JPH0391484A - オリゴヌクレオチド依存性核酸増幅反応の汚染を制御する方法 - Google Patents
オリゴヌクレオチド依存性核酸増幅反応の汚染を制御する方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、核酸配列を増幅する方法の改良に関する。特
に、本発明は、その後の増幅方法の実施に悪影響を及ぼ
す、オリゴヌクレオチド依存性核酸増幅方法の実施産物
を排除することにより核酸サンプルの交差汚染を防止す
る方法を開示する。
に、本発明は、その後の増幅方法の実施に悪影響を及ぼ
す、オリゴヌクレオチド依存性核酸増幅方法の実施産物
を排除することにより核酸サンプルの交差汚染を防止す
る方法を開示する。
上記改良は、増幅方法の結果が交差汚染核酸鋳型の存在
を示さないことを保証するものである。
を示さないことを保証するものである。
［従来の技術］
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法は、変性、オリゴ
ヌクレオチドプライマーのアニーリングおよびＤＮＡポ
リメラーゼによるプライマーの延長を含む一連の操作を
通して特定の核酸配列を増幅する（ムリンス・ケービー
等、アメリカ特許第４゜６８３．２０２号、アメリカ特
許第４，６８３，１９５号、ムリンス・ケービー、ヨー
ロッパ特許第２０１．１８４号、エルリッヒ・エイチ、
ヨーロッパ特許第５０，４２４号、第８４，７９６号、
第２５８．０１７号、第２３７，３６２号、エルリッヒ
・エイチ、アメリカ特許第４，５８２，７８８号、サイ
キ・アール等、アメリカ特許第４，６８３，２０２号、
ムリンス・ケービー等、コールド・スプリング・ハーバ
−・シンポジウム、クオンティタティプ・バイオロジー
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｂｏｒＳｙｍｐ、
Ｑｕａｎｔ、 Ｂｉｏｌ、 ）、５１巻２６３頁（１
９８６年）、サイキ・アール等、サイエンス（Ｓ ｃｉ
ｅｎｃｅ）、２３０巻１３５０頁（１９８５年）、サイ
キ・アール、サイエンス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ）、２３１
巻４８７頁（１９８８年）、ロー・イーワイ等、サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４３巻２１７頁（１９８８
年）参照）。これらの段階は何回も反復することができ
、原特定配列のコピー数の大きな増幅をもたらすことが
できる。ＤＮＡ配列１コピーでざえも増幅して数百ナノ
グラムの産生物を産生ずることができる（リー・エイチ
等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３３５巻４１４頁（
１９８８年））。
ヌクレオチドプライマーのアニーリングおよびＤＮＡポ
リメラーゼによるプライマーの延長を含む一連の操作を
通して特定の核酸配列を増幅する（ムリンス・ケービー
等、アメリカ特許第４゜６８３．２０２号、アメリカ特
許第４，６８３，１９５号、ムリンス・ケービー、ヨー
ロッパ特許第２０１．１８４号、エルリッヒ・エイチ、
ヨーロッパ特許第５０，４２４号、第８４，７９６号、
第２５８．０１７号、第２３７，３６２号、エルリッヒ
・エイチ、アメリカ特許第４，５８２，７８８号、サイ
キ・アール等、アメリカ特許第４，６８３，２０２号、
ムリンス・ケービー等、コールド・スプリング・ハーバ
−・シンポジウム、クオンティタティプ・バイオロジー
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｂｏｒＳｙｍｐ、
Ｑｕａｎｔ、 Ｂｉｏｌ、 ）、５１巻２６３頁（１
９８６年）、サイキ・アール等、サイエンス（Ｓ ｃｉ
ｅｎｃｅ）、２３０巻１３５０頁（１９８５年）、サイ
キ・アール、サイエンス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ）、２３１
巻４８７頁（１９８８年）、ロー・イーワイ等、サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４３巻２１７頁（１９８８
年）参照）。これらの段階は何回も反復することができ
、原特定配列のコピー数の大きな増幅をもたらすことが
できる。ＤＮＡ配列１コピーでざえも増幅して数百ナノ
グラムの産生物を産生ずることができる（リー・エイチ
等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３３５巻４１４頁（
１９８８年））。
他の既知核酸増幅方法はコウ・デイ−等、プロシーデイ
ンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サ
イエンシーズ・ニーニス−エイ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）、８６巻１１７３
頁（１９８９年）の転写に基づく増幅システムを含んで
いる。生成物である「ジヌクレオチド」配列を有し、そ
れによりジヌクレオチドを増幅する核酸の存在下２種（
またはそれ以上）のオリゴヌクレオチドの結合に基づく
方式は既知である（つ・ディーワイおよびワレンス・ア
ールビー、ゲノミックス、第４巻、第５６０頁（１９８
９年））。
ンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サ
イエンシーズ・ニーニス−エイ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）、８６巻１１７３
頁（１９８９年）の転写に基づく増幅システムを含んで
いる。生成物である「ジヌクレオチド」配列を有し、そ
れによりジヌクレオチドを増幅する核酸の存在下２種（
またはそれ以上）のオリゴヌクレオチドの結合に基づく
方式は既知である（つ・ディーワイおよびワレンス・ア
ールビー、ゲノミックス、第４巻、第５６０頁（１９８
９年））。
ＰＣＨのような増幅方法の結果の１つは、増幅産生物自
体がその後のＰＣＲ法の基質となることができることで
ある。さらに、増幅産生物の量が大きくなり得、またＰ
ＣＨの感受性が大変大きいため、実験室の中でのＰＣＲ
反応のような反応のごく小さい分画の散乱でさえも、そ
の後の他のサンプルを増幅する試みの汚染を導くことが
あり得り、それによって誤った性質を生ずる。極端な注
意が、交差汚染を避けるために必要である（コウ・ニス
およびヒグチ・アール、ネイチャー、第３３９巻、第２
３７頁（１９８７年））、このことば大変不都合でＰＣ
Ｈのような増幅を行なう費用を顕著に増加する。
体がその後のＰＣＲ法の基質となることができることで
ある。さらに、増幅産生物の量が大きくなり得、またＰ
ＣＨの感受性が大変大きいため、実験室の中でのＰＣＲ
反応のような反応のごく小さい分画の散乱でさえも、そ
の後の他のサンプルを増幅する試みの汚染を導くことが
あり得り、それによって誤った性質を生ずる。極端な注
意が、交差汚染を避けるために必要である（コウ・ニス
およびヒグチ・アール、ネイチャー、第３３９巻、第２
３７頁（１９８７年））、このことば大変不都合でＰＣ
Ｈのような増幅を行なう費用を顕著に増加する。
すなわち、増幅が、それ以前の増幅からの交差汚染の可
能性に関係なしに実施することができるオリゴヌクレオ
チド依存性核酸増幅の日常的で経済的な方法の必要性が
存在する。
能性に関係なしに実施することができるオリゴヌクレオ
チド依存性核酸増幅の日常的で経済的な方法の必要性が
存在する。
［発明の構成］
本発明はオリゴヌクレオチド依存性増幅法の間にＤＮＡ
またはＲＮＡの中ヘエキソサンプルヌクレオチドを組み
入れる方法を含む。
またはＲＮＡの中ヘエキソサンプルヌクレオチドを組み
入れる方法を含む。
本発明は、一般にインビトロオリゴヌクレオチド依存性
、核酸増幅方法上の改良を示す。本発明の方法では、増
幅産生物を、増幅産生物に別の特性を与える方法で、増
幅の開始に用いた核酸基質と識別可能にする。従って、
新規増幅反応の開始前に、これらの別の特性を、その後
の増幅反応中で以前の増幅産生物が鋳型として不活性化
させるために利用することができる。
、核酸増幅方法上の改良を示す。本発明の方法では、増
幅産生物を、増幅産生物に別の特性を与える方法で、増
幅の開始に用いた核酸基質と識別可能にする。従って、
新規増幅反応の開始前に、これらの別の特性を、その後
の増幅反応中で以前の増幅産生物が鋳型として不活性化
させるために利用することができる。
それ故、本発明は、
ａ）第１サンプルの核酸を増幅し、その際上記増幅は１
種またはそれ以上の特定オリゴヌクレオチドに依存する
ものであり、上記特定オリゴヌクレオチドの少なくとも
１種がエキソサンプルヌクレオチドを含み、 ｂ）上記エキソサンプルヌクレオチドを含む核酸を上記
特定オリゴヌクレオチドに依存する増幅中で実質的に非
増幅性にするが、上記エキソサンプルヌクレオチドを含
まない核酸増幅に実質的に作用しない処理を第２サンプ
ルの核酸に施す 段階を含み、それにより第２サンプルを汚染している第
１サンプル由来増幅核酸配列が第２サンプルの核酸配列
の特定オリゴヌクレオチド依存増幅の間に実質的にこれ
以上増幅しないようにすることからなる、サンプル中に
１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド依存性核酸を
増幅する方法を提供する。
種またはそれ以上の特定オリゴヌクレオチドに依存する
ものであり、上記特定オリゴヌクレオチドの少なくとも
１種がエキソサンプルヌクレオチドを含み、 ｂ）上記エキソサンプルヌクレオチドを含む核酸を上記
特定オリゴヌクレオチドに依存する増幅中で実質的に非
増幅性にするが、上記エキソサンプルヌクレオチドを含
まない核酸増幅に実質的に作用しない処理を第２サンプ
ルの核酸に施す 段階を含み、それにより第２サンプルを汚染している第
１サンプル由来増幅核酸配列が第２サンプルの核酸配列
の特定オリゴヌクレオチド依存増幅の間に実質的にこれ
以上増幅しないようにすることからなる、サンプル中に
１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド依存性核酸を
増幅する方法を提供する。
本発明はさらに増幅が、１種の核酸または核酸の混合物
（各核酸は同じまたは異なった長さの２種の別の相補鎖
を含む）中に含まれる少なくとも１種の特定の核酸配列
を増幅する方法であり、さ らに ｅ）鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列につ
