JPH0789932B2 - オリゴヌクレオチド依存性核酸増幅反応の汚染を制御する方法 - Google Patents
オリゴヌクレオチド依存性核酸増幅反応の汚染を制御する方法Info
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- JPH0789932B2 JPH0789932B2 JP2232284A JP23228490A JPH0789932B2 JP H0789932 B2 JPH0789932 B2 JP H0789932B2 JP 2232284 A JP2232284 A JP 2232284A JP 23228490 A JP23228490 A JP 23228490A JP H0789932 B2 JPH0789932 B2 JP H0789932B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、核酸配列を増幅する方法の改良に関する。特
に、本発明は、その後の増幅方法の実施に悪影響を及ぼ
す、オリゴヌクレオチド依存性核酸増幅方法の実施産物
を排除することにより核酸サンプルの交差汚染を防止す
る方法を開示する。上記改良は、増幅方法の結果が交差
汚染核酸鋳型の存在を示さないことを保証するものであ
る。
に、本発明は、その後の増幅方法の実施に悪影響を及ぼ
す、オリゴヌクレオチド依存性核酸増幅方法の実施産物
を排除することにより核酸サンプルの交差汚染を防止す
る方法を開示する。上記改良は、増幅方法の結果が交差
汚染核酸鋳型の存在を示さないことを保証するものであ
る。
［従来の技術］ ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）方法は、変性、オリゴヌ
クレオチドプライマーのアニーリングおよびDNAポリメ
ラーゼによるプライマーの延長を含む一連の操作を通し
て特定の核酸配列を増幅する（ムリンス・ケービー等、
アメリカ特許第4,683,202号、アメリカ特許第4,683,195
号、ムリンス・ケービー、ヨーロッパ特許第201,184
号、エルリッヒ・エイチ、ヨーロッパ特許第50,424号、
第84,796号、第258,017号、第237,362号、エルリッヒ・
エイチ、アメリカ特許第4,582,788号、サイキ・アール
等、アメリカ特許第4,683,202号、ムリンス・ケービー
等、コールド・スプリンク・ハーバー・シンポジウム、
クオンティタティブ・バイオロジー（Cold Spring Habo
r Symp.Quant.Biol.）、51巻263頁（1986年）、サイキ
・アール等、サイエンス（Science）、230巻1350頁（19
85年）、サイキ・アール、サイエンス（Science）、231
巻487頁（1988年）、ロー・イーワイ等、サイエンス（S
cience）、243巻217頁（1988年）参照）。これらの段階
は何回も反復することができ、原特定配列のコピー数の
大きな増幅をもたらすことができる。DNA配列１コピー
でさえも増幅して数百ナノグラムの産生物を産生するこ
とができる（リー・エイチ等、ネイチャー（Nature）、
335巻414頁（1988年））。
クレオチドプライマーのアニーリングおよびDNAポリメ
ラーゼによるプライマーの延長を含む一連の操作を通し
て特定の核酸配列を増幅する（ムリンス・ケービー等、
アメリカ特許第4,683,202号、アメリカ特許第4,683,195
号、ムリンス・ケービー、ヨーロッパ特許第201,184
号、エルリッヒ・エイチ、ヨーロッパ特許第50,424号、
第84,796号、第258,017号、第237,362号、エルリッヒ・
エイチ、アメリカ特許第4,582,788号、サイキ・アール
等、アメリカ特許第4,683,202号、ムリンス・ケービー
等、コールド・スプリンク・ハーバー・シンポジウム、
クオンティタティブ・バイオロジー（Cold Spring Habo
r Symp.Quant.Biol.）、51巻263頁（1986年）、サイキ
・アール等、サイエンス（Science）、230巻1350頁（19
85年）、サイキ・アール、サイエンス（Science）、231
巻487頁（1988年）、ロー・イーワイ等、サイエンス（S
cience）、243巻217頁（1988年）参照）。これらの段階
は何回も反復することができ、原特定配列のコピー数の
大きな増幅をもたらすことができる。DNA配列１コピー
でさえも増幅して数百ナノグラムの産生物を産生するこ
とができる（リー・エイチ等、ネイチャー（Nature）、
335巻414頁（1988年））。
他の既知核酸増幅方法はコウ・ディー等、プロシーディ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシーズ・ユーエス−エイ（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA）、86巻1173頁（1989年）の転写に基づく増幅システ
ムを含んでいる。生成物である「ジヌクレオチド」配列
を有し、それによりジヌクレオチドを増幅する核酸の存
在下２種（またはそれ以上）のオリゴヌクレオチドの結
合に基づく方式は既知である（ウ・ディーワイおよびワ
レンス・アールビー、ゲノミックス、第４巻、第560頁
（1989年））。
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシーズ・ユーエス−エイ（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA）、86巻1173頁（1989年）の転写に基づく増幅システ
ムを含んでいる。生成物である「ジヌクレオチド」配列
を有し、それによりジヌクレオチドを増幅する核酸の存
在下２種（またはそれ以上）のオリゴヌクレオチドの結
合に基づく方式は既知である（ウ・ディーワイおよびワ
レンス・アールビー、ゲノミックス、第４巻、第560頁
（1989年））。
PCRのような増幅方法の結果の１つは、増幅産生物自体
がその後のPCR法の基質となることができることであ
る、さらに、増幅産生物の量が大きくなり得、またPCR
の感受性が大変大きいため、実験室の中でのPCR反応の
ような反応のごく小さい分画の散乱でさえも、その後の
他のサンプルを増幅する試みの汚染を導くことがあり得
り、それによって誤った性質を生ずる。極端な注意が、
交差汚染を避けるために必要である（コウ・エスおよび
ヒグチ・アール、ネイチャー、第339巻、第237頁（1987
年））、このことは大変不都合でPCRのような増幅を行
なう費用を顕著に増加する。
がその後のPCR法の基質となることができることであ
る、さらに、増幅産生物の量が大きくなり得、またPCR
の感受性が大変大きいため、実験室の中でのPCR反応の
ような反応のごく小さい分画の散乱でさえも、その後の
他のサンプルを増幅する試みの汚染を導くことがあり得
り、それによって誤った性質を生ずる。極端な注意が、
交差汚染を避けるために必要である（コウ・エスおよび
ヒグチ・アール、ネイチャー、第339巻、第237頁（1987
年））、このことは大変不都合でPCRのような増幅を行
なう費用を顕著に増加する。
すなわち、増幅が、それ以前の増幅からの交差汚染の可
能性に関係なしに実施することができるオリゴヌクレオ
チド依存性核酸増幅の日常的で経済的な方法の必要性が
存在する。
能性に関係なしに実施することができるオリゴヌクレオ
チド依存性核酸増幅の日常的で経済的な方法の必要性が
存在する。
［発明の構成］ 本発明はオリゴヌクレオチド依存性増幅法の間にDNAま
たはRNAの中へエキソサンプルヌクレオチドを組み入れ
る方法を含む。
たはRNAの中へエキソサンプルヌクレオチドを組み入れ
る方法を含む。
本発明は、一般にインビトロオリゴヌクレオチド依存
性、核酸増幅方法上の改良を示す。本発明の方法では、
増幅産生物を、増幅産生物に別の特性を与える方法で、
増幅の開始に用いた核酸基質と識別可能にする。従っ
て、新規増幅反応の開始前に、これらの別の特性を、そ
の後の増幅反応中で以前の増幅産生物が鋳型として不活
性化させるために利用することができる。
性、核酸増幅方法上の改良を示す。本発明の方法では、
増幅産生物を、増幅産生物に別の特性を与える方法で、
増幅の開始に用いた核酸基質と識別可能にする。従っ
て、新規増幅反応の開始前に、これらの別の特性を、そ
の後の増幅反応中で以前の増幅産生物が鋳型として不活
性化させるために利用することができる。
それ故、本発明は、 ａ）第１サンプルの核酸を増幅し、その際上記増幅は１
種またはそれ以上の特定オリゴヌクレオチドに依存する
ものであり、上記特定オリゴヌクレオチドの少なくとも
１種がエキソサンプルヌクレオチドを含み、 ｂ）上記エキソサンプルヌクレオチドを含む核酸を上記
特定オリゴヌクレオチドに依存する増幅中で実質的に非
増幅性にするが、上記エキソサンプルヌクレオチドを含
まない核酸増幅に実質的に作用しない処理を第２サンプ
ルの核酸に施す 段階を含み、それにより第２サンプルを汚染している第
１サンプル由来増幅核酸配列が第２サンプルの核酸配列
の特定オリゴヌクレオチド依存増幅の間に実質的にこれ
以上増幅しないようにすることからなる、サンプル中に
１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド依存性核酸を
増幅する方法を提供する。
種またはそれ以上の特定オリゴヌクレオチドに依存する
ものであり、上記特定オリゴヌクレオチドの少なくとも
１種がエキソサンプルヌクレオチドを含み、 ｂ）上記エキソサンプルヌクレオチドを含む核酸を上記
特定オリゴヌクレオチドに依存する増幅中で実質的に非
増幅性にするが、上記エキソサンプルヌクレオチドを含
まない核酸増幅に実質的に作用しない処理を第２サンプ
ルの核酸に施す 段階を含み、それにより第２サンプルを汚染している第
１サンプル由来増幅核酸配列が第２サンプルの核酸配列
の特定オリゴヌクレオチド依存増幅の間に実質的にこれ
以上増幅しないようにすることからなる、サンプル中に
１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド依存性核酸を
増幅する方法を提供する。
本発明はさらに増幅が、１種の核酸または核酸の混合物
（各核酸は同じまたは異なった長さの２種の別の相補鎖
を含む）中に含まれる少なくとも１種の特定の核酸配列
を増幅する方法であり、さらに ｅ）鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列につ
いて、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプライマ
ーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅され
ているそれぞれの異なった特定配列に対する２種のオリ
ゴヌクレオチドプライマーで処理し、上記プライマー
は、それぞれの特定配列の異なった鎖に充分相補的で相
手とハイブリダイズし、その結果１種のプライマーから
合成された延長産生物がその相補体から分離するとき、
他方のプライマーの延長産生物の合成の鋳型として働く
ように選ばれたものであり、 ｆ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｇ）プライマー延長産生物が段階ｆ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合成される条件下にお
いて段階ｅ）のプライマーで段階ｆ）から発生した一本
鎖分子を処理する ことからなる上記方法を提供する。
（各核酸は同じまたは異なった長さの２種の別の相補鎖
を含む）中に含まれる少なくとも１種の特定の核酸配列
を増幅する方法であり、さらに ｅ）鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列につ
いて、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプライマ
ーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅され
ているそれぞれの異なった特定配列に対する２種のオリ
ゴヌクレオチドプライマーで処理し、上記プライマー
は、それぞれの特定配列の異なった鎖に充分相補的で相
手とハイブリダイズし、その結果１種のプライマーから
合成された延長産生物がその相補体から分離するとき、
他方のプライマーの延長産生物の合成の鋳型として働く
ように選ばれたものであり、 ｆ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｇ）プライマー延長産生物が段階ｆ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合成される条件下にお
いて段階ｅ）のプライマーで段階ｆ）から発生した一本
鎖分子を処理する ことからなる上記方法を提供する。
さらに本発明は、 （Ａ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列
について、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプラ
イマーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅
されているそれぞれの異なった特定配列に対する２種の
オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、少なくともプ
ライマーの１種はエキソサンプルヌクレオチドを含み、
上記プライマーは、それぞれの特定配列の異なった鎖に
充分相補的で相手とハイブリダイズし、その結果１種の
プライマーから合成された延長産生物がその相補体から
分離するとき、他方のプライマーの延長産生物の合成の
鋳型として働くように選ばれたものであり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｃ）プライマー延長産生物が段階ｂ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合成される条件下にお
いて段階ａ）のプライマーで段階ｂ）から発生した上記
一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅
し、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列が第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）エキソサンプルヌクレオチドを含む核酸を上記特定
オリゴヌクレオチドに依存する増幅中で実質的に非増幅
性にするが、上記エキソサンプルヌクレオチドを含まな
い核酸増幅に実質的に作用しない処理を第２サンプルの
核酸に施し、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする 段階からなる１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する
方法を提供する。
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列
について、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプラ
イマーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅
されているそれぞれの異なった特定配列に対する２種の
オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、少なくともプ
ライマーの１種はエキソサンプルヌクレオチドを含み、
上記プライマーは、それぞれの特定配列の異なった鎖に
充分相補的で相手とハイブリダイズし、その結果１種の
プライマーから合成された延長産生物がその相補体から
分離するとき、他方のプライマーの延長産生物の合成の
鋳型として働くように選ばれたものであり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｃ）プライマー延長産生物が段階ｂ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合成される条件下にお
いて段階ａ）のプライマーで段階ｂ）から発生した上記
一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅
し、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列が第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）エキソサンプルヌクレオチドを含む核酸を上記特定
オリゴヌクレオチドに依存する増幅中で実質的に非増幅
性にするが、上記エキソサンプルヌクレオチドを含まな
い核酸増幅に実質的に作用しない処理を第２サンプルの
核酸に施し、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする 段階からなる１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する
方法を提供する。
最後に、本発明は、 （Ａ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列
について、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプラ
イマーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅
されているそれぞれの異なった特定配列に対する２種の
オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、少なくともプ
ライマーの１種はデオキシウリジンを含み、上記プライ
マーは、それぞれの特定配列の異なった鎖に充分相補的
で相手とハイブリダイズし、その結果１種のプライマー
から合成された延長産生物がその相補体から分離すると
き、他方のプライマーの延長産生物の合成の鋳型として
働くように選ばれたものであり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｃ）プライマー延長産生物が段階ｂ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合成される条件下にお
いて段階ａ）のプライマーで段階ｂ）から発生した上記
一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅
し、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列は第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）上記鎖をウラシルDNAグリコシラーゼで処理し、 ｆ）ウラシルDNAグリコシラーゼの鎖上における作用を
熱により終結させ、 ｇ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第２サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅
し、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする 段階からなる１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する
方法を提供する。
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列
について、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプラ
イマーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅
されているそれぞれの異なった特定配列に対する２種の
オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、少なくともプ
ライマーの１種はデオキシウリジンを含み、上記プライ
マーは、それぞれの特定配列の異なった鎖に充分相補的
で相手とハイブリダイズし、その結果１種のプライマー
から合成された延長産生物がその相補体から分離すると
き、他方のプライマーの延長産生物の合成の鋳型として
働くように選ばれたものであり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｃ）プライマー延長産生物が段階ｂ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合成される条件下にお
いて段階ａ）のプライマーで段階ｂ）から発生した上記
一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅
し、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列は第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）上記鎖をウラシルDNAグリコシラーゼで処理し、 ｆ）ウラシルDNAグリコシラーゼの鎖上における作用を
熱により終結させ、 ｇ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第２サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅
し、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする 段階からなる１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する
方法を提供する。
［発明の記載］ 以下の記載で、分子生物学および核酸増幅技術で使われ
る用語が広範囲に使用される。明細書および請求の範囲
の明白および一貫性のある理解を提供するために、上記
用語に与えられるべき範囲を含み、次の定義が提供され
る。
る用語が広範囲に使用される。明細書および請求の範囲
の明白および一貫性のある理解を提供するために、上記
用語に与えられるべき範囲を含み、次の定義が提供され
る。
ここで使われる「増幅」はヌクレオチド配列または複数
の配列のコピー数を増加する任意のインビトロ方法を表
している。核酸増幅はDNAまたはRNAの中へのヌクレオチ
ドの組み入れをもたらす。ここで使う場合、１種の増幅
反応はDNA複製の多数の回数からなることができる。例
えば、１種のPCR反応は変性および複製の30−100「サイ
クル」からなる。
の配列のコピー数を増加する任意のインビトロ方法を表
している。核酸増幅はDNAまたはRNAの中へのヌクレオチ
ドの組み入れをもたらす。ここで使う場合、１種の増幅
反応はDNA複製の多数の回数からなることができる。例
えば、１種のPCR反応は変性および複製の30−100「サイ
クル」からなる。
ここで使われる「ヌクレオチド」は塩基−糖−りん酸塩
結合物を表す技術用語である。ヌクレオチドは核酸ポリ
マー、すなわちDNAおよびRNAの単量体ユニットである。
この語はrATP、rCTP、rGTPまたはrUTPのようなリボヌク
レオシドトリホスフェートおよびdATP、dCTP、dGTPまた
はdTTPのようなデオキシリボヌクレオシドトリホスフェ
ートを含む。「ヌクレオチド」は、塩基−糖結合物、す
なわちりん酸部分を欠失しているヌクレオチドを表す。
結合物を表す技術用語である。ヌクレオチドは核酸ポリ
マー、すなわちDNAおよびRNAの単量体ユニットである。
この語はrATP、rCTP、rGTPまたはrUTPのようなリボヌク
レオシドトリホスフェートおよびdATP、dCTP、dGTPまた
はdTTPのようなデオキシリボヌクレオシドトリホスフェ
ートを含む。「ヌクレオチド」は、塩基−糖結合物、す
なわちりん酸部分を欠失しているヌクレオチドを表す。
ここで使われる「エキソサンプルヌクレオチド」は一般
に増幅すべき配列中に見られないヌクレオチドを表して
いる。ほとんどのDNAサンプルでは、デオキシウリジン
がエキソサンプルヌクレオチドの例である。デオキシウ
リジントリホスフェート型、dUTPは代謝中間体として生
物体に存在しているが、ほとんどDNA中に組み入れられ
ない。dUTPがDNA中に組み入れられると、結果として生
ずるデオキシウリジンは例えば酵素ウラシルDNAグリコ
シラーゼ（UDG）を含む方法のような正常過程によりイ
ンビトロで素早く除去される。すなわち、デオキシウリ
ジンは天然DNA中ではほとんどまたは決して存在しな
い。ある種の生物体はDNA中にデオキシウリジンを自然
に組み入れることができることが認められている。これ
らの生物体の核酸サンプルではデオキシウリジンはエキ
ソサンプルヌクレオチドと考えられない。デオキシウリ
ジンまたは他のエキソサンプルヌクレオチドの存在は当
業者によく知られた方法により容易に測定することがで
きる。
に増幅すべき配列中に見られないヌクレオチドを表して
いる。ほとんどのDNAサンプルでは、デオキシウリジン
がエキソサンプルヌクレオチドの例である。デオキシウ
リジントリホスフェート型、dUTPは代謝中間体として生
物体に存在しているが、ほとんどDNA中に組み入れられ
ない。dUTPがDNA中に組み入れられると、結果として生
ずるデオキシウリジンは例えば酵素ウラシルDNAグリコ
シラーゼ（UDG）を含む方法のような正常過程によりイ
ンビトロで素早く除去される。すなわち、デオキシウリ
ジンは天然DNA中ではほとんどまたは決して存在しな
い。ある種の生物体はDNA中にデオキシウリジンを自然
に組み入れることができることが認められている。これ
らの生物体の核酸サンプルではデオキシウリジンはエキ
ソサンプルヌクレオチドと考えられない。デオキシウリ
ジンまたは他のエキソサンプルヌクレオチドの存在は当
業者によく知られた方法により容易に測定することがで
きる。
技術用語である「ウラシルDNAグリコシラーゼ」（UDG）
は塩基ウラシルと糖デオキシリボースの間のグリコシド
結合を開裂する酵素であって、これは単量体ヌクレオチ
ドdUTPがDNA分子に組み入れられているときにのみ作用
し、この場合デオキシウリジン部分の組み入れが結果と
して生ずる（ダンカン・ビー、ザ・エンザイム、第14
巻、第565頁（1981年））。酵素は遊離dUTP、遊離デオ
キシウリジンまたはRNAには作用しない（デュカン、前
掲）。
は塩基ウラシルと糖デオキシリボースの間のグリコシド
結合を開裂する酵素であって、これは単量体ヌクレオチ
ドdUTPがDNA分子に組み入れられているときにのみ作用
し、この場合デオキシウリジン部分の組み入れが結果と
して生ずる（ダンカン・ビー、ザ・エンザイム、第14
巻、第565頁（1981年））。酵素は遊離dUTP、遊離デオ
キシウリジンまたはRNAには作用しない（デュカン、前
掲）。
ここで使われる「組み入れる」は、核酸ポリマーの部分
になっていくことを表す。
になっていくことを表す。
ここで使われる「終結する」は、処理の停止をひき起こ
すことを意味する。この用語は永久的および条件付きの
両方の停止方法を含む。例えば処理が酵素的ならば、永
久的停止は熱変性であり、例えば条件付き停止は酵素活
性範囲の範囲外の温度に使用される。終結の両方の型は
本発明の用語の範囲内に包括される。
すことを意味する。この用語は永久的および条件付きの
両方の停止方法を含む。例えば処理が酵素的ならば、永
久的停止は熱変性であり、例えば条件付き停止は酵素活
性範囲の範囲外の温度に使用される。終結の両方の型は
本発明の用語の範囲内に包括される。
ここで使われる「オリゴヌクレオチド」は、「オリゴヌ
クレオチド」および「ポリヌクレオチド」の２つの技術
用語を集合的で取り替え可能に表す。オリゴヌクレオチ
ドおよびポリヌクレオチドは別々の技術用語ではある
が、それらの間に正確な分割線はなく、ここでは取り替
え可能に使われる。
クレオチド」および「ポリヌクレオチド」の２つの技術
用語を集合的で取り替え可能に表す。オリゴヌクレオチ
ドおよびポリヌクレオチドは別々の技術用語ではある
が、それらの間に正確な分割線はなく、ここでは取り替
え可能に使われる。
ここで使われる「オリゴヌクレオチド依存性増幅」は核
酸配列を増幅するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレ
オチドを使う増幅を表す。オリゴヌクレオチド依存性増
幅は長さにおいて２種またはそれ以上のモノヌクレオチ
ドサブユニットであり、新規に形成する増幅核酸分子の
一部分になる１種またはそれ以上のオリゴヌクレオチド
またはポリヌクレオチドの存在を要求する任意の増幅で
ある。
酸配列を増幅するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレ
オチドを使う増幅を表す。オリゴヌクレオチド依存性増
幅は長さにおいて２種またはそれ以上のモノヌクレオチ
ドサブユニットであり、新規に形成する増幅核酸分子の
一部分になる１種またはそれ以上のオリゴヌクレオチド
またはポリヌクレオチドの存在を要求する任意の増幅で
ある。
ここで使われる「プライマー」は増幅の間にヌクレオチ
ド単量体の共有付加により延長される１本鎖オリゴヌク
レオチドまたは１本鎖ポリヌクレオチドを表す。核酸増
幅は核酸ポリメラーゼによる核酸合成に基づく。多くの
上記ポリメラーゼは延長されて上記核酸合成を開始する
ことができるプライマーの存在を必要とする。
ド単量体の共有付加により延長される１本鎖オリゴヌク
レオチドまたは１本鎖ポリヌクレオチドを表す。核酸増
幅は核酸ポリメラーゼによる核酸合成に基づく。多くの
上記ポリメラーゼは延長されて上記核酸合成を開始する
ことができるプライマーの存在を必要とする。
［好ましい態様の詳細な説明］ 本発明の方法は、上記増幅産生物の検出分析を妨げない
が、その後の増幅反応中鋳型として役立つ能力を破壊す
るある種の処置で上記増幅産生物を特有に影響させる方
法で原核産基質から増幅産生物を区別することを可能に
する。この感受性のため、本発明により増幅された前処
置サンプルはサンプルからのそれ以前の増幅で生じ得る
汚染産生物の除去を可能にする。
が、その後の増幅反応中鋳型として役立つ能力を破壊す
るある種の処置で上記増幅産生物を特有に影響させる方
法で原核産基質から増幅産生物を区別することを可能に
する。この感受性のため、本発明により増幅された前処
置サンプルはサンプルからのそれ以前の増幅で生じ得る
汚染産生物の除去を可能にする。
本明細書に示されているのと類似の方法が1989年６月１
日出願のアメリカ特許出願番号第07/360,120番のハート
レイ・ジェイエルにより使われたが（これを引用して本
明細書に包含させる）、ここでは原鋳型から上記増幅配
列を区別するために増幅製法それ自体の間にエキソサン
プルヌクレオチドが増幅産生物に組みいれられる。
日出願のアメリカ特許出願番号第07/360,120番のハート
レイ・ジェイエルにより使われたが（これを引用して本
明細書に包含させる）、ここでは原鋳型から上記増幅配
列を区別するために増幅製法それ自体の間にエキソサン
プルヌクレオチドが増幅産生物に組みいれられる。
本発明は、ここでの上記増幅産生物を区別するのに使わ
れるエキソサンプルヌクレオチドが増幅前にオリゴマー
またはポリマーの一部として供給されるのに対し、ハー
トレイの方法は増幅の間にポリマー核酸中に組み入れる
ようになるヌクレオチド三りん酸塩として供給される点
で、ハートレイの方法と区別される。
れるエキソサンプルヌクレオチドが増幅前にオリゴマー
またはポリマーの一部として供給されるのに対し、ハー
トレイの方法は増幅の間にポリマー核酸中に組み入れる
