CN1321773A - 生长变更剂对微生物菌落影响的确定方法 - Google Patents

生长变更剂对微生物菌落影响的确定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1321773A
CN1321773A CN01117809A CN01117809A CN1321773A CN 1321773 A CN1321773 A CN 1321773A CN 01117809 A CN01117809 A CN 01117809A CN 01117809 A CN01117809 A CN 01117809A CN 1321773 A CN1321773 A CN 1321773A
Authority
CN
China
Prior art keywords
colony
growth
changing agent
microbe
forming unit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN01117809A
Other languages
English (en)
Inventor
斯蒂芬·C·沃德罗
罗伯特·A·利费恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WODROW PARTNERSHIP Inc
Original Assignee
WODROW PARTNERSHIP Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by WODROW PARTNERSHIP Inc filed Critical WODROW PARTNERSHIP Inc
Publication of CN1321773A publication Critical patent/CN1321773A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种生长变更剂对一种或多种微生物菌落影响的确定方法。该方法采用将生长变更剂混合进生长培养基的至少一部分,并包括以下步骤:(a)以可能使菌落形成单位复制成微生物菌落的方式培养菌落形成单位;(b)用接种物对生长培养基接种,所述的接种物具有一种或多种有活力的菌落形成单位;(c)量化暴露于生长变更剂的一种或多种单个微生物菌落的一个或多个特性;和(d)评估量化的特性以确定生长变更剂对单个微生物菌落的影响。

