CN112961911B - 一种dna中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种DNA中5‑羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，本发明是基于AbasI酶特异性识别并切割含有5ghmC的双链DNA特性，结合连接‑聚合酶链式反应（PCR）反应建立5hmC的定量分析方法。AbasI酶能够识别双链DNA中的5ghmC，并能在距修饰的胞嘧啶3´侧11‑13碱基处进行切割，形成一个2‑3碱基的3´突出末端。酶切后的产物会与Harpin探针在SplintR连接酶的作用下进行连接，然后将连接产物作为模板进行PCR扩增，最后根据标准曲线图来定量实际样品中5hmC的含量。本发明样品处理步骤简单，对实验操作者及实验条件没有特殊要求。本发明的灵敏度高，选择性好，成本较低。

Description

一种DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是涉及一种DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法。

背景技术

5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是重要的表观遗传修饰，它是由TET家族酶氧化5-甲基胞嘧啶（5mC）产生的。进一步的研究表明5hmC参与基因表达调控，它与胚胎发育、神经系统功能以及肿瘤研究高度相关。许多研究发现，在包括黑色素，恶性神经胶质瘤，肝癌等在内的肿瘤中缺乏5hmC表达，5hmC是疾病诊断和治疗的潜在标志物。因此，准确检测5hmC对揭示其功能和机理具有重要意义。

在早期研究中，研究者通过薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）或者质谱（MS）等仪器建立5hmC的分析方法。这些方法可以检测DNA样本中所有位点5hmC的总含量，但是不能确定DNA序列中5hmC的分布也无法确定特定位点5hmC的含量。

为了解决这一问题，高通量测序技术被用来研究5hmC在基因组DNA中的分布和定量。如氧化亚硫酸氢盐测序（oxBS-Seq）和TET辅助亚硫酸氢盐测序（TAB-Seq）。在亚硫酸氢盐测序方法（BS-Seq）中，亚硫酸氢盐处理DNA并测序后，胞嘧啶（C）转变成胸腺嘧啶（T），5mC和5hmC表现为C。在氧化亚硫酸氢盐测序（oxBS-Seq）中，经过高钌酸钾（KRuO₄）氧化和亚硫酸氢盐处理DNA并测序后，C和5hmC转变成T，5mC表现为C。通过对比BS-Seq和oxBS-Seq结果，可以确定5hmC的分布和含量。TAB-seq通过使用β-葡萄糖基转移酶（β-GT）将葡萄糖转移到5hmC上，生成β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶（5ghmC），然后利用TET酶将5mC氧化为5-羧基胞嘧啶（5caC）。在经过糖基化转移酶、TET氧化酶和亚硫酸氢盐处理之后，在最终测序后，5mC会变为T，而5hmC会变为C。通过与未处理样品的BS-seq结果做对比，就可以确定5mC和5hmC的分布。这两种方法都可用于以在单碱基分辨率绘制5hmC分布并定量5hmC的相对丰度。高通量的测序方法非常耗时、并昂贵，适用于基因组DNA上大量的5hmC的分析。如果用高通量测序方法分析少量的特定位点5hmC的含量，显得浪费。

为了分析特定位点的5hmC的含量，需要发展步骤简单、灵敏度高、特异性好的特定位点的分析方法。

目前存在的特定位点5hmC的分析方法包括硼酸介导的聚合酶链式反应（PCR）分析方法，基于连接反应的滚环扩增方法，HpaII介导的连接-PCR法和过氧钨酸钾氧化介导的两相扩增系统（POM-TPAS）法。

