CN1306270C - 采用空间定位的分析物繁殖检测和定量样品中的分析物 - Google Patents

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Abstract

通过将样品物质接种到生长培养基来测试该物质(例如生物或环境物质)中一种或多种目的微生物分析物的存在与否。可将培养基与分析物特异性标记材料(LASM)混合，此材料可穿过培养基移动并均匀分布在整个培养基中。LASM可预先与培养基混合，或在接种了所述物质之后再加入到培养基中。待测样品加入到培养基中之后，样品中目的分析物菌落的生长将导致结合的LASM的量逐渐增加，因此在培养基上形成局部强烈标记的区域，可通过目视或光度测定来检测。

Description

采用空间定位的分析物繁殖检测和 定量样品中的分析物
                       技术领域
本发明涉及用于如下目的的装置和方法：通过目视或光度测定来检测样品中一种或多种微生物目的分析物存在与否；当发现存在时，对样品中的分析物进行记数。待分析的材料可能是生物材料；环境材料；食物材料；或可能藏匿目的分析物的其它材料。目的分析物是可能在待测样品中发现的一种或多种特定的活的生物，例如微生物、细菌、真菌、支原体或原生动物；通过适当的生长培养基中一种或多种分析物的新陈代谢繁殖来检测一种或多种分析物存在与否。可以在支持目的分析物选择性生长、但限制样品中可能存在的其它活生物生长的凝胶或半固体生长材料中进行分析。由此，在培养基中形成可检测的目的分析物菌落。可以通过多种技术对菌落进行检测和记数，包括使用可选择性结合到目的分析物某部分的目视或光度测定可检测的材料。
                       背景技术
将样品放在无菌的生长培养基上对样品中目的细菌或其它活的生物(例如真菌和原生动物)的存在与否进行分析是大家所熟知的。通常通过它们的外观、它们与生长或其它培养基的化学反应或采用酶的或免疫学的试剂来鉴别各种细菌。因为不同种的细菌菌落看起来相似，所以通常必须在建立正确的鉴定之前对许多菌落进行许多实验。如果必须区分细菌亚种，例如查明大肠杆菌血清型O157:H7在其它外观上一致的大肠杆菌混合物中的存在，这将尤其成问题。具有专门特性的生长培养基有助于这种生物的快速可视的检测，但是目的生物与背景的关系越紧密，仅采用化学方法来区分它们就越困难。如果能快速而特异地确定这种菌落，尤其如果技术人员不需要其它操作，将是更为理想的。
                       发明内容
本发明涉及检测样品中一种或多种目的微生物分析物存在与否的方法和装置。通过在营养培养基中培养目的分析物以致其在培养基中形成菌落，然后对培养基中可能形成的、任何产生的目的分析物菌落进行检测和记数，来进行目的分析物的检测。
在可能还含有或者混合有一种或多种分析物特异性标记材料(LASMs)的培养基中进行分析。LASMs在整个培养基中均匀分布。LASMs包括一种结合因子，它可以是对目的分析物中或其上的结合位点特异的蛋白质、凝集素或核酸序列。标记可以是与结合因子接的染料或荧光团，包括胶体或颗粒。培养基中的LASMs可以穿过培养基向目的分析物菌落扩散和移动，并且结合到菌落中单个生物上，从而突出菌落与培养基的其余部分的差别。LASMs既可以直接结合到生物表面，也可结合到生物的产物上，例如它的荚膜物质或内在的分子结构，只要如此结合的LASM不会明显离开这个位点。因为LASM的结合局部地损耗目的分析物菌落所占据的培养基区域中LASM的浓度，所以在每个目的分析物菌落的周围将形成较低LASM浓度的“晕环”，在每个晕环的中心将是一个相应于标记菌落的高强度点。培养基中没有任何目的生物存在就将不结合LASMs并显示出这种特征。
将待分析的材料样品接种到培养基中或涂布到培养基上。如果要求定量分析，就应测量样品接种物的体积量。因为生物繁殖，将形成菌落并在培养基中或其上保持一个固定的位置。按大小选择培养基中的LASMs以便能够在培养基中或穿过培养基移动。因此，目的分析物菌落区域中的LASMs穿过培养基自由移动并结合在菌落中的目的生物或它们的产物上。这将导致目的分析物菌落比培养基中周围的区域显示出更强的标记信号。此处的原因是目的生物菌落富集了LASM，而周围区域的LASM也渐渐损耗。培养基中毗连目的生物菌落的紧邻周围区域将趋向于发出减弱的标记信号。最终的结果是培养基中形成“亮”点，其周围环绕着“暗淡的”晕环。如果样品中没有目的分析物存在，培养基将保持一个相对均匀水平的标记信号发射，似乎是平均“上色”的。