いて、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプライマ
ーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅され
ているそれぞれの異なった特定配列に対する２種のオリ
ゴヌクレオチドプライマーで処理し、上記プライマーは
、それぞれの特定配列の異なった鎖に充分相補的で相手
とハイブリダイズし、その結果１種のプライマーから合
成された延長産生物がその相補体から分離するとき、他
方のプライマーの延長産生物の合成の鋳型として働くよ
うに選ばれたものであり、 ｒ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、ｇ）プライマー延長産生
物が段階ｒ）で製造され・た一本鎖のそれぞれを鋳型と
して使って合成される条件下において段階ｅ）のプライ
マーで段階ｆ）から発生した一本鎖分子を処理する ことからなる上記方法を提供する。
（各核酸は同じまたは異なった長さの２種の別の相補鎖
を含む）中に含まれる少なくとも１種の特定の核酸配列
を増幅する方法であり、さ らに ｅ）鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列につ
いて、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプライマ
ーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅され
ているそれぞれの異なった特定配列に対する２種のオリ
ゴヌクレオチドプライマーで処理し、上記プライマーは
、それぞれの特定配列の異なった鎖に充分相補的で相手
とハイブリダイズし、その結果１種のプライマーから合
成された延長産生物がその相補体から分離するとき、他
方のプライマーの延長産生物の合成の鋳型として働くよ
うに選ばれたものであり、 ｒ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、ｇ）プライマー延長産生
物が段階ｒ）で製造され・た一本鎖のそれぞれを鋳型と
して使って合成される条件下において段階ｅ）のプライ
マーで段階ｆ）から発生した一本鎖分子を処理する ことからなる上記方法を提供する。
さらに本発明は、
（Ａ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ’ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配
列について、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプ
ライマーの延長産生物が合成されるような条件下で、増
幅されているそれぞれの異なった特定配列に対する２種
のオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、少なくとも
プライマーの１種はエキソサンプルヌクレオチドを含み
、上記ブライマーは、それぞれの特定配列の異なった鎖
に充分相補的で相手とハイブリダイズし、その結果１種
のプライマーから合成された延長産生物がその相補体か
ら分離するとき、他方のプライマーの延長産生物の合成
の鋳型として働くように選ばれたものであり、ｂ）プラ
イマー延長産生物をそれらが合成された鋳型から分離し
て一本鎖分子を生じ、Ｃ）プライマー延長産生物が段階
ｂ）で製造された一本鎖のそれぞれを鋳型として使って
合成される条件下において段階ａ）のプライマーで段階
ｂ）から発生した上記一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅し
、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列が第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）エキソサンプルヌクレオチドを含む核酸を上記特定
オリゴヌクレオチドに依存する増幅中で実質的に非増幅
性にするが、上記エキソサンプルヌクレオチドを含まな
い核酸増幅に実質的に作用しない処理を第２サンプルの
核酸に施し、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする 段階からなる１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する
方法を提供する。
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ’ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配
列について、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプ
ライマーの延長産生物が合成されるような条件下で、増
幅されているそれぞれの異なった特定配列に対する２種
のオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、少なくとも
プライマーの１種はエキソサンプルヌクレオチドを含み
、上記ブライマーは、それぞれの特定配列の異なった鎖
に充分相補的で相手とハイブリダイズし、その結果１種
のプライマーから合成された延長産生物がその相補体か
ら分離するとき、他方のプライマーの延長産生物の合成
の鋳型として働くように選ばれたものであり、ｂ）プラ
イマー延長産生物をそれらが合成された鋳型から分離し
て一本鎖分子を生じ、Ｃ）プライマー延長産生物が段階
ｂ）で製造された一本鎖のそれぞれを鋳型として使って
合成される条件下において段階ａ）のプライマーで段階
ｂ）から発生した上記一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅し
、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列が第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）エキソサンプルヌクレオチドを含む核酸を上記特定
オリゴヌクレオチドに依存する増幅中で実質的に非増幅
性にするが、上記エキソサンプルヌクレオチドを含まな
い核酸増幅に実質的に作用しない処理を第２サンプルの
核酸に施し、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする 段階からなる１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する
方法を提供する。
最後に、本発明は、
（Ａ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列
について、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプラ
イマーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅
されているそれぞれの異なった特定配列に対する２種の
オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、少なくともプ
ライマーの１種はデオキシウリジンを含み、上記プライ
マーは、それぞれの特定配列の異なった鎖に充分相補的
で相手とハイブリダイズし、その結果１種のプライマー
から合成された延長産生物がその相補体から分離すると
き、他方のプライマーの延長産生物の合成の鋳型として
働くように選ばれたものであり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、Ｃ）プライマー延長産生
物が段階ｂ）で製造された一本鎖のそれぞれを鋳型とし
て使って合成される条件下において段階ａ）のプライマ
ーで段階ｂ）から発生した上記一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅し
、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列は第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）上記鎖をウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理し、 ｆ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼの畝上における作用
を熱により終結させ、 ｇ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第２サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅し
、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする 段階からなる１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する
方法を提供する。
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列
について、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプラ
イマーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅
されているそれぞれの異なった特定配列に対する２種の
オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、少なくともプ
ライマーの１種はデオキシウリジンを含み、上記プライ
マーは、それぞれの特定配列の異なった鎖に充分相補的
で相手とハイブリダイズし、その結果１種のプライマー
から合成された延長産生物がその相補体から分離すると
き、他方のプライマーの延長産生物の合成の鋳型として
働くように選ばれたものであり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、Ｃ）プライマー延長産生
物が段階ｂ）で製造された一本鎖のそれぞれを鋳型とし
て使って合成される条件下において段階ａ）のプライマ
ーで段階ｂ）から発生した上記一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅し
