento duplo de acordo com esta invenção são produzidas de dois oligonucleotídeos complementares de comprimentos diferentes. Um filamento é rotulado com um fluoróforo e o outro é rotulado com um extintor. Em modalidades menos preferidas, o extintor de fluorescência pode ser substituído por um receptor de fluorescência do fluoróforo. As sondas de filamento duplo podem ter diferentes estruturas sob diferentes condições, e isto é refletido pela mudança de fluorescência. Quando auto-hibridizados em uma estrutura estável de filamento duplo, o fluoróforo e o extintor, ou o doador da energia de fluorescência e o receptor, acham-se em proximidade íntima. O fluoróforo ou o doador de energia é extinto pelo extintor ou o receptor de energia, e as sondas são não fluorescentes no comprimento de onda da emissão do fluoróforo ou doador de energia. Quando sob condições desnaturadas, tais como em solução ácida, básica ou em alta temperatura, os dois filamentos da sonda são separados, e o fluoróforo (ou doador de energia) se toma fluorescente. Na presença do alvo na solução de hibridização, o filamento mais longo da sonda pode espontaneamente ligar-se ao alvo, a sonda de filamento duplo se toma dissociado, e o fluoróforo (ou doador de energia) se toma fluorescente.

Reação Espontânea Entre As Sondas De Filamento Duplo Com Seus Alvos As sondas de filamento duplo que possuem filamentos de diferentes comprimentos podem espontaneamente reagir com os oligonucleotídeos de filamento único em solução. Nesta reação, o filamento curto na sonda de filamento duplo é deslocado pela seqüência alvo de oligonucleotídeos para formar um duplex termodinamicamente mais estável. A dissociação resultante da sonda de filamento duplo produz um aumento na fluorescência. Nesta reação, modalidades facilmente projetadas das sondas de filamento duplo têm a capacidade de distinguir alvos perfeitamente combinados dos alvos mal combinados de nucleotídeos únicos em temperatura ambiente. Esta especificidade extremamente elevada situa-se no fato de que o reconhecimento mal combinado é desvantajoso em comparação com a auto-reação dos filamentos duplos na própria sonda. Isto é superior às sondas de filamento único, porque as sondas de filamento único são termodinamicamente instáveis, e podem ser hibridizadas com outro polinucleotídeo de filamento único mesmo que exista uma má combinação. Os sinais moleculares são mais específicos do que as sondas lineares por causa de sua estrutura estável de tronco-alça que pode super-competir com uma reação estável de má combinação. Entretanto, a porção de reconhecimento dos sinais moleculares, a alça, é ainda monofilamentar, e isto deixa ambiente para a hibridização mal combinada, se o tronco não for comprido o bastante ou a seqüência da alça for muito longa. Isto é refletido por um recente relato de que os sinais moleculares não podem ser diretamente usados para discriminação de nucleotídeos únicos quando combinados com NASBA, uma técnica isotérmica de amplificação de ácido nucléico bem conhecida.

Com referência à Figura 1, a sonda 1 de filamento duplo é composta de dois oligonucleotídeos complementares 2, 3 de diferentes comprimentos. O filamento mais longo, neste caso o filamento 2 positivo, é rotulado com um fluoróforo 4 e o filamento 3 negativo mais curto é rotulado com um extintor 5. A sonda é não fluorescente por causa da íntima proximidade do fluoróforo com o extintor. Na presença do alvo 6, o filamento 3 negativo é deslocado pelo alvo, e o fluoróforo 4 que se tenha escapado se toma fluorescente. Será observado que a fluorescência deve também resultar, caso o fluoróforo 4 e o extintor 5 forem intercambiados.

Combinação das sondas de filamento duplo com a amplificação de ácidos nucléicos.

Como observado acima, as sondas de filamento duplo de acordo com esta invenção podem reagir espontaneamente com o alvo de filamento único. Verificou-se que elas também podem ser usadas para detectar o amplicon recém-produzido em um formato em tempo real. Durante um ciclo típico de PCR que compreenda a desnaturação em alta temperatura, o recozimento em baixa temperatura e o alongamento em temperatura intermediária, as sondas de duplo filamento são desnaturadas durante a etapa de desnaturação (ou de fusão), e tomam-se fluorescentes. Durante a etapa de recozimento, na ausência do alvo, os dois filamentos da sonda estarão na conformação de duplo filamento, e assim serão não fluorescentes. Na presença do alvo, entretanto, os dois filamentos da sonda hibridizarão com o alvo. A fluorescência será produzida como um resultado. Durante a etapa de extensão, os filamentos da sonda sairão dos alvos. Mediante a medição da fluorescência durante cada etapa de recozimento de uma reação de PCR, a amplificação pode ser monitorada em um formato em tempo real.