Description

生长变更剂对微生物菌落影响的确定方法
一般地，本发明涉及生长变更剂对生物样品中的一种或多种微生物影响的确定方法，具体地说，涉及生长变更剂对生物样品中的独立的微生物菌落影响的确定方法。
对病人有效的治疗经常需要对生物样品中的微生物进行鉴别，和确定这些微生物对生长变更剂的敏感度。历来，人们制备生物样品并将其应用于或添加到微生物生长培养基(称为“培养物”)中，接着主要进行基于肉眼的检查和测试。在大多数常规测试中，用病人的样品接种合适的生长培养基，且接着培养，直至出现可见的微生物生长迹象。大多数生物需要至少18至24小时的培养期，用以形成可见的菌落。独立的菌落开始为单个或一小簇用显微镜可见的细胞或活的单位(总称为菌落形成单位或CFU)，它们被包含于接种物中。在最初的迟滞期之后，有活力的微生物以指数增长：在一代中一个细胞增长成两个细胞，在三代中增长到八个细胞，在六代中增长到64个细胞，直至产生肉眼可见的菌落，所述的迟滞期是指生物体由于其自身适应新环境和新的历程几乎不生长或没有生长的时期。
如果接种物包含许多不同的微生物，每种微生物将形成其特有的菌落，能够或不能够从彼此之间被辨别出来。然而对于大多数目的，在生物体生长中只有单独一种微生物存在是理想的。例如，某人想要测试一种生物样品对具体的抗生素的敏感度，若该样品和随后的培养物含多种生物种类，他就不能确定在培养物中单个的生物体种类对抗生素的敏感度。为了确定单个生物体种类的敏感度，需要制备“纯”培养物(即含一种单独种类微生物的培养物)，它是通过在第一固体生长培养基上培养初始的样品接种物，并从第一生长培养基取单个菌落、或一组同样的菌落，并将其接种于第二固体生长培养基或在使用液体培养基的情况下形成悬浮液而制备的。本领域普通技术人员公认该方法花费时间，且一般需要熟练技术人员。
在需要知道生长变更剂(例如抗生素、生长促进剂、营养素、防腐剂等)对生物体的效力的情况下，现有技术一般的惯例是使用一种下述之一的评估方法。在一种方法中，生长变剂在培养之前，被施用于固体接种生长培养基区，且在施用区生物体的生长被评估，或与没有施用生长变更剂的区域生物体的生长比较。Kirby-Bauer平板测试是这种目测方法的一个实例。Kirby-Bauer方法包括培养生长培养基直至在整个生长培养基上形成连片生长。含有从一圆盘扩散出来的有效的生长变更剂(抗菌剂)的生长培养基区域，如果抗菌剂在清除生物方面是有效的话，不会含有生物体的生长。围绕该圆盘的无生长区域的大小接着与参照进行比较，以确定生物体对临床中有效浓度的生长变更剂是否敏感。第二种评估方法包括向接种了待测生物的液体培养基中添加已知量的生长变更剂。浑浊度测试是这种类型目测方法的一个实例。浑浊度测试测量液体样品的浊度，以确定样品的生物体含量。样品浊度的增长表明样品中生物体含量的增长。第三种评估方法包括观察生物体生长对染色试剂的效果，其中染色试剂对一种或多种生长生物体的成分或代谢产物产生反应。这些目测评估方法任意得到的信息一般说，性质上也是宏观的；例如，以具体浓度施用的生长变更剂或者影响生物体的生长，或者不影响生物体的生长。关于例如死亡机理、生物是否有横隔形成、或培养物中生物群体的任何统计信息，却只能提供很少或不能提供更多信息。
上述目测方法的一个问题是由于等待直至生物体的可见层或可接受的生物体浓度的出现而产生的测试错误。生物体菌落在生长培养基上或其内部生长要竞争食物，结果由于竞争而不是由于生长变更剂导致生长被抑制。那些同样的生物体也会由于其排泄物和代谢副产物而彼此影响。如果没有这样的干扰发生，则可能更准确地分析生长变更剂对特定微生物的影响。
用生物体目测评估的另一个问题是要产生有意义的结果需要时间。如上所述，一般需要将生物体培养物培养大致18至24小时，用以产生出生长充分的生物体以便目测评估(例如，如果生物体每20至60分钟复制一次，就需要至少产生20代生物体)。然而实际地说，产生培养物并用常规方法分析它，由于操作、评估等至少需要花费48小时。因为，微生物生长的速率是如此之快，且测试时间是如此之长，所以被怀疑有微生物感染的病人，在确切微生物和其敏感度被鉴别之前，最初经常用广谱抗生素治疗。在接受测试数据之后，才进行更有针对性的治疗。然而，本领域普通技术人员认识到，提供更迅速治疗的广谱抗生素相对于掌握具体信息的更有针对性的治疗不是优选的。实际上，相对于更有针对性的药物，广谱抗生素可能昂贵得多并更具有负作用。如今也是相当令人担忧的就是广谱抗生素的过度使用，可能促进了生物体抗生素抗性的发展，因此限制了其药效。
为解决与进行上述宏观测试需要花费时间有关的问题，已经提出许多用于快速测定抗生素敏感性的方法，包括测试单个生物体的方法。这些方法利用了敏感细菌当暴露于抗生素时，可以改变其形状、大小或内部的化学过程(或其中的一些组合)这样的一个事实。然而，一些种类的细菌不与抗生素发生可检测的反应，直至最初几代繁殖之后。因此，只考虑最初不多的几代的生物体的测试，在各种情况下均不能提供有用的信息，且被认为是无效的，除非预先知道生物体的行为。由Ledley提出了用于结核分支杆菌(MTB)抗生素敏感性测定的具体微生物分析的实例(美国专利US5922282)。在Ledley的方法中，通过添加会导致活的生物体发荧光的质粒改变单独的生物体的DNA。比较添加抗菌剂之前和之后生物体发出的荧光，以确定抗菌剂是否消除了荧光，因此杀死了MTB微生物。除了产生荧光的手段以外，这个单一生物体技术类似于那些早先公开的技术，且只适用于窄范围的生物体。用于测定液体肉汤培养基中生长变更剂的效果的另一种方法，如欧洲专利说明书EP0635126B1中所述。在该欧洲专利说明书中，图象处理被用于确定单一生物体大小、数量或形状的变化，以确定是否有源于抗生素的效果。这种方法的问题之一是由于是在液体培养基中进行的，我们相信它不能分析针对具体的CFU或CFU的特性，例如CFU的复制速率的效果。
还提出了检验微生物生长和新陈代谢的其它方法，就是添加当暴露于微生物生长时将改变颜色的试剂。还有其它方法(如美国专利US4724215、US4720463和US4856073所公开的)，就是用电视摄像检验微生物的变化。据我们所知，所有的这些方法实际上也是宏观的，因此不提供有关单一微生物菌落在其早期的信息，且因此不能在非常短的时间内提供可靠的抗生素抗药性信息。它们只提供宏观信息，即生长变更剂对微生物生长有还是没有可检测的影响。
同样众所周知的是，给定群体中的所有细菌不会对任何具体的生长变更剂以同样的方式响应。在任何微生物群体中均有用任何目前技术不易定量的对生长变更剂抗性的变异。如果这个群体数据是常规可得的，可以预知正被讨论的微生物产生抗生素抗药性的可能性，因此有助于确定最佳的治疗时间。
生长变更剂对微生物影响的所有前述检验方法，我们觉得可以被分成两个基本类型。第一组着眼于对裸眼来说是可见的对生物体生长的效果，例如，可见菌落或浑浊度的形成，或与这种生长相关的颜色改变。第二组依靠的是在对数生长期之前，液体生长培养基内的单一生物体的变化。
需要一种用于确定微生物对生长变更剂反应的方法，使微生物得到识别的方法，可以以一般商业用途方法所花费时间的一小部分来提供前述信息的方法，以及不需要肉眼可见的生长且不限制于着眼于单一生物体的方法。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于在培养的最初的几个小时内，研究生长变更剂对微生物菌落影响的方法。
本发明的另一个目的是提供一种鉴别微生物的方法，它是通过确定何种营养素或抑制剂影响其生长而实现的。
本发明提供一种生长变更剂对微生物菌落影响的确定方法。本文所用的术语“微生物菌落”或“小菌落”指的是在易于被裸眼识别之前的最早期增长阶段的微生物菌落。如本文所使用的，术语“生长变更剂”包括会变更、抑制或增强微生物生长的试剂。生长变更剂的例子包括但不限于抗生素、防腐剂、营养素或生长促进剂。生长变更剂也可以是环境类型的条件例如温度、湿度、光、气态环境。
在本方法下分析的各微生物菌落是单独的微观菌落，由接种物内存在的菌落形成单位(CFU)形成。在本发明方法下，可以产生有意义的信息，其使用的菌落所处的生长范围，包括由其CFU翻倍1次至翻倍20次左右[更少]。在本方面方法下，能够提供有意义的信息的该生长范围的菌落也可以按照生长时间、菌落大小或后代来描述。在大多数情况下，本发明方法采用的微生物菌落一般不能被人的裸眼看见。因此，本发明方法可以描述为微观方法，与现有技术方法形成对照，现有技术方法是用肉眼评估多个彼此邻近的微生物菌落，它们集合在一起足够大而肉眼看到。另外，本发明方法可靠地用数量表示生长特性。
