CN1367259A - 微生物群体及其生长的快速测定 - Google Patents

Abstract

本发明阐述一种用于快速测定微生物群体及其生长的方法。含有微生物的样本被接种于粘稠液体培养基中,然后在培养的过程中进行显微镜观察。液体培养基粘稠度的增加帮助生于同一母亲细胞的子代细胞呆在一起而形成微菌落。通过比较不同培养时间总细胞数和微菌落数,微生物群体的数目、群体生长的速度、以及活的并可生殖的微生物的比例可在同一测试中得知。

Description

微生物群体及其生长的快速测定

本发明涉及一种快速测定微生物群体及其生长的方法。

现有的测定微生物群体及其生长的方法可规纳为两大类：(1)直接计数微生物细胞数；(2)从其它与微生物细胞数目相关的测定间接估算微生物细胞数(详见P.Gerhardt等编1994年美国微生物学会于美国华盛顿特区出版的专著《普通和分子细菌学手册》，以下仅选每一类型的常用的方法作为代表加以简述并指出各自的优缺点)。

直接计数微生物细胞的方法分为两种：不经过培养的即时计数和经过培养的延迟计数。即时计数包括显微镜计数、电子计数和流动细胞仪计数。显微镜计数包括对放在计数室内未染色的微生物用相差显微技术进行计数，或对阻留在滤膜上的微生物染色后进行莹光显微计数，如吖定橙染色计数。电子计数使用不同的颗粒计数装置。流动细胞仪已被用于对未染色微生物或已染色的微生物进行计数。延迟计数包括平板计数菌落形成单位和液体系列稀释法测定最可能数。

对微生物群体的间接测定可以建立在所有微生物都共有的一些生物质指标之上。这些指标包括干重，蛋白质浓度，核酸浓度和总氮量。对微生物群体的间接测定也可以建立在某一组微生物所特有的生物质指标上。例如，辅酶M的数量可作为估计甲烷菌数目的指标。对微生物群体的间接测定还可以建立在微生物的代谢活动之上。首先，许多酶的活性水平可被测定。其次，基底物质被消耗的数量和速率可被测定。再者，产物生成的数量和速率可被测定。对微生物群体的间接测定还可进一步地建立在对培养物整体理化特性的测定之上。常用的理化特性指标包括混浊度/透明度、电阻性/电导性、发光度和莹光度。

生物的生长通常是指个体在所有生化组成成份上有序的增长。但由于微生物个体太小而且跟踪个体太困难，对微生物的生长通常不是建立在对个体的测量而是对群体的测量之上。从生物学的角度和从哲学的角度看，个体生长和群体生长是不同的。但在常规微生物学中这个差别往往被忽视。事实上，所有的微生物学教科书都把微生物群体生长作为微生物生长的同义词看待。从人类实用的观点来看，对微生物群体生长的测定比对微生物个体生长的测量更为重要。这是因为任一显著的微生物作用要发生或被发现的话，都需要有一定数量的微生物群体作基础。

微生物群体的生长是由于微生物的生殖，或者更通俗地讲是微生物的分裂或繁殖。因此，在不同时间对细胞数目进行计数是最为直接和准确的确定微生物群体生长的方式。由于细胞数目的增加通常导致生物质(总的细胞质量或特别细胞成份)和/或微生物群体活性的增加，对生物质和生物活性的测定也被用作一种间接反映细胞群体生长的方法。微生物群体的生长还可导致培养物理化特性上的不同改变。因此，测定诸如光学透明度、电子通导性、化学pH等大体指标也可反应微生物群体的生长伏态。