、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列は第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）上記鎖をウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理し、 ｆ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼの畝上における作用
を熱により終結させ、 ｇ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第２サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅し
、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする 段階からなる１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する
方法を提供する。
［発明の記載コ
以下の記載で、分子生物学および核酸増幅技術で使われ
る用語が広範囲に使用される。明細書および請求の範囲
の明白および一貫性のある理解を提供するために、上記
用語に与えられるべき範囲を含み、次の定義が提供され
る。
る用語が広範囲に使用される。明細書および請求の範囲
の明白および一貫性のある理解を提供するために、上記
用語に与えられるべき範囲を含み、次の定義が提供され
る。
ここで使われる「増幅」はヌクレオチド配列または複数
の配列のコピー数を増加する任意のインビトロ方法を表
している。核酸増幅はＤＮＡまたはＲＮＡの中へのヌク
レオチドの組み入れをもたらす。ここで使う場合、１種
の増幅反応はＤＮＡ複製の多数の回数からなることがで
きる。例えば、１種のＰＣＲ反応は変性および複製の３
０−１００「サイクル」からなる。
の配列のコピー数を増加する任意のインビトロ方法を表
している。核酸増幅はＤＮＡまたはＲＮＡの中へのヌク
レオチドの組み入れをもたらす。ここで使う場合、１種
の増幅反応はＤＮＡ複製の多数の回数からなることがで
きる。例えば、１種のＰＣＲ反応は変性および複製の３
０−１００「サイクル」からなる。
ここで使われる「ヌクレオチド」は塩基−糖−りん酸塩
結合物を表す技術用語である。ヌクレオチドは核酸ポリ
マー、すなわちＤＮＡおよびＲＮＡの単量体ユニットで
ある。この語はｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰまたはｒ
ＵＴＰのようなりボヌクレオシドトリホスフェートおよ
びｄＡＴＰｌｄＣＴＰ。
結合物を表す技術用語である。ヌクレオチドは核酸ポリ
マー、すなわちＤＮＡおよびＲＮＡの単量体ユニットで
ある。この語はｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰまたはｒ
ＵＴＰのようなりボヌクレオシドトリホスフェートおよ
びｄＡＴＰｌｄＣＴＰ。
ｄＧＴＰまたはｄＴＴＰのようなデオキシリボヌクレオ
シドトリホスフェートを含む。 「ヌクレオシド」は、
塩基−糖結合物、すなわちりん酸部分を欠失しているヌ
クレオチドを表す。
シドトリホスフェートを含む。 「ヌクレオシド」は、
塩基−糖結合物、すなわちりん酸部分を欠失しているヌ
クレオチドを表す。
ここで使われる「エキソサンプルヌクレオチド」は一般
に増幅すべき配列中に見られないヌクレオチドを表して
いる。はとんどのＤＮＡサンプルでは、デオキシウリジ
ンがエキソサンプルヌクレオチドの例である。デオキシ
ウリジントリホスフェート型、ｄＵＴＰは代謝中間体と
して生物体に存在しているが、はとんどＤＮＡ中に組み
入れられない。ｄＵＴＰがＤＮＡ中に組み入れられると
、結果として生ずるデオキシウリジンは例えば酵素ウラ
シルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を含む方法のよう
な正常過程によりインビトロで素早く除去される。すな
わち、デオキシウリジンは天然ＤＮＡ中ではほとんどま
たは決して存在しない。ある種の生物体はＤＮＡ中にデ
オキシウリジンを自然に組み入れることができることが
認められている。これらの生物体の核酸サンプルではデ
オキシウリジンはエキソサンプルヌクレオチドと考えら
れない。デオキシウリジンまたは他のエキソサンプルヌ
クレオチドの存在は当業者によく知られた方法により容
易に測定することができる。
に増幅すべき配列中に見られないヌクレオチドを表して
いる。はとんどのＤＮＡサンプルでは、デオキシウリジ
ンがエキソサンプルヌクレオチドの例である。デオキシ
ウリジントリホスフェート型、ｄＵＴＰは代謝中間体と
して生物体に存在しているが、はとんどＤＮＡ中に組み
入れられない。ｄＵＴＰがＤＮＡ中に組み入れられると
、結果として生ずるデオキシウリジンは例えば酵素ウラ
シルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を含む方法のよう
な正常過程によりインビトロで素早く除去される。すな
わち、デオキシウリジンは天然ＤＮＡ中ではほとんどま
たは決して存在しない。ある種の生物体はＤＮＡ中にデ
オキシウリジンを自然に組み入れることができることが
認められている。これらの生物体の核酸サンプルではデ
オキシウリジンはエキソサンプルヌクレオチドと考えら
れない。デオキシウリジンまたは他のエキソサンプルヌ
クレオチドの存在は当業者によく知られた方法により容
易に測定することができる。
技術用語である「ウラシルＤＮＡグリコシラーゼＪ（Ｕ
ＤＧ）は塩基ウラシルと糖デオキシリボースの間のグリ
コシド結合を開裂する酵素であって、これは単量体ヌク
レオチドｄＵＴＰがＤＮＡ分子に組み入れられていると
きにのみ作用し、この場合デオキシウリジン部分の組み
入れが結果として生ずる（ダンカン・ビー、ザ・エンザ
イム、第１４巻、第５６５頁（１９８１年））。酵素は
遊離ｄＵＴＰ、遊離デオキシウリジンまたはＲＮＡには
作用しない（デュカン、前掲）。
ＤＧ）は塩基ウラシルと糖デオキシリボースの間のグリ
コシド結合を開裂する酵素であって、これは単量体ヌク
レオチドｄＵＴＰがＤＮＡ分子に組み入れられていると
きにのみ作用し、この場合デオキシウリジン部分の組み
入れが結果として生ずる（ダンカン・ビー、ザ・エンザ
イム、第１４巻、第５６５頁（１９８１年））。酵素は
遊離ｄＵＴＰ、遊離デオキシウリジンまたはＲＮＡには
作用しない（デュカン、前掲）。
ここで使われる「組み入れる」は、核酸ポリマーの部分
になっていくことを表す。
になっていくことを表す。
ここで使われる「終結する」は、処理の停止をひき起こ
すことを意味する。この用語は永久的および条件付きの
両方の停止方法を含む。例えば処理が酵素的ならば、永
久的停止は熱変性であり、例えば条件付き停止は酵素活
性範囲の範囲外の温度に使用される。終結の両方の型は
本発明の用語の範囲内に包括される。
すことを意味する。この用語は永久的および条件付きの
両方の停止方法を含む。例えば処理が酵素的ならば、永
久的停止は熱変性であり、例えば条件付き停止は酵素活
性範囲の範囲外の温度に使用される。終結の両方の型は
本発明の用語の範囲内に包括される。
ここで使われる「オリゴヌクレオチド」は、「オリゴヌ
クレオチド」および「ポリヌクレオチド」の２つの技術
用語を集合的で取り替え可能に表す。
クレオチド」および「ポリヌクレオチド」の２つの技術
用語を集合的で取り替え可能に表す。
オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは別々の技
術用語ではあるが、それらの間に正確な分割線はなく、
ここでは取り替え可能に使われる。
術用語ではあるが、それらの間に正確な分割線はなく、
ここでは取り替え可能に使われる。
ここで使われる「オリゴヌクレオチド依存性増幅」は核
酸配列を増幅するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレ
オチドを使う増幅を表す。オリゴヌクレオチド依存性増
幅は長さにおいて２種またはそれ以上のモノヌクレオチ
ドサブユニットであり、新規に形成する増幅核酸分子の
一部分になる１種またはそれ以上のオリゴヌクレオチド
またはポリヌクレオチドの存在を要求する任意の増幅で
ある。
酸配列を増幅するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレ
オチドを使う増幅を表す。オリゴヌクレオチド依存性増
幅は長さにおいて２種またはそれ以上のモノヌクレオチ
ドサブユニットであり、新規に形成する増幅核酸分子の
一部分になる１種またはそれ以上のオリゴヌクレオチド
またはポリヌクレオチドの存在を要求する任意の増幅で
ある。
ここで使われる「プライマー」は増幅の間にヌクレオチ
ド単量体の共有付加により延長される１本鎖オリゴヌク
レオチドまたは１本鎖ポリヌクレオチドを表す。核酸増
幅は核酸ポリメラーゼによる核酸合成に基づく。多くの
上記ポリメラーゼは延長されて上記核酸合成を開始する
ことができるプライマーの存在を必要とする。
ド単量体の共有付加により延長される１本鎖オリゴヌク
レオチドまたは１本鎖ポリヌクレオチドを表す。核酸増
幅は核酸ポリメラーゼによる核酸合成に基づく。多くの
上記ポリメラーゼは延長されて上記核酸合成を開始する
ことができるプライマーの存在を必要とする。
［好ましい態様の詳細な説明コ
本発明の方法は、上記増幅産生物の検出分析を妨げない
が、その後の増幅反応生鋳型として役立つ能力を破壊す
るある種の処置で上記増幅産生物を特有に影響させる方
法で原核酸基質から増幅産生物を区別することを可能に
する。この感受性のため、本発明により増幅された前処
置サンプルはサンプルからのそれ以前の増幅で生じ得る
汚染産生物の除去を可能にする。
が、その後の増幅反応生鋳型として役立つ能力を破壊す
るある種の処置で上記増幅産生物を特有に影響させる方
法で原核酸基質から増幅産生物を区別することを可能に
する。この感受性のため、本発明により増幅された前処
置サンプルはサンプルからのそれ以前の増幅で生じ得る
汚染産生物の除去を可能にする。
本明細書に示されているのと類似の方法が１９８９年６
月１日出願のアメリカ特許出願番号第０７／３６０．１
２０番のハートレイ・ジエイエルにより使われたが（こ
れを引用して本明細書に包含させる）、ここでは原鋳型
から上記増幅配列を区別するために増幅製法それ自体の
間にエキソサンプルヌクレオチドが増幅産生物に組みい
れられる。
月１日出願のアメリカ特許出願番号第０７／３６０．１
２０番のハートレイ・ジエイエルにより使われたが（こ
れを引用して本明細書に包含させる）、ここでは原鋳型
から上記増幅配列を区別するために増幅製法それ自体の
間にエキソサンプルヌクレオチドが増幅産生物に組みい