硼酸介导的PCR分析方法是基于硼酸（BA）可以与5ghmC中的邻二醇发生作用并抑制Taq DNA聚合酶的扩增活性，而建立的5hmC的定量分析方法。该方法是第一个特定位点5hmC的定量分析方法，可以应用于任何DNA片段中5hmC的分析。然而该方法具有一定的局限性，5hmC产生的是负向信号，限制了其在复杂生物样品中的应用。基于连接反应的滚环扩增方法是基于oxBS和连接-滚环扩增反应建立的区分5hmC和5mC的定量分析方法，但该方法只能将5hmC与5mC区别开来，而不能区分5hmC与C，这极大地限制了此方法的应用。HpaII介导的连接-PCR法是基于HpaII酶切、oxBS和连接-PCR扩增反应建立的5hmC的定量分析方法。使用甲基化敏感限制性内切酶（HpaII）将5hmC和5mC与未修饰的C进行区分，因为HpaII可以切割未含有甲基化的CCGG位点。然后使用KRuO₄选择性地将5hmC氧化为5-甲酰基胞嘧啶（5fC），再然后用亚硫酸氢盐处理样品，最后进行连接反应和PCR扩增反应。根据扩增的结果可以将5hmC与5mC和C进行区分，以达到对特定位点5hmC高分辨率、高灵敏度的分析。该方法虽然可以从5mC和C中精确区分5hmC，但是步骤繁多、过程复杂。此外，此方法具有一定的局限性，只能测定特定序列CCGG上的5hmC，不能测定其他序列上的5hmC。过氧钨酸钾氧化介导的两相扩增系统（POM-TPAS）法是基于过氧钨酸钾氧化和两相扩增系统而建立的5hmC定量分析方法，这种方法步骤相对简单。然而该方法中用到了化学试剂来处理DNA，所以会对DNA造成一定的损伤。因此，建立一种操作简单、灵敏度高、特异性好的分析检测5hmC的方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法。以解决现有方法过程复杂、特异性和灵敏度不理想的问题。

本发明的目的是这样实现的：一种DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，包括以下步骤：

（a）使用T4噬菌体β-葡糖基转移酶将尿嘧啶二磷酸葡萄糖的葡萄糖基团转移至待检测DNA的5-羟甲基胞嘧啶上，形成含有β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶的双链DNA；

（b）使用AbasI酶特异性识别含有β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶的双链DNA，并在距β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶的3´侧11-13 碱基处进行切割，形成一个2-3碱基的3´突出末端；

（c）设计并合成Harpin探针，所述Harpin探针从5´端到3´端依次为茎区Ⅰ、环区、茎区Ⅱ、目标识别区，且Harpin探针序列的5´端修饰有磷酸基团，所述茎区Ⅰ与茎区Ⅱ互补配对，所述目标识别区与待检测DNA序列切割形成的3´突出末端序列互补；

（d）将所述Harpin探针与步骤（b）中形成含有3´突出末端的双链DNA在DNA连接酶的作用下进行连接反应；

（e）以步骤（d）所得的连接产物为模板进行聚合酶链式反应，并加入Taqman探针，实时检测荧光信号，根据预先测定的标准曲线确定待检测DNA中5-羟甲基胞嘧啶的含量。

所述Harpin探针的茎区为6-20个碱基序列。

所述Harpin探针的目标识别区为2-3个碱基序列。

所述DNA连接酶包括T4 DNA连接酶、SplintR DNA 连接酶、T3 DNA 连接酶、T7 DNA连接酶、Taq DNA 连接酶。

所述T4噬菌体β-葡糖基转移酶的反应条件为37℃孵育60 min；所述AbasI酶的反应条件为25℃孵育12h。

所述DNA连接酶为SplintR DNA 连接酶，将反应体系放入PCR仪中，于25℃孵育30min进行连接反应。

所述聚合酶链式反应采用实时定量PCR系统，反应程序为94℃下加热 2 min，然后进行45个热循环，其中，每个热循环为94℃、30 s；56℃、30 s；同步监测荧光信号。

本发明是基于AbasI酶特异性识别并切割含有5ghmC的双链DNA特性，结合连接-PCR反应建立5hmC的定量分析方法。该方法以含有待测位点（含有C或5mC或5hmC）的双链DNA为目标序列。当待测DNA链上有5hmC修饰T4 β-GT可以特异性地将UDP-Glc的葡萄糖基团转移至双链DNA的5-羟甲基胞嘧啶残基上，形成5ghmC，对于C和5mC而言，T4 β-GT对其并没有产生影响。AbasI酶能够识别双链DNA中的5ghmC，并能在距修饰的胞嘧啶3´侧11-13碱基处进行切割，形成一个2-3碱基的3´突出末端。酶切后的产物会与Harpin探针在SplintR连接酶的作用下进行连接，然后将连接产物作为模板进行PCR扩增，最后根据标准曲线图来定量实际样品中5hmC的含量。