本发明方法采用了固体或半固体生长培养基，且生长变更剂被混合进至少一部分的生长培养基，包括下述步骤：
(a)用具有一种或多种活的菌落形成单位的接种物接种生长培养基；
(b)以可能导致菌落形成单位复制成微生物菌落的方式培养菌落形成单位；
(c)对暴露于生长变更剂的一种或多种单个的微生物菌落的一种或多种特性进行定量；和
(d)评估该定量的特性，以确定生长变更剂对单一微生物菌落的影响。
在量化步骤中，暴露于生长变更剂的微生物菌落的特性和在一些情况下作为对照的微生物菌落的特性被量化。菌落特性可以是任何可以被量化以提供有意义的有关生长变更剂对菌落影响的数据的性质。一般用于确定影响的菌落特性，包括但不限于，菌落面积、周长、周长-面积比、边缘粗糙度、边缘轮廓和菌落密度的均匀性。可改变用于量化特性的方法以适合已有判定、被量化的特性和提供有用数据必须的特异性水平。量化方法包括，但不限于测量、比较和检验类型的方法。量化以时间为函数进行。在所有的情况下，量化特性以确定变化。在大多数情况下，通过在时间轴上的两个或更多个点(例如，在T1、T2、T3、…、TN)的特性比较来确定变化。然而在一些情况下，通过在时间轴上的一个单独的点量化特性就可能获得有意义的信息。一种或多种微生物菌落必须被量化的次数取决于收集数据的充分性；即关于生长变更剂的影响做出临床上充分的判断所必需的任何次数。在量化步骤中采用的设备一般是成像装置(例如，数字照相机等)，产生出清晰的图象，足以被测量、比较、检验或别的方式量化图象中截获的特性。或者可以使用其它图象装置例如条形码扫描仪或飞点扫描仪。小菌落图象可以实时利用和/或储存。
生长变更剂对微生物菌落影响的判定是通过评估被量化的特性而作出的。象量化步骤一样，量化的特性被评估的方式将依赖于现有的判定、被量化的特性和提供有用的数据必需的特异性水平。在一些情况下，评估只是看一下是否有量化的特性存在(例如，是否有菌落生长存在，或菌落的边缘是否粗糙等)，且评估的作出可采用时间轴时上一个单独的点或多个点收集的特性数据作出。在这样情况下生长变更剂对微生物菌落的影响的判定可以只基于量化的特性作出。在其它情况下，可以通过考虑对照参照物评估量化特性作出。
对照参照物可以是在评估被考虑的微生物菌落的特性方面提供有用数据的任何信息源。例如，如果接种物含已知的生物体，使用提供如下数据的对照参照物可以进行评估，这些数据有关生物体在类似的环境条件下，正常生长的特性；例如，临床上获得的数据等。或者，可使用无生长变更剂或处于不同浓度生长变更剂之下、接种了相同接种物并在类似条件下培养的部份生长培养基形式的对照参照物进行评估。生长培养基的对照参照物部分的菌落特性和生长培养基中施用生长变更剂区域的菌落特性被量化，并彼此参照进行评估。在许多情况下，比较评估得到的数据足以作出判定。或者也可以采用其它类型的评估。
本发明方法相对于目前使用的生物体对具体的生长变更剂敏感性的确定方法有几个明显的优点。一个显著的优点是有关生长变更剂对生物体影响的判定作出的速度。当本发明方法用于确定抗生素对一种或多种生物体的影响时，这点是特别确实的。如上所述，由于最初缺乏来自病人样品的特有信息，会经常使用广谱抗生素。广谱抗生素不如针对性强的抗生素，这是因为它们给病人服用可能会带来很大的副作用的风险，它们的过量使用可能会促进生物体的抗生素抗药性的产生，而且它们也可能非常昂贵。使用本发明方法，可以经常在2小时或更短的时间内提供抗生素敏感性的信息，明显小于使用目前采用方法的一般性周转时间。结果，现在经常可以一开始就有效地使用针对性强的抗生素，而不是最初用广谱抗生素处理病人。
这几个优点基于这样的事实，就是本发明方法使用由单一的菌落收集的特性数据确定生长变更剂对生物体的影响。如上所述，本发明方法在培养物内可以不是同样起源或同样种类的任何肉眼可见的聚集的菌落出现之前，在培养过程非常早的阶段就利用了菌落(菌落一般有2至20次翻倍)。基于单一菌落的数据的一个优点是，有可能在一些情况下使用“不纯的”培养物。因为是从单一的微观的菌落收集数据，故分离不同种类菌落的需要降低，这一点与在固体培养基上或液体悬浮液中进行的宏观方法不同，其中，若宏观方法在固体培养基上进行，很可能会有许多生物体聚集成肉眼可见的不纯的块，若在液体悬浮液中进行，则难以区别生物体彼此之间的生长。对肉眼可见的不纯的块施用生长变更剂可能会产生有限的信息，因为生长变更剂对多种不同的生物体的影响是不可分开的。由尿或脑脊髓的样品制备的培养物是可能不纯的培养物的实例，在其中本发明可以用于评估不同组成的生物体，而不用首先将其分离。
基于单一菌落数据的另一个优点是可以统计分析有关生长变更剂影响的数据。统计数据可以是有用的，例如，在确定生物体对抗生素的抗药性方面。有关生物体抗生素的抗药性的信息反过来可以提供有关最佳处理时间的有价值的信息。如果，例如生物体被发现对高浓度之外的所有的抗生素均具有抗药性，并且敏感性机理需要几代才能变得有效，则此时抗生素处理比马上就受抗生素影响的更敏感的生物体的情况需要更长的时间。
单一菌落数据也有利地允许鉴定生长变更物质非特征性影响的生物体突变。例如，单一菌落的生长速率可以进行统计比较。如果生长速率的范围超过预期的对照标准偏差，说明生物体比通常更具有抗药性，且抗药性可能正在发展。强调任何微生物治疗必须直接针对组内最具有抗药性的生物体是重要的，因为这些生物体即使在更敏感的生物体已经被消灭之后，仍然会繁殖。
本发明方法的另一个优点是迅速地提供准确的生长变更剂的敏感性信息。Kirby-Bauer测试的缺点是在生长培养基中任何给定的点有许多变量影响抗生素浓度。基于清晰区域大小计算抗生素浓度的公式已经公开，但这些公式很少使用，且被认为最多是近似值。Kirby-Bauer中，影响抗生素浓度的确定的一个变量是相邻的生物体之间的竞争。在标准的平板测试中生物体为了食物竞争，且因此可能由于竞争而不是生长变更剂造成生长受到抑制。通过它们的排泄和代谢副产物，生物体之间也互相影响。本发明方法通过在接种之后很快检验该菌落而避免了这些类型的干扰，而不是一直等到生物体增殖到一定程度可以被裸眼看见为止。
本发明方法的另一个优点是其多用途。例如，本发明方法能够从生物体被施用于生长培养基的时候起收集有关生长变更剂对生物体影响的数据。本发明方法因此并不局限于观察最初几代微生物，也不局限于后期可以通过肉眼看见的各代，而是可以在生物体的整个成长过程使用。本发明方法另一个多用途的例子是可以用于在一个单个的测试中检验具体浓度的生长变更剂或检验浓度梯度的生长变更剂。该梯度方法避免了必须创建多稀释度抗生素，以例如确定抗生素用于具体生物体的最小抑制浓度。本发明方法的另一个多用途的例子是其可以用于兽医学。
本发明方法也可以被用来便于具体生物体的鉴别。例如，如果在一个具体的测试中，对照参照物是不含糖的生长培养基，而生长培养基的测试区域含糖，那些可以代谢糖的生物体在测试区域中会比在对照区域生长得更快。因此，可以使用许多不同的生长增强和生长抑制物质以识别被怀疑的生物体。
本发明方法的另一个优点是能够提供在统计上小数量发生却具有关于生长变更剂对微生物影响的重要意义的效果、反应或没有发生反应的信息。该优点基于的事实是本发明方法评估小菌落而不是肉眼可见的菌落。在生长培养基上给定区域中小菌落的数量会远远大于在同样区域中肉眼可见菌落的数量，从而提供对于评估该区域的统计上更有效的群体。例如，众所周知一些细菌具有低的突变率，其中在某一特定环境下对具体的抗生素大约在104中有1个至106中有1个可以有抵抗力。如果这种有抵抗力的菌株的生长没有被发现，该菌株很可能被错误地报导为是对抗生素敏感的，而事实上该菌株是有抗药性的。本发明提供的该优点也许最好通过实例说明。如果某人用摄影机来记录常规琼脂平板上肉眼可见的菌落(正如目前用一些对菌落计数的仪器)，则在琼脂平板上没有足够的空间包含出现上述抗性细菌在统计上必需数目的非汇合的肉眼可见的菌落。例如，10cm直径的平板，每间隔2mm培养出具有肉眼可见的菌落，只可能拥有约2000个这样的菌落，该群体明显对于发现这种突变在统计上是不充分的。这种统计上不充分的群体是为什么用于抗生素敏感性的常规琼脂平板菌落太拥挤而产生汇合生长的另一个原因。相反地，在本发明方法中，培养成小菌落的CFU可以以10μm的间距被接种，从而可以对统计上数量充足的每平方厘米104个小菌落进行评估，而且允许在小菌落彼此汇合之前进行评估。