No estágio de recozimento, esta sonda deve passar pelo auto-recozimento e tomar-se não fluorescente na ausência do alvo. Entretanto, na presença do alvo, o filamento rotulado de fluoróforo, diga-se o filamento positivo, da sonda deve dissociar-se do filamento negativo, ligar-se ao alvo, e tomar-se fluorescente. Quando a temperatura é aumentada para permitir a extensão dos iniciadores (72°C), os dois filamentos da sonda devem dissociar-se do alvo e devem não interferir com a extensão da cadeia. Mediante medição da intensidade da fluorescência durante o estágio de recozimento de cada ciclo, a PCR pode ser seguida em um formado em tempo real.

Com referência à Figura 2, é mostrada uma sonda 21 de filamento duplo e um amplicon 30 de filamento duplo, ambos os quais estando presentes em uma reação de amplificação da PCR durante um ciclo intermediário de PCR. A sonda 21 compreende o filamento 22, rotulado com o fluoróforo 24, e o filamento complementar 23, rotulado com o extintor 25. Os rótulos são aplicados aos términos de extremidade cega dos filamentos. Como apresentado, os filamentos 22,23 são de comprimentos iguais, os quais podem ser, mas não necessariamente, para uso em PCR em tempo real. O amplicon 30 compreende os filamentos complementares 31, 32. Após a desnaturação em alta temperatura, os filamentos 22, 23 da sonda se separam, como o fazem os filamentos 31, 32 do amplicon. Quando a temperatura é reduzida à temperatura de recozimento (para o recozimento do iniciador de PCR), os filamentos 22, 23 da sonda recozem, ou hibridizam, a seus filamentos 31, 32 do alvo complementar do amplicon. O fluoróforo 24 não é extinto pelo extintor 25, e apresenta fluorescência.

Proieto Das Sondas De Filamento Duplo O comprimento relativo dos dois filamentos: na maior parte dos casos, os dois filamentos das sondas são diferentes no comprimento e, comumente, o comprimento mais longo é mais longo de 1 a 5 bases do que o filamento mais curto para PCR e de 2 a 10, preferivelmente de 2 a 7, bases mais longo para discriminação de alelos isotérmicos. Em certas modalidades de ensaios de acordo com esta invenção, tais sondas de filamento duplo usadas na detecção do RNA ou sondas de filamento duplo usadas em PCR em tempo real, quando os filamentos alvo tanto positivos quanto negativos competem para hibridizarem-se com os filamentos das sondas, os dois filamentos podem ser iguais no comprimento. A posição de rotulagem da sonda de filamento duplo: tanto o fluoróforo quando o extintor podem estar nas bases terminais ou internas. Em modalidades preferidas, eles estão nas bases complementares terminais opostas dos dois filamentos. Em modalidades especialmente preferidas, tanto o fluoróforo quanto o extintor acham-se na extremidade cega da sonda. Em alguns casos, especialmente quando as sondas são rotuladas com o doador e o receptor de transferência de energia de fluorescência, a posição dos rótulos pode ser ajustada de acordo com a transferência ótima de energia. Em uma modalidade preferida, mas não limitativa, o doador e o receptor de energia de fluorescência são rotulados nas bases terminais de ambos os filamentos, e um filamento é usualmente bloqueado com um grupo fosforado.

Instrumento adequado para sondas de filamento duplo: as sondas de filamento duplo podem ser combinadas com a amplificação de ácido nucléico comum, especialmente PCR, e o amplicon pode ser medido tanto no formato em tempo real quanto de ponto final. Quanto à detecção de tempo real, a fluorescência é medida na temperatura de recozimento. Instrumentos de amplificação/detecção em tempo real correntemente disponíveis, com os quais as sondas de filamento duplo podem ser usadas, incluem o Model 7700 e o Model 5700 da Applied Biosystems (ABI), o IQ Cycler da Bio-Rad, o LightCycler da Hoffmann-La Roche, e o Rotor-Gene 2000 da Corbett Research, entre outros.