本发明的有益效果如下：

1.在本发明中，DNA样品不需要任何化学试剂对样品进行处理，减少了DNA样品的损伤。

2.DNA样品不需要任何纯化回收步骤，减少了DNA样品的损失。

3.此方法对测定的5hmC序列没有特别要求，能测定绝大部分的5hmC。

4.在本发明中，样品处理步骤简单，对实验操作者及实验条件没有特殊要求。

5.本发明的灵敏度高，选择性好，成本较低。

附图说明

图1是基于连接-聚合酶链式反应定量检测DNA链上5hmC的原理示意图。

图2是不同浓度的目标序列5hmC的荧光强度随着循环次数变化的实时荧光曲线图。

图3是C_T值与目标序列5hmC浓度的负对数（-lg）值之间的线性关系。

图4是20 pM目标序列C，5mC和5hmC产生的实时荧光曲线图。

图5是基于连接反应的PCR技术检测目标序列5hmC、5mC和C的相对信号强度图。

图6是在目标序列5hmC和5mC的混合物中，不同比例5hmC的实时荧光曲线图。

图7是C_T值与目标序列5hmC浓度的负对数（-lg）值之间的线性关系。

图8是在目标序列5hmC和C的混合物中，不同比例5hmC的实时荧光曲线图。

图9是C_T值与目标序列5hmC浓度的负对数（-lg）值之间的线性关系。

图10是138ng鼠脑基因组DNA和138ng鼠脑基因组DNA +5fM目标序列5hmC产生的实时荧光曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，下述实施例仅作为说明，并不以任何方式限制本发明的保护范围。

在下述实施例中未详细描述的过程和方法是本领域公知的常规方法，实施例中所用试剂均为分析纯或化学纯，且均可市购或通过本领域普通技术人员熟知的方法制备。下述实施例均实现了本发明的目的。

实施例1

检测5-羟甲基胞嘧啶，检测原理如图1所示，具体检测方法如下：1、含有5hmC的DNA序列5'-CCAGGTCCCACAGATCTATCACC ^5hm CGGGGCTCTTCAAACTCTGCAGG-3'（画下划线的碱基是5-羟甲基胞嘧啶，斜体部分为PCR引物区，由宝生物工程（大连）有限公司提供），互补链序列5'-CCTGCAGAGTTTGAAGAGCCCCGGGTGATAGATCTGTGGGACCTGG-3'（由宝生物工程（大连）有限公司提供），5'-CCAGGTCCCACAGATCTATCACC ^5m CGGGGCTCTTCAAACTCTGCAGG-3'（画下划线的碱基是5-甲基胞嘧啶，斜体部分为PCR引物区），5'-CCAGGTCCCACAGATCTATCACC CGGGGCTCTTCAAACTCTGCAGG-3'（画下划线的碱基是未被修饰的胞嘧啶，斜体部分为PCR引物区），这三条链除了中间的一个胞嘧啶分别被修饰为5hmC，5mC和C，其余碱基都相同，分别命名为目标序列5hmC，目标序列5mC和目标序列C。设计合成了Harpin探针，Harpin 探针的碱基序列为 5'-po₄ ACAGGACT TTTTCTACCTCAATGCTTCGTTCCGTCCTTTT AGTCCTGTTG-3' （斜体的部分为茎区、画下划线的部分为环区，既有下画线又有斜体的部分为PCR引物区，加粗部分为目标序列识别区，由生工生物工程（上海）股份有限公司提供）。

2、在200 μL离心管中加入1 μL 2 μM的目标链，1 μL 2 μM的互补链，1 μL 10XNEBuffer 4（500 mM KAc, 200 mM Tris-Ac, 100 mM Mg(Ac)₂, 10 mM DTT, PH 7.9 @ 25°C）（同时作空白对比实验，空白是加入水来代替目标链水溶液和互补链水溶液），混合均匀，作为溶液A。在200 μL离心管中加入6.6 μL的水，0.2 μL 50X UDP，2 U T4噬菌体β-葡糖基转移酶，混合均匀，作为溶液B。在200 μL离心管中加入7.5 μL的水，1 μL的10 XCutSmart Buffer（500 mM KAc, 200 mM Tris-Ac, 100 mM Mg(Ac)₂, 1000 μg/ml BSA,PH 7.9 @ 25 °C），0.5 μL 1X的DTT，10 U AbaSI酶混合均匀，作为溶液C。将溶液A放入PCR仪中，95 ℃加热2 min，再降至室温孵育10 min，使目标链（5hmC/5mC/C）与互补链杂交，杂交结束后向溶液A中加入溶液B，37 ℃孵育60 min进行糖基化反应，65 ℃孵育20 min对T4β-GT进行失活。反应结束后，再将溶液C加入到溶液A和溶液B的混合液中，25 ℃孵育12小时进行酶切反应，65 ℃孵育20 min对AbaSI酶进行失活。