れられる。
本発明は、ここでの上記増幅産生物を区別するのに使わ
れるエキソサンプルヌクレオチドが増幅前にオリゴマー
またはポリマーの一部として供給されるのに対し、ハー
トレイの方法は増幅の間にポリマー核酸中に組み入れる
ようになるヌクレオシド三りん酸塩として供給される点
で、ハートレイの方法と区別される。
れるエキソサンプルヌクレオチドが増幅前にオリゴマー
またはポリマーの一部として供給されるのに対し、ハー
トレイの方法は増幅の間にポリマー核酸中に組み入れる
ようになるヌクレオシド三りん酸塩として供給される点
で、ハートレイの方法と区別される。
本発明の方法は核酸増幅技術の主な問題として前述の増
幅製法の最終産生物による出発原料の汚染を防ぐ。
幅製法の最終産生物による出発原料の汚染を防ぐ。
本発明の方法は、酵素を用いて特定核酸配列を増幅する
任意のインビトロ方法特にＰＣＨに適用できる。
任意のインビトロ方法特にＰＣＨに適用できる。
好ましい態様では、エキソサンプルヌクレオチドを含む
プライマーを使用する増幅により製造された核酸産生物
はエキソサンプルヌクレオチドを含む増幅により製造さ
れない出発鋳型と化学的に異なる。この化学的相異はエ
キソサンプルヌクレオチドを含むプライマーを使う増幅
により製造された核酸産生物をさらに指数増幅ができな
いようにさせることを可能にする。エキソサンプルヌク
レオチドのプライマーへのとり込みは、上記増幅の間に
製造されたＤＮＡまたはＲＮＡが増幅前にサンプル中に
存在する原核酸と区別されることを可能にする。所望な
らば、増幅反応それ自体がさらに例えばハートレイ（前
掲）に教えられたような複製核酸への組み入れ用のエキ
ソサンプルヌクレオチドを提供することができる。
プライマーを使用する増幅により製造された核酸産生物
はエキソサンプルヌクレオチドを含む増幅により製造さ
れない出発鋳型と化学的に異なる。この化学的相異はエ
キソサンプルヌクレオチドを含むプライマーを使う増幅
により製造された核酸産生物をさらに指数増幅ができな
いようにさせることを可能にする。エキソサンプルヌク
レオチドのプライマーへのとり込みは、上記増幅の間に
製造されたＤＮＡまたはＲＮＡが増幅前にサンプル中に
存在する原核酸と区別されることを可能にする。所望な
らば、増幅反応それ自体がさらに例えばハートレイ（前
掲）に教えられたような複製核酸への組み入れ用のエキ
ソサンプルヌクレオチドを提供することができる。
典型的に、オリゴヌクレオチド中の４種のりボヌタレオ
チド（ＡＴＰ、ＵＴＰＳＣＴＰおよびＧＴＰ）またはデ
オキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ。
チド（ＡＴＰ、ＵＴＰＳＣＴＰおよびＧＴＰ）またはデ
オキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ。
ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）の１種またはそれ
以上を１種またはそれ以上のエキソサンプルヌクレオチ
ドで置きかえたプライマーを使用する。
以上を１種またはそれ以上のエキソサンプルヌクレオチ
ドで置きかえたプライマーを使用する。
エキソサンプルヌクレオチド高割合のプライマーを使用
する態様は、少量のエキソサンプルヌクレオチド含有オ
リゴヌクレオチドを用いるものより好ましい。特に、プ
ライマーの３°ＯＨ末端に位置するエキソサンプルヌク
レオチドの高分画のプライマーが好ましい。別の好まし
い態様は、エキソサンプルヌクレオチドが３′ヌクレオ
チドであるものである。
する態様は、少量のエキソサンプルヌクレオチド含有オ
リゴヌクレオチドを用いるものより好ましい。特に、プ
ライマーの３°ＯＨ末端に位置するエキソサンプルヌク
レオチドの高分画のプライマーが好ましい。別の好まし
い態様は、エキソサンプルヌクレオチドが３′ヌクレオ
チドであるものである。
ひとつの態様としては、増幅核酸を非増幅性にさせるエ
キソサンプルヌクレオチドの処置は増幅反応の開始前に
実施する。
キソサンプルヌクレオチドの処置は増幅反応の開始前に
実施する。
別の態様としては、増幅核酸を非増幅性にさせるエキソ
サンプルヌクレオチドの処置は第１増幅反応を終結させ
、およびさらに分析のために増幅産生物のサンプルを除
去した後であって、サンプル中の原出発核酸を新規、第
２増幅反応に付す前に実施する。例えば増幅後および分
析のための増幅サンプルの除去後、残留することのでき
る増幅した産生物はエキソサンプルヌクレオチドを含む
増幅核酸を実質的に非増幅性にさせる処置に付す。
サンプルヌクレオチドの処置は第１増幅反応を終結させ
、およびさらに分析のために増幅産生物のサンプルを除
去した後であって、サンプル中の原出発核酸を新規、第
２増幅反応に付す前に実施する。例えば増幅後および分
析のための増幅サンプルの除去後、残留することのでき
る増幅した産生物はエキソサンプルヌクレオチドを含む
増幅核酸を実質的に非増幅性にさせる処置に付す。
エキソサンプルヌクレオチドを含む増幅核酸を非増幅性
にさせる上記処置は物理的、化学的、酵素的または生物
学的処置であることができる。上記処置は分離段階とし
て行なうことができ、または好ましくは増幅する核酸配
列を含む第２サンプルの存在下行なうことができる。従
って、第２サンプルを汚染するエキソサンプルヌクレオ
チドの存在下第１サンプルを増幅することにより製造さ
れた増幅核酸配列は、たとえ同じオリゴヌクレオチドが
プライマーとして使われるとしても、核酸配列の第２オ
リゴヌクレオチド依存性増幅の間実質的にこれ以上増幅
しない。
にさせる上記処置は物理的、化学的、酵素的または生物
学的処置であることができる。上記処置は分離段階とし
て行なうことができ、または好ましくは増幅する核酸配
列を含む第２サンプルの存在下行なうことができる。従
って、第２サンプルを汚染するエキソサンプルヌクレオ
チドの存在下第１サンプルを増幅することにより製造さ
れた増幅核酸配列は、たとえ同じオリゴヌクレオチドが
プライマーとして使われるとしても、核酸配列の第２オ
リゴヌクレオチド依存性増幅の間実質的にこれ以上増幅
しない。
好ましい態様としては、デオキシリボヌクレオチドデオ
キシウリジンはＰＣＲにより例示したオリゴヌクレオチ
ド依存性ＤＮＡ増幅法で使用されるプライマーに好便に
組み入れることができるエキソサンプルヌクレオチドと
して使用され、それによりデオキシウリジン含有ＤＮＡ
増幅産生物を結果として生ずる。上記反応のＤＮＡ産生
物は、一般に非エキソサンプルヌクレオチド含有プライ
マー中に存在するチミジン類と同数のウラシル塩基を含
む。
キシウリジンはＰＣＲにより例示したオリゴヌクレオチ
ド依存性ＤＮＡ増幅法で使用されるプライマーに好便に
組み入れることができるエキソサンプルヌクレオチドと
して使用され、それによりデオキシウリジン含有ＤＮＡ
増幅産生物を結果として生ずる。上記反応のＤＮＡ産生
物は、一般に非エキソサンプルヌクレオチド含有プライ
マー中に存在するチミジン類と同数のウラシル塩基を含
む。
エキソヌクレオチドデオキシウリジンを含まない核酸お
よび増幅反応のデオキシウリジン含有産生物との識別は
、酵素ＵＤＧにより得ることが可能である。ＵＤＧによ
るウラシル塩基含有ＤＮＡの処置はＤＮＡ糖−りん酸塩
骨格のデオキシリボースおよびウラシル塩基との間のグ
リコシド結合の開裂を生ずる。ウラシルの損失は相補Ｄ
ＮＡ鎖の合成に対する鋳型としてのＤＮＡ鎖の使用から
ＤＮＡポリメラーゼを遮断するＤＮＡ中の非ピリミジン
部位を作る（シャツパー・アール等、プロシーデインゲ
ス・オブ・ザ・ナシちナル・アカデミ−・オプ・サイエ
ンシーズ・イン・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）、第８０巻、第４
８７頁（１９８３年））。
よび増幅反応のデオキシウリジン含有産生物との識別は
、酵素ＵＤＧにより得ることが可能である。ＵＤＧによ
るウラシル塩基含有ＤＮＡの処置はＤＮＡ糖−りん酸塩
骨格のデオキシリボースおよびウラシル塩基との間のグ
リコシド結合の開裂を生ずる。ウラシルの損失は相補Ｄ
ＮＡ鎖の合成に対する鋳型としてのＤＮＡ鎖の使用から
ＤＮＡポリメラーゼを遮断するＤＮＡ中の非ピリミジン
部位を作る（シャツパー・アール等、プロシーデインゲ
ス・オブ・ザ・ナシちナル・アカデミ−・オプ・サイエ
ンシーズ・イン・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）、第８０巻、第４
８７頁（１９８３年））。
エキソサンプルヌクレオチドを含むプライマーの提供に
より、上記エキソサンプルヌクレオチドは、増幅するＤ
ＮＡ鋳型のそれぞれの鎖の５′末端に位置する。デオキ
シウリジン含有プライマーが使用され、サンプルをＵＤ
Ｇで処置する場合、それぞれのＤＮＡ標的鋳型分子の５
°−末端中に非ピリミジン部位の実質的な数がみられる
。上記非ピリミジン部位は新しく鎖を作る３°−末端で
配列の合成を妨げる。これらの３°−末端配列は原エキ
ソサンプル含有プライマー結合の標的である。すなわち
、これらのプライマーはエキソサンプルヌクレオチド含
有プライマーにより開始された分子から誘導された核酸
を結合することができる標的配列を有する。
より、上記エキソサンプルヌクレオチドは、増幅するＤ
ＮＡ鋳型のそれぞれの鎖の５′末端に位置する。デオキ
シウリジン含有プライマーが使用され、サンプルをＵＤ
Ｇで処置する場合、それぞれのＤＮＡ標的鋳型分子の５
°−末端中に非ピリミジン部位の実質的な数がみられる
。上記非ピリミジン部位は新しく鎖を作る３°−末端で
配列の合成を妨げる。これらの３°−末端配列は原エキ
ソサンプル含有プライマー結合の標的である。すなわち
、これらのプライマーはエキソサンプルヌクレオチド含
有プライマーにより開始された分子から誘導された核酸
を結合することができる標的配列を有する。
ここで例示したデオキシウリジンと異なる他のエキソサ
ンプルヌクレオチドを考えることができる。多くのＤＮ
Ａグリコシラーゼは当業者には既知である。オリゴヌク
レオチドに化学的または酵素的に組み入れられることが
できるエキソサンプルヌクレオチドおよびそ２れに作用
するＤＮＡグリコシラーゼが本発明に使用される。他の
エキソサンプルヌクレオチドも当業者に周知である。例
えばＤＮＡ増幅に使用されるＲＮＡプライマーは塩基ま
たは適当なりボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）により容易
に破壊することができる。ＲＮａｓｅＨはＲＮＡ：ＤＮ
ＡハイブリッドのＲＮＡを分解させ、変性段階後１本鎖
ＲＮＡを消化するのに役立つ多数の１重鎖ＲＮａｓｅが