As Vantagens Das Sondas De Filamento Duplo Projeto simples e fácil: nenhuma exigência adicional existe para o sistema de reação original, quando do projeto de sondas de filamento duplo. O próprio projeto das sondas é muito mais fácil em comparação com as sondas correntes de rotulagem de corantes dual ou as sondas de hibridização de forma adjacente. As sondas de acordo com esta invenção podem ser projetadas por qualquer pessoa que seja familiar com os projetos de sondas convencionais.

Preparação eficaz quanto ao custo: o procedimento de rotulagem envolvido na preparação dos filamentos para sondas de filamento duplo é apenas a modificação de corante único, o que pode ser realizado em qualquer sintetizador de DNA sem exigência técnica adicional. A purificação envolve apenas uma etapa. Está é muito superior à outra modificação de corantes dual de filamentos de sondas ou modificação interna dos filamentos das sondas, quando a modificação e a purificação da etapa múltipla são necessárias, e a produção final é grandemente reduzida, assim aumentando o dispêndio.

Alta especificidade: já foi provado pelos sinais moleculares que as sondas restritas à estrutura possuem maior especificidade do que as sondas lineares convencionais. As sondas de filamento duplo são uma espécie de sondas restritas à estrutura neste contexto. As sondas podem ligar-se a seu alvo apenas quando a energia livre produzida é maior do que aquela da sonda de filamento duplo. Se existir mutação nos alvos, a sonda de filamento duplo podem manter seu próprio estado de filamento duplo sem qualquer reação que seja termodinamicamente não vantajosa. EXEMPLO 1 Reação espontânea de sonda de filamento duplo com seu alvo. Cinqüenta μΐ de sonda de filamento duplo 0,80 μΜ em Tris 10 mM-HCl (pH 8,0) contendo MgCl2 1,5 mM, foram mantidos a 25°C, e sua fluorescência foi monitorada através do tempo em um espectrofluorímetro Eclipse (Varian). A intensidade da fluorescência foi primeiro medida por 2 minutos em 25°C. Depois, um excedente molar duplo (5 μΐ de solução a 16 μΜ) do oligonucleotídeo alvo foi adicionado, e o nível de fluorescência foi registrado em intervalos de 15 segundos. As seqüências de nucleotídeos dos filamentos de duas sondas foram 5 ’ -F AM-ACG A ACCTC AAACAGAC ACC AT -3 ’ (filamento mais longo) e 5’-TGTCTGTTTGAGGTTGCT-dabcyl-3’ (filamento mais curto). O alvo complementar ao filamento mais longo foi 5 ’-CCATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCT-3 ’, e o alvo contendo uma substituição de nucleotídeo único (alvo mal combinado) foi 5 ’-CCATGGTGTCTCTTTÇAGGTTGCT-3 ’, onde um sublinhado identifica a substituição do nucleotídeo. A Figura 3 mostra a fluorescência (F) observada no decorrer do tempo tanto para o alvo perfeitamente complementar (linha 41) quanto para o alvo mal combinado (linha 42). Pode ser observado que a fluorescência acima de 20 vezes pode ser obtida. Se existir uma má combinação de nucleotídeo único no alvo, nenhuma fluorescência pode ser observada. EXEMPLO 2 Deteccão de PCR em tempo real de β-globina humana com sonda de filamento duplo Para testar a utilidade das sondas de filamento duplo como detectores de amplicon de tempo real em ensaios de PCR, as amplificações de PCR foram realizadas com uma série de dilatação do alvo. Cada reação de 50 μΐ continha 5 μΐ de modelo diluído em série, 0,2 μΜ de sonda de filamento duplo, 0,4 μΜ de cada iniciador, 2,0 unidade de Taq polimerase, 200 μΜ de cada desoxirribonucleosídeo trifosfato, KC1 50 mM, MgCl2 2,0 mM e Tris 10 mM-HCl (pH 8,3). Após a desnaturação a 94°C por 5 minutos, 40 ciclos de amplificação (95°C por 30 segundos, 50°C por 30 segundos e 72°C por 1 minuto) foram realizados em tubos selados em um ciclizador térmico fluorométrico (Rotor-Gene 2000. Corbett Research). A fluorescência foi registrada no estágio de recozimento. O DNA humano original extraído foi diluído em série em etapas décuplas e usado como modelo. Foi usada água no lugar do modelo para a amostra de controle. A sonda de filamento duplo contém uma sequência de ácido nucléico complementar aos amplicons produzidos do alvo. Por simplicidade, dizemos que a sonda é complementar ao alvo; entretanto, as pessoas familiares com a amplificação e detecção entenderão que por “alvo” denotamos, neste caso, tanto o alvo de filamento único original quanto seu complemento, ambos os quais são copiados em amplificação exponencial de PCR. Um fragmento de 268 pares de base do gene de β-globina humana (código do GenBank HuMMB5E, -195~+73) foi amplificado. Os iniciadores dianteiros e reversos foram 5’- GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3’ e 5’-CAACTTCATCCACGTTCACC-3’, respectivamente. A seqüência alvo da sonda foi localizada no meio do amplicon. Os filamentos das sondas positivas e negativas foram 5 ’-FAM-AGCAACCTCAAACAGACACCATGG-PO4-3 ’ e 5’-GGTGTCTGTTTGAGGTTGCT-dabcyl-3 ’.