本发明方法的另一个优点是也可以用于检测生长变更剂的存在。例如，用于在牛奶样品中确定抗生素或其它生长变更剂存在。目前牛奶测试工艺需要预先已知测试抗生素的种类；即对具体的抗生素测试是特定的。在本发明方法中，牛奶被混合进生长介质中，且接种物被接种进生长培养基。接种物选择为有可能受牛奶中生长变更剂(例如，抗生素残余物)存在的影响的类型。如果发源于接种物的小菌落的生长不同于现有条件下的常规生长，则已知或未知的抗生素很可能存在牛奶样品中。
本发明的这些和其它目的、特征和优点，根据对其最佳模式的实施方案的详细说明，并结合附图说明会变得显而易见。
图1A-1D包括铺有产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)的固体培养基的影像图1A和1C包括未处理的影像，图1B和1D是图1A和1C同样的影像，但在量化其特性之前，影像经过了数字处理来定位菌落。
图2A-2D包括了大肠杆菌(E.coli)菌落的影像，其中一些菌落暴露于抗生素。图2A和2B是在铺板之后马上拍摄得到的，而图2C和2D是在培养约2小时之后拍摄得到的。
图3A-3D包括E.faecalis(E.faecalis)的影像，其中一些暴露于抗生素。图3A和3B是在铺板之后马上拍摄得到的，而图3C和3D是在培养约2小时之后拍摄得到的。
图4A-4D包括E.faecium的影像，其中一些暴露于抗生素。图4A和4B是在铺板之后马上拍摄得到的，而图4C和4D是在培养约2小时之后拍摄得到的。
用于生长变更剂对小菌落影响的确定的本发明方法，采用了能够支持微生物菌落生长的一种或多种生长培养基，优选凝胶、半固体或可渗透的固体形式。在使用期间可以被再水合的脱水生长培养基是特别优选的，因为它们可以在延长的时间内易于贮存。接种之后是透明或半透明的生长培养基也是优选的，因为它便于下述的量化和评估步骤。然而如果采用了将在下面讨论的合适的照明小菌落可以用任何生长培养基量化和评估。可以使用一种或多种培养基质以适合现有的应用。
术语“生长变更剂”可以是任何化学或环境试剂，它们将会改变、抑制或增强微生物生长。化学生长变更剂包括，但不限于抗生素、防腐剂、营养素和生长促进剂。环境类型生长变更剂包括但不限于参数例如，温度、湿度、光和气态环境。化学类型生长变更剂可以以多种途径被混合进生长培养基。在那些期望仅将生长变更剂掺入部份生长培养基的情况中，可使用置于生长培养基所选部份之上的胶体或其它固体或半固体载体来掺入生长变更剂。在其它情况下，生长变更剂可以使用渗入整个生长培养基的液体载体来掺入。环境类型生长变更剂可以通过将生长培养基暴露于具体的因子而被引入；例如，将一对生长培养基置于不同的温度、不同水平的湿度或光等条件下。
含生物体的接种物来源于尿、脑脊液、体腔液或其它样品来源，例如，来源于早先分离的菌落的生物体悬浮液，该接种物被用于接种生长培养基。用于接种生长培养基的的技术在本领域是公知的，且不用在以后进一步讨论。已接种的生长培养基以可能导致接种物成分复制成微生物菌落的方式被培养。
复制成小菌落的接种物中的成分本文指的是菌落形成单位(CFU)。CFU可以是接种物中活的单个生物体细胞或一丛生物体细胞。在生长培养基被接种，且已经开始培养之后，各CFU至少会有一次翻倍(没有抑制因素)，且变成小菌落。在本发明方法下在CFU被翻倍4至8次之前，且几乎总是在其已经翻倍约20次之前，一般可以产生有意义的信息。应该注意到本文所用的术语“翻倍”指的是小菌落面积或体积的翻倍，与单一的生物体不同，因此不能被用于确定单个生物体的大小。小菌落的“翻倍”可以是由于生物体数量的翻倍或其平均大小的翻倍或其一些组合。然而，由于单个的生物体的生长受限制，特别是经过了几代的时间之后，本文指的“翻倍”更经常反映的是真实的复制生长，而不是生物体大小的改变。
可以产生有意义的信息的时期，也可以菌落生长时间或大小而不仅是培养期间CFU翻倍的次数来定义。例如，如果要被评估的生物体是已知的，很可能有在类似环境条件下有关该生物体翻倍次数的信息。如果那样，时间可以被用作判定中的对照参数，而不是必需直接确立生物体有多少次翻倍。在一些情况下，生物体的大小和小菌落面积或体积的增长速率可以提供有关生物体的种类和生长变更剂对该生物体生长速率的影响的信息。可以产生有意义的信息的时期，也可以后代来定义。具体地说，在单一小菌落(各菌落代表源于一个具体的祖先的生长)与其它源于不同祖先生长的小菌落连接或接近之前，可以进行判定。可以产生有意义的信息的时期，也可以小菌落的生长导致大量的小菌落彼此汇合之前的时间来定义。
不管评估期被如何定义，在本发明方法下采用的微生物菌落一般不能被人的肉眼看见。因此，本发明方法可被描述成微观的，与现有方法形成对比，现有方法宏观地评估彼此接触的许多微生物菌落，这些菌落集合在一起足够大，使得肉眼可见。
在开始培养且一些菌落形成单位成为适于评估的小菌落之后，在一或多个时间点上检验暴露于生长变更剂的一种或多种小菌落，量化这些菌落相关的特性。要被量化的菌落特性基于可能显露出菌落暴露于生长变更剂的结果的那些特性，而被选择。用于量化特性的优选方法包括对含小菌落的一部分生长培养基进行电子成像，所述的小菌落暴露于生长变更剂。如果即将进行的测试使用生长培养基上的小菌落作为对照参照物(该小菌落要么没有暴露于生长变更剂，要么暴露于不同的浓度的生长变更剂)，则也对一部分对比参照生长培养基进行电子成像。
可以使用许多设备对生长培养基和其上含有的一或多种小菌落进行电子成像能创建电子图形文件的数字照相机是特别方便的，所述的电子图形文件可以被个人计算机显示。数字照相机可以设置于普通显微镜上，或优选，设置在例如待审定的美国专利申请09/255673中所述的自动显微镜上。在相对于生长培养基小菌落不易被识别的一些情况下，可以采用有助于使微生物菌落相对于生长培养基形成反差的技术。透射法是一个可接受的照明技术，该技术利用了小菌落相对于大多数生长培养基具有相当不同折光率的事实。具体地说，照射小菌落的光的散射与照射生长培养基的光的散射不同，因此使小菌落比生长培养基显得更暗。利用了光散射性不同的其它技术包括窄角照明或暗视野检验。区分生长培养基和小菌落的另一种方法包括对小菌落和承载小菌落的生长培养基染色的方法。例如，色素/染料(例如，吖啶橙)被混合进生长培养基，然后被小菌落吸收使两者形成反差。或者，通过“负”染料在两者之间造成反差，其中染料给生长培养基提供颜色或荧光，而生长的小菌落则将颜色和荧光遮挡在外。小菌落的位置和范围也可以通过数字处理软件来提供，该软件探查小菌落的边缘，且数字化“填充”小菌落的内部区域，以将其与小菌落的外部区域分别出来，反之亦然。或者根据即将进行的测试的性质，也可以使用电子成像系统(例如，实时连续成像)。
如上所述，本发明方法包括量化作为时间函数的一或多种小菌落的特性。如果不止一次量化小菌落特性是必需的，则成像装置必须能够不止一次在生长培养基上进行具体位置的定位。具体位置的定位可以通过多种不同的方式完成。例如，成像装置和生长培养基其中之一或这两者的移动和定位，可以通过机械控制或机电一体化控制。也可以通过定位在生长培养基上或与生长培养基靠得很近的可识别特性的利用，从而使生长培养基上的位置也是可定位的。例如，许多以静止图案分散在生长培养基上的非反应性珠子，可以用作生长培养基上的导航浮标。美国专利申请09/366881描述了这样的方法。或者也可以使用其它定位方法或机理。
可以通过检验、测量或比较特性来量化特性。例如在一些情况下，可以通过检验一或多种小菌落的边缘粗糙度，来收集有用的数据。在其它情况下，通过测量一或多种小菌落的面积，来收集有用的数据。在另外的一些情况中，通过比较暴露于生长变更剂的一或多种小菌落的面积与没有暴露于生长变更剂的其它小菌落的面积，或暴露于不同浓度的同样的生长变更剂的小菌落的面积，来收集有用的数据。也可以通过比较被暴露的菌落与另一暴露于影响是已知的，但品种不同的生长变更剂的菌落来收集有用的数据。如何使菌落特性被量化的更详细的实例将在下文提供。