如果使用灵敏的光学机械光度测定读出器(opto-mechanicalphotometric reader)，例如1999年2月提交的共同未决申请USSN09/255,673中所描述的，可在将样品接种培养基后1到2小时之内完成测定，如果使用目视检查，可在大约18小时之内完成。因为已知接种到或涂布到培养基上的样品体积，通过对培养基中加亮的菌落数进行记数，可以确定每单位体积标本样品中目的分析物的数量。这使得使用本发明可以获得目的分析物的定量分析。可以将一部分含有LASM的培养基不接种样品，这样使得这部分培养基可作为阴性对照。一些样品，尤其是那些采自“肮脏”来源的，例如环境样品或那些含有大量其它材料的样品，可能含有许多具有一定水平非特异信号的颗粒或其它材料，并且这些非特异的信号可能会与目的分析物所产生的信号混淆。但是可以通过目视或光度测定获得培养基中相同区域的连续图像来解决这一问题，这些图像彼此相隔适当的时间区段。由于目的生物的连续生长，只有那些目的生物形成的菌落的信号强度会增加。连续图像的比较，优选使用数字图像处理来进行，可以将强度增加的这些区域与周围的培养基区分开来。这种动力学分析的方法在可获得合适的光度测定读出装置的任何情况下都是优选的，因为这种技术将提供完成此分析最高的灵敏度、最好的选择性和最短的时间。
为了达到最大的信号/噪声比，可使培养基尽可能薄，例如大约1毫米或更薄，优选小于约0.5毫米。标记的浓度应当使它发出的信号正好可从培养基的非接种区得到检测。对于目视检测，有用的信号是在合适的照明条件下用裸眼可些微辨认、而且不那么明显以免使得菌落信号变得模糊的信号。对于自动检测，应该控制浓度达到相对于“黑暗”背景具有一个适当的信号/噪声比的强度，这样将容许定量。确切的量必须基于所使用仪器的光度测定特性来确定。对于光度测定分析方案，可以使用荧光团，例如荧光素、硫罗丹明(sulforhodamine)、以及Cy-3、Cy-5和Cy-7作为标记。应当指出，如果能够区别针对每个目标的LASMs标记，例如能通过LASMs显示的颜色、和/或发射的光波来区别，则使用本方法可以检测两种或多种目的生物。
因此，本发明的目的是提供能够用于测试标本样品中目的分析物存在与否的方法和装备。
本发明的另一个目的是提供具有所描述性质的方法和装备，其中将样品放于混合有能够在培养基中迁移的、对目的分析物特异的标记材料的培养基上。
本发明的另一个目的是提供具有所描述性质的方法和装备，其中目的分析物是活的生物。
本发明的另一个目的是提供具有所描述性质的方法和装备，其中在同一培养基上能够检测两种或多种目的分析物。
本发明另外的目的是提供具有所描述性质的方法和装备，其中通过在培养基中生长目的分析物菌落，并由此在目的分析物的菌落中产生局部浓度逐渐增加的分析物特异性标记材料，来检测目的分析物。
当与附图联合起来理解时，从以下本发明的详述中，将更加容易明确本发明的这些或其它目的和优点，其中
                        附图简述
图1是依照本发明所形成的目的分析物特异的标记材料与目的分析物生长培养基混合物的平面视图；
图2和3是与图1相似的平面视图，但显示了由于待测试样品中存在目的分析物，在混合物中各种程度的局部强烈标记区域的形成；以及
图4是采用光度测定的光发射信号检测仪器扫描得到的样品所发射的信号强度水平，或者目视所观察的信号强度水平的象形曲线图。
                实施本发明的详细实施例
现在参考图1，显示通常用数字2表示的、适合实施本发明方法的培养基矩形部分的平面视图。图1显示的培养基区域被均匀地加上阴影以表示在将样品接种到培养基中之前或当样品中没有目的分析物存在时接种样品和孵育之后，通过人眼或通过扫描仪器将检测到的均匀分布的标记信号发射。培养基2的3区是不接种待测样品的区域，但它含有样品中所使用的所有试剂，因此可作为一个阴性对照区。图2和3举例说明当样品中存有目的分析物时，培养基2中标记发射水平所得的变化。图2表示样品中目的分析物水平相对较低的结果，在培养基2中产生许多较为强烈标记的菌落4，其周围是较低水平标记的晕环6。图3表示样品中含有相对高水平目的分析物时的结果。应当指出根据图2和3可以将菌落4记数，而且因为可以知道样品接种物的体积和培养基2的区域大小，通过以下本发明的程序可以得到每单位样品体积中分析物的浓度。图4是自动分析仪器对培养基进行线性扫描所检测的标记发射强度的象形曲线图。迹线8表示培养基中标记的发射水平。下降10表示“暗淡的”晕环6发出的低水平标记信号发射；峰12表示“明亮的”菌落4发出的高水平标记信号发射。