总的来讲，即时细胞计数允许对微生物群体及其生长进行快速测定。用显微镜进行即时计数具有高度的特异性。因为可轻而易举地将微生物与其它非微生物颗粒分别开来。但由于需要一定细胞密度(通常为每毫升百万以上细胞)，所以即时显微计数敏感度较低。显微镜计数由于微生物分布不均和采样容量的变异而具有精确度较低之缺点。显微计数的更严重的缺点是在现行的条件下执行起来非常乏味和消耗人力。当人力有限的时候，这种冗长的操作意味着在完成分析方面会有显著的拖延。电子计数省力省时，但它并不特异(不管是否为微生物，只要是颗粒就被数进去)。电子计数也不敏感(通常只在每毫升百万细胞以上才可检测)。电子计数装置的正确性受细胞大小和形状的影响较大，许多电子计数装置并不适合诸如细菌等较小的微生物。电子计数设备的昂贵也限制其广泛应用。流动细胞仪可通过特异性标记细胞而显著地增加细胞数目测定的特异性，并且测定速度非常之快和具有较广的敏感度范围。此法具有很高的正确性、精确性和分辨率。但由于需要较长的训练和花费很多的钱购买仪器和维持仪器，因此不便于普通实验室应用。

延迟的细胞计数方法如菌落形成单位计数和最可能数测定具有很高的特异性和敏感性，同时也具有正确性、精确性和很高的分辨率。使用起来较为方便和便宜。这一方法只报告具有繁殖能力的微生物，这一点可以是一个有用的特点。因为最终只有那些能繁殖的微生物对微生物群体的生长和产生不同效应有重要意义。然而，为了等肉眼可见的菌落形成或较高混浊度的最可能数管出现，这一方法具有拖延时间较长这一显著的缺点。视微生物繁殖的快慢而定，这一拖延可以是半天也可是数周。需培养才能进行微生物群体测定的方法的另一问题是很多微生物生长所需的适合条件(培养基类型和生长环境)尚不知道。此外，活的但不生殖的微生物是不能由这些方法计数的。然而现有研究表明活的但不生殖的微生物在自然界大量存在并发挥重要作用。

对细胞成份的测量通常不太敏感。由于这些方法需要大量的微生物细胞，这些方法对测量低细胞密度的微生物群体并不适宜。这些方法的分辨率较低，因而也不适合报告较小程度的微生物群体生长。这些缺点在干重测量上表现得尤为突出。干重测量还耗费时间。此外，细胞成份的增加并不总是与微生物细胞教目的增加成比例。这是因为一个微生物细胞的组成成份在不同的生长条件下会有很大不同。例如，在营养丰富的培养基中生长的微生物含有蛋白质的量就高于在营养差的培养基中所生长的微生物含有蛋白质的量。

对代谢活动和基质消耗/产物形成的测量需要特别的试剂和仪器。这些指标与微生物群体大小间的关系也不总是十分了然。视生长条件的不同，完全有可能出现同一数目的微生物群体表现不同的活性水平。此外，代谢活性的测量不能区分活性来自活的细胞还是死的细胞或细胞碎片。许多测量活性的方法需要特别试剂和仪器而不适合常规应用。

对大体特性如混浊度的测量是一常用的测定微生物群体密度和生长状态的方法。这些测量容易进行而且很快就出结果。但是这些方法的敏感性和特异性较低。这些方法不适合测量群体密度较低时的早期的微生物群体生长。这些方法易受培养基中非生物因素变化的影响，因为这些大体特征反映的是存在于液体中的所有颗粒，不管此颗粒是微生物还不是微生物，也不管此微生物是活的还是死的。

需要指出的是，生物质/生物活性和细胞数目的变化可以是同时发生的，也可以是各自独立的。许多生物和环境的因素以不同的方式影响生物质/细胞活性的关系，因此间接方法都需要校准才可将其测定指标转换成有效的细胞数目。这种校准往往要求对所测微生物有一定的了解，而且这种校准只在一定条件下准确。以微生物培养物之大体特征为基础的间接测定也需要校准。因此，尽管基于生物质、生物活性和培养物特性的间接测量法可被用来指示微生物群体及其生长状态，这些方法单独使用并不能显示微生物群体的绝对数目。

还需要指出的是菌落形成单位和最可能教的测定由于能反映群体中生殖细胞(所谓的“活细胞”)而较其它方法有优越性。其它方法计数所有细胞，不管细胞是活而有生殖力的、活而无生殖力的，或是垂死的和已死的。因为最终只有可生殖的细胞参与微生物群体的生长并且显著地影响各种微生物的过程，所以测定可生殖的微生物比测定不生殖的微生物更为重要。正因为如此，菌落形成单位和最可能数的测定一直是主要和标准的计数微生物群体和其生长的方法。