知られている。（ＤＮＡ鎖が逆でない限り、汚染ＤＮＡ
のＲＮａｓｅＨ消化後に１本鎖デオキシリボヌクレアー
ゼ（ＤＮａｓｅ）により除去されるが、その変性前では
汚染ＤＮＡは直鎖形式で増幅される。しかしながら、は
とんどのオリゴヌクレオチド依存性ＤＮＡ増幅方式は指
数的にＤＮＡを増幅するので、このことは汚染レベルが
異常に高くない限り問題にはならない。本発明のＲＮＡ
開始態様を発展させる当業者は不当な実験なしで、それ
らの検出法において最低の汚染許容レベルを決定するこ
とができる。、）別の態様では、ブロモデオキシウリジ
ンを含むデオキシオリゴヌクレオチド（Ｂｄｕｒｔ）が
エキソサンプルヌクレオチドとして使用される。ＢｄＵ
Ｒを含むＤＮＡは適当な条件下、光の影響により分解す
ることができる。
ンプルヌクレオチドを考えることができる。多くのＤＮ
Ａグリコシラーゼは当業者には既知である。オリゴヌク
レオチドに化学的または酵素的に組み入れられることが
できるエキソサンプルヌクレオチドおよびそ２れに作用
するＤＮＡグリコシラーゼが本発明に使用される。他の
エキソサンプルヌクレオチドも当業者に周知である。例
えばＤＮＡ増幅に使用されるＲＮＡプライマーは塩基ま
たは適当なりボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）により容易
に破壊することができる。ＲＮａｓｅＨはＲＮＡ：ＤＮ
ＡハイブリッドのＲＮＡを分解させ、変性段階後１本鎖
ＲＮＡを消化するのに役立つ多数の１重鎖ＲＮａｓｅが
知られている。（ＤＮＡ鎖が逆でない限り、汚染ＤＮＡ
のＲＮａｓｅＨ消化後に１本鎖デオキシリボヌクレアー
ゼ（ＤＮａｓｅ）により除去されるが、その変性前では
汚染ＤＮＡは直鎖形式で増幅される。しかしながら、は
とんどのオリゴヌクレオチド依存性ＤＮＡ増幅方式は指
数的にＤＮＡを増幅するので、このことは汚染レベルが
異常に高くない限り問題にはならない。本発明のＲＮＡ
開始態様を発展させる当業者は不当な実験なしで、それ
らの検出法において最低の汚染許容レベルを決定するこ
とができる。、）別の態様では、ブロモデオキシウリジ
ンを含むデオキシオリゴヌクレオチド（Ｂｄｕｒｔ）が
エキソサンプルヌクレオチドとして使用される。ＢｄＵ
Ｒを含むＤＮＡは適当な条件下、光の影響により分解す
ることができる。
ここで例示したように、好ましい態様において、基礎的
な増幅プロトコールのＰＣＲは３つの方法で修飾されて
いる。（１）増幅は最初にデオキシチミジンを置換した
デオキシウリジンを含むオリゴヌクレオチドプライマー
を使用して実施し、および分析のため増幅産生物のサン
プルを除去し、（２）その後ＵＤＧがＰＣＲ反応混合物
に加えられ、および（３）インキュベーション時間が、
以前のＰＣＨの汚染産生物中のウラシル含有配列にＵＤ
Ｇが作用するために加えられる。
な増幅プロトコールのＰＣＲは３つの方法で修飾されて
いる。（１）増幅は最初にデオキシチミジンを置換した
デオキシウリジンを含むオリゴヌクレオチドプライマー
を使用して実施し、および分析のため増幅産生物のサン
プルを除去し、（２）その後ＵＤＧがＰＣＲ反応混合物
に加えられ、および（３）インキュベーション時間が、
以前のＰＣＨの汚染産生物中のウラシル含有配列にＵＤ
Ｇが作用するために加えられる。
増幅製法を続ける前にＵＤＧを不活性化しなければなら
ない。ＵＤＧは第１ＰＣＲサイクル中で高温または一般
的に好ましいＰＣＲプロトコールのＴａｇＤＮＡポリメ
ラーゼを使用した高温のどちらかによって永久的に不活
性化することができる。
ない。ＵＤＧは第１ＰＣＲサイクル中で高温または一般
的に好ましいＰＣＲプロトコールのＴａｇＤＮＡポリメ
ラーゼを使用した高温のどちらかによって永久的に不活
性化することができる。
この不活性化はＵＤＧが新規合成ＰＣＲ産生を破壊する
ことを防ぐ。ＵＤＧ活性を本質的に除去しない核酸増幅
プロトコールは普通過剰ＵＤＧ不活性化段階が必要であ
る。
ことを防ぐ。ＵＤＧ活性を本質的に除去しない核酸増幅
プロトコールは普通過剰ＵＤＧ不活性化段階が必要であ
る。
エキソサンプルヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド
を多量に有する態様が好ましい。しかしながら、２つの
オリゴヌクレオチドプライマーに依存する標準ＰＣＲ態
様でも、本発明は少なくとも１種のプライマーがエキソ
サンプルヌクレオチドを含む限りＰＣＲ汚染を非増幅性
にさせることができる。
を多量に有する態様が好ましい。しかしながら、２つの
オリゴヌクレオチドプライマーに依存する標準ＰＣＲ態
様でも、本発明は少なくとも１種のプライマーがエキソ
サンプルヌクレオチドを含む限りＰＣＲ汚染を非増幅性
にさせることができる。
１本鎖エキソサンプルヌクレオチド含有プライマーは全
てが与えられた条件でＰＣＲ産生物の増幅を充分に低い
レベルに減少させることができるのではない。当業者は
不必要な実験なしに、決まった最適化およびＰＣＲ検定
試験で、どのプライマーが受は入れられるかを経験的に
発見することができる。
てが与えられた条件でＰＣＲ産生物の増幅を充分に低い
レベルに減少させることができるのではない。当業者は
不必要な実験なしに、決まった最適化およびＰＣＲ検定
試験で、どのプライマーが受は入れられるかを経験的に
発見することができる。
オリゴヌクレオチド適切化を試験するための日常的検定
最適化は、（１）エキソサンプルヌクレオチド含有オリ
ゴヌクレオチドを作り、（２）プライマーを使って標的
配列の第１核酸増幅を実施し、（３）生ずる第１産生物
の様々な量を標的配列を含まない新規、第２増幅で接種
し、（４）エキソサンプルヌクレオチド含有核酸を非増
幅性にさせるため第２増幅を処理し、（５）第２増幅を
実施し、および（６）生ずる第２産生物を第１ハイブリ
ツド化からの汚染配列の存在について検定することによ
り行うことができる。これらの段階全てが実験的制御お
よび方法の標準的変更の部分として日常的に行なわれる
。本発明の実施をする者に必要である唯一の付加的作業
は、必要であり得る任意のオリゴヌクレオチドの日常的
合成を含む。一般的に、オリゴヌクレオチドが適当では
ないと気付いたら、置換物はたやすく発見され、同様に
試験されることができる。
最適化は、（１）エキソサンプルヌクレオチド含有オリ
ゴヌクレオチドを作り、（２）プライマーを使って標的
配列の第１核酸増幅を実施し、（３）生ずる第１産生物
の様々な量を標的配列を含まない新規、第２増幅で接種
し、（４）エキソサンプルヌクレオチド含有核酸を非増
幅性にさせるため第２増幅を処理し、（５）第２増幅を
実施し、および（６）生ずる第２産生物を第１ハイブリ
ツド化からの汚染配列の存在について検定することによ
り行うことができる。これらの段階全てが実験的制御お
よび方法の標準的変更の部分として日常的に行なわれる
。本発明の実施をする者に必要である唯一の付加的作業
は、必要であり得る任意のオリゴヌクレオチドの日常的
合成を含む。一般的に、オリゴヌクレオチドが適当では
ないと気付いたら、置換物はたやすく発見され、同様に
試験されることができる。
当業者に理解されるように、本発明の方法は指数的増幅
を防御するが直線的増幅を防御しない。
を防御するが直線的増幅を防御しない。
直線的増幅は増幅方法で普通実質的問題を呈示しない。
例えば、各サイクル上で２倍づつ増幅される、ＰＣＨの
２０サイクルによるサンプルを汚染する増幅産生物１分
子は直線的増幅ならばたった約２０分子しか生じないが
、もし最大理論効率で指数的に増幅するならば約百万分
子を生ずる。すなわち、直線増幅は一般的に取るに足ら
ないものである。
２０サイクルによるサンプルを汚染する増幅産生物１分
子は直線的増幅ならばたった約２０分子しか生じないが
、もし最大理論効率で指数的に増幅するならば約百万分
子を生ずる。すなわち、直線増幅は一般的に取るに足ら
ないものである。
本発明は核酸ポリメラーゼを使用しない増幅と共に使用
するように適合させることができる。例えば、以前に作
った産生物によるサンプルの汚染はリガーセによるオリ
ゴヌクレオチドポリマー化の増幅方式により制御するこ
とができる（例えば、つおよびウォーレンス、前掲）。
するように適合させることができる。例えば、以前に作
った産生物によるサンプルの汚染はリガーセによるオリ
ゴヌクレオチドポリマー化の増幅方式により制御するこ
とができる（例えば、つおよびウォーレンス、前掲）。
以上一般的に本発明を説明したが、以下では実施例を引
用して理解を容易ならしめる。これらは説明の目的のた
めにのみここに含まれ、特にことわらない限り限定され
るものではない。
用して理解を容易ならしめる。これらは説明の目的のた
めにのみここに含まれ、特にことわらない限り限定され
るものではない。
［実施例］
実施例！
一般的試験条件
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はヒト乳頭腫ウィルス
型１６（ＨＰＶｌ ６）ＤＮＡの１領域を増幅するため
に実施した（デュルスト・エム等、プロシーデインダス
・才プ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ザ・サイ
エンシーズ・イン・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）、第８０巻、第３８１２頁（
１９８３年））。使用したオリゴヌクレオチドプライマ
ーの配列は、５°ＧＧＵＣＧＡＵＧＵＡＵＧＵＣＵＵＧ
ＵＵＧ３°および５’ＧＵＣＵＡＣＧＵＧＵＧＵＧＣＵ
ＵＵＧＵＡＣ３’（それぞれｄＵプライマーｄＴ、およ
びｄＴｔ）または５′ＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴ
ＴＧＴＴＧ３′および５°ＧＴＣＴＡＣＧＴＧＴＧＴＧ
ＣＴＴＴＧＴＡＣ３°（それぞれ制御ｄＴプライマーｄ
Ｔ＋およびｄＴ 、）のどちらかである。ｄＴ、および
ｄＴ、の配列はＴに対するＵの変換を除けば同一であり
、ｄ Ｔ ｔおよびｄＵ、も同様に同一である。
型１６（ＨＰＶｌ ６）ＤＮＡの１領域を増幅するため
に実施した（デュルスト・エム等、プロシーデインダス
・才プ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ザ・サイ
エンシーズ・イン・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ）、第８０巻、第３８１２頁（
１９８３年））。使用したオリゴヌクレオチドプライマ
ーの配列は、５°ＧＧＵＣＧＡＵＧＵＡＵＧＵＣＵＵＧ
ＵＵＧ３°および５’ＧＵＣＵＡＣＧＵＧＵＧＵＧＣＵ
ＵＵＧＵＡＣ３’（それぞれｄＵプライマーｄＴ、およ