以下是利用本发明的技术能够检测的目的分析物和检测每个分析物所用试剂的实例。
                        实施例1
在从食物或环境来源检测大肠杆菌O157:H7的情况下，通过将荧光团，例如荧光素或Texas红与对O157:H7生物特异的抗体共价结合获得LASM。将LASM与生长培养基例如Muller-Hinton琼脂、MacConkey’sSorbital培养基等等混合，以便达到在适当波长光的照射下可见，或通过成像系统能够容易测量的足够LASM浓度。在目视检测的情况下，优选荧光素作为标记。当使用光度测定分析方案时，标记可以是硫罗丹明标记、或Cy-3、Cy-5或是Cy-7标记，后者的Cy标记发出红光、或接近红外线的波长的信号，虽然人眼无法观察到，但可以通过光度测定来检测。
在平皿中倒入优选厚度为0.5毫米的适用于仪器检测形式的培养基/LASM混合物；或倒入大约厚度为1.0毫米的混合物层以适用于目视检测形式。如果样品是临床来源的，可将它直接平板接种到培养基上。如果样品是食物来源的，将优选将食物源分散在无菌溶液中，然后过滤去除掉样品中可见的颗粒物质。环境来源的样品可采用与食物来源样品同样的方法处理。将样品在大约35℃的温度下孵育后，按照以上所描述的对平板接种的样品进行定期检测。对怀疑只含有少量生物的样品，可通过如过滤大量的待测样品，然后将滤膜放在培养基上来进行浓缩。因为滤膜是定义具有透性的，所以LASMs可穿过滤膜并附着到生长的生物上，就象该生物本身在培养基表面生长一样。
                     实施例2
在从例如乳酪样品中检测单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的情况下，优选按照以上的实施例1进行分析，除了通过将荧光团或其它染料与对此利斯特氏菌属生物特异的抗体共价结合来获得LASMs。将LASM与生长培养基例如Esculin-基础革兰氏阳性选择性琼脂(Esculin-based gram positive selective agar)混合。将待分析的样品接种到培养基上之后，将平板在35℃下孵育。然后按照以上所描述的对平板进行定期目视或光度测定上的检测。
                     实施例3
在从例如来自食物、水或临床的样品检测伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)的情况下，优选按照以上的实施例1进行分析，除了通过将荧光团或其它染料与对伤寒沙门氏菌生物特异的的抗体共价结合来获得LASM。将LASM与生长培养基例如亚硫酸铋琼脂或Hektoen肠琼脂(Hektoen enteric agar)混合。在将待分析的样品接种到培养基之上或之中后，将平板在35℃下孵育。然后按照以上所描述的对平板进行定期目视或光度测定上的检测。
                     实施例3
在从临床样品中检测白假丝酵母(Candida albicans)的情况下，优选按照以上的实施例1进行分析，除了通过将荧光团或其它染料与对白假丝酵母生物特异的抗体或凝集素共价结合来获得LASM。将LASM与生长培养基例如Sabouraud氏葡糖琼脂(Sabouraud’s dextrous agar)培养基混合。将待分析的样品接种到培养基上之后，将平板在35℃下孵育。然后按照以上所描述的对平板进行定期目视或光度测定上的检测。
应当很容易理解，以上所描述的方法和装置可以用来检测可能存在于待分析样品中的多种微生物的存在与否。可在生长培养基上形成的强烈标记的目的微生物菌落周围出现局部微弱标记的晕环，使得可进行目视或光度测定上的检测，并将在培养基上形成的任何目的微生物菌落记数。使用具有选择性质的培养基可促进目的微生物菌落的生长并抑制非目的微生物菌落的生长。可使用此技术通过形成菌落的简单记数以及接种到培养基上或其中的样品体积的记录来评价样品中目的微生物的浓度。从培养基相同区域顺序读数以便检测局部LASM浓度的变化，而此变化与目的分析物的生长相关。
因为在不违背发明概念的情况下，可在本发明的公开实施方案中进行许多改变和变化，故其并不旨在用来限制附及权利要求所要求保护的本发明。

Claims (26)

1.一种用于在怀疑含有目的微生物分析物的材料样品中通过目视或光度测定检测一种或多种目的活微生物分析物的装置，该装置包含：