3、取步骤（2）中的样品，根据所需浓度对其进行稀释。在200 μL离心管中加入1 μL50 nM Harpin probe，1 μL 10 X SplintR 反应缓冲液（500 mM Tris-HCl，100 mM MgCl₂,10 mM ATP, 100 mM DTT），1 μL目标链，6.9 μL水和2.5 U SplintR ligase 酶，将混液放入PCR仪中25 ℃温育30 min进行连接反应，65 ℃温育20 min对连接酶进行失活，反应结束后连接产物立即放在冰上。

4、取步骤（3）中2.0 μL连接反应产物加入到8.0 μL聚合酶链式反应（PCR）混合溶液中进行PCR反应，其中PCR反应混合溶液由6.1 μL灭菌水、1.0 μL 10×JumpStart™ TaqDNA聚合酶缓冲溶液（100 mM Tris-HCl，pH=8.3，500 mM KCl，15 mM MgCl₂，0.01%（w/v）明胶）、0.2 μL 2.5 mM脱氧核苷三磷酸（dNTP）水溶液、0.1 μL 10 μM 正向引物（5'-GGTCCCACAGATCTATCACC -3'，由生工生物工程（上海）股份有限公司提供）水溶液、0.1 μL10 μM 反向引物（5'-GACGGAACGAAGCATTGAG -3'，由生工生物工程（上海）股份有限公司提供）水溶液、0.1 μL 10 μM Taqman探针（5'-FAM-ACCCGGGGCTCTTCA-BHQ1-3'，由宝生物工程（大连）有限公司提供）和1 U JumpStart™ Taq DNA 聚合酶，混合均匀后立刻放到 StepOne实时定量PCR系统中（Applied Biosystems，美国），94 ℃ 下加热 2 min，然后进行45个热循环，每个热循环94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s；同步监测荧光信号，间隔1个循环采集一次实时荧光强度信号，检测结果如图2所示，并绘制实时荧光曲线的C_T值与5hmC浓度的负对数（-lg）之间的线性关系曲线，结果如图3所示。

从图2中可以看出，随着5hmC的浓度从200 pM降至2 fM时，对应扩增曲线的C_T值逐渐增加，且不同浓度梯度之间可以相互区分，同时，从图3中可以看出实时荧光曲线的C_T值与5hmC浓度的负对数（-lg）值在2 fM到200 pM之间呈现良好的线性关系，线性相关方程为C_T=-15.95-3.69 lgC_5hmC（M），相关系数R²=0.991。因此，本发明可以定量检测低至2 fM的5hmC，线性范围跨越5个数量级。

实施例2：

特异性是5hmC分析方法的关键，本发明的目的是区分5hmC、5mC和C，并建立5hmC的分析方法。目标序列C和5mC对5hmC的干扰越小，分析方法的假阳性信号越少，对5hmC的分析越准确。因此，我们对该方法的特异性进行研究，使用实施例1的方法对20 pM 目标序列C、5mC和5hmC进行实验，具体步骤与实施例1相同，结果如图4所示。从图4中可以看出由20 pM目标序列C和5mC产生的荧光信号远低于目标序列5hmC的，根据目标序列5hmC对应的线性方程（图3）计算，20 pM目标序列C和5mC产生的荧光信号分别等于3.60 fM和36.8 fM 5hmC产生的荧光信号。将目标序列5hmC产生的相对强度定为100 %，计算目标序列5mC和C的相对强度，结果如图5所示。从图5中可以看出C的非特异性干扰为0.02 %，5mC的非特异性干扰为0.18 %。实验结果表明，目标序列C和5mC对目标序列5hmC的测定的干扰很小，说明本发明的方法具有很高的特异性。