量化特性足够多次，以确保可以作出有关生长变更剂对生物体影响的临床充分的判定。在一些状况下，量化菌落的特性一次，就可以是足够的。例如，在一些情况下，具体特性(例如，生长、奇异的菌落形态等)的存在可以足以作出临床判定。在其它状况下，临床充分的判定可以需要量化特性许多次。例如，需要在一段时间内存在具体的影响的临床判定需要周期性量化特性。
经常检验小菌落的一个优点是，它是采用这种动力学技术，可以发现在最早期的时间里的相关信息，从而提供快速的临床结果。多次量化特性也可以产生额外的令人满意的信息。例如，一些生物体，当存在一些抗生素时，显示了早期生长的形态，随着抗菌剂控制的影响，接着生长缓慢和停止或退化。在其它情况下，生物体生长非常缓慢，随着最终突破了抗菌剂，接着就加速生长。在两种情况下，通过对几代的生长进行检验，可说明有抗药性模式或缺乏抗药性模式。抗生素敏感性的机理也可以通过检验小菌落形状和密度的变化而得到说明。例如，具有静止的而不是杀灭影响的那些抗生素可以通过CFU的持久性被看见，然而具有杀灭影响的抗生素将显示出CFU的消失，或在一些生长之后，小菌落大小突然降低。由于杀灭影响是更强大的，且经常需要较短过程的处理，这种区别是重要的。
一旦特性被量化，就会被评估以确定是否生长变更剂对小菌落有影响。用于评估量化特性的标准依赖于已有的测试，特性和提供有用数据所必需的特异性水平。在一些情况下，评估标准可以是简单的，不管是否有量化特性。特性被量化以确立其存在，是否生长变更剂具有影响的判定以特性的存在为前提；例如，是否已经有菌落生长；小菌落的边缘是否粗糙等。在这样的情况下，量化的特性独自能够作出判定。在其它情况下，优选鉴于对照参照物评估量化的特性。
在评估被考虑的小菌落的特性中，对照参照物可以是提供有用数据的任何信息源。例如，如果接种物含已知的生物体，使用对照参照物可以进行评估，该对照参照物提供有关在类似环境条件下生物体正常生长特性的数据，例如临床上获得的数据等。作为一个例子，如果给定的生物体已知在现有的环境下，以每30分钟翻倍一次的速率生长，而实际翻倍速率(例如，菌落体积或面积的改变)小于已知速率，则推测生长变更剂延迟了生物体的倍增和生长。或者，可使用无生长变更剂或处于不同浓度生长变更剂之下、接种了相同接种物并在类似条件下培养的部份生长培养基形式的对照参照物进行评估。在生长培养基的对照参照物部分的一或多种菌落的特性和生长培养基的施用生长变更剂的区域中的一或多种菌落的特性被量化，并通常通过比较彼此参照进行评估。
如上所述，用于确定生长变更剂对小菌落影响的本发明方法相对于目前使用的方法具有明显的优势。下文提供本发明方法在使用中的实施例，以便于获得对本发明方法的全面了解。但是，本发明并不限于这些实施例。
实施例Ⅰ
图1A-1D包括接种了产气肠杆菌的固体生长培养基的影像。图1A显示了在接种之后马上(该时间在下文用“T1”表示)成像的生长培养基的区域。图1C显示如图1A同样的区域，但这是在培养约2小时之后(该时间在下文用“T2”表示)拍摄的图像图1B和图1D分别是与图1A和图1C完全同样的图像，但图1B和图1D为了便于小菌落的特性的量化步骤而已经进行了数字处理。在该实施例中，可以被很容易量化以产生有用信息的特性是小菌落的面积和形状。该数字处理有助于小菌落的面积和形状的量化步骤，这是通过探查有关的小菌落的边缘，并用反差的颜色填充这些小菌落，以使其更明显而实现的。数字处理也可以用于定位有关的小菌落。例如，如果小菌落的面积影响了其可提供的有用信息的量，则数字处理软件可以用于只是定位那些具有的表面积等于或大于给定的表面积阈值的小菌落。Spectrum Analytics of Vienna,Virginia,U.S.A市售的“IPLabs Spectrum”是可以用于数字成像和量化小菌落的软件包的例子。
在有关的小菌落的面积被量化之后，即对各小菌落的面积值比较性地进行评估(T1对T2)，以确定生长变更剂的影响。在一些测试中，可以采用多次评估(即，在T1、T2、T3、T4等)。可以基于平均小菌落面积进行评估，或通过在有或没有生长变更剂的区域中小菌落面积的分布进行评估。在第一种情况下，如果生长变更剂导致生长速率的增加(或降低)，则具有生长变更剂的区域中小菌落的面积会大于(或小于)对照参照物中小菌落的面积。在第二种情况下，可能有一些小菌落比平均值生长得更快(或更慢)，且虽然平均面积可以是相同的，但在具有生长变更剂的区域和对照参照物的区域之间，菌落面积的分布是不同的。如果进行两次以上的评估，通过评估顺序的时间之间的特性可以确定生长速率的变化。
为了说明量化和评估小菌落的特性，特别是小菌落的生长的步骤，图1A-1D中所示的生长培养基没有暴露于生长变更剂。图1C和1D中所包括的图像清楚地显示了小菌落的生长。本领域普通技术人员会从该实施例中了解到，可以在2个小时内获得有用的信息，在该时间里小菌落的直径只有约3-5μm，远远早于它们可以被肉眼看见。可以轻易地了解，在这两个小时的培养期里，可以确定生长从而确定生长变更剂的影响。
实施例Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ：
图2A-2D、3A-3D和4A-4D显示了暴露于不同生长变更剂的不同微生物的数字图像。这里同样，各图中所包括的以“A”和“B”表示的图像是在接种之后马上拍摄得到的，各图中所包括的以“C”和“D”表示的图像是在培养约2小时之后拍摄得到的。图2A-2D、3A-3D和4A-4D的图像均没有经过数字处理增强。各图中所包括的以“B”和“D”表示的图像显示了已暴露于生长变更剂的生长培养基区域。各图中所包括的以“A”和“C”表示的图像没有暴露于生长变更剂，可以用作对比参照的区域。a．实施例Ⅱ
在图2A和2B中所包括的图像显示了用大肠杆菌接种之后即刻的Kirby-Bauer类型生长培养基的区域。在图2C和2D中包括的图像显示了在两小时培养期之后的同样的区域。图2C中所包括的图像显示了在没有生长变更剂的情况下，大肠杆菌小菌落的生长。图2D所包括的图像显示了暴露于2μm/ml标准临床浓度的抗生素头孢氨噻的大肠杆菌小菌落。如果想要发现微生物敏感性的阈值，例如用来确定最小抑制浓度(MIC)，则一系列各含一定浓度的生长变更剂的分离区域可以被使用，并对在各分离区域中的相对生长进行评估。或者，可以采用如待审美国专利申请09/255681中所述的生长变更剂的浓度梯度，并对连续的浓度比较小菌落的生长。图2D中显示的小菌落显示了增加的周长/面积比特征，说明了通过抑制微生物菌落内中隔的形成，抗生素抑制生长。b．实施例Ⅲ
在图3A和3B中所包括的图像显示了用E.faecalis接种之后即刻的Kirby-Bauer类型生长培养基的区域。在图3C和3D中包括的图像显示了在两小时培养期之后的同样的区域。图3C中所包括的图像显示了在没有生长变更剂的情况下，E.faecalis小菌落的生长。图3D所包括的图像显示了暴露于2μg/ml标准临床浓度的抗生素万古霉素的E.faecalis小菌落。图2D显示的小菌落在两小时之后不显示任何生长。c．实施例Ⅳ
在图4A和4B中所包括的图像显示了用E.faecium接种之后即刻的Kirby-Bauer类型生长培养基的区域。在图4C和4D中包括的图像显示了在两小时培养期之后的同样的区域。图4C中所包括的图像显示了在没有生长变更剂的情况下，E.faecium小菌落的生长。图4D所包括的图像显示了暴露于2μg/ml标准临床浓度的抗生素万古霉素的E.faecium小菌落。图4D中显示的菌落显示出可检测的生长，从而显示出施用浓度的该抗生素对E.faecium不是有效的抑制剂。
虽然本发明已经显示和描述了有关详细的实施方案，应该理解本领域的技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以作出形式和细节上的许多改变。例如，上述详细描述说明测试区域可以位于生长培养基的第一部分，而对照参照物可以位于同样的生长培养基的第二部分。或者，测试区域可以位于第一生长培养基，而对照参照物位于第二生长培养基。另一个可以在不背离本发明精神和范围前提下所做的改变的例子是步骤的顺序。例如，优选在用接种物接种生长培养基，并培养该接种物之前将生长变更剂混合进生长培养基的一部分或全部。然而可以改变步骤顺序而仍保持在本发明方法范围内。