びｄＴｔ）または５′ＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴ
ＴＧＴＴＧ３′および５°ＧＴＣＴＡＣＧＴＧＴＧＴＧ
ＣＴＴＴＧＴＡＣ３°（それぞれ制御ｄＴプライマーｄ
Ｔ＋およびｄＴ 、）のどちらかである。ｄＴ、および
ｄＴ、の配列はＴに対するＵの変換を除けば同一であり
、ｄ Ｔ ｔおよびｄＵ、も同様に同一である。
ＨＰＶｌ ６ＤＮＡは制限酵素ＢａｍＨＩで完全な長さ
のプラスミドクローンｐＴ７ＨＰＶ１６から切り出した
（本発明の目的としてシードフ・ケイ８１頁（１９８５
年）記載のｐＵＣ８プラスミドと均等）。直鎖ＤＮＡ（
１０ピコグラム）を、５０マイクロリツトルの２５ｍＭ
）リス−ＨＣＩＩ）Ｈ８。
のプラスミドクローンｐＴ７ＨＰＶ１６から切り出した
（本発明の目的としてシードフ・ケイ８１頁（１９８５
年）記載のｐＵＣ８プラスミドと均等）。直鎖ＤＮＡ（
１０ピコグラム）を、５０マイクロリツトルの２５ｍＭ
）リス−ＨＣＩＩ）Ｈ８。
３、ＭｇＣ１＊５ｍＭ、ＮａＣｌ３０ｍＭ、０．０１％
ゼラチン、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ％ｄＣＴＰをそれぞれ０
．２ｍＭ、ｄＵＴＰまたはｄＴＴＰのいずれかを０．２
ｍＭ、それぞれのプライマーを１マイクロモルおよびテ
ルムス・アクティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃ
ｕｓ）（シーラス／パーキン−エルマー社）からの熱安
定ＤＮＡポリメラーゼ１２．５ユニツトを含むＰＣＲ反
応物に加えた。プライマーおよびトリホスフェートを次
のとおりに組みにした。
ゼラチン、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ％ｄＣＴＰをそれぞれ０
．２ｍＭ、ｄＵＴＰまたはｄＴＴＰのいずれかを０．２
ｍＭ、それぞれのプライマーを１マイクロモルおよびテ
ルムス・アクティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃ
ｕｓ）（シーラス／パーキン−エルマー社）からの熱安
定ＤＮＡポリメラーゼ１２．５ユニツトを含むＰＣＲ反
応物に加えた。プライマーおよびトリホスフェートを次
のとおりに組みにした。
ｄＴＴＰとｄＵブライｖ−（ｐＵｙ：Ｔ反応（ｐｒｉｍ
ｅｄ ｗｉｔｈ Ｕ 、 ｅｘｔｅｎｄｅｄ
ｗｉｔｈ Ｔ ））およびｄＵＴＰと制御ｄＴプライ
マー（ｐＴｘＵ反応）。反応は次の温度表を使ってサー
マルシルサー（シーラス／パーキン−エルマー社）で増
幅した。９４℃５分間、その後９４°ＣＩ分を（変性）
、５５℃で２分間（アニーリング）および７２℃３分間
（プライマー延長）０分間、最後の延長をした。ＰＣＲ
反応産生物（レイン当り各反応物５マイクロリツトル）
のアガロース／臭化エチジウムゲル電気泳動（マニアナ
イス・ティー等、モレキュラー・クローニング（ＭＯｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２年））で２８
４塩基対ＨＰＶ １６ＤＮＡフラグメントの増幅を確認
した。全反応物は実質的増幅を示した。Ｉ−（ＰＶＩ６
ＤＮＡを加えない陰性対照反応ではＤＮＡ産生物は製造
されなかった。ＰＣＲ増幅生産物の濃度はアガロースゲ
ルから推定した。
ｅｄ ｗｉｔｈ Ｕ 、 ｅｘｔｅｎｄｅｄ
ｗｉｔｈ Ｔ ））およびｄＵＴＰと制御ｄＴプライ
マー（ｐＴｘＵ反応）。反応は次の温度表を使ってサー
マルシルサー（シーラス／パーキン−エルマー社）で増
幅した。９４℃５分間、その後９４°ＣＩ分を（変性）
、５５℃で２分間（アニーリング）および７２℃３分間
（プライマー延長）０分間、最後の延長をした。ＰＣＲ
反応産生物（レイン当り各反応物５マイクロリツトル）
のアガロース／臭化エチジウムゲル電気泳動（マニアナ
イス・ティー等、モレキュラー・クローニング（ＭＯｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２年））で２８
４塩基対ＨＰＶ １６ＤＮＡフラグメントの増幅を確認
した。全反応物は実質的増幅を示した。Ｉ−（ＰＶＩ６
ＤＮＡを加えない陰性対照反応ではＤＮＡ産生物は製造
されなかった。ＰＣＲ増幅生産物の濃度はアガロースゲ
ルから推定した。
実施例２
２種のデオキシウリジン含有プライマーを使用した増幅
新規ｐＵｘＴＰＣＲ反応はｄＴＴＰを含むがｄＵプライ
マーを欠失したもので製造された。これらは以前の反応
からのｐＵｘＴ増幅産生物ＩＯフェントゲラムで汚染し
、ＵＤＧ（ジエイ・パン・ド・サンプ、ユニバージティ
ー・オブ・カルガリー（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｃａｌｇａｒｙ）。アメリカ合衆国１９３０１
ペンシルバニア、バオリ、イースト・セントラル・アベ
ニュー １０番のダンカン・ラボラトリーズからも入手
される）の存在または不存在下で３７°ＣＩ５分間イン
キュベートした。これらの反応物はその後ＵＤＧを不活
性化させるために９０℃でインキュベートし、１５℃に
冷却し、ｄＵプライマーを加えた。
マーを欠失したもので製造された。これらは以前の反応
からのｐＵｘＴ増幅産生物ＩＯフェントゲラムで汚染し
、ＵＤＧ（ジエイ・パン・ド・サンプ、ユニバージティ
ー・オブ・カルガリー（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｃａｌｇａｒｙ）。アメリカ合衆国１９３０１
ペンシルバニア、バオリ、イースト・セントラル・アベ
ニュー １０番のダンカン・ラボラトリーズからも入手
される）の存在または不存在下で３７°ＣＩ５分間イン
キュベートした。これらの反応物はその後ＵＤＧを不活
性化させるために９０℃でインキュベートし、１５℃に
冷却し、ｄＵプライマーを加えた。
新規ｐＴｘＵＰｃＲ反応はｄＴプライマーおよびｄＵ’
Ｉ’Ｐで製造され、ｐＴｘＵ増幅産生物ＩＯフェントゲ
ラムで汚染した。これらの反応物はそれぞれＵＤＧ活性
およびＰＣＲ増幅の制御としてＵＤＧ存在または不存在
下で３７℃１５分間インキュベートした。
Ｉ’Ｐで製造され、ｐＴｘＵ増幅産生物ＩＯフェントゲ
ラムで汚染した。これらの反応物はそれぞれＵＤＧ活性
およびＰＣＲ増幅の制御としてＵＤＧ存在または不存在
下で３７℃１５分間インキュベートした。
新規ＰＣＲ反応はその後上記記載の同じＰＣＲ温度サイ
クルに付した。アガロース／臭化エチジウムゲル電気泳
動は、ＵＤＧ処理なしではｐＵｘＴおよびｐＴｘＵ反応
産生物両方ともＰＣＨにより再増幅することができ、Ｈ
ＰＶ ｌ ６ＤＮＡの増幅で得られたものの外観と同様
な結果が得られた。これと異なって、ＵＤＧ処理の場合
はｄＵプライマーを含むｐＴｘＵ反応産生物（陽性対照
）およびｐＵｘＴ反応産生物の両方の再増幅を終結させ
た。別の試験では、デオキシウリジンの不存在下でプラ
イマーまたは延長産生物のどちらかでＵＤＧは天然型Ｈ
ＰＶ１６ＤＮＡのＰＣＲ増幅に影響されなかった。
クルに付した。アガロース／臭化エチジウムゲル電気泳
動は、ＵＤＧ処理なしではｐＵｘＴおよびｐＴｘＵ反応
産生物両方ともＰＣＨにより再増幅することができ、Ｈ
ＰＶ ｌ ６ＤＮＡの増幅で得られたものの外観と同様
な結果が得られた。これと異なって、ＵＤＧ処理の場合
はｄＵプライマーを含むｐＴｘＵ反応産生物（陽性対照
）およびｐＵｘＴ反応産生物の両方の再増幅を終結させ
た。別の試験では、デオキシウリジンの不存在下でプラ
イマーまたは延長産生物のどちらかでＵＤＧは天然型Ｈ
ＰＶ１６ＤＮＡのＰＣＲ増幅に影響されなかった。
ＵＤＧ処理なしでは、デオキシウリジン含有ＰＣＲ産生
物は再増幅することができ、アガロースゲル電気泳動法
から明らかなように、デオキシウリジンを含まず、標準
ＨＰＶｌ ６ＤＮＡを増幅により得られた産生物から大
きさ上では識別できないＤＮＡ産生物が得られた。ＤＮ
Ａをデオキシウリジン含有プライマーから作り出し、Ｐ
ＣＨの前にＵＤＧとインキュベートした反応物ではアガ
ロースゲル上で産生物をみることがなかった。別の試験
ではＵＤＧが天然型ＤＮＡの増幅に影響を与えないこと
がわかった。
物は再増幅することができ、アガロースゲル電気泳動法
から明らかなように、デオキシウリジンを含まず、標準
ＨＰＶｌ ６ＤＮＡを増幅により得られた産生物から大
きさ上では識別できないＤＮＡ産生物が得られた。ＤＮ
Ａをデオキシウリジン含有プライマーから作り出し、Ｐ
ＣＨの前にＵＤＧとインキュベートした反応物ではアガ
ロースゲル上で産生物をみることがなかった。別の試験
ではＵＤＧが天然型ＤＮＡの増幅に影響を与えないこと
がわかった。
実施例３
シングルデオキシウリジン含有プライマーを使用した増
幅 さらに試験は２ＭのＰＣＲの■つだけがプライマーエキ
ソサンプルヌクレオチドを含む必要があることを示した
。ＰＣＲ増幅は次のプライマ一対を使用して上記記載の
ように本質的に行った＝（１）ｄＴ、とｄＵ、、（２）
ｄＵｔとｄＴｌ、（３）ｄ’ｒｔとｄＵ、および（４）
ｄｕｅとｄＵ、。全ての組合わせはＰＣＨの第２ラウン
ドの前にＵＤＧのあるなしで処置した。増幅（４）はＵ
ＤＧの活性および汚染を除去する能力を試験したのに対
して、増幅（１）はＰＣＲ増幅の成功を試験した。増幅
（３）はＰＣＩ（の第２ラウンドでＵＤＧ処置処置質実
質的増幅しないことが観察され、それにより必要である
ＰＣＲプライマーの１組のひとつだけがサンプル汚染の
効果を減少または除去するためにエキソサンプルヌクレ
オチドを含む必要があることが示された。
幅 さらに試験は２ＭのＰＣＲの■つだけがプライマーエキ
ソサンプルヌクレオチドを含む必要があることを示した
。ＰＣＲ増幅は次のプライマ一対を使用して上記記載の
ように本質的に行った＝（１）ｄＴ、とｄＵ、、（２）
ｄＵｔとｄＴｌ、（３）ｄ’ｒｔとｄＵ、および（４）
ｄｕｅとｄＵ、。全ての組合わせはＰＣＨの第２ラウン
ドの前にＵＤＧのあるなしで処置した。増幅（４）はＵ
ＤＧの活性および汚染を除去する能力を試験したのに対
して、増幅（１）はＰＣＲ増幅の成功を試験した。増幅
（３）はＰＣＩ（の第２ラウンドでＵＤＧ処置処置質実
質的増幅しないことが観察され、それにより必要である
ＰＣＲプライマーの１組のひとつだけがサンプル汚染の
効果を減少または除去するためにエキソサンプルヌクレ
オチドを含む必要があることが示された。
増幅（＋）よりも実質的に低レベルであるが、増幅（２
）は再増幅することがみられた。
）は再増幅することがみられた。
実施例４
要約
要約すると、プライマーまたは複数のプライマ−中でデ
オキシウリジンを含むＰＣＲ増幅産生物はＵＤＧがない
ときうまく増幅した。増幅はあらかじめＵＤＧとインキ