实施例3：

为了进一步评价该方法的性能，使用实施例1检测5hmC的方法测定混合样品（目标序列5hmC和C的混合物或目标序列5hmC和5mC的混合物）中的目标序列5hmC，混合物的总浓度为20 pM。将目标序列5hmC与目标序列5hmC + C的比例从0调整到100％，分别为0.05％，0.1％，1％，10％，100％。将目标序列5hmC与目标序列5hmC + 5mC的比例从0调整到100％，分别为0.5％，1％，10％和100％。其他步骤与实施例1相同，结果如图所示6-9。从图6和8可以看出，不同比例的5hmC产生了清晰的荧光曲线，并且C_T值随着目标序列5hmC比例的增加而降低。从图7和9可以看出，实时荧光曲线的C_T值与5hmC浓度的负对数（-lg）之间存在良好的线性关系，相应的线性方程分别为C_T =-15.57-3.73 lgC_5hmC（M）和C_T =-15.72-3.74lgC_5hmC（M），这些线性相关方程与图3中的非常相似，表明目标序列C和5mC的存在对5hmC的定量检测几乎没有干扰。结果表明本发明所提出的测定方法可以很好地检测混合样品中的5hmC。

实施例4：

为了评估该方法的实用性，我们将本发明应用于小鼠脑基因组DNA中特定位点5hmC的定量检测，具体的操作步骤与实施例1相同，结果如图10所示。图10是138 ng小鼠脑基因组DNA和5 fM 5hmC+138 ng小鼠脑基因组DNA产生的实时荧光曲线，根据相应的线性相关方程（图3）计算138 ng小鼠大脑基因组DNA中5hmC的浓度为1.74 fM（在10 uL体系中），加5 fM目标序列5hmC的回收率为88.4 %。此结果表明本发明方法对基因组DNA中特定位点5hmC的定量检测是可行的。

Claims (7)

1.一种非诊断目的的DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

（a）使用T4噬菌体β-葡糖基转移酶将尿嘧啶二磷酸葡萄糖的葡萄糖基团转移至待检测DNA的5-羟甲基胞嘧啶上，形成含有β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶的双链DNA；

（b）使用AbasI酶特异性识别含有β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶的双链DNA，并在距β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶的3´侧11-13 碱基处进行切割，形成一个2-3碱基的3´突出末端；

（c）设计并合成Harpin探针，所述Harpin探针从5´端到3´端依次为茎区Ⅰ、环区、茎区Ⅱ、目标识别区，且Harpin探针序列的5´端修饰有磷酸基团，所述茎区Ⅰ与茎区Ⅱ互补配对，所述目标识别区与待检测DNA序列切割形成的3´突出末端序列互补；

（d）将所述Harpin探针与步骤（b）中形成含有3´突出末端的双链DNA在DNA连接酶的作用下进行连接反应；

（e）以步骤（d）所得的连接产物为模板进行聚合酶链式反应，并加入Taqman探针，实时检测荧光信号，根据预先测定的标准曲线确定待检测DNA中5-羟甲基胞嘧啶的含量。

2.根据权利要求1所述的非诊断目的DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，其特征在于，所述Harpin探针的茎区为6-20个碱基序列。

3.根据权利要求1所述的非诊断目的DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，其特征在于，所述Harpin探针的目标识别区为2-3个碱基序列。

4.根据权利要求1所述的非诊断目的DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，其特征在于，所述DNA连接酶包括T4 DNA连接酶、SplintR DNA 连接酶、T3 DNA 连接酶、T7 DNA 连接酶、Taq DNA 连接酶。

5.根据权利要求1所述的非诊断目的DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，其特征在于，所述T4噬菌体β-葡糖基转移酶的反应条件为37℃孵育60 min；所述AbasI酶的反应条件为25℃孵育12h。

6.根据权利要求1所述的非诊断目的DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，其特征在于，所述DNA连接酶为SplintR DNA 连接酶，将反应体系放入PCR仪中，于25℃孵育30 min进行连接反应。

7.根据权利要求1所述的非诊断目的DNA中5-羟甲基胞嘧啶的定量分析方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应采用实时定量PCR系统，反应程序为94℃下加热 2 min，然后进行45个热循环，其中，每个热循环为94℃、30 s；56℃、30 s；同步监测荧光信号。

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