Os resultados da detecção em tempo real da fluorescência (F) medida através de quarenta ciclos durante a amplificação de PCR, são mostrados na Figura 4. As concentrações iniciais do alvo na série da diluição decrescem da linha 51, a mais concentrada, para a linha 54, a menos concentrada. A linha 55 mostra o controle não alvo (água).

Quando presentes em concentrações semelhantes às dos iniciadores, as sondas de duplo filamento podem reagir rapidamente com os filamentos alvo. A fração de sondas que não encontram um alvo rapidamente se associa uma com a outra e extinguem sua própria fluorescência. Assim, elas podem ser usadas em ensaios de amplificação de ácido nucléico em tempo real. Nos ensaios de PCR para a detecção do gene de β-globina humana, nós escolhemos um filamento negativo de 20 nucleotídeos com uma temperatura de fusão (Tm) próxima daquela dos iniciadores, e um filamento positivo de 24 nucleotídeos de modo a obter um híbrido alvo da sonda que se fundia a cerca 10°C mais elevada. Denominou-se esta sonda de “sonda 24/20”. No estágio de recozimento, esta sonda sofre o auto recozimento e se toma não fluorescente na ausência do alvo. No entanto, na presença do alvo, o filamento positivo da sonda se dissocia do filamento negativo, liga-se ao alvo e se toma fluorescente. Quando a temperatura é aumentada para permitir a extensão dos iniciadores (72°C), os dois filamentos da sonda se dissocia do alvo e não interfere com a extensão da cadeia.

Onze sondas de filamento duplo de diferentes comprimentos (22/22 a 22/17 e 20/20 a 20/16) foram pesquisadas, e elas todas funcionaram bem em ensaios de PCR em tempo real. mesmo aquelas em que ambos os filamentos eram do mesmo comprimento. Estas observações demonstraram a grande flexibilidade no projeto de sondas de filamentos duplos para PCR em tempo real. EXEMPLO 3 Deteccão de mutação em PCR em tempo real.