ようになるヌクレオチド三りん酸塩として供給される点
で、ハートレイの方法と区別される。
本発明の方法は核酸増幅技術の主な問題として前述の増
幅製法の最終産生物による出発原料の汚染を防ぐ。
幅製法の最終産生物による出発原料の汚染を防ぐ。
本発明の方法は、酵素を用いて特定核酸配列を増幅する
任意のインビトロ方法特にPCRに適用できる。
任意のインビトロ方法特にPCRに適用できる。
好ましい態様では、エキソサンプルヌクレオチドを含む
プライマーを使用する増幅により製造された核酸産生物
はエキソサンプルヌクレオチドを含む増幅により製造さ
れない出発鋳型と化学的に異なる。この化学的相違はエ
キソサンプルヌクレオチドを含むプライマーを使う増幅
により製造された核酸産生物をさらに指数増幅ができな
いようにさせることを可能にする。エキソサンプルヌク
レオチドのプライマーへのとり込みは、上記増幅の間に
製造されたDNAまたはRNAが増幅前にサンプル中に存在す
る原核酸と区別されることを可能にする。所望ならば、
増幅反応それ自体がさらに例えばハートレイ（前掲）に
教えられたような複製核酸への組み入れ用のエキソサン
プルヌクレオチドを提供することができる。
プライマーを使用する増幅により製造された核酸産生物
はエキソサンプルヌクレオチドを含む増幅により製造さ
れない出発鋳型と化学的に異なる。この化学的相違はエ
キソサンプルヌクレオチドを含むプライマーを使う増幅
により製造された核酸産生物をさらに指数増幅ができな
いようにさせることを可能にする。エキソサンプルヌク
レオチドのプライマーへのとり込みは、上記増幅の間に
製造されたDNAまたはRNAが増幅前にサンプル中に存在す
る原核酸と区別されることを可能にする。所望ならば、
増幅反応それ自体がさらに例えばハートレイ（前掲）に
教えられたような複製核酸への組み入れ用のエキソサン
プルヌクレオチドを提供することができる。
典型的に、オリゴヌクレオチド中の４種のリボヌクレオ
チド（ATP、UTP、CTPおよびGTP）またはデオキシリボヌ
クレオチド（dATP、dTTP、dCTPおよびdGTP）の１種また
はそれ以上を１種またはそれ以上のエキソサンプルヌク
レオチドで置きかえたプライマーを使用する。エキソサ
ンプルヌクレオチド高割合のプライマーを使用する態様
は、少量のエキソサンプルヌクレオチド含有オリゴヌク
レオチドを用いるものより好ましい。特に、プライマー
の３′OH末端に位置するエキソサンプルヌクレオチドの
高分画のプライマーが好ましい。別の好ましい態様は、
エキソサンプルヌクレオチドが３′ヌクレオチドである
ものである。
チド（ATP、UTP、CTPおよびGTP）またはデオキシリボヌ
クレオチド（dATP、dTTP、dCTPおよびdGTP）の１種また
はそれ以上を１種またはそれ以上のエキソサンプルヌク
レオチドで置きかえたプライマーを使用する。エキソサ
ンプルヌクレオチド高割合のプライマーを使用する態様
は、少量のエキソサンプルヌクレオチド含有オリゴヌク
レオチドを用いるものより好ましい。特に、プライマー
の３′OH末端に位置するエキソサンプルヌクレオチドの
高分画のプライマーが好ましい。別の好ましい態様は、
エキソサンプルヌクレオチドが３′ヌクレオチドである
ものである。
ひとつの態様としては、増幅核酸を非増幅性にさせるエ
キソサンプルヌクレオチドの処置は増幅反応の開始前に
実施する。
キソサンプルヌクレオチドの処置は増幅反応の開始前に
実施する。
別の態様としては、増幅核酸を非増幅性にさせるエキソ
サンプルヌクレオチドの処置は第１増幅反応を終結さ
せ、およびさらに分析のために増幅産生物とサンプルを
除去した後であって、サンプル中の原出発核酸を新規、
第２増幅反応に付す前に実施する。例えば増幅後および
分析のための増幅サンプルの除去後、残留することので
きる増幅した産生物はエキソサンプルヌクレオチドを含
む増幅核酸を実質的に非増幅性にさせる処置に付す。
サンプルヌクレオチドの処置は第１増幅反応を終結さ
せ、およびさらに分析のために増幅産生物とサンプルを
除去した後であって、サンプル中の原出発核酸を新規、
第２増幅反応に付す前に実施する。例えば増幅後および
分析のための増幅サンプルの除去後、残留することので
きる増幅した産生物はエキソサンプルヌクレオチドを含
む増幅核酸を実質的に非増幅性にさせる処置に付す。
エキソサンプルヌクレオチドを含む増幅核酸を非増幅性
にさせる上記処置は物理的、化学的、酵素的または生物
学的処置であることができる。上記処置は分離段階とし
て行なうことができ、または好ましくは増幅する核酸配
列を含む第２サンプルの存在下行なうことができる。従
って、第２サンプルを汚染するエキソサンプルヌクレオ
チドの存在下第１サンプルを増幅することにより製造さ
れた増幅核酸配列は、たとえ同じオリゴヌクレオチドが
プライマーとして使われるとしても、核酸配列の第２オ
リゴヌクレオチド依存性増幅の間実質的にこれ以上増幅
しない。
にさせる上記処置は物理的、化学的、酵素的または生物
学的処置であることができる。上記処置は分離段階とし
て行なうことができ、または好ましくは増幅する核酸配
列を含む第２サンプルの存在下行なうことができる。従
って、第２サンプルを汚染するエキソサンプルヌクレオ
チドの存在下第１サンプルを増幅することにより製造さ
れた増幅核酸配列は、たとえ同じオリゴヌクレオチドが
プライマーとして使われるとしても、核酸配列の第２オ
リゴヌクレオチド依存性増幅の間実質的にこれ以上増幅
しない。
好ましい態様としては、デオキシリボヌクレオチドデオ
キシウリジンはPCRにより例示したオリゴヌクレオチド
依存性DNA増幅法で使用されるプライマーに好便に組み
入れることができるエキソサンプルヌクレオチドとして
使用され、それによりデオキシウリジン含有DNA増幅産
生物を結果として生ずる。上記反応のDNA産生物は、一
般に非エキソサンプルヌクレオチド含有プライマー中に
存在するチミジン類と同数のウラシル塩基を含む。
キシウリジンはPCRにより例示したオリゴヌクレオチド
依存性DNA増幅法で使用されるプライマーに好便に組み
入れることができるエキソサンプルヌクレオチドとして
使用され、それによりデオキシウリジン含有DNA増幅産
生物を結果として生ずる。上記反応のDNA産生物は、一
般に非エキソサンプルヌクレオチド含有プライマー中に
存在するチミジン類と同数のウラシル塩基を含む。
エキソヌクレオチドデオキシウリジンを含まない核酸お
よび増幅反応のデオキシウリジン含有産生物との識別
は、酵素UDGにより得ることが可能である。UDGによるウ
ラシル塩基含有DNAの処置はDNA糖−りん酸塩骨格のデオ
キシリボースおよびウラシル塩基との間のグリコシド結
合の開裂を生ずる。ウラシルの損失は相補DNA鎖の合成
に対する鋳型としてのDNA鎖の使用からDNAポリメラーゼ
を遮断するDNA中の非ピリミジン部位を作る（シャッパ
ー・アール等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユー
エスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、第80巻、第487
頁（1983年））。
よび増幅反応のデオキシウリジン含有産生物との識別
は、酵素UDGにより得ることが可能である。UDGによるウ
ラシル塩基含有DNAの処置はDNA糖−りん酸塩骨格のデオ
キシリボースおよびウラシル塩基との間のグリコシド結
合の開裂を生ずる。ウラシルの損失は相補DNA鎖の合成
に対する鋳型としてのDNA鎖の使用からDNAポリメラーゼ
を遮断するDNA中の非ピリミジン部位を作る（シャッパ
ー・アール等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユー
エスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、第80巻、第487
頁（1983年））。
エキソサンプルヌクレオチドを含むプライマーの提供に
より、上記エキソサンプルヌクレオチドは、増幅するDN
A鋳型のそれぞれの鎖の５′末端に位置する。デオキシ
ウリジン含有プライマーが使用され、サンプルをUDGで
処置する場合、それぞれのDNA標的鋳型分子の５′−末
端中に非ピリミジン部位の実質的な数がみられる。上記
非ピリミジン部位は新しく鎖を作る３′−末端で配列の
合成を妨げる。これらの３′−末端配列は原エキソサン
プル含有プライマー結合の標的である。すなわち、これ
らのプライマーはエキソサンプルヌクレオチド含有プラ
イマーにより開始された分子から誘導された核酸を結合
することができる標的配列を有する。
より、上記エキソサンプルヌクレオチドは、増幅するDN
A鋳型のそれぞれの鎖の５′末端に位置する。デオキシ
ウリジン含有プライマーが使用され、サンプルをUDGで
処置する場合、それぞれのDNA標的鋳型分子の５′−末
端中に非ピリミジン部位の実質的な数がみられる。上記
非ピリミジン部位は新しく鎖を作る３′−末端で配列の
合成を妨げる。これらの３′−末端配列は原エキソサン
プル含有プライマー結合の標的である。すなわち、これ
らのプライマーはエキソサンプルヌクレオチド含有プラ
イマーにより開始された分子から誘導された核酸を結合
することができる標的配列を有する。
ここで例示したデオキシウリジンと異なる他のエキソサ
ンプルヌクレオチドを考えることができる。多くのDNA
グリコシラーゼは当業者には既知である。オリゴヌクレ
オチドに化学的または酵素的に組み入れられることがで
きるエキソサンプルヌクレオチドおよびそれに作用する
DNAグリコシラーゼが本発明に使用される。他のエキソ
サンプルヌクレオチドも当業者に周知である。例えばDN
A増幅に使用されるRNAプライマーは塩基または適当なリ
ボヌクレアーゼ（RNase）により容易に破壊することが
できる。RNaseHはRNA:DNAハイブリッドのRNAを分解さ
せ、変性段階後１本鎖RNAを消化するのに役立つ多数の
１本鎖RNaseが知られている。（DNA鎖が逆でない限り、
汚染DNAのRNaseH消化後に１本鎖デオキシリボヌクレア
ーゼ（DNase）により除去されるが、その変性前では汚
染DNAは直鎖形式で増幅される。しかしながら、ほとん
どのオリゴヌクレオチド依存性DNA増幅方式は指数的にD
NAを増幅するので、このことは汚染レベルが異常に高く
ない限り問題にはならない。本発明のRNA開始態様を発
展させる当業者は不当な実験なしで、それらの検出法に
おいて最低の汚染許容レベルを決定することができ
る。） 別の態様では、ブロモデオキシウリジンを含むデオキシ
オリゴヌクレオチド（BdUR）がエキソサンプルヌクレオ
チドとして使用される。BdURを含むDNAは適当な条件
下、光の影響により分解することができる。