然而，按现行的方法用菌落形成单位和最可能数法测定微生物群体及其生长状态需拖延较长时间才能报告结果。但节省测定微生物群体及其生长上所花的时间非常重要和关键。这是因为，在等待测试样本中的微生物繁殖到可检测水平的同时，这些微生物也在样本所取之处生殖。在很多情况下，这些地方对我们和我们的环境具有重要意义。例如，被微生物感染的人体或被微生物污染的饮用水和食品。因此，长期以来大家都在努力寻找方法能加速测定微生物群体及生长。

近来已有不少努力试图从以下两种途径来缩短测定微生物群体及其生长所需要的时间。一是减少在制备培养基方面所花的时间；二是缩短检测微生物生长所要的时间。从第一个途径的努力结果来看，已有许多预先分装好的即时可用的脱水培养基可被使用，最近的例子包括授予Hansen等人的第4565783号美国专利。然而，即使使用这些预备好的培养基，现行的方法仍然要等待较长的时间才能检测微生物的生长。这是因为，只要对微生物生长的检测是基于传统的标准，即琼脂平板上肉眼可见的大菌落或肉汤最可能数管中可测定的混浊度，那么改进方法在加快检测速度上是有限制的。这种限制是由微生物生物特性和所用标准本身所决定的。一个简单的数学计算表明至少需要10个生殖周期才能由一个1立方微米的细菌形成一个1立方毫米的菌落。对于所谓的“快速生长”细菌如大肠杆菌，这意味着至少要等待200分钟(假设平均生殖周期是20分钟)才可检查到大菌落。对于那些“慢速生长”的微生物来讲，这种时间上的耽搁就更长。例如，结核分枝杆菌通常要数周才可在平板上长出肉眼可见的菌落。

另有一些革新寻求大菌落或混浊度以外的微生物特性来早期检测微生物的生长，这些方法通常依赖于对指定待测微生物有特异性的生化试验。例如，授予Strenkoski等的第5843699号美国专利描述一种使用一组对待测微生物有特异性的生化试验来快速检查待测微生物。授予Mach等的第5723308号美国专利描述为快速计数大肠杆菌而特制的一种培养基。另外一种途径是使用针对一定分类学范围内之微生物的特异性探针如核昔酸序列对待测微生物的存在进行早期检测。一种常用的探针是针对核糖体RNA基因，如授予Stanbridge等人的人第5851767号美国专利所示。然而，这些早期检测微生物生长的替代方法需要对待测微生物有一定的知识。其所用生化试剂和分子探针的特异性也限制其广泛使用。除此以外，这些方法涉及额外而复杂的步骤，因而不适合普通实验室常规使用。

如果菌落的形成在早期微小的阶段，即仅含几个子代细胞的微菌落的时侯，就可检测到的话，就可极大地缩短测定微生物群体生长所要的时间。Bayne-Jones和Adolph等的研究(1933年发表于《细胞此较生理学杂志》(J.Cell.Comp.Physiol.)第二卷329-348页)已报告在固体培养基玻片培养中观察到微菌落的形成。Postgate等的研究(1961年发表于《普通微生物学杂志》(J.Gen.Microbiol.)第24期15-24页)显示使用固体培养基的玻片培养可以用来计数微生物并区分“活的”(实为活的并且可生殖的)和“死的”(实际上也包括活的但不能生殖的)微生物。近来的一些革新对传统的玻片培养作了进一步改进。例如，授予Hill的5417576号美国专利披露一种容器用作对固体培养基中的微生物进行原位的显微镜观察。美国专利第5770441号描述一种方法，装置和套合用于培养和鉴定生长在含有预制培养基的玻片小室之中的微生物如真菌。然而，由于现有的玻片培养法仍有下述不同的缺点，因而尚未有实际意义的应用。这些缺点包括：