Para demonstrar a utilidade das sondas de acordo com esta invenção na detecção de mutação de nucleotídeo único por PCR em tempo real, nós preparamos dois modelos de DNA (alvos) do gene de β-globina humano, que diferiam entre si por uma substituição de nucleotídeos únicos. Nós também preparamos uma sonda de filamento duplo complementar ao alvo “tipo selvagem” e uma sonda de filamento duplo complementar ao alvo “mutante”. Projetamos as sondas de tal modo que os híbridos alvo das sondas pudessem fundir-se a cerca de 10°C acima de uma temperatura de recozimento de PCR típica (cerca de 50°C) e cerca de 10°C abaixo da temperatura de extensão preferida (cerca de 72°C) para a Taq DNA polimerase. As sondas eram sondas 24/20 (filamento positivo de 24 nucleotídeos de comprimento, quatro nucleotídeos mais longo do que o filamento negativo). A sonda complementar ao alvo do tipo selvagem foi rotulada com FAM; a sonda complementar ao alvo mutante foi rotulada com Texas Red. Ambas tinham extintores dabcyl. Ambas foram bloqueadas para impedir a extensão das sondas. Cada fluoróforo pôde ser distintamente detectado, porque as duas possuem diferentes espectros de emissão. Desenvolvemos quatro reações de PCR em que ambas as sondas de filamentos duplos estavam presentes. As reações diferiram de acordo com o alvo amplificável: nenhum (Negativo), apenas alvo do tipo selvagem (Selvagem), apenas alvo mutante (Mutante), e ambos os alvos tipo selvagem e mutante (Selvagem + Mutante). O filamento positivo da sonda específica à seqüência do tipo selvagem do gene de beta-globina humano era um 24-mero da seqüência: FAM-5 ’ - AGC AACCTÇAAAC AGAC ACCCTGG-3 ’ -P03 e o filamento negativo da sonda era um 20-mero da seqüência: 5 ’-ATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCT-3 ’-dabcyl. Os dois filamentos da sonda específica à versão mutante da beta-globina foram: Texas Red-5’- AGCAACCTGAAACAGACACCATGG-3 ’-P03 e 5’-ATGGTGTCTGTTTÇAGGTTGCT-3’-dabcyl. Os dois filamentos de cada sonda foram recozidos um com o outro antes da sua adição à mistura de reação. Os modelos de DNA correspondentes aos genes de beta-globina tipo selvagem e mutante foram preparados por um método de mutagênese in vitro. Os iniciadores para a PCR em tempo real foram: 5’-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3’ e 5 ’-CAACTTCATCCACGTTCACC-3 *. Cada reação de 50 microlitros continha 5000 cópias de modelos, 0,4 iniciadores micro M, 0,2 micro M de filamento positivo e 0,24 micro M de filamento negativo de cada sonda, MgCl2 4,0 mM junto com outros componentes genético necessários para a PCR. Após a incubação das misturas de reação em 94°C por 5 minutos, 40 ciclos do perfil térmico a 95 °C por 30 segundos, 50°C por 60 segundos e 72°C por 1 minuto, foram realizados em um ciclizador térmico fluorométrico. A fluorescência foi monitorada durante as etapas de tratamento térmico. Os resultados da fluorescência em tempo real contra o número de ciclos de PCR são apresentados na Figura 5. A fluorescência da sonda em relação ao alvo do tipo selvagem é mostrada em círculos cheios (pontos negros). A fluorescência da sonda em relação ao alvo mutante é mostrada em círculos não cheios.

Com a amostra negativa, não houve qualquer fluorescência (F), nem da sonda do tipo selvagem, curva 71, nem da sonda mutante (curva 72). O resultado mostrou que apenas quando o modelo é incluído na reação obtém-se um aumento na fluorescência. Com ambos os alvos presentes na amostra, a fluorescência aumentou marcadamente tanto da sonda do tipo selvagem, curva 73, quanto da sonda mutante, curva 74. Entretanto, com o alvo do tipo selvagem, a fluorescência aumentou marcadamente da sonda do tipo selvagem, curva 75, mas não da sonda mutante, curva 76; e, ao contrário, com o alvo mutante, a fluorescência aumentou marcadamente da sonda mutante, curva 78, mas não da sonda do tipo selvagem, curva 77. Os resultados mostraram que apenas a sonda combinada produziu o sinal correto. A discriminação entre o modelo do tipo selvagem e o modelo mutante foi completa, de 100%. Isto provou que as sondas de acordo com esta invenção discriminam entre os alvos diferindo por um nucleotídeo único. Nenhum sinal foi observado quando não existia qualquer modelo, e dois sinais foram observados quando existiam dois modelos.

Pesquisou-se a “janela” de temperaturas em que as sondas de filamentos duplos são capazes de discriminar mutações de nucleotídeos únicos. Foi apresentado na literatura que os sinais moleculares têm uma janela maior do que as sondas lineares e, assim, têm melhor discriminação. Não obstante, a janela para os sinais moleculares tem sido apresentada não ser suficientemente grande para permitir a discriminação em temperaturas baixas, o que explica a falha relatada dos sinais moleculares em discriminar tais alelos em uma amplificação isotérmica. Observou-se que as sondas de filamento duplo de acordo com esta invenção possuem janelas ainda maiores, o que, acredita-se, toma-as adequada para discriminação em reações de amplificações isotérmicas.

REIVINDICAÇÕES

Claims (13)

1. Sonda de hibridização de ácido nucleico de filamento duplo para uma sequência alvo de ácido nucleico pré-selecionada, caracterizada pelo fato de compreender: um primeiro oligonucleotídeo que compreende uma primeira sequência perfeitamente complementar à referida sequência alvo, um segundo oligonucleotídeo que compreende uma segunda sequência que é complementar à referida primeira sequência, mas é mais curta do que a referida primeira sequência em até dez nucleotídeos, um rótulo de fluoróforo ligado a um dos referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos, e um segundo rótulo do grupo consistindo em um extintor e um receptor de fluorescência ligado ao outro dos referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos, de modo a interagir com o referido rótulo de fluoróforo quando referidos oligonucleotídeos são hibridizados entre si.