ンプルヌクレオチドを考えることができる。多くのDNA
グリコシラーゼは当業者には既知である。オリゴヌクレ
オチドに化学的または酵素的に組み入れられることがで
きるエキソサンプルヌクレオチドおよびそれに作用する
DNAグリコシラーゼが本発明に使用される。他のエキソ
サンプルヌクレオチドも当業者に周知である。例えばDN
A増幅に使用されるRNAプライマーは塩基または適当なリ
ボヌクレアーゼ（RNase）により容易に破壊することが
できる。RNaseHはRNA:DNAハイブリッドのRNAを分解さ
せ、変性段階後１本鎖RNAを消化するのに役立つ多数の
１本鎖RNaseが知られている。（DNA鎖が逆でない限り、
汚染DNAのRNaseH消化後に１本鎖デオキシリボヌクレア
ーゼ（DNase）により除去されるが、その変性前では汚
染DNAは直鎖形式で増幅される。しかしながら、ほとん
どのオリゴヌクレオチド依存性DNA増幅方式は指数的にD
NAを増幅するので、このことは汚染レベルが異常に高く
ない限り問題にはならない。本発明のRNA開始態様を発
展させる当業者は不当な実験なしで、それらの検出法に
おいて最低の汚染許容レベルを決定することができ
る。） 別の態様では、ブロモデオキシウリジンを含むデオキシ
オリゴヌクレオチド（BdUR）がエキソサンプルヌクレオ
チドとして使用される。BdURを含むDNAは適当な条件
下、光の影響により分解することができる。
ここで例示したように、好ましい態様において、基礎的
な増幅プロトコールのPCRは３つの方法で修飾されてい
る。（１）増幅は最初にデオキシチミジンを置換したデ
オキシウリジンを含むオリゴヌクレオチドプライマーを
使用して実施し、および分析のため増幅産生物のサンプ
ルを除去し、（２）その後UDGがPCR反応混合物に加えら
れ、および（３）インキュベーション時間が、以前のPC
Rの汚染産生物中のウラシル含有配列にUDGが作用するた
めに加えられる。
な増幅プロトコールのPCRは３つの方法で修飾されてい
る。（１）増幅は最初にデオキシチミジンを置換したデ
オキシウリジンを含むオリゴヌクレオチドプライマーを
使用して実施し、および分析のため増幅産生物のサンプ
ルを除去し、（２）その後UDGがPCR反応混合物に加えら
れ、および（３）インキュベーション時間が、以前のPC
Rの汚染産生物中のウラシル含有配列にUDGが作用するた
めに加えられる。
増幅製法を続ける前にUDGを不活性化しなければならな
い。UDGは第1PCRサイクル中で高温または一般的に好ま
しいPCRプロトコールのTagDNAポリメラーゼを使用した
高温のどちらかによって永久的に不活性化することがで
きる。
い。UDGは第1PCRサイクル中で高温または一般的に好ま
しいPCRプロトコールのTagDNAポリメラーゼを使用した
高温のどちらかによって永久的に不活性化することがで
きる。
この不活性化はUDGが新規合成PCR産生を破壊することを
防ぐ。UDG活性を本質的に除去しない核酸増幅プロトコ
ールは普通過剰UDG不活性化段階が必要である。
防ぐ。UDG活性を本質的に除去しない核酸増幅プロトコ
ールは普通過剰UDG不活性化段階が必要である。
エキソサンプルヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド
を多量に有する態様が好ましい。しかしながら、２つの
オリゴヌクレオチドプライマーに依存する標準PCR態様
でも、本発明は少なくとも１種のプライマーがエキソサ
ンプルヌクレオチドを含む限りPCR汚染を非増幅性にさ
せることができる。
を多量に有する態様が好ましい。しかしながら、２つの
オリゴヌクレオチドプライマーに依存する標準PCR態様
でも、本発明は少なくとも１種のプライマーがエキソサ
ンプルヌクレオチドを含む限りPCR汚染を非増幅性にさ
せることができる。
１本鎖エキソサンプルヌクレオチド含有プライマーは全
てが与えられた条件でPCR産生物の増幅を充分に低いレ
ベルに減少させることができるのではない。当業者は不
必要な実験なしに、決まった最適化およびPCR検定試験
で、どのプライマーが受け入れられるかを経験的に発見
することができる。
てが与えられた条件でPCR産生物の増幅を充分に低いレ
ベルに減少させることができるのではない。当業者は不
必要な実験なしに、決まった最適化およびPCR検定試験
で、どのプライマーが受け入れられるかを経験的に発見
することができる。
オリゴヌクレオチド適切化を試験するための日常的検定
最適化は、（１）エキソサンプルヌクレオチド含有オリ
ゴヌクレオチドを作り、（２）プライマーを使って標的
配列の第１核酸増幅を実施し、（３）生ずる第１産生物
の様々な量を標的配列を含まない新規、第２増幅で接種
し、（４）エキソサンプルヌクレオチド含有核酸を非増
幅性にさせるため第２増幅を処理し、（５）第２増幅を
実施し、および（６）生ずる第２産生物を第１ハイブリ
ッド化からの汚染配列の存在について検定することによ
り行うことができる。これらの段階全てが実験的制御お
よび方法の標準的変更の部分として日常的に行なわれ
る。本発明の実施をする者に必要である唯一の付加的作
業は、必要であり得る任意のオリゴヌクレオチドの日常
的合成を含む。一般的に、オリゴヌクレオチドが適当で
はないと気付いたら、置換物はたやすく発見され、同様
に試験されることができる。
最適化は、（１）エキソサンプルヌクレオチド含有オリ
ゴヌクレオチドを作り、（２）プライマーを使って標的
配列の第１核酸増幅を実施し、（３）生ずる第１産生物
の様々な量を標的配列を含まない新規、第２増幅で接種
し、（４）エキソサンプルヌクレオチド含有核酸を非増
幅性にさせるため第２増幅を処理し、（５）第２増幅を
実施し、および（６）生ずる第２産生物を第１ハイブリ
ッド化からの汚染配列の存在について検定することによ
り行うことができる。これらの段階全てが実験的制御お
よび方法の標準的変更の部分として日常的に行なわれ
る。本発明の実施をする者に必要である唯一の付加的作
業は、必要であり得る任意のオリゴヌクレオチドの日常
的合成を含む。一般的に、オリゴヌクレオチドが適当で
はないと気付いたら、置換物はたやすく発見され、同様
に試験されることができる。
当業者に理解されるように、本発明の方法は指数的増幅
を防御するが直線的増幅を防御しない。直線的増幅は増
幅方法で普通実質的問題を呈示しない。例えば、各サイ
クル上で２倍づつ増幅される、PCRの20サイクルによる
サンプルを汚染する増幅産生物１分子は直線的増幅なら
ばたった約20分子しか生じないが、もし最大理論効率で
指数的に増幅するならば約百万分子を生ずる。すなわ
ち、直線増幅は一般的に取るに足らないものである。
を防御するが直線的増幅を防御しない。直線的増幅は増
幅方法で普通実質的問題を呈示しない。例えば、各サイ
クル上で２倍づつ増幅される、PCRの20サイクルによる
サンプルを汚染する増幅産生物１分子は直線的増幅なら
ばたった約20分子しか生じないが、もし最大理論効率で
指数的に増幅するならば約百万分子を生ずる。すなわ
ち、直線増幅は一般的に取るに足らないものである。
本発明は核酸ポリメラーゼを使用しない増幅と共に使用
するように適合させることができる。例えば、以前に作
った産生物によるサンプルの汚染はリガーセによるオリ
ゴヌクレオチドポリマー化の増幅方式により制御するこ
とができる（例えば、ウおよびウォーレンス、前掲）。
するように適合させることができる。例えば、以前に作
った産生物によるサンプルの汚染はリガーセによるオリ
ゴヌクレオチドポリマー化の増幅方式により制御するこ
とができる（例えば、ウおよびウォーレンス、前掲）。
以上一般的に本発明を説明したが、以下では実施例を引
用して理解を容易ならしめる。これらは説明の目的のた
めにのみここに含まれ、特にことわらない限り限定され
るものではない。
用して理解を容易ならしめる。これらは説明の目的のた
めにのみここに含まれ、特にことわらない限り限定され
るものではない。
［実施例］ 実施例１ 一般的試験条件 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）はヒト乳頭腫ウイルス型1
6（HPV16）DNAの１領域を増幅するために実施した（デ
ュルスト・エム等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・ザ・サイエンシーズ・イ
ン・ユーエスエイ（Proc、Natl.Sci.USA）、第80巻、第
3812頁（1983年））。使用したオリゴヌクレオチドプラ
イマーの配列は、５′GGUGAUGUAUGUCUUGUUG3′および
５′GUCUACGUGUGUGCUUUGUAC3′（それぞれdUプライマー
dT1およびdT2）または５′GGTCGATGTATGTCTTGTTG3′お
よび５′GTCTACGTGTGTGCTTTGTAC3′（それぞれ制御dTプ
ライマーdT1およびdT2）のどちらかである。dT1およびd
T2の配列はＴに対するＵの変換を除けば同一であり、dT
2およびdU2も同様に同一である。
6（HPV16）DNAの１領域を増幅するために実施した（デ
ュルスト・エム等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・ザ・サイエンシーズ・イ
ン・ユーエスエイ（Proc、Natl.Sci.USA）、第80巻、第
3812頁（1983年））。使用したオリゴヌクレオチドプラ
イマーの配列は、５′GGUGAUGUAUGUCUUGUUG3′および
５′GUCUACGUGUGUGCUUUGUAC3′（それぞれdUプライマー
dT1およびdT2）または５′GGTCGATGTATGTCTTGTTG3′お
よび５′GTCTACGTGTGTGCTTTGTAC3′（それぞれ制御dTプ
ライマーdT1およびdT2）のどちらかである。dT1およびd
T2の配列はＴに対するＵの変換を除けば同一であり、dT
2およびdU2も同様に同一である。
HPV16DNAは制限酵素BamHIで完全な長さのプラスミドク
ローンpT7HPV16から切り出した（本発明の目的としてシ
ードフ・ケイ等、バイロロジー（Virol.）、第145巻、
第181頁（1985年）記載のpUC8プラスミドと均等）。直
鎖DNA（10ピコグラム）を、50マイクロリットルの25mM
トリス−HClpH8.3、MgCl25mM、NaCl50mM、0.01％ゼラチ
ン、dATP、dGTP、dCTPをそれぞれ0.2mM、dUTPまたはdTT
Pのいずれかを0.2mM、それぞれのプライマーを１マイク
ロモルおよびテルムス・アクティクス（Thermus aquat
icus）（シータス／パーキン−エルマー社）からの熱安
定DNAポリメラーゼ12.5ユニットを含むPCR反応物に加え