Claims (37)

1．一种生长变更剂对一种或多种微生物菌落影响的确定方法，包括以下步骤：
提供一种固体或半固体生长培养基；
将所述的生长变更剂混合进所述的生长培养基的至少一部分；
用接种物对所述的生长培养基接种，所述的接种物具有一种或多种有活力的菌落形成单位；
以可能使所述的菌落形成单位复制成所述的微生物菌落的方式培养所述的菌落形成单位；
量化暴露于所述的生长变更剂的一种或多种所述微生物菌落的一个或多个特性；和
评估所述的特性以确定所述的生长变更剂对所述的微生物菌落的影响。
2．根据权利要求1的方法，其中在所述的菌落形成单位已经翻倍一次之后，和所述的菌落形成单位翻倍超过20次之前，对暴露于所述的生长变更剂的一种或多种所述微生物菌落的所述特性进行量化。
3．根据权利要求2的方法，其中在所述的菌落形成单位已经翻倍8次之前，对暴露于所述的生长变更剂的一种或多种所述微生物菌落的所述特性进行量化。
4．根据权利要求1的方法，其中所述的微生物菌落均具有初始面积，且在至少一些所述的微生物菌落其面积增长到其所述的初始面积的两倍之后和大多数所述的微生物菌落其面积增长到其所述初始面积的20倍之前，对所述的微生物菌落的所述特性进行量化。
5．根据权利要求1的方法，其中所述的微生物菌落均具有初始体积，且在至少一些所述的微生物菌落其体积增长到其所述的初始体积的两倍之后和大多数所述的微生物菌落其体积增长到其所述初始体积的20倍之前，对所述的微生物菌落的所述特性进行量化。
6．根据权利要求1的方法，其中所述的特性被量化，而各微生物菌落是具体始祖菌落形成单位的产物。
7．一种生长变更剂对生长培养基支持的一种或多种微生物菌落影响的确定方法，其中生长培养基中至少一部分掺入了所述的生长变更剂，所述的方法包括以下步骤：
用含一种或多种有活力的菌落形成单位的接种物接种所述的生长培养基；
以可能使所述的菌落形成单位复制成所述的微生物菌落的方式培养所述的菌落形成单位；
量化暴露于所述的生长变更剂的一种或多种所述微生物菌落的一个或多个特性；和
将所述的一个或多个特性与对照参照物进行比较，以确定所述的生长变更剂对所述的微生物菌落的影响。
8．根据权利要求7的方法，其中所述的生长变更剂被混合进所述生长培养基的第一部分，而所述对照参照物包括没有所述生长变更剂的所述生长培养基的第二部分。
9．根据权利要求7的方法，其中所述的生长变更剂以第一浓度被混合进所述生长培养基的第一部分，而所述的对照参照物包括所述生长培养基的第二部分并且所述的生长变更剂以不同于所述第一浓度的第二浓度被混合进所述的第二部分。
10．根据权利要求9的方法，其中所述的第二浓度小于所述的第一浓度。
11．根据权利要求7的方法，其中所述的生长变更剂以浓度梯度的方式被使用，所述的浓度梯度具有较大的浓度端和较小的浓度端，而其中所述的对照参照物紧临所述的较低浓度端。
12．根据权利要求11的方法，其中在所述较低端的所述生长变更剂的所述浓度对所述的微生物菌落没有影响。
13．根据权利要求7的方法，其中所述的对照参照物包括临床获得的数据。
14．根据权利要求7的方法，其中所述的对照参照物包括一种或多种具有公知生长特性的比较微生物菌落。
15．根据权利要求7的方法，其中所述的对照参照物定位于独立的第二生长培养基中。
16．一种生长变更剂对生长培养基支持的一种或多种微生物菌落影响的确定方法，所述生长培养基中至少一部分掺入了所述的生长变更剂，所述的方法包括以下步骤：
用含一种或多种有活力的菌落形成单位的接种物接种所述的生长培养基；
以可能使所述的菌落形成单位复制成所述的微生物菌落的方式培养所述的菌落形成单位；
定期量化暴露于所述的生长变更剂的所述的一种或多种微生物菌落的一个或多个特性；和
对所述特性的所述定期量化进行评估，以确定所述的生长变更剂对所述的微生物菌落的影响。
17．根据权利要求16的方法，其中所述的定期量化一种或多种微生物菌落的步骤包括定期使所述微生物菌落成像。
18．根据权利要求17的方法，其中所述的评估步骤包括比较所述的定期图像，以确定所述的生长变更剂对所述的微生物菌落的影响。
19．根据权利要求18的方法，其中所述的评估步骤包括将所述的定期图像与对照参照物进行比较，以确定所述的生长变更剂对所述的微生物菌落的影响。
20．根据权利要求19的方法，其中在所述的菌落形成单位已经翻倍一次之后，和所述的菌落形成单位翻倍超过20次之前，对暴露于所述的生长变更剂的一种或多种所述微生物菌落所述特性进行定期成像。
21．根据权利要求17的方法，其中所述的微生物菌落均具有初始面积，且在至少一些所述的微生物菌落其面积增长到其所述的初始面积的两倍之后和大多数所述的微生物菌落其面积增长到其所述初始面积的20倍之前，对所述的微生物菌落的所述特性进行定期成像。
22．根据权利要求17的方法，其中所述的微生物菌落均具有初始体积，且在至少一些所述的微生物菌落其体积增长到其所述的初始体积的两倍之后和大多数所述的微生物菌落其体积增长到其所述初始体积的20倍之前，对所述的微生物菌落的所述特性进行定期成像。
23．根据权利要求17的方法，其中所述的特性被定期成像，而各微生物菌落是具体始祖菌落形成单位的产物。
24．一种生长变更剂对生长培养基上支持的一种或多种微生物菌落影响的确定方法，所述生长培养基中至少一部分掺入了所述的生长变更剂，所述的方法包括以下步骤：
用含一种或多种有活力的菌落形成单位的接种物接种所述的生长培养基；
以可能使所述的菌落形成单位复制成所述的微生物菌落的方式培养所述的菌落形成单位；
定期使暴露于所述的生长变更剂的一种或多种所述的微生物菌落成像，以显示所述的微生物菌落的特性；和
对所述特性进行评估，以确定所述的生长变更剂对所述的微生物菌落的影响。
25．根据权利要求24的方法，其中所述的特性选自由微生物菌落面积、周长、周长与面积比、边缘粗糙度、边缘轮廓和菌落密度均匀性组成的组。
26．一种生长变更剂对生物样品影响的确定方法，该样品被接种进固体或半固体生长培养基中，并培养以产生由所述样品中存在的菌落形成单位复制的微生物菌落，所述的方法包括下述步骤：
将所述生长变更剂混合进所述生长培养基的至少一部分；
在一段时间内，当几乎所有的所述微生物菌落彼此分离时，对暴露于所述生长变更剂的所述微生物菌落成像；和
评估所述的微生物菌落特性，以确定所述的生长变更剂对所述的微生物菌落的影响。
27．一种生长变更剂对生长培养基上支持的一种或多种微生物菌落作用机理的确定方法，包括以下步骤：
用含一种或多种有活力的菌落形成单位的接种物接种所述的生长培养基；
将所述生长变更剂混合进所述生长培养基的至少一部分；
以可能使所述的菌落形成单位复制成所述的微生物菌落的方式培养所述的菌落形成单位；
定期对暴露于所述的生长变更剂的所述的一种或多种所述的微生物菌落成像；和
对所述的定期成像进行评估，以确定所述的生长变更剂的作用机理。
28．一种生长变更剂对生物体影响的确定方法，包括以下步骤：
将所述生长变更剂混合进固体或半固体生长培养基的至少一部分；
用含源于所述微生物的一种或多种有活力的菌落形成单位的接种物接种所述的生长培养基；
以可能使所述的菌落形成单位复制成所述的生物体小菌落的方式培养所述的菌落形成单位；
对暴露于所述的生长变更剂的一种或多种所述的小菌落成像许多次，从而创建按时间顺序编排的所述的一种或多种小菌落的图像；和
评估所述的按时间顺序编排的图像，以确定所述的生长变更剂对所述的生物体的影响。
29．根据权利要求28的方法，其中所述的按时间顺序编排的图像，创建于所述的菌落形成单位已经翻倍一次之后，和所述的菌落形成单位翻倍超过20次之前。
30．根据权利要求28的方法，其中按时间顺序编排的图像，创建于至少一些所述的小菌落其面积增长到两倍之后和大多数所述的小菌落其面积增长到20倍之前。
31．根据权利要求28的方法，其中按时间顺序编排的图像，创建于至少一些所述的小菌落其体积增长到两倍之后和大多数所述的小菌落其体积增长到20倍之前。
32．根据权利要求28的方法，其中创建所述的按时间顺序编排的图像，而各微生物菌落是具体始祖菌落形成单位的产物。
33．根据权利要求28的方法，其中单个所述小菌落的特性作为测试组被评估，并与对照组相比较，以确定是否所述测试组的所述特性与所述对照组的特性在统计学上不同。
34．根据权利要求33的方法，其中所述的统计比较用于对所述的生长变更剂敏感性的变异进行预报。
35．根据权利要求34的方法，其中所述的变异是对抗微生物剂的抵抗力增加。
36．一种生长变更剂对一种或多种微生物菌落影响的确定方法，包括以下步骤：
提供一种固体或半固体生长培养基；
将所述的生长变更剂混合进所述的生长培养基的至少一部分；
用接种物对所述的生长培养基接种，所述的接种物具有许多菌落形成单位，其中所述的菌落形成单位分散于所述的生长培养基上，彼此分开的距离一般不小于5μm，并不大于100μm；
以可能使所述的菌落形成单位复制成所述的微生物菌落的方式培养所述的菌落形成单位；
在大多数所述的小菌落彼此汇合之前，量化暴露于所述的生长变更剂的一种或多种所述微生物菌落的一个或多个特性；和
评估所述的特性以确定所述的生长变更剂对所述的微生物菌落的影响。
37．一种探查样品中生长变更剂存在的方法，包括以下步骤：
提供一种固体或半固体生长培养基；
将所述的样品混合进所述的生长培养基的至少一部分；
用接种物对所述的生长培养基接种，所述的接种物具有一种或多种有活力的菌落形成单位；
以可能使所述的菌落形成单位复制成一种或多种微生物菌落的方式培养所述的菌落形成单位；
量化暴露于所述的样品的一种或多种所述微生物菌落的一个或多个特性；和
评估所述的特性以探查所述的生长变更剂的存在。
CN01117809A 2000-02-17 2001-02-16 生长变更剂对微生物菌落影响的确定方法 Pending CN1321773A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/506,157 2000-02-17
US09/506,157 US6472166B1 (en) 2000-02-17 2000-02-17 Method for determining the effects of a growth-altering agent on a microbial colony