ュベートすることにより妨害することができる。言い替
えれば、ＵＤＧは、デオキシチミジン含有プライマーで
作ったＤＮＡの増幅に実質的に作用しないがデオキシウ
リジン含有プライマーで作ったＰＣＲ産生物の増幅を実
質的に終結させた。
オキシウリジンを含むＰＣＲ増幅産生物はＵＤＧがない
ときうまく増幅した。増幅はあらかじめＵＤＧとインキ
ュベートすることにより妨害することができる。言い替
えれば、ＵＤＧは、デオキシチミジン含有プライマーで
作ったＤＮＡの増幅に実質的に作用しないがデオキシウ
リジン含有プライマーで作ったＰＣＲ産生物の増幅を実
質的に終結させた。
ここでの全参考文献は引用して本明細書に包含させる。
上記は特に好ましい実施例を述べたが、それにより本発
明が制限されるものではないことはいうまでもない。様
々な修飾を、ここに記載した実施態様についてなし得る
が、上記修飾は本発明の範囲内であることが当業者に理
解される。
明が制限されるものではないことはいうまでもない。様
々な修飾を、ここに記載した実施態様についてなし得る
が、上記修飾は本発明の範囲内であることが当業者に理
解される。
Claims (19)
- （１） ａ）第１サンプルの核酸を増幅し、その際上記増幅は１
種またはそれ以上の特定オリゴヌ クレオチドに依存するものであり、上記特 定オリゴヌクレオチドの少なくとも１種が エキソサンプルヌクレオチドを含み、 ｂ）上記エキソサンプルヌクレオチドを含む核酸を上記
特定オリゴヌクレオチドに依存す る増幅中で実質的に非増幅性にするが、上 記エキソサンプルヌクレオチドを含まない 核酸増幅を実質的に妨害しない処理を第２ サンプルの核酸に施す 段階を含み、それにより第２サンプルを汚染している第
１サンプル由来増幅核酸配列が第２サンプルの核酸配列
の特定オリゴヌクレオチド依存増幅の間に実質的にこれ
以上増幅しないようにすることからなる、サンプル中に
１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド依存性核酸を
増幅する方法。 - （２）エキソサンプルヌクレオチドがデオキシウリジン
である請求項１記載の方法。 - （３）処理が物理的、化学的、酵素的または生物学的処
理からなる群から選ばれる請求項１記載の方法。 - （４）処理が酵素的処理である請求項３記載の方法。
- （５）酵素的処理がウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理
である請求項４記載の方法。 - （６）さらに ｃ）第２サンプルの核酸配列を増幅する 段階を含む請求項１記載の方法。
- （７）さらに ｄ）段階ｂ）の処理を終結させる 段階を含む請求項１記載の方法。
- （８）終結を熱により達成する請求項７記載の方法。
- （９）特定オリゴヌクレオチドの少なくとも２種がエキ
ソサンプルヌクレオチドを含む請求項１項記載の方法。 - （１０）増幅が、１種の核酸または核酸の混合物（各核
酸は同じまたは異なった長さの２種の別の相補鎖を含む
）中に含まれる少なくとも１種の特定の核酸配列を増幅
する方法であり、さらに ｅ）鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列につ
いて、それぞれの核酸鎖に相補的 なそれぞれのプライマーの延長産生物が合 成されるような条件下で、増幅されている それぞれの異なった特定配列に対する２種 のオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、上記プライ
マーは、それぞれの特定配列の 異なった鎖に充分相補的で相手とハイブリ ダイズし、その結果１種のプライマーから 合成された延長産生物がその相補体から分 離するとき、他方のプライマーの延長産生 物の合成の鋳型として働くように選ばれた ものであり、 ｆ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｇ）プライマー延長産生物が段階ｆ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合 成される条件下において段階ｅ）のプライマーで段階ｆ
）から発生した一本鎖分子を処理する ことからなる請求項１記載の方法。 - （１１） （Ａ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列
について、それぞれの核酸鎖に相補 的なそれぞれのプライマーの延長産生物が 合成されるような条件下で、増幅されてい るそれぞれの異なった特定配列に対する２ 種のオリゴヌクレオチドプライマーで処理 し、少なくともプライマーの１種はエキソ サンプルヌクレオチドを含み、上記プライ マーは、それぞれの特定配列の異なった鎖 に充分相補的で相手とハイブリダイズし、 その結果１種のプライマーから合成された 延長産生物がその相補体から分離するとき、他方のプラ
イマーの延長産生物の合成の鋳 型として働くように選ばれたものであり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｃ）プライマー延長産生物が段階ｂ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合 成される条件下において段階ａ）のプライマーで段階ｂ
）から発生した上記一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核 酸配列を増幅し、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列が第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）エキソサンプルヌクレオチドを含む核酸を上記特定
オリゴヌクレオチドに依存する増 幅中で実質的に非増幅性にするが、上記エ キソサンプルヌクレオチドを含まない核酸 増幅に実質的に作用しない処理を第２サン プルの核酸に施し、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする 段階からなる１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する
方法。 - （１２）エキソサンプルヌクレオチドがデオキシウリジ
ンである請求項１１記載の方法。 - （１３）段階ａ）の処置が酵素的処置である請求項１１
記載の方法。 - （１４）酵素的処理がウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処
理である請求項１３記載の方法。 - （１５）段階（Ｂ）の間に ｆ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第２サンプルに含まれる特異核 酸配列の任意のものを増幅する 段階を含む請求項１１記載の方法。 - （１６）さらに段階（Ｂ）の間に ｇ）段階ｅ）の処置を終結する 段階を含む請求項１１記載の方法。
- （１７）物理的、化学的、酵素的または生物学的処理が
熱により達成される請求項１６記載の方法。 - （１８）少なくともオリゴヌクレオチドプライマーの２
種がエキソサンプルヌクレオチドを含む請求項１１記載
の方法。 - （１９） （Ａ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列
について、それぞれの核酸鎖に相補 的なそれぞれのプライマーの延長産生物が 合成されるような条件下で、増幅されてい るそれぞれの異なった特定配列に対する２ 種のオリゴヌクレオチドプライマーで処理 し、少なくともプライマーの１種はデオキ シウリジンを含み、上記プライマーは、そ れぞれの特定配列の異なった鎖に充分相補 的で相手とハイブリダイズし、その結果１ 種のプライマーから合成された延長産生物 がその相補体から分離するとき、他方のプ ライマーの延長産生物の合成の鋳型として 働くように選ばれたものであり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｃ）プライマー延長産生物が段階ｂ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合 成される条件下において段階ａ）のプライマーで段階ｂ
）から発生した上記一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核 酸配列を増幅し、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列は第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）上記鎖をウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理し、 ｆ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼの鎖上における作用
を熱により終結させ、 ｇ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第２サンプルに含まれる特定核 酸配列を増幅し、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする 段階からなる１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US40184089A | 1989-09-01 | 1989-09-01 | |
| US401,840 | 1995-03-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0391484A true JPH0391484A (ja) | 1991-04-17 |
| JPH0789932B2 JPH0789932B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=23589437
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2232284A Expired - Lifetime JPH0789932B2 (ja) | 1989-09-01 | 1990-08-31 | オリゴヌクレオチド依存性核酸増幅反応の汚染を制御する方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0415755B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0789932B2 (ja) |