(a)很难往一很小的固体培养基表面接种起始微生物群体。

(b)很难将接种物中聚集成堆的微生物打散成均匀分布的单细胞初始群体。

(c)可观察的表面大小有限。

(d)很难在很小的容器中准备固体培养基。

(e)较难在较长培养时间内保持少量固体培养基的理想理化特征。

(f)不便于往固体培养基中添加额外物质。

(g)不便于在固体培养基中进行附加的反应和试验。

本发明的目的是克服现有玻片培养法在测定微生物群体及其生长上所具有的缺点而使其成为一种有用且好用的快速测定微生物群体和生长的方法。

本发明的目的是通过如下措施来达到：使用粘稠的液体培养基来培养微生物，通过对不同时间计数的微生物的个体总数和微菌落数来判断原始测试样本中微生物的总数及可生殖的微生物的数目。

与常规方法和其它改良方法相比，本发明克服了常规液体培养基和固体培养基各自的缺点，而又结合了两者的优点。这些优点特别对解决上述已知玻片培养中所存技术问题有重大意义，并可在以下的描述中见到。

(a)往液体培养基中接种微生物比往固体培养基中接种微生物要容易的多，尤其是当培养基是

盛在很小的容器中的时候。

(b)要想在固体培养基上创造均匀的接种是很困难或者是不可能的。然而，在粘稠液体培养基中创造均匀的微生物分布是轻而易举之事。

(c)与往固体培养基上涂抹接种物相比，通过充分地混合接种物和粘稠培养基更可能获得呈单一细胞的初始微生物群体。

(d)相对于同体积的固体培养基而言，更多的微生物可被接种于液体培养基中。

(e)在粘稠液体培养基中，对微生物群体及其生长的计数可在更多的聚集平面进行，而固体培养基仅表面一层可用作观察计数。

(f)粘稠液体培养基较固体培养基更为便于操作。

(g)微生物在粘绸液体培养基中的成像效果较在固体培养基上好。

(h)同固体培养基相比，粘绸液体培养基能较长时间地保持其初始的理化状态。

(i)往粘稠的液体培养基中添加其它物质是很容易的。

(j)对悬浮于粘稠液体培养基中的微生物进行额外的实验比对粘附在固体培养基表面的微生物要容易。

本发明所提供的方法包括以下基本步骤：

(a)制备一种粘稠的液体培养基，

(b)接种微生物样本于粘稠培养基之中，

(c)培养已接种的粘稠液体培养物，

(d)在不同的培养时间观察粘稠的液体培养物，

(e)对不同培养时间的观察结果进行记录和比较。

不言而喻，上述各步骤单项地讲都是熟知的技术，任何一个在本行业有常规技能的人都能理解和进行上述操作。但是，将上述各项步骤结合在一个方法中使用，使得本发明具有新颖性、特别性和强大的功能。为了更好地利用上述步骤进行快速测定微生物群体和其生长，下面将本发明中各步的不同操作方式进行举例说明。这些例子也被用于各种不同方式的组合，而不应看作对本发明范围的特别限制。

(a)粘稠物质的选择和粘稠培养基的制备

常规的微生物玻片培养经常使用固化剂如琼脂来制备培养基，以固定微生物于同一位置而方便连续的显微镜检查。然而，使用固体培养基于显微镜培养有一主要缺点，很难做到微生物接种的均匀分布。这对使用固体培养基来作微生物群体的计数来讲创造了一个难题，因为微生物群体分布非常的不均一。本发明通过使用粘稠物质而克服了这一技术难题。粘稠物质可以限制微生物的快速运动，但又保持培养基的液态特征以便最初接种时进行混合。

液体培养基的粘稠度增加至一定程度就可极大地减少微生物被动的布朗运动和主动的游动。这一现象早就已知(见W.R.Schneider和R.N.Doetsch 1974年发表于《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)第117卷696-701页的论文)。本发明者的研究显示完全可以在粘稠液体培养基内对同一细菌进行长期观察(对大肠杆菌而言，长达6小时不成问题)直到一定大小的微菌落形成(见S.V.Liu 1999年发表于《中国科学》(Sci.in China)第42卷644-654页的论文)。这样，从理论上来讲，完全有可能对悬浮在粘稠液体培养基内的微生物群体进行计数并观察其在培养基中的生长。