a)样品容器；
b)该样品容器中的生长支持培养基，该生长支持培养基可限制该培养基中所形成的目的微生物分析物菌落在培养基中的迁移；和
c)一种或多种均匀分布在整个该生长支持培养基中的分析物特异性标记材料(LASM(s))，所述的LASM(s)能够在该生长支持培养基中向着在该生长支持培养基中或上形成的目的微生物分析物菌落移动，并且，所述的LASM(s)是标记的抗体或标记的凝集素。
2.权利要求1的装置，其中所述的生长支持培养基可促进在该生长支持培养基内或上目的分析物微生物菌落的形成并抑制非目的分析物微生物菌落的形成。
3.权利要求1的装置，其中所述的目的微生物分析物包括大肠杆菌0157:H7；所述的LASM(s)包括与敏感标记偶联的大肠杆菌0157:H7特异性抗体；所述的生长支持培养基是选自Muller-Hinton琼脂Kirby-Bauer培养基、MacConkey’s Sorbital培养基的生长支持培养基。
4.权利要求3的装置，其中所述的敏感标记选自荧光团、Cy-3、Cy-5和Cy-7。
5.权利要求4的装置，其中所述的标记是硫罗丹明。
6.权利要求4的装置，其中所述的标记是荧光素。
7.权利要求1的装置，其中所述的目的微生物分析物包括单核细胞增生利斯特氏菌；所述的LASM(s)包括与敏感标记偶联的单核细胞增生利斯特氏菌特异性抗体；且所述的生长支持培养基是Esculin-基础革兰氏阳性选择性琼脂。
8.权利要求7的装置，其中所述的敏感标记是荧光团。
9.权利要求8的装置，其中所述的荧光团是硫罗丹明。
10.权利要求8的装置，其中所述的荧光团是荧光素。
11.权利要求1的装置，其中所述的目的微生物分析物包括伤寒沙门氏菌；所述的LASM(s)包括与敏感标记偶联的伤寒沙门氏菌特异性抗体；且所述的生长支持培养基是一种选自亚硫酸铋琼脂和Hektoen肠琼脂的琼脂培养基。
12.权利要求11的装置，其中所述的敏感标记是荧光团。
13.权利要求12的装置，其中所述的荧光团是硫罗丹明。
14.权利要求12的装置，其中所述的荧光团是荧光素。
15.权利要求1的装置，其中所述的目的微生物分析物包括白假丝酵母；所述的LASM(s)包括与敏感标记结合的白假丝酵母特异性抗体或凝集素；且所述的生长支持培养基选自Muller-Hinton琼脂Kirby-Bauer培养基。
16.权利要求15的装置，其中所述的敏感标记是荧光团。
17.权利要求16的装置，其中所述的荧光团是硫罗丹明。
18.权利要求16的装置，其中所述的荧光团是荧光素。
19.权利要求1的装置，用于通过光度测定来检测一种或多种目的微生物分析物，其中所述分析物特异性标记材料包括选自硫罗丹明、Cy-3、Cy-5和Cy-7的光度测定敏感的标记。
20.权利要求19的装置，其中所述的生长支持培养基可促进在该生长支持培养基内或上目的分析物微生物菌落的形成，并抑制非目的分析物微生物菌落的形成。
21.权利要求19的装置，其中所述的LASM(s)包括选自Cy-3、Cy-5和Cy-7的光度测定敏感的标记。
22.一种用于在怀疑含有目的微生物分析物的材料样品中通过光度测定来检测一种或多种目的活微生物分析物的方法，该方法包括：
a)提供样品容器的步骤；
b)提供该样品容器中的生长支持培养基的步骤，该生长支持培养基可限制该培养基中所形成的目的微生物分析物菌落在培养基中的迁移；
c)提供一种或多种均匀分布在整个该生长支持培养基中的分析物特异性标记材料(LASM(s))的步骤，所述的LASM(s)是光度测定上可检测的，并能够在该生长支持培养基中向着在该生长支持培养基中或上形成的目的微生物分析物菌落移动，并且所述的LASM(s)是标记的抗体或标记的凝集素；
d)在该生长支持培养基上或其中接种待分析材料的步骤；以及
e)光度测定扫描所接种的培养基以检测强烈标记的目的分析物菌落存在与否的步骤。
23.权利要求22的方法，其中所述的生长支持培养基可促进在该生长支持培养基内或上目的分析物微生物菌落的形成，并抑制非目的分析物微生物菌落的形成。
24.权利要求22的方法，其中所述的LASM(s)包括选自Cy-3、Cy-5和Cy-7的光度测定敏感的标记。
25.权利要求22的方法，其中所述的强烈标记的目的分析物菌落周围是该培养基中暗淡标记的晕环。
26.权利要求22的方法，其中从该培养基相同区域顺序读数以便检测局部LASM浓度的变化，此变化与目的分析物的生长相关。
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