| AT (1) | ATE131878T1 (ja) |
| CY (1) | CY2073B1 (ja) |
| DE (1) | DE69024286T2 (ja) |
| DK (1) | DK0415755T3 (ja) |
| ES (1) | ES2080807T3 (ja) |
| GR (1) | GR3019092T3 (ja) |
| HK (1) | HK1000380A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0690755A (ja) * | 1991-07-12 | 1994-04-05 | Life Technol Inc | 核酸増幅反応の汚染を防除する方法 |
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|---|---|---|---|---|
| US5683896A (en) | 1989-06-01 | 1997-11-04 | Life Technologies, Inc. | Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions |
| US5035996A (en) | 1989-06-01 | 1991-07-30 | Life Technologies, Inc. | Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions |
| HU218095B (hu) * | 1990-05-01 | 2000-05-28 | Amgen Inc. | Eljárás átvitt szennyeződések csökkentésére, amplifikációs eljárásokban |
| US5650302A (en) * | 1990-05-01 | 1997-07-22 | Amgen Inc. | Method for reducing carryover contamination in an amplification procedure |
| FR2663949A1 (fr) * | 1990-06-29 | 1992-01-03 | Genset Sa | Perfectionnements a un procede d'amplification enzymatique in vitro. |
| DK0540693T3 (da) * | 1990-07-24 | 1999-09-13 | Hoffmann La Roche | Reduktion af ikke-specifik amplifikation under in vitro-nukleinsyreamplifikation under anvendelse af modificerede nukleinsy |
| CA2058232A1 (en) * | 1991-01-22 | 1992-07-23 | Joseph A. Walder | Process to prevent contamination by amplified nucleic acid sequence |
| EP0590327B1 (en) * | 1992-09-11 | 2003-04-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Detection of nucleic acids in blood |
| US5464744A (en) * | 1992-09-24 | 1995-11-07 | Norval B. Galloway | Methods and compositions for reducing false positive signals in an RNA amplification system |
| US5338671A (en) * | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
| CA2122203C (en) * | 1993-05-11 | 2001-12-18 | Melinda S. Fraiser | Decontamination of nucleic acid amplification reactions |
| AU7718594A (en) * | 1993-09-03 | 1995-03-22 | United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services | Method and compositions for primer specific solid-phase detection of pcr products |
| US6117634A (en) * | 1997-03-05 | 2000-09-12 | The Reagents Of The University Of Michigan | Nucleic acid sequencing and mapping |
| US6197557B1 (en) | 1997-03-05 | 2001-03-06 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for analysis of nucleic acids |
| JP2001520054A (ja) * | 1997-10-23 | 2001-10-30 | エグザクト サイエンシーズ コーポレイション | Ｐｃｒを用いる分子診断におけるコンタミネーションを検出するための方法 |
| US6818404B2 (en) | 1997-10-23 | 2004-11-16 | Exact Sciences Corporation | Methods for detecting hypermethylated nucleic acid in heterogeneous biological samples |
| US7270958B2 (en) | 1998-09-10 | 2007-09-18 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for analysis of nucleic acids |
| EP1689879A4 (en) | 2003-11-12 | 2008-08-27 | Geneohm Sciences Inc | METHODS OF HYBRIDIZING NUCLEIC ACID |
| EP1632578A1 (en) | 2004-09-03 | 2006-03-08 | Roche Diagnostics GmbH | DNA decontamination method |
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| ATE173508T1 (de) * | 1988-05-20 | 1998-12-15 | Hoffmann La Roche | Befestigung von sequenzspezifischen proben |
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| FR2649122B1 (fr) * | 1989-07-03 | 1991-10-18 | Pasteur Institut | Perfectionnements apportes aux techniques d'amplification par reaction de polymerisation en chaine (pcr) |
-
1990
- 1990-08-30 DE DE69024286T patent/DE69024286T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-30 AT AT90309492T patent/ATE131878T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-08-30 DK DK90309492.8T patent/DK0415755T3/da active
- 1990-08-30 EP EP90309492A patent/EP0415755B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-30 ES ES90309492T patent/ES2080807T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-31 JP JP2232284A patent/JPH0789932B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-02-23 GR GR960400512T patent/GR3019092T3/el unknown
-
1997
- 1997-10-21 HK HK97101961A patent/HK1000380A1/xx not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-09-11 CY CY9802073A patent/CY2073B1/xx unknown
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|---|---|---|---|---|
| JPH0690755A (ja) * | 1991-07-12 | 1994-04-05 | Life Technol Inc | 核酸増幅反応の汚染を防除する方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0415755T3 (da) | 1996-01-22 |
| DE69024286D1 (de) | 1996-02-01 |
| CY2073B1 (en) | 1998-09-11 |
| JPH0789932B2 (ja) | 1995-10-04 |
| ES2080807T3 (es) | 1996-02-16 |
| EP0415755A3 (en) | 1991-08-28 |
| GR3019092T3 (en) | 1996-05-31 |
| DE69024286T2 (de) | 1996-05-30 |
| ATE131878T1 (de) | 1996-01-15 |
| EP0415755B1 (en) | 1995-12-20 |
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