た。プライマーおよびトリホスフェートを次のとおりに
組みにした。dTTPとdUプライマー（pUxT反応（primed w
ith U,extended with Ｔ））およびdUTPと制御dTプラ
イマー（pTxU反応）。反応は次の温度表を使ってサーマ
ルシルサー（シータス／パーキン−エルマー社）で増幅
した。94℃５分間、その後94℃１分を（変性）、55℃で
２分間（アニーリング）および72℃３分間（プライマー
延長）を30サイクル。温度サイクル完了後、72℃10分
間、最後の延長をした。PCR反応産生物（レイン当り各
反応物５マイクロリットル）のアガロース／臭化エチジ
ウムゲル電気泳動（マニアティス・ティー等、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular Cloning）、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（1982年））で
284塩基対HPV16DNAフラグメントの増幅を確認した。全
反応物は実質的増幅を示した。HPV16DNAを加えない陰性
対照反応ではDNA産生物は製造されなかった。PCR増幅生
産物の濃度はアガロースゲルから推定した。
ローンpT7HPV16から切り出した（本発明の目的としてシ
ードフ・ケイ等、バイロロジー（Virol.）、第145巻、
第181頁（1985年）記載のpUC8プラスミドと均等）。直
鎖DNA（10ピコグラム）を、50マイクロリットルの25mM
トリス−HClpH8.3、MgCl25mM、NaCl50mM、0.01％ゼラチ
ン、dATP、dGTP、dCTPをそれぞれ0.2mM、dUTPまたはdTT
Pのいずれかを0.2mM、それぞれのプライマーを１マイク
ロモルおよびテルムス・アクティクス（Thermus aquat
icus）（シータス／パーキン−エルマー社）からの熱安
定DNAポリメラーゼ12.5ユニットを含むPCR反応物に加え
た。プライマーおよびトリホスフェートを次のとおりに
組みにした。dTTPとdUプライマー（pUxT反応（primed w
ith U,extended with Ｔ））およびdUTPと制御dTプラ
イマー（pTxU反応）。反応は次の温度表を使ってサーマ
ルシルサー（シータス／パーキン−エルマー社）で増幅
した。94℃５分間、その後94℃１分を（変性）、55℃で
２分間（アニーリング）および72℃３分間（プライマー
延長）を30サイクル。温度サイクル完了後、72℃10分
間、最後の延長をした。PCR反応産生物（レイン当り各
反応物５マイクロリットル）のアガロース／臭化エチジ
ウムゲル電気泳動（マニアティス・ティー等、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular Cloning）、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（1982年））で
284塩基対HPV16DNAフラグメントの増幅を確認した。全
反応物は実質的増幅を示した。HPV16DNAを加えない陰性
対照反応ではDNA産生物は製造されなかった。PCR増幅生
産物の濃度はアガロースゲルから推定した。
実施例２ ２種のデオキシウリジン含有プライマーを使用した増幅 新規pUxTPCR反応はdTTPを含むがdUプライマーを欠失し
たもので製造された。これらは以前の反応からのpUxT増
幅産生物10フェントグラムで汚染し、UDG（ジェイ・バ
ン・ド・サンデ、ユニバーシティー・オブ・カルガリー
（University of Calgary）。アメリカ合衆国19301、ペ
ンシルバニア、パオリ、イースト・セントラル・アベニ
ュー 10番のダンカン・ラボラトリーズからも入手され
る）の存在または不存在下で37℃15分間インキュベート
した。これらの反応物はその後UDGを不活性化させるた
めに90℃でインキュベートし、15℃に冷却し、dUプライ
マーを加えた。
たもので製造された。これらは以前の反応からのpUxT増
幅産生物10フェントグラムで汚染し、UDG（ジェイ・バ
ン・ド・サンデ、ユニバーシティー・オブ・カルガリー
（University of Calgary）。アメリカ合衆国19301、ペ
ンシルバニア、パオリ、イースト・セントラル・アベニ
ュー 10番のダンカン・ラボラトリーズからも入手され
る）の存在または不存在下で37℃15分間インキュベート
した。これらの反応物はその後UDGを不活性化させるた
めに90℃でインキュベートし、15℃に冷却し、dUプライ
マーを加えた。
新規pTxUPCR反応はdTプライマーおよびdUTPで製造さ
れ、pTxU増幅産生物10フェントグラムで汚染した。これ
らの反応物はそれぞれUDG活性およびPCR増幅の制御とし
てUDG存在または不存在下で37℃15分間インキュベート
した。
れ、pTxU増幅産生物10フェントグラムで汚染した。これ
らの反応物はそれぞれUDG活性およびPCR増幅の制御とし
てUDG存在または不存在下で37℃15分間インキュベート
した。
新規PCR反応はその後上記記載の同じPCR温度サイクルに
付した。アガロース／臭化エチジウムゲル電気泳動は、
UDG処理なしではpUxTおよびpTxU反応産生物両方ともPCR
により再増幅することができ、HPV16DNAの増幅で得られ
たものの外観と同様な結果が得られた。これと異なっ
て、UDG処理の場合はdUプライマーを含むpTxU反応産生
物（陽性対照）およびpUxT反応産生物の両方の再増幅を
終結させた。別の試験では、デオキシウリジンの不存在
下でプライマーまたは延長産生物のどちらかでUDGは天
然型HPV16DNAのPCR増幅に影響されなかった。
付した。アガロース／臭化エチジウムゲル電気泳動は、
UDG処理なしではpUxTおよびpTxU反応産生物両方ともPCR
により再増幅することができ、HPV16DNAの増幅で得られ
たものの外観と同様な結果が得られた。これと異なっ
て、UDG処理の場合はdUプライマーを含むpTxU反応産生
物（陽性対照）およびpUxT反応産生物の両方の再増幅を
終結させた。別の試験では、デオキシウリジンの不存在
下でプライマーまたは延長産生物のどちらかでUDGは天
然型HPV16DNAのPCR増幅に影響されなかった。
UDG処理なしでは、デオキシウリジン含有PCR産生物は再
増幅することができ、アガロースゲル電気泳動法から明
らかなように、デオキシウリジンを含まず、標準HPV16D
NAを増幅により得られた産生物から大きさ上では識別で
きないDNA産生物が得られた。DNAをデオキシウリジン含
有プライマーから作り出し、PCRの前にUDGとインキュベ
ートした反応物ではアガロースゲル上で産生物をみるこ
とがなかった。別の試験ではUDGが天然型DNAの増幅に影
響を与えないことがわかった。
増幅することができ、アガロースゲル電気泳動法から明
らかなように、デオキシウリジンを含まず、標準HPV16D
NAを増幅により得られた産生物から大きさ上では識別で
きないDNA産生物が得られた。DNAをデオキシウリジン含
有プライマーから作り出し、PCRの前にUDGとインキュベ
ートした反応物ではアガロースゲル上で産生物をみるこ
とがなかった。別の試験ではUDGが天然型DNAの増幅に影
響を与えないことがわかった。
実施例３ シングルデオキシウリジン含有プライマーを使用した増
幅 さらに試験は２種のPCRの１つだけがプライマーエキソ
サンプルヌクレオチドを含む必要があることを示した。
PCR増幅は次のプライマー対を使用して上記記載のよう
に本質的に行った： （１）dT2とdU1、（２）dU2とdT1、（３）dT2とdU1およ
び（４）dU2とdU10全ての組合わせはPCRの第２ラウンド
の前にUDGのあるなしで処置した。増幅（４）はUDGの活
性および汚染を除去する能力を試験したのに対して、増
幅（１）はPCR増幅の成功を試験した。増幅（３）はPCR
の第２ラウンドでUDG処置後実質的に再増幅しないこと
が観察され、それにより必要であるPCRプライマーの１
組のひとつだけがサンプル汚染の効果を減少または除去
するためにエキソサンプルヌクレオチドを含む必要があ
ることが示された。増幅（１）よりも実質的に低レベル
であるが、増幅（２）は再増幅することがみられた。
幅 さらに試験は２種のPCRの１つだけがプライマーエキソ
サンプルヌクレオチドを含む必要があることを示した。
PCR増幅は次のプライマー対を使用して上記記載のよう
に本質的に行った： （１）dT2とdU1、（２）dU2とdT1、（３）dT2とdU1およ
び（４）dU2とdU10全ての組合わせはPCRの第２ラウンド
の前にUDGのあるなしで処置した。増幅（４）はUDGの活
性および汚染を除去する能力を試験したのに対して、増
幅（１）はPCR増幅の成功を試験した。増幅（３）はPCR
の第２ラウンドでUDG処置後実質的に再増幅しないこと
が観察され、それにより必要であるPCRプライマーの１
組のひとつだけがサンプル汚染の効果を減少または除去
するためにエキソサンプルヌクレオチドを含む必要があ
ることが示された。増幅（１）よりも実質的に低レベル
であるが、増幅（２）は再増幅することがみられた。
実施例４ 要約 要約すると、プライマーまたは複数のプライマー中でデ
オキシウリジンを含むPCR増幅産生物はUDGがないときう
まく増幅した。増幅はあらかじめUDGとインキュベート
することにより妨害することができる。言い替えれば、
UDGは、デオキシチミジン含有プライマーで作ったDNAの
増幅に実質的に作用しないがデオキシウリジン含有プラ
イマーで作ったPCR産生物の増幅を実質的に終結させ
た。
オキシウリジンを含むPCR増幅産生物はUDGがないときう
まく増幅した。増幅はあらかじめUDGとインキュベート
することにより妨害することができる。言い替えれば、
UDGは、デオキシチミジン含有プライマーで作ったDNAの
増幅に実質的に作用しないがデオキシウリジン含有プラ
イマーで作ったPCR産生物の増幅を実質的に終結させ
た。
ここでの全参考文献は引用して本明細書に包含させる。
上記は特に好ましい実施例を述べたが、それにより本発
明が制限されるものではないことはいうまでもない。様
々な修飾を、ここに記載した実施態様についてなし得る
が、上記修飾は本発明の範囲内であることが当業者に理
解される。
上記は特に好ましい実施例を述べたが、それにより本発
明が制限されるものではないことはいうまでもない。様
々な修飾を、ここに記載した実施態様についてなし得る
が、上記修飾は本発明の範囲内であることが当業者に理
解される。
この発明によって下記の各事項が可能となる。
（１） ａ）第１サンプルの核酸を増幅し、その際上記増幅は１