2. Sonda de filamento duplo de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos hibridizam para produzir uma extremidade cega de filamento duplo, e em que o referido rótulo de fluoróforo e o referido segundo rótulo são ligados à referida extremidade cega.

3. Sonda de filamento duplo de acordo com qualquer uma dentre a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que os referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos têm as extremidades 3’ que são bloqueadas contra o fato de serem extensíveis por uma polimerase.

4. Sonda de filamento duplo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que peló menos um dos referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos compreende pelo menos um nucleotídeo não natural ou pelo menos uma articulação de nucleotídeo não natural.

5. Reação de amplificação e detecção de sequência alvo de ácido nucleico em tempo real, caracterizadas pelo fato de que os amplicons alvo são detectados por uma sonda de hibridização fluorescentemente rotulada, a referida amplificação compreendendo usar como referida sonda de hibridização uma sonda de hibridização de ácido nucléico de filamento duplo para referida sequência alvo compreendendo: um primeiro oligonucleotídeo que compreende uma primeira sequência perfeitamente complementar à referida sequência alvo, um segundo oligonucleotídeo que compreende uma segunda sequência que é complementar à referida primeira sequência, em que a referida segunda sequência é mais curta do que a referida primeira sequência em até 10 nucleotídeos, um rótulo de fluoróforo ligado a um dos referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos, e um segundo rótulo do grupo consistindo em um extintor e um receptor de fluorescência ligado ao outro dentre os referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos, de modo a interagir com o referido rótulo de fluoróforo quando os referidos oligonucleotídeos forem hibridizados entre si.

6. Reação de amplificação em tempo real de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que os referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos da sequência hibridizam para produzir uma extremidade cega de filamento duplo, e em que referido rótulo de fluoróforo e o referido segundo rótulo são ligados à referida extremidade cega.

7. Reação de amplificação em tempo real de acordo com qualquer uma dentre a reivindicação 5 ou reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que os referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos têm as extremidades 3’ que são bloqueadas contra o fato de serem extensíveis por uma polimerase.

8. Reação de amplificação em tempo real de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 7, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos compreende pelo menos um nucleotídeo não natural ou pelo menos uma articulação de nucleotídeos não naturais.

9. Reação de amplificação e detecção de ácido nucleico em tempo real, caracterizada pelo fato de que pelo menos duas sequências alvo são alelos que diferem em pelo menos um nucleotídeo único, e em que os amplicons de cada sequência alvo alélica são detectados por uma sonda de hibridização fluorescentemente rotulada a eles complementares, o melhoramento em que cada sonda de hibridização é uma sonda de hibridização de ácido nucleico de filamento duplo para sua sequência alvo alélica compreendendo: um primeiro oligonucleotídeo que compreende uma primeira sequência perfeitamente complementar à referida sequência alvo alélica, um segundo oligonucleotídeo que compreende uma segunda sequência que é complementar à referida primeira sequência, em que a referida segunda sequência é mais curta do que a referida primeira sequência em até 10 nucleotídeos, um rótulo de fluoróforo ligado a um dos referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos, e um rótulo de extintor ligado ao outro dos referidos primeiro e segundo oligonucleotídeos de modo que o fluoróforo e o extintor fiquem em um relacionamento de extinção quando os referidos oligonucleotídeos são hibridizados entre si, e o rótulo de fluoróforo de cada uma das referidas sondas de filamento duplo é distintamente detectado.

10. Reação de amplificação em tempo real de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o primeiro e o segundo nucleotídeos de cada sonda hibridizam para produzir uma extremidade cega de filamento duplo, e em que os rótulos de fluoróforo e extintor são ligados à referida extremidade cega.

11. Reação de amplificação em tempo real de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 10, caracterizada pelo fato de que os primeiro e segundo oligonucleotídeos das referidas sondas têm extremidades 3 ’ que são bloqueadas contra serem estendidas por uma polimerase.

12. Reação de amplificação em tempo real de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 11, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos primeiro e segundo oligonucleotídeos de pelo menos uma das referidas sondas compreende pelo menos um nucleotídeo não natural ou pelo menos uma articulação de nucleotídeo não natural.

13. Ensaio para detectar uma seqüência alvo de ácido nucléico, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar a uma amostra que se suspeite conter a sequência alvo, uma sonda como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, e medir uma mudança na fluorescência.