基于以前的研究，一系列化学物质被认定为粘稠物质，其中包括聚乙烯毗咯烷酮、甲基纤维糖、明胶、角叉藻聚糖和葡聚糖。在应用粘稠物质制备用于测定微生物群体及其生长的粘稠液体培养基时，粘稠物质的最终浓度应当调整为能使粘稠培养基有效地限制微生物的快速运动但又不妨碍微菌落形成的程度。由于某些具有较强游动功能的微生物较游动力较差或无游动力的微生物需要更高的粘稠剂浓度，对合适的粘稠度浓度的选择或许要通过预试验来决定。对聚乙烯毗咯烷酮(PVP-360)而言，研究结果表明3％的最终浓度可以有效地限制大肠杆菌的运动而又允许微菌落的形成(见S.V.Liu 1999年发表于《中国科学》(Sci.in China)第42卷644-654页的论文)。

粘稠物质可以是加入未接种的空白培养基中，也可以是加入已接种的培养物中，还可以是加入到接种物中然后一起接种培养基。

(b)推荐使用的培养装置

任何常规的容器都可用来悬浮微生物样本于粘稠的液体培养基中和对接种的培养物进行培养。然而，为了便于显微镜观察和保持微菌落中个体微生物间的脆弱联系，推荐对微生物的培养和检查最好是用同一容器进行。最理想的是培养装置的大小和形状能适合于直接放在常规显微镜的物镜和聚集镜之间。整个装置或者至少培养室的顶部和底部应当由诸如玻璃和塑料的透明材料制成。

(c)推荐使用的显微观察方法

对悬液/培养物中单个细胞和微菌落的计数可由操作人员手工进行或使用特别设计的计算机软件自动进行。为了测定的准确，悬液/培养物的几个不同地区应当接受检查，以使所得的细胞和微菌落的平均密度更准确地反映培养物的真实情况。检查可以是基于显微镜目镜的即时观察，也可以是基于对记录图象在离开显微镜的情况下进行检查。

对不同时间的显微图象进行比较可以显示微生物群体是否有变化和生长速度有多快。微菌落的数目应当反映最初接种物所含的能生殖的微生物。将微菌落的数目除以开始时就存在于悬液/培养物中的总的细胞数，就可得知活的并且可生殖的微生物的部分。通过测量随时间而增长的总的细胞数(包括自由的细胞和聚集在微菌落中的细胞)，生长速率(群体倍增时间)就可获得。

限制玻片培养法应用的一个主要原因是缺乏方便和经济的手段以记录显微图象和缺乏自动化的手段计数与比较图象中的微生物细胞。然而，随着计算机硬件和软件的发展，现在对大量的显微图象进行便于提取的记录已较若干年前方便和便宜得多。现在也完全可能发展计算机软件以实现图象分析的全部自动化。

Claims (10)

1.一种用于快速测定微生物群体及其生长的方法，包括以下手段：

(a)接种微生物于含指定成份容于指定容器内的粘稠液体培养基之中，

(b)在指定条件下培养微生物，

(c)用指定的过程对微生物培养物的不同区域进行图象记录，

(d)用指定的过程对微生物培养物的变化进行测定。

2.权力要求1所指粘稠液培养基包括一定的粘稠物质以指定的数量存在。

3.权力要求2所指粘稠物质可选自下列一组物质包括聚乙烯毗咯烷酮、甲基纤维糖和明胶。

4.权力要求1所述容器，由一均匀深度的小室组成，包含一平整的由透明材料制成的顶部和底部，其大小和形状适合直接用于显微镜观察。

5.权力要求1所指生长微生物的手段包括在显微镜载物台上进行生长和在显微镜以外的地方生长。

6.权力要求1所述观察微生物的方法包括用人的肉眼进行显微镜观察和用图象记录装置进行观察。

7.权力要求6所指图象记录装置包括用于显微照相、显微录像、显微电影、和数码成像的仪器。

8.权力要求1指测定微生物数量与分布变化的方法包括比较两个或两个以上时间点的显微观察结果。

9.权力要求8所述的分布变化包括微菌落的形成。

10.权力要求8所指的对显微观察的比较方法包括人工检查和自动图象分析。