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1321773A true CN1321773A (zh) 2001-11-14

Family

ID=24013434

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN01117809A Pending CN1321773A (zh) 2000-02-17 2001-02-16 生长变更剂对微生物菌落影响的确定方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US6472166B1 (zh)
EP (1) EP1126033A3 (zh)
JP (1) JP2001245694A (zh)
CN (1) CN1321773A (zh)
CA (1) CA2334072A1 (zh)
NO (1) NO20010770L (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107254505A (zh) * 2017-07-17 2017-10-17 中国家用电器研究院 一种材料样块防霉性能的评价方法
CN111512316A (zh) * 2017-10-05 2020-08-07 贝克顿·迪金森公司 用于生物样本评定处理的应用程序开发环境

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030153023A1 (en) * 1999-05-13 2003-08-14 Starzl Timothy W. Enumeration method of analyte detection
ES2329986T3 (es) 2001-09-06 2009-12-03 Rapid Micro Biosystems Inc Deteccion rapida de celulas en replicacion.
AU2004273783A1 (en) 2003-07-12 2005-03-31 Accelr8 Technology Corporation Sensitive and rapid biodetection
US20120077206A1 (en) 2003-07-12 2012-03-29 Accelr8 Technology Corporation Rapid Microbial Detection and Antimicrobial Susceptibility Testing
US7341841B2 (en) 2003-07-12 2008-03-11 Accelr8 Technology Corporation Rapid microbial detection and antimicrobial susceptibility testing
US8481280B1 (en) * 2004-02-02 2013-07-09 S. S. Steiner, Inc. Method for determining activity of an antibiotic with hops
KR20070115929A (ko) * 2005-03-22 2007-12-06 가부시키가이샤 메디넷 세포배양 평가시스템, 세포배양 평가방법 및 세포배양평가프로그램
US9057046B2 (en) 2005-09-26 2015-06-16 Rapid Micro Biosystems, Inc. Cassette containing growth medium
CN102224410B (zh) 2008-09-24 2017-02-08 施特劳斯控股公司 用于测试分析物的成像分析仪
ES2551922T3 (es) 2011-03-07 2015-11-24 Accelerate Diagnostics, Inc. Sistemas rápidos de purificación celular
US10254204B2 (en) 2011-03-07 2019-04-09 Accelerate Diagnostics, Inc. Membrane-assisted purification
EP2776550B1 (en) 2011-11-07 2018-01-10 Rapid Micro Biosystems, Inc. Cassette for sterility testing
CA3171698A1 (en) 2012-04-16 2013-10-24 Rapid Micro Biosystems, Inc. Cell culturing device
US9677109B2 (en) 2013-03-15 2017-06-13 Accelerate Diagnostics, Inc. Rapid determination of microbial growth and antimicrobial susceptibility
EP3278115A2 (en) 2015-03-30 2018-02-07 Accelerate Diagnostics, Inc. Instrument and system for rapid microorganism identification and antimicrobial agent susceptibility testing
US10253355B2 (en) 2015-03-30 2019-04-09 Accelerate Diagnostics, Inc. Instrument and system for rapid microorganism identification and antimicrobial agent susceptibility testing
ES2975773T3 (es) * 2017-09-28 2024-07-15 Bd Kiestra Bv Métodos y sistemas para la evaluación automatizada de la sensibilidad a antibióticos
WO2019204784A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 First Light Biosciences, Inc. Detection of targets
EP4172354A4 (en) * 2020-06-25 2024-07-03 Qvella Corp SYSTEMS AND METHODS FOR CLASSIFYING MICROBIAL CELLS GROWN IN MICROCOLONIES
CN118397570B (zh) * 2024-06-28 2024-09-03 临沂大学 一种食线虫真菌培养实验室环境远程监控系统