種またはそれ以上の特定オリゴヌクレオチドに依存する
ものであり、上記特定オリゴヌクレオチドの少なくとも
１種がエキソサンプルヌクレオチドを含み、 ｂ）上記エキソサンプルヌクレオチドを含む核酸を上記
特定オリゴヌクレオチドに依存する増幅中で実質的に非
増幅性にするが、上記エキソサンプルヌクレオチドを含
まない核酸増幅を実質的に妨害しない処理を第２サンプ
ルの核酸に施す 段階を含み、それにより第２サンプルを汚染している第
１サンプル由来増幅核酸配列が第２サンプルの核酸配列
の特定オリゴヌクレオチド依存増幅の間に実質的にこれ
以上増幅しないようにすることからなる、サンプル中に
１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド依存性核酸を
増幅する方法。
種またはそれ以上の特定オリゴヌクレオチドに依存する
ものであり、上記特定オリゴヌクレオチドの少なくとも
１種がエキソサンプルヌクレオチドを含み、 ｂ）上記エキソサンプルヌクレオチドを含む核酸を上記
特定オリゴヌクレオチドに依存する増幅中で実質的に非
増幅性にするが、上記エキソサンプルヌクレオチドを含
まない核酸増幅を実質的に妨害しない処理を第２サンプ
ルの核酸に施す 段階を含み、それにより第２サンプルを汚染している第
１サンプル由来増幅核酸配列が第２サンプルの核酸配列
の特定オリゴヌクレオチド依存増幅の間に実質的にこれ
以上増幅しないようにすることからなる、サンプル中に
１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド依存性核酸を
増幅する方法。
（２）エキソサンプルヌクレオチドがデオキシウリジン
である１記載の方法。
である１記載の方法。
（３）処理が物理的、化学的、酵素的または生物学的処
理からなる群から選ばれる１記載の方法。
理からなる群から選ばれる１記載の方法。
（４）処理が酵素的処理である３記載の方法。
（５）酵素的処理がウラシルDNAグリコシラーゼ処理で
ある４記載の方法。
ある４記載の方法。
（６）さらに ｃ）第２サンプルの核酸配列を増幅する 段階を含む１記載の方法。
（７）さらに ｄ）段階ｂ）の処理を終結させる 段階を含む１記載の方法。
（８）終結を熱により達成する７記載の方法。
（９）特定オリゴヌクレオチドの少なくとも２種がエキ
ソサンプルヌクレオチドを含む１記載の方法。
ソサンプルヌクレオチドを含む１記載の方法。
（10）増幅が、１種の核酸または核酸の混合物（各核酸
は同じまたは異なった長さの２種の別の相補鎖を含む）
中に含まれる少なくとも１種の特定の核酸配列を増幅す
る方法であり、さらに ｅ）鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列につ
いて、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプライマ
ーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅され
ているそれぞれの異なった特定配列に対する２種のオリ
ゴヌクレオチドプライマーで処理し、上記プライマー
は、それぞれの特定配列の異なった鎖に充分相補的で相
手とハイブリダイズし、その結果１種のプライマーから
合成された延長産生物がその相補体から分離するとき、
他方のプライマーの延長産生物の合成の鋳型として働く
ように選ばれたものであり、 ｆ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｇ）プライマー延長産生物が段階ｆ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合成される条件下にお
いて段階ｅ）のプライマーで段階ｆ）から発生した一本
鎖分子を処理する ことからなる１記載の方法。
は同じまたは異なった長さの２種の別の相補鎖を含む）
中に含まれる少なくとも１種の特定の核酸配列を増幅す
る方法であり、さらに ｅ）鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列につ
いて、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプライマ
ーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅され
ているそれぞれの異なった特定配列に対する２種のオリ
ゴヌクレオチドプライマーで処理し、上記プライマー
は、それぞれの特定配列の異なった鎖に充分相補的で相
手とハイブリダイズし、その結果１種のプライマーから
合成された延長産生物がその相補体から分離するとき、
他方のプライマーの延長産生物の合成の鋳型として働く
ように選ばれたものであり、 ｆ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｇ）プライマー延長産生物が段階ｆ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合成される条件下にお
いて段階ｅ）のプライマーで段階ｆ）から発生した一本
鎖分子を処理する ことからなる１記載の方法。
（11） （Ａ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列
について、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプラ
イマーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅
されているそれぞれの異なった特定配列に対する２種の
オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、少なくともプ
ライマーの１種はエキソサンプルヌクレオチドを含み、
上記プライマーは、それぞれの特定配列の異なった鎖に
充分相補的で相手とハイブリダイズし、その結果１種の
プライマーから合成された延長産生物がその相補体から
分離するとき、他方のプライマーの延長産生物の合成の
鋳型として働くように選ばれたものであり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｃ）プライマー延長産生物が段階ｂ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合成される条件下にお
いて段階ａ）のプライマーで段階ｂ）から発生した上記
一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅
し、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列が第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）エキソサンプルヌクレオチドを含む核酸を上記特定
オリゴヌクレオチドに依存する増幅中で実質的に非増幅
性にするが、上記エキソサンプルヌクレオチドを含まな
い核酸増幅に実質的に作用しない処理を第２サンプルの
核酸に施し、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする 段階からなる１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する
方法。
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列
について、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプラ
イマーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅
されているそれぞれの異なった特定配列に対する２種の
オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、少なくともプ
ライマーの１種はエキソサンプルヌクレオチドを含み、
上記プライマーは、それぞれの特定配列の異なった鎖に
充分相補的で相手とハイブリダイズし、その結果１種の
プライマーから合成された延長産生物がその相補体から
分離するとき、他方のプライマーの延長産生物の合成の
鋳型として働くように選ばれたものであり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｃ）プライマー延長産生物が段階ｂ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合成される条件下にお
いて段階ａ）のプライマーで段階ｂ）から発生した上記
一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅
し、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列が第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）エキソサンプルヌクレオチドを含む核酸を上記特定
オリゴヌクレオチドに依存する増幅中で実質的に非増幅
性にするが、上記エキソサンプルヌクレオチドを含まな
い核酸増幅に実質的に作用しない処理を第２サンプルの
核酸に施し、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする 段階からなる１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する
方法。
（12）エキソサンプルヌクレオチドがデオキシウリジン
である11記載の方法。
である11記載の方法。
（13）段階ａ）の処置が酵素的処置である11記載の方
法。
法。
（14）酵素的処理がウラシルDNAグリコシラーゼ処理で
ある13記載の方法。
ある13記載の方法。
（15）段階（Ｂ）の間に ｆ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第２サンプルに含まれる特異核酸配列の任意の
ものを増幅する 段階を含む11記載の方法。
れにより第２サンプルに含まれる特異核酸配列の任意の
ものを増幅する 段階を含む11記載の方法。
（16）さらに段階（Ｂ）の間に ｇ）段階ｅ）の処置を終結する 段階を含む11記載の方法。
（17）物理的、化学的、酵素的または生物学的処理が熱
により達成される16記載の方法。
により達成される16記載の方法。
（18）少なくともオリゴヌクレオチドプライマーの２種
がエキソサンプルヌクレオチドを含む11記載の方法。
がエキソサンプルヌクレオチドを含む11記載の方法。
（19） （Ａ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列
について、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプラ
イマーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅
されているそれぞれの異なった特定配列に対する２種の
オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、少なくともプ
ライマーの１種はデオキシウリジンを含み、上記プライ
マーは、それぞれの特定配列の異なった鎖に充分相補的
で相手とハイブリダイズし、その結果１種のプライマー
から合成された延長産生物がその相補体から分離すると
き、他方のプライマーの延長産生物の合成の鋳型として
働くように選ばれたものであり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｃ）プライマー延長産生物が段階ｂ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合成される条件下にお
いて段階ａ）のプライマーで段階ｂ）から発生した上記
一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅
し、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列は第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）上記鎖をウラシルDNAグリコシラーゼで処理し、 ｆ）ウラシルDNAグリコシラーゼの鎖上における作用を
熱により終結させ、 ｇ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第２サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅
し、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする 段階からなる１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する
方法。
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列
について、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプラ
イマーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅
されているそれぞれの異なった特定配列に対する２種の
オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、少なくともプ
ライマーの１種はデオキシウリジンを含み、上記プライ
マーは、それぞれの特定配列の異なった鎖に充分相補的
で相手とハイブリダイズし、その結果１種のプライマー
から合成された延長産生物がその相補体から分離すると
き、他方のプライマーの延長産生物の合成の鋳型として
働くように選ばれたものであり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｃ）プライマー延長産生物が段階ｂ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合成される条件下にお
いて段階ａ）のプライマーで段階ｂ）から発生した上記
一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅
し、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列は第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）上記鎖をウラシルDNAグリコシラーゼで処理し、 ｆ）ウラシルDNAグリコシラーゼの鎖上における作用を
熱により終結させ、 ｇ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第２サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅
し、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする 段階からなる１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する
方法。
Claims (3)
- 【請求項１】ａ）第１サンプルの核酸を増幅し、その際
上記増幅は１種またはそれ以上の特定オリゴヌクレオチ
ドに依存するものであり、上記特定オリゴヌクレオチド
の少なくとも１種はデオキシウリジンを含むものである
段階と、 ｂ）上記デオキシウリジンを含む核酸を上記特定オリゴ
ヌクレオチドに依存する増幅中で実質的に非増幅性にす
るが、上記デオキシウリジンを含まない核酸増幅を実質
的に妨害しないウラシルDNAグリコシラーゼによる処理
を第２サンプルの核酸に施す段階 を含み、それにより第２サンプルを汚染している第１サ
ンプル由来増幅核酸配列が第２サンプルの核酸配列の特
定オリゴヌクレオチド依存増幅の間に実質的にこれ以上
増幅しないようにすることからなる、サンプル中で１つ
またはそれ以上の核酸をオリゴヌクレオチド依存性増幅
させる方法。 - 【請求項２】（Ａ）１種の核酸配列または核酸配列混合
物（それぞれの核酸配列は同じまたは異なった長さの２
種の別の相補鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列
について、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプラ
イマーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅
されているそれぞれの異なった特定配列に対する２種の
オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、少なくともプ
ライマーの１種はデオキシウリジンを含み、上記プライ
マーは、それぞれの特定配列の異なった鎖に充分相補的
で相手とハイブリダイズし、その結果１種のプライマー
から合成された延長産生物がその相補体から分離すると
き、他方のプライマーの延長産生物の合成の鋳型として
働くことが出来るように選ばれたものであり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｃ）プライマー延長産生物が段階ｂ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合成される条件下にお
いて段階ａ）のプライマーで段階ｂ）から発生した上記
一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅す
る段階、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列が第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）デオキシウリジンを含む核酸を上記特定オリゴヌク
レオチドに依存する増幅中で実質的に非増幅性にする
が、上記デオキシウリジンを含まない核酸増幅に実質的
に作用しないウラシルDNAグリコシラーゼによる処理を
第２サンプルの核酸に施す段階 を含み、それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプ
ル中に存在する第１サンプルのプライマー延長産生物が
実質的にこれ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする
ことからなる、サンプル中で１つまたはそれ以上の核酸
配列を増幅する方法。 - 【請求項３】（Ａ）１種の核酸配列または核酸配列混合
物（それぞれの核酸配列は同じまたは異なった長さの２
種の別の相補鎖を有する）を含む第１サンプルで、 ａ）上記鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列
について、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプラ
イマーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅
されているそれぞれの異なった特定配列に対する２種の
オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、少なくともプ
ライマーの１種はデオキシウリジンを含み、上記プライ
マーは、それぞれの特定配列の異なった鎖に充分相補的
で相手とハイブリダイズし、その結果１種のプライマー
から合成された延長産生物がその相補体から分離すると
き、他方のプライマーの延長産生物の合成の鋳型として
働くように選ばれたものであり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｃ）プライマー延長産生物が段階ｂ）で製造された一本
鎖のそれぞれを鋳型として使って合成される条件下にお
いて段階ａ）のプライマーで段階ｂ）から発生した上記
一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第１サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅
し、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列は第２サンプル中
に存在することができる）を含む第２サンプルで、 ｅ）上記鎖をウラシルDNAグリコシラーゼで処理し、 ｆ）ウラシルDNAグリコシラーゼの鎖上における作用を
熱により終結させ、 ｇ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
れにより第２サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅
し、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにすることから
なる、サンプル中で１つまたはそれ以上の核酸配列を増
幅する方法。
Applications Claiming Priority (2)
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