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE403382B (sv) 1974-03-12 1978-08-14 Orion Yhtyme Oy Orion Diagnost Sett vid undersokning av effekten av ett biologiskt aktivt emne pa tillvexten av mikroorganismer som odlas pa ett fast eller gelformigt odlingsmedium
US4204045A (en) 1978-02-15 1980-05-20 Orion-Yhtyma Oy Device for examining microorganisms
US4604351A (en) * 1981-09-10 1986-08-05 Bronx Lebanon Hospital Method for determining bacterial sensitivity to chemical agents
US4517292A (en) * 1982-05-18 1985-05-14 Spiral System Instruments, Inc. Method and apparatus for testing microbial interaction with growth affecting substances
US4514495A (en) 1982-05-18 1985-04-30 Spiral Systems Instruments, Inc. Method for testing microbial interaction with growth affecting substances
US4724215A (en) 1985-02-27 1988-02-09 Sherwood Medical Company Automated microbiological testing apparatus and method
US4720463A (en) 1985-03-01 1988-01-19 Sherwood Medical Company Automated microbiological testing apparatus
SE456246B (sv) 1985-08-01 1988-09-19 Biodisk Ab Anordning for kenslighetsbestemning av mikroorganismer innefattande en icke-poros testremsa med tva olika testsubstanser
US5246837A (en) 1988-10-19 1993-09-21 Spiral System Instruments, Inc. Processor implemented method for determining the potency of a growth affecting substance interacting with micro-organisms on the surface of microbial culture media
US5501959A (en) 1989-01-17 1996-03-26 Alamar Biosciences Laboratory, Inc. Antibiotic and cytotoxic drug susceptibility assays using resazurin and poising agents
US5639632A (en) 1990-03-02 1997-06-17 Ab Biodisk Method and device for studying and quantifying interacting effects of substances on biological cells
US5206151A (en) 1990-06-11 1993-04-27 Nalco Chemical Company Rapid selection of biocide using a reduction oxidation indicator system
US5164301A (en) 1990-06-22 1992-11-17 Difco Laboratories Process and kit for detecting microbial metabolism
US5429944A (en) * 1991-08-29 1995-07-04 Spiral System Instruments, Inc. Method for testing the comparative effect of growth-affecting substances by multiple depositions of test microorganisms
IL101522A (en) 1992-04-08 1997-09-30 Combact Imaging Systems Ltd Detection of microorganisms in a sample and determination of the sensitivity of microorganisms to antibiotics
JP3749933B2 (ja) * 1993-05-14 2006-03-01 スリーエム カンパニー 微生物増殖の迅速な定量化の方法
US5563043A (en) * 1994-10-24 1996-10-08 Spiral Biotech, Inc. Method for measuring the bactericidal and bacteriostatic effects of antimicrobial agents
US5694478A (en) * 1994-12-15 1997-12-02 Minnesota Mining And Manufacturing Company Method and apparatus for detecting and identifying microbial colonies
US5922282A (en) 1995-06-07 1999-07-13 Ledley; Robert S. Super fast tuberculosis diagnosis and sensitivity testing method
EP0983499B1 (en) * 1997-05-23 2005-10-26 Becton, Dickinson and Company Automated microbiological testing apparatus and methods therefor
GB9714347D0 (en) * 1997-07-09 1997-09-10 Oxoid Ltd Image analysis systems and devices for use therewith
US6140069A (en) * 1998-03-07 2000-10-31 Wardlaw Partners, Ll.P. Method for determining antibiotic sensitivity of bacteria
US6284526B1 (en) * 1998-03-07 2001-09-04 Wardlaw Partners Lp Method and apparatus for determining the sensitivity of a microorganism to a growth altering agent
US6022734A (en) * 1998-03-07 2000-02-08 Wardlaw Partners, L.P. Disposable apparatus for determining antibiotic sensitivity of bacteria
US6153400A (en) * 1999-03-12 2000-11-28 Akzo Nobel N.V. Device and method for microbial antibiotic susceptibility testing

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107254505A (zh) * 2017-07-17 2017-10-17 中国家用电器研究院 一种材料样块防霉性能的评价方法
CN111512316A (zh) * 2017-10-05 2020-08-07 贝克顿·迪金森公司 用于生物样本评定处理的应用程序开发环境

Also Published As

Publication number Publication date
CA2334072A1 (en) 2001-08-17
NO20010770D0 (no) 2001-02-15
US6472166B1 (en) 2002-10-29
JP2001245694A (ja) 2001-09-11
EP1126033A3 (en) 2003-11-12
NO20010770L (no) 2001-08-20
EP1126033A2 (en) 2001-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1321773A (zh) 生长变更剂对微生物菌落影响的确定方法
Banada et al. Label-free detection of multiple bacterial pathogens using light-scattering sensor
Jepras et al. Development of a robust flow cytometric assay for determining numbers of viable bacteria
CN104871177B (zh) 检测产气微生物菌落的方法
Konopka et al. The use of carbon substrate utilization patterns in environmental and ecological microbiology
David et al. Viability and membrane potential analysis of Bacillus megaterium cells by impedance flow cytometry
London et al. An automated system for rapid non-destructive enumeration of growing microbes
Rüger et al. A flow cytometric method for viability assessment of Staphylococcus aureus and Burkholderia cepacia in mixed culture
Özel Duygan et al. Rapid detection of microbiota cell type diversity using machine-learned classification of flow cytometry data
CN106755287B (zh) 一种微生物相对含量检测计数方法
Dungan et al. Development and applications of Ray’s fluid thioglycollate media for detection and manipulation of Perkinsus spp. pathogens of marine molluscs
Lopez-Amoros et al. Use of two oxonols and a fluorescent tetrazolium dye to monitor starvation of Escherichia coli in seawater by flow cytometry
Maeda et al. Colony fingerprint for discrimination of microbial species based on lensless imaging of microcolonies
Damjanovic et al. Bacterial and algal symbiont dynamics in early recruits exposed to two adult coral species
Salvesen et al. Evaluation of plate count methods for determination of maximum specific growth rate in mixed microbial communities, and its possible application for diversity assessment
Vestrum et al. Investigating fish larvae-microbe interactions in the 21st century: old questions studied with new tools
Wang et al. Detection and Quantification of Antimicrobial-Resistant Cells in Aquatic Environments by Bioorthogonal Noncanonical Amino Acid Tagging
Zubkov et al. Coexistence of dominant groups in marine bacterioplankton community—a combination of experimental and modelling approaches
van Hoof et al. Evaluation of a biomonitor based on the phototactic behaviour of Daphnia magna using infrared detection and digital image processing
Branson Clinical relevance of minimum inhibitory concentrations (MICs)
Yun et al. Enhanced eDNA monitoring for detection of viable harmful algal bloom species using propidium monoazide
Steele et al. Assessment of FlowCam technology as a potential tool for rapid semi-automatic analysis of lacustrine Arcellinida (testate lobose amoebae)
Rodenacker et al. Quantification of biofilms in multi-spectral digital1 volumes from confocal laser-scanning microscopes
AU772490B2 (en) Method for determining the effects of a growth-altering agent on a microbial colony
O’Callaghan et al. Dynamic biospeckle analysis, a new tool for the fast screening of plant nematicide selectivity

Legal Events

Date Code Title Description
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C06 Publication
PB01 Publication
AD01 Patent right deemed abandoned
C20 Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned