JP2001245694A - 微生物コロニーに対する生長改変剤の作用の測定方法 - Google Patents

微生物コロニーに対する生長改変剤の作用の測定方法

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JP2001245694A JP2001040557A JP2001040557A JP2001245694A JP 2001245694 A JP2001245694 A JP 2001245694A JP 2001040557 A JP2001040557 A JP 2001040557A JP 2001040557 A JP2001040557 A JP 2001040557A JP 2001245694 A JP2001245694 A JP 2001245694A
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Stephen C Wardlaw
シー、ウォードロー スチーブン
Robert A Levine
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来技術の欠点を有していないと同時に、１
個または２個以上の微生物コロニーに対する生長改変剤
の作用を短時間で、また簡単に測定する方法を提供す
る。 【解決手段】 本発明は、１個または２個以上の微生物
コロニーに対する生長改変剤の作用を測定する方法を提
供する。本発明の方法は、生長培地の少なくとも１部分
に生長改変剤を配合する方法であり、（ａ）１種または
２種以上の生存可能なコロニー形成性単体を含有する接
種剤を接種する工程；（ｂ）コロニー形成性単体が微生
物コロニーに複製されるような方法で、コロニー形成性
単体をインキュベートする工程；（ｃ）生長改変剤にさ
らされた１個または２個以上の各微生物コロニーの１種
または２種以上の特徴を計測する工程；および（ｄ）計
測された特徴を評価し、各微生物コロニーに対する生長
改変剤の作用を測定する工程；を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】（発明の背景） （１．技術分野）本発明は一般に、生物学的試料中の１
種または２種以上の微生物に対する生長改変剤(growth-
altering agent) の作用を測定する方法および特に、生
物学的試料中の各微生物コロニーに対する生長改変剤の
作用を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】（２．背景情報）効果的な患者の処置に
はしばしば、生物学的試料中の微生物の同定およびこれ
らの微生物の生長改変剤に対する感受性の測定が求めら
れる。歴史的に、生物学的試料を採取し、次いで生物学
的生長培地（「培地」(cultures)と称される）に適用ま
たは添加する。次いで顕微鏡により検査し、また初期試
験を行う。最も慣用の試験方法では、適当な生長培地に
患者の試料を接種し、次いで微生物生長の証拠が見える
まで、インキュベートする。大部分の生物は、目に見え
るコロニーの形成に、少なくとも１８〜２４時間を要す
る。各コロニーは、接種剤中に含有されている単独のも
のとして、もしくは顕微鏡でやっとみえる程の細胞の小
型クラスターまたは生存可能な単体（これらを総合し
て、コロニー形成性単体またはＣＦＵと称する）として
出発する。僅かに生長するか、または生長しない初期誘
導期（この期間中に、生物体はそれ自体、その新しい環
境および体験に順応する）の後、生存可能な微生物は、
生存可能なコロニーが生成されるまで、指数関数的に生
長する、すなわち１個の細胞が１世代で２個の細胞に、
３世代で８個の細胞に、６世代で６４個の細胞に等に生
長する。
【０００３】接種剤が複数種の相違する微生物（microo
rganism）を含有する場合、各種類の生物体（organis
m）は、それ自体の特徴を有するコロニーを形成する。
このコロニーは相互に相違していてもよく、または相違
していなくてもよい。しかしながら、大部分の目的に対
しては、１種のみの生物体が生長する生物体内に存在す
ることが望ましい。例えば、特定の抗生物質に対する感
受性にかかわり生物学的試料を試験しようとする場合で
あって、試料および引き続く培養物が複数種の生物体を
含有する場合、当該培養物中の各種生物体の抗生物質に
対する感受性を測定することはできない。また各種生物
体それぞれの感受性を測定する場合、第一の固体生長培
地に初期試料接種剤を接種し、次いで第一生長培地から
単一のコロニーまたは同一コロニー群を分離し、次いで
分離したコロニーを第二の固体生長培地に入れるか、ま
たは液状培地を用いる場合は、懸濁液を形成することに
よって、「純粋」培養物（すなわち、単一種の微生物を
含有するもの）を生成する必要がある。この方法が時間
を消費する方法であり、また一般に、熟練した技術を要
することは、当業者に認識されることである。
【０００４】生物体に対する生長改変剤（例えば、抗生
物質、生長促進剤、栄養剤、消毒剤など）の作用を知る
ことが望まれる場合、従来の方法では一般に、下記の評
価方法の一つの使用が指示される。一方法では、インキ
ュベーションに先立ち、固体の接種された生長培地の或
る領域に生長改変剤を施し、次いでこの施用領域におい
て生長した生物体を評価するか、または生長改変剤が施
用されていない領域で生長した生物体と比較する。カー
ビイ−バウアー(Kirby-Bauer) プレート試験は、この種
の肉眼的方法の例である。このカービイ−バウアー法
は、生長培地全体に密集生長体が形成されるまで、生長
培地をインキュベートすることを包含する。ディスクか
ら拡散する生長培地内の効果的な生長改変剤（抗微生物
剤）を含有する領域は、当該抗微生物剤が生物体の抑制
に有効である場合には、生長した生物体を含有していな
い。このディスクを取り囲む生長がない領域の大きさを
次いで、対照と比較し、当該生物体が臨床的に有用な濃
度で生長改変剤に対する感受性を有するか否かを決定す
る。
【０００５】第二の評価方法は、被験生物体が接種され
ている液状培地に既知量の生長改変剤を添加することを
包含する。この混濁試験法は、この種の肉眼的方法の例
である。この混濁試験法では、液状試料の「混濁度」(c
loudiness)を測定し、試料の生物体含有量を測定する。
試料の混濁度の増加は、試料中の生物体含有量の増加を
表わす。第三の評価方法は、生長する生物体の代謝生成
物または構成物質の１種または２種以上に応答する着色
試薬によって、有効な生物体の生長を観察することを包
含する。これらの肉眼的評価方法のいずれかから得られ
る情報はまた、一般的に言って、本質的にマクロなもの
であり、例えば特定の濃度で添加された生長改変剤が当
該生物体（１種または２種以上）の生長に対して効果を
有するか、または有していないかを判断するだけであ
る。例えば死滅のメカニズム、生物体が隔膜形成を体験
したか否か、または培地中の生物体の集団に対するいず
れかの統計学的情報など利用できる追加の情報はほとん
どないか、まったくない。
【０００６】上記肉眼的方法が付随する問題の一つは、
生物体の可視層が発現するまで、または受容される濃度
が発現するまで待たねばならないことから生じる試験誤
差である。生長培地上または生長培地中で生長する生物
体コロニーは、食物と競合し、その結果として、生長改
変剤による生長抑制よりも、この競合により生長が抑制
されることがある。同一生物体がまた、それらの排泄お
よび代謝副生成物により、相互に影響し合うこともあ
る。特定の微生物に対する生長改変剤の作用のさらに正
確な分析は、このような干渉が生じない場合に可能であ
る。
【０００７】生物体の肉眼的評価方法が付随するもう一
つの問題は、意味ある結果を得るのに要する時間にあ
る。上記したように、肉眼的評価に適する生長を得るた
めには、いずれの場合も一般に、生物体の培養物を１８
〜２４時間、インキュベートする必要がある（生物体が
２０〜６０分毎に複製された場合、生物体の少なくとも
２０世代が必要である）。しかしながら、実際的に言え
ば、慣用の方法を用いる培養物の発生および分析は、操
作、評価などにより少なくとも４８時間を要する。微生
物生長速度は、非常に急速であり、また試験に要する時
間が長いことから、微生物感染の可能性がある患者はし
ばしば、実際の微生物およびその感受性を同定する以前
に、広スペクトル抗生物質により初期処置される。その
先の目標を定めた処置は、この試験データが得られた後
に適用することができる。しかしながら、広範囲に利用
できる広スペクトル抗生物質による処置が、特定の情報
により利用できる目標を定めた処置よりも好ましいもの
ではないことは、当業者に認識されている。実際に、広
スペクトル抗生物質は、格別にさらに高価であり、また
目標を定めた医薬よりもさらに多くの有害な副作用を有
する。また現在、広スペクトル抗生物質の過剰使用は、
生物体内に抗生物質耐性の発現を促進することがあり、
これによりそれらの効果が制限されるという格別の問題
が存在する。
【０００８】上記肉眼的方法を行う際に要する時間に付
随する問題を認識するにあたり、抗生物質感受性を迅速
に測定するために、各生物体を検査する方法を包含する
多くの方法が提供されている。これらの方法は、抗生物
質にさらされると、感染可能な細菌が、それらの形状、
大きさまたは内部化学的性質（もしくはその或る組み合
わせ）を変化することができるという事実を利用する方
法である。しかしながら、数種の細菌は、最初の数世代
が発現した後まで、抗生物質と検知できるほどには反応
しない。従って、それらの最初の数世代の生物体を考慮
するのみの試験法は、それぞれの場合について有用な情
報を提供することができず、当該生物体の挙動を予め知
っていないかぎり、無効であると考えられる。特定の微
生物にかかわる評価の例が、マイコバクテリウム ツベ
ルクロリス(mycobacterium tuberculosis)(MTB)に対す
る抗生物質感受性の測定にかかわり、レドレイ(Ledley)
により提供されている（米国特許第5,922,282 号）。
【０００９】このレドレイの方法では、各生物体のＤＮ
Ａを、生存している生物体に蛍光を生じさせるプラスミ
ドを添加することによって改変する。この生物体の蛍光
を、抗微生物剤の添加前および添加後に評価し、当該抗
微生物剤がこの蛍光によって区別され、従ってMTB 生物
体を殺滅するか否かを測定する。この単種の微生物に対
する技法は、蛍光発生手段を用いる点を除いて、公開さ
れた方法に類似するが、狭い範囲の生物体に適用できる
のみである。液体ブロス中の生長改変剤の作用を測定す
るためのもう一つの方法は、欧州特許明細書No.EP06351
26B1に記載されている。この欧州特許明細書では、抗生
物質の中から有効な抗生物質を決定する場合、各生物体
の大きさ、数または形状の変化の評価に撮影法(image p
rocessing)が用いられている。この方法の問題点は、液
体培地で行うことから、ＣＦＵ複製速度などのＣＦＵの
特徴または特定のＣＦＵに対する作用の評価が不可能で
ある点にある。
【００１０】微生物生長および代謝を監視するもう一つ
の方法が提案されており、この方法は微生物生長にさら
された場合、色を変化するようにデザインされた試薬を
添加する。さらにもう一つの別種の方法（米国特許第4,
724,215 号、同第4,720,463号および同第4,856,073 号
に記載されている）は、ビデオカメラを用いて微生物の
変化を検査する方法である。我々の知るかぎり、これら
の方法の全部は、本質的にマクロな方法であり、従って
それらの初期段階における各微生物コロニーにかかわる
情報を提供するものではなく、従って非常に短い経過時
間内に信頼できる抗生物質耐性情報を提供することはで
きない。これらの方法は、マクロな（macroscopic）情
報、すなわち当該生長改変剤が微生物生長に対して検知
できる効果を有するか、または有していないかという情
報を提供するのみである。
【００１１】指定の集団内の全部の細菌は、特定の生長
改変剤に対して同一様相で応答するものではない。現在
の技術のいずれかを用いて容易に計測することができな
い、微生物集団の全部における生長改変剤に対する耐性
には変化が存在する。この集団のデータが常習的に利用
可能である場合、問題の微生物に対する抗生物質耐性の
発現の可能性を予測することができ、従って処置の最適
長さを決定する助けとすることができる。微生物に対す
る生長改変剤の効果を検査する前記方法の全部は、二つ
の基本的カテゴリーに分類することができるものと考え
られる。第一のグループでは、補助されていない裸眼で
見ることができる生物体の生長の効果、例えば目に見え
るコロニーの形成またはこのような生長に付随する色の
変化を検査する。第二のグループでは、指数関数生長以
前の液状培地中の単一の生物体内の変化に依存する。生
長改変剤に対する微生物の反応を測定する方法が必要と
することには、微生物を同定することができること、現
時点で商業的に利用することができる方法が要する時間
の一部分に相当する時間で前記情報を提供することがで
きること、および目に見える肉眼的生長を必要とせず、
また単一の生物体の検査に制限されないことがある。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】（本発明の説明）本発
明の課題は、最初の数時間のインキュベーション時間内
に微生物コロニーに対する生長改変剤の作用を測定する
方法を提供することにある。本発明のもう一つの課題
は、微生物の生長に有害に作用する栄養物質またはイン
ヒビターを測定することによって当該微生物を同定する
方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、微生物に対す
る生長改変剤の作用を測定する方法を提供する。本明細
書で使用されているものとして、「微生物コロニー」(m
icrobial colony)または「微小コロニー」(microcolon
y) の用語は、裸眼で容易に見ることができるようにな
る以前の発現の初期段階にある微生物コロニーを表わ
す。本明細書で使用されているものとして、「生長改変
剤」(growth-altering agent) の用語は、微生物生長の
改変、抑制または増強する薬剤を包含する。生長改変剤
の例には、これらに制限されないものとして、抗生物
質、消毒剤、栄養物質、または生長促進剤が包含され
る。生長改変剤はまた、温度、湿度、光、気体状環境な
どの環境型反応剤であることもできる。
【００１４】本発明の方法で評価される微生物コロニー
はそれぞれ、接種剤(inoculum)中に存在するコロニー形
成性単体(colony-forming unit) （ＣＦＵ）から形成さ
れる個別の微生物コロニーである。それらのＣＦＵから
一度、倍化されたコロニーから２０倍または「数倍」に
倍化されたコロニーまでを包含する生長範囲にあるコロ
ニーを用いる本発明の方法によって、意味ある情報を得
ることができる。本発明の方法により意味ある情報を提
供することができるコロニーの生長範囲は、成長時間、
コロニーの大きさまたはプロジェニー（progeny）で説
明することができる。多くの場合、本発明の方法で利用
する微生物コロニーは一般に、ヒトの裸眼では見ること
はできない。従って、裸眼で見ることができるのに総合
して十分に大きく、相互に連続している複数の微生物コ
ロニーを肉眼により評価する従来技術の方法に対して、
本発明の方法は、顕微鏡的方法であると言うことができ
る。さらにまた、本発明の方法では、生長特徴が確実に
計測される。
【００１５】本発明の方法は、固体または半固体の生長
培地およびこの生長培地の少なくとも一部分に配合され
た生長改変剤を用いる方法であって、下記工程を包含す
る： (a) 生長培地に、１個または２個以上の生存可能なコロ
ニー形成性単体を含有する接種剤を接種する工程； (b) 上記コロニー形成性単体が微生物コロニーに複製さ
れるような方法で、このコロニー形成性単体をインキュ
ベートする工程； (c) 生長改変剤にさらされた１個または２個以上の各微
生物コロニーの特徴の１種または２種以上を計測する工
程；および (d) 計測された特徴を評価し、各微生物コロニーに対す
る生長改変剤の作用を測定する工程。
【００１６】この計測工程期間中に、生長改変剤にさら
された微生物コロニーの特徴および或る場合には、対照
標準に配置された微生物コロニーの特徴が計測される。
コロニーの特徴は、当該コロニーに対する生長改変剤の
作用にかかわる意味あるデータを提供することができる
いずれかのものであることができる。作用の測定に代表
的に有用であるコロニー特徴には、これらに制限されな
いものとして、コロニー面積、周囲の長さ、周囲の長さ
対面積比、縁端の粗さ、縁端の輪郭、およびコロニー密
度の均一度が包含される。特徴の計測に用いられる方法
は、用意された測定法、計測される特徴、および有用な
データを提供するのに要するレベルの特異性に適するよ
うに変えることができる。計測方法には、これらに制限
されないものとして、測定、比較、および検査型の工程
が包含される。計測は、経過時間の関数として行われ
る。全部の場合、これらの特徴を計測して、変化を推定
する。多くの場合、この変化は経過時間における２つま
たは３つ以上の時点（例えば、Ｔ1、Ｔ2、Ｔ3……，
ＴN）で特徴を比較することによって測定される。
【００１７】しかしながら、或る種の場合、経過時間の
１時点において特徴（１種または２種以上）を計測する
ことによって、意味ある情報を得ることもできる。微生
物コロニーを計測しなければならない時間数は、採集す
るデータの詳細度、すなわち生長改変剤の作用にかかわ
り臨床的に十分の測定をなすのに必要な時間数に応じ
る。この計測工程期間中に用いられる装置は代表的に、
映像に記録された特徴を測定し、比較し、検査し、また
は別段の方法で計測することを可能にするのに十分に明
確である画像をもたらす撮影装置（例えば、デジタルカ
メラなど）である。バースキャナー(bar scanners)また
はフライイング−スポットスキャナー(flying-spot sca
nners)などの別種の撮影装置もまた、使用することがで
きる。微小コロニー画像は、リアルタイムでおよび／ま
たは時間を節約して、利用することができる。
【００１８】微生物コロニーに対する生長改変剤の作用
の測定は、計測された特徴を評価することによって達成
することができる。計測された特徴を評価する方法は、
計測工程と同様に、用意された測定法、計測される特
徴、および有用なデータを提供するのに要するレベルの
特異性に依存する。或る種の場合、この評価は、計測さ
れる特徴が存在するか否か（例えば、コロニー生長が存
在するか、またはコロニーの縁端が粗いかなど）を検査
するのみであることもあり、またこの評価は、経過時間
の１時点で、または経過時間の複数の時点で採取された
特徴データを用いて行うこともできる。このような場
合、微生物コロニーに対する生長改変剤の作用の測定
は、計測された特徴のみに基づいてなすことができる。
別の場合、この測定は、対照標準の観点から計測された
特徴を評価することによってなすこともできる。
【００１９】対照標準は、問題の微生物コロニーの特徴
の評価に有用なデータを提供するいずれかの情報源であ
ることができる。例えば、接種剤が公知微生物を含有し
ている場合、この評価は類似の環境条件における微生物
の正常な生長特徴に関連するデータ、例えば臨床的に明
らかになったデータを提供する対照標準を用いて行うこ
とができる。別法として、この評価は、対照標準を同一
接種剤が接種されており、類似条件でインキュベートさ
れた生長培地の区分であって、生長改変剤に全くさらさ
れていないか、または相違する濃度の生長改変剤にさら
されている区分の形態で使用して行うことができる。こ
の生長培地の対照標準部分の特徴と生長培地の生長改変
剤が施用されている領域の特徴とを計測し、相互に評価
する。かなりの場合、この比較評価は、決定に十分なデ
ータをもたらす。別種の評価では、この逆を用いること
ができる。
【００２０】本発明の方法は、特定の生長改変剤に対す
る生物の感受性の測定に現時点で利用できる方法に優る
数種の格別の利点を提供する。一つの格別の利点は、生
物に対する生長改変剤の作用にかかわり測定をすること
ができる速度にある。この利点は、本発明の方法を１種
または２種以上の生物に対する抗生物質の効果の測定に
使用した場合に特に実現される。上記したように、初め
は、患者の試料からの特定の情報が欠落していることか
ら、多くの場合に、広スペクトル抗生物質が投与され
る。広スペクトル抗生物質は有害な副作用という重大な
危険に患者をさらし、それらの過剰使用が生物体内にお
ける抗生物質耐性の発現を助長し、またこれらがまた、
非常に高価であることから、狭く標的が定められている
抗生物質に比較して好ましくない。本発明の方法を使用
することによって、ほとんど完全に、抗生物質感受性情
報を２時間またはそれ以下の時間で提供することができ
る。この時間は、現時点で利用できる方法を用いて可能
である代表的所要時間よりも劇的に短い。その結果とし
て、多くの場合、患者を広スペクトル抗生物質で初期処
置する代わりに、出発時点で狭く標的が定められた抗生
物質を効果的に使用することができる。
【００２１】本発明の方法は、個別のコロニーから採取
した特徴データを用いて、生物体に対する生長改変剤の
作用を測定するという事実から、数種の利点がまた、生
じる。上記したように、本発明の方法では、同一または
同一種の生物体ではないこともある培養物中のコロニー
の肉眼的凝集物が生じる以前に、インキュベーション工
程における非常に初期のコロニー（一般に、２度〜２０
度に倍化したコロニー）を使用する。個別のコロニーデ
ータから生じる利点の一つは、かなりの場合に、「不純
な」(impure)培養物を使用することができることにあ
る。データが個別の顕微鏡的コロニーから採集されてい
ることから、種々の生物体が肉眼的不純培地中で凝集す
る固体培地における肉眼的方法の場合または１種の生物
体の生長と他の１種の生物体の生長とを区別することが
困難である液状懸濁液で凝集する場合のように、相違す
るタイプのコロニーを分離する必要性が減少される。肉
眼的に不純な培地に生長改変剤を適用すると、種々の相
違する生物体に対する生長改変剤の作用を分別すること
ができないことから、制限された情報がもたらされる。
尿または脳脊髄試料から生成された培養物は、たぶん不
純培地の例であるが、本発明の方法は、これらを最初に
分離することなく、相違する構成を有する生物体の評価
に使用することができる。
【００２２】個別のコロニーデータから得られるもう一
つの利点は、生長改変剤の作用に適切なデータを統計学
的に分析することができることにある。統計学的データ
は、例えば生物体の抗生物質に対する耐性の測定に有用
であることがある。生物体の抗生物質に対する耐性に関
連する情報はまた、最適処置期間にかかわる価値ある情
報を提供することができる。一例として、生物体が高濃
度であるが、全部の抗生物質に対して耐性であり、また
感受性メカニズムが効果的になるには数世代を要するこ
とが見出されている生物体の場合、抗生物質による処置
は、抗生物質により直ちに作用される感受性の高い生物
体の場合に比較して、長期間を要する。
【００２３】個別のコロニーのデータはまた、生長改変
物質により非特徴的に影響されている生物変異体の同定
を有利に可能にする。一例として、個別のコロニーの成
長速度を統計学的に比較することができる。生長速度範
囲が予想される対照の標準誤差を越える場合、これは当
該生物体が通常よりも耐性であり、また耐性が発現する
可能性があることを示唆している。全部の微生物治療は
グループ内の最も耐性の生物体に向けられなければなら
ないことを強調することは重要である。この理由は、こ
れらの生物体が、さらに感受性の生物体が排除された後
でさえも、増殖するからである。
【００２４】本発明の方法のもう一つの利点は、正確な
生長改変剤感受性情報を容易に提供できることにある。
カービイ−バウアー試験の欠点は、生長培地内のいずれ
か指定の地点の抗生物質濃度が影響する可変要素が多い
ことにある。クリアー領域の広さに基づく抗生物質濃度
を計算することができる方程式が提示されているが、こ
れらの方程式はほとんど使用されず、また最高でも、推
定値であると考えられている。カービイ−バウアー法に
おける抗生物質濃度測定に影響を及ぼすことができる可
変要素の一つは、隣接生物体間の競合にある。標準プレ
ート試験法では、生物体が食物と競合関係にあり、従っ
て生長改変剤の結果よりも、競合の結果である抑制され
た生長を体験することがある。生物体はまた、それらの
排泄および代謝副生成物により相互に影響し合うことも
ある。本発明の方法は、生物体が裸眼で見ることができ
る程度にまで増殖するまで待つ代わりに、接種後の短時
間でコロニーを検査することによって、これらの種類の
干渉を排除することができる。
【００２５】本発明の方法のもう一つの利点は、その多
能性にある。一例として、本発明の方法では、生物体が
生長培地に添加された時点から、当該生物体に対する生
長改変剤の作用にかかわるデータの収集が可能である。
従って、本発明の方法は最初の数世代の微生物の検査に
制限されず、裸眼で見ることができる後続世代ばかりで
なく、また当該微生物の発育全体を通して使用すること
ができる。本発明の方法の多能性を示すもう一つの例
は、１回の試験で生長改変剤の特定の濃度、または生長
改変剤の勾配濃度を詳しく調べることができることであ
る。この勾配濃度の検討は、例えば特定の生物体に対す
る抗生物質の最低抑止濃度を決定するために抗生物質と
多段階にわたって希釈することを、回避する手段を提供
する。本発明の方法の多能性を示すさらにもう一つの例
は、この方法を獣医学で使用できることにある。
【００２６】本発明の方法はまた、特定の生物体の同定
に容易に使用することができる。一例として、特定の試
験における対照標準が糖を含有していない生長培地であ
り、この生長培地の試験領域が糖を含有している場合、
糖を代謝することができる生物体は、対照領域に比較し
て試験領域で急速に生長する。従って、多数の生長増強
物質および生長遅延物質を使用して、問題の生物体を同
定することができる。
【００２７】本発明の方法のもう一つの利点は、統計学
的に少ない回数で、それでも微生物に対する生長改変剤
の作用に対しては有意の関連性を有することができる作
用、反応または反応の欠落にかかわる情報を提供する能
力を有する点にある。この利点は、本発明の方法がマク
ロなコロニーよりも、微小コロニーを評価する方法であ
るという事実から派生している。生長培地内の一定の領
域に存在する微小コロニーの数は同一面積内の肉眼的コ
ロニーの数よりもはるかに多い。従って或る領域の評価
に統計学的に有意の多くの集団が提供される。例えば、
或る種の細菌は低い変異率を有し、たとえば、１／１０
4〜１／１０6が或る状況下に特定の抗生物質に対して耐
性である場合、この耐性株（１種または２種以上）の生
長が検出されない場合、この株が実際には耐性であるの
に、この株は抗生物質に対して感受性であるものと誤っ
て報告されてしまう。
【００２８】この利点は、例をあげることによりよく理
解されるものと思われる。慣用の寒天プレート上のマク
ロなコロニーの撮影にビデオカメラが使用される場合
（現在、コロニーの数の測定に使用される或る種の装置
とともに使用されている）、この寒天プレートは、上記
耐性細菌の発生に統計学的に必要である数の融合してし
まっていないマクロなコロニーを含有するには十分の余
地を有していない。一例として、それぞれ２ｍｍの間隔
で離れているマクロなコロニーにより覆われている１０
ｃｍ径のプレートは、約２０００個のこのようなコロニ
ーを保持することができるのみである。この数値は、こ
のような変異株の検出には統計学的に不十分な集団であ
る。この統計学的に不十分な集団は、何故に抗生物質感
受性にかかわり用いられる慣用の寒天プレートが密に覆
われており、これにより密集生長が生じているかのもう
一つの理由である。これに対して、本発明の方法では、
接種すると微小コロニーになるＣＦＵを、１０ミクロン
（１０μ）離れているのみで近接して接種することがで
き、これにより微小コロニーが相互に密集する以前に、
評価を行うことが可能にされるとともに、統計学的に適
度の１０4微小コロニー／平方センチメーターの評価が
可能になる。
【００２９】本発明のもう一つの利点は、この方法を生
長改変剤の存在の検出に使用することができる点にあ
る。この例には、牛乳試料中の抗生物質または別種の生
長改変剤の存在の測定用途がある。現時点の牛乳試験法
は、試験される抗生物質の種類が既知であることが必要
である。すなわち、試験は特定の抗生物質に対して特別
に設計される。本発明の方法では、牛乳を生長培地中に
混合し、次いでこの生長培地に接種剤を接種する。この
接種剤は、牛乳中の生長改変剤（例えば、抗生物質残留
物）の存在によりまた影響を受けるものである。この接
種剤に由来する微小コロニーの生長が付近の条件下にお
ける正常生長とは相違している場合、既知または未知の
抗生物質が牛乳試料中に存在する。本発明のこれらのお
よびその他の課題、特徴および利点は、添付図面に示さ
れているように、本発明の最良の態様の詳細な説明から
明白なるものと見做される。
【００３０】（図面の簡単な説明）図１Ａ〜１Ｄは、エ
ンテロバクター アエロゲネス(enterobacter aerogene
s)に覆われている固体培地の画像を包含している。図１
Ａおよび図１Ｃは、未処理像を示しており、また図１Ｂ
および図１Ｄは、像がデジタル処理されており、それら
の特徴を計測する以前のコロニーの位置を示している。
図２Ａ〜２Ｄは、イー・コリ(E.coli)コロニーの画像を
包含しており、その幾つかは、抗生物質にさらされたも
のである。図２Ａおよび２Ｂは、プレート形成直後に撮
影したものであり、また図２Ｃおよび２Ｄは接種してほ
ぼ２時間後に撮影したものである。図３Ａ〜３Ｄは、イ
ー・ファエカリス(E.faecalis)の画像を包含しており、
その幾つかは、抗生物質にさらされたものである。図３
Ａおよび３Ｂは、プレート形成直後に撮影したものであ
り、また図３Ｃおよび３Ｄは接種してほぼ２時間後に撮
影したものである。図４Ａ〜４Ｄは、イー・ファシウム
（E.faecium)の画像を包含しており、その幾つかは、抗
生物質にさらされたものである。図４Ａおよび４Ｂは、
プレート形成直後に撮影したものであり、また図４Ｃお
よび４Ｄは接種してほぼ２時間後に撮影したものであ
る。
【００３１】
【発明の実施の形態】（発明の詳細な説明）微小コロニ
ーに対する生長改変剤の作用を測定するための本発明の
方法は、微生物コロニーの生長を支持することができる
１種または２種以上の生長培地、好ましくはゲル、半固
体または透過性固体形態の生長培地を使用する。使用中
に再水和することができる脱水した生長培地は、これら
が延長された期間にわたり容易に保存することができる
ことから、特に好適である。接種後に清明であるか、ま
たは中程度にのみ透明である生長培地はまた、以下で説
明する計測工程および評価工程を補助することから、好
適である。しかしながら、以下で説明するような適当な
照明を使用する場合、微小コロニーは、いずれの生長培
地でも計測し、また評価することができる。１種または
２種以上の生長培地を使用して、用途に合わせることが
できる。
【００３２】「生長改変剤」の用語は、微生物の生長を
変更、抑制または増強する全部の化学剤および環境要素
であることができる。化学的生長改変剤には、これらに
制限されないものとして、抗生物質、消毒剤、栄養物質
および生長促進剤が包含される。環境型の生長改変要素
には、これらに制限されないものとして、温度、湿度、
光および気体状環境要素(environmental agents)が包含
される。化学型の生長改変剤は、種々の方法で生長培地
中に配合することができる。生長培地の一部分のみに生
長改変剤を配合することが望まれる場合、生長改変剤
を、ゲルまたは別様には、固体または半固体担体を用い
て配合し、これを生長培地の選択された部分に配置す
る。別の場合、生長改変剤は、生長培地全体に浸透する
液状担体を用いて配合することができる。環境型生長改
変要素は、生長培地を特定の環境要素にさらすことによ
って、例えば一対の生長培地を相違する温度、相違する
湿度または光などに維持することによって、組み入れる
ことができる。
【００３３】尿、脳脊髄液、身体空洞体液または予め分
離されたコロニー（１個または２個以上）の生物体の懸
濁液などのその他の試料源の試料からの生物体を含有す
る接種剤を用いて、生長培地に接種する。生長培地に対
する接種技術は、当業者にとって周知であり、詳細には
説明しない。接種した生長培地を、接種剤中の成分を微
生物コロニーに複製するような方法でインキュベートす
る。本明細書において、微小コロニーに複製される接種
在中の成分を、コロニー形成性単体（ＣＦＵ）で表わ
す。ＣＦＵは接種剤中に存在する生存可能な単一の生物
体細胞または生物体細胞塊であることができる。生長培
地に接種し、次いでインキュベーションを開始した後、
各ＣＦＵは、少なくとも１度、倍化し（抑制因子が存在
しない場合）、微小コロニーになる。本発明の方法で
は、ＣＦＵが四ないし八（４〜８）度、倍化する以前
に、ほとんど常時、二十（２０）度またはそれ以上に倍
化する以前に、意味ある情報を提供することができる。
本明細書で使用されているものとして、「倍化」(doubl
ing)の用語は、個別の生物体に対して、微小コロニーの
面積または容積の倍化を表わすことに留意するべきであ
る。微小コロニーの「倍化」は、生物体の数の倍化また
はそれらの平均の大きさの倍化、もしくはその或る組み
合わせによるものである。しかしながら、単一の生物体
の生長は制限され、特に数世代にわたり制限されること
から、本明細書において、この「倍化」は多くの場合
に、生物体の大きさの変化よりも実際の再生生長を表わ
す。
【００３４】意味ある情報を生じることができる期間は
また、ＣＦＵがインキュベーション中に倍化される時間
数を表わすというよりも、コロニー成長時間またはコロ
ニーの大きさを表わす用語として定義することができ
る。一例として、評価する生物体が既知である場合、情
報は類似条件下における生物体倍化時間にかかわる情報
である。この場合、この時間は、どの程度の時間で生物
体が倍化されたかを直接に特定するというよりも、測定
における制御パラメーターとして使用することができ
る。生物体の大きさおよびその微小コロニーの面積また
は容積が或る程度にまで増加する速度は、生物体の種類
および当該生物体の生長速度に対する生長改変剤の作用
を見抜く情報を提供することができる。意味ある情報を
もたらすことができる期間はまた、プロジェニー（prog
eny）の用語で定義することができる。詳細に言えば、
この測定は、個別の微小コロニー（これらのコロニーは
それぞれ、特定の祖先から生長したものである）が相違
する祖先から生長した別の微小コロニーと結合するか、
または連続するようになる以前に、行うことができる。
意味ある情報をもたらすことができる期間はまた、微小
コロニーの生長が実質的数の微小コロニーを生じ、相互
に融合してしまうまでの期間であると定義することがで
きる。
【００３５】評価期間をどのように定義するかに関し
て、本発明の方法により用いられる微小コロニーは一般
に、ヒトの補助されていない裸眼によっては見ることが
できない。従って、本発明の方法は、裸眼で見ることが
できるのに総合的に十分に大きい、相互に連続している
複数の微小コロニーを肉眼で評価する従来技術とは異な
り、顕微鏡的であると言うことができる。インキュベー
ションが開始され、コロニー形成性単体の若干が評価に
適する微小コロニーになった後、これらの生長改変剤に
さらされた微小コロニーの１個または２個以上を検査
し、これらのコロニーの永続的特徴を経過時間の一時点
またはそれ以上の時点で計測する。計測するコロニー特
徴は、生長改変剤に対するコロニーの露呈の作用を見る
ことができるような特徴に基づいて選択する。特徴の好
適計測方法は、生長改変剤にさらされた微小コロニーを
含有する生長培地の一部分の電気式撮影を包含する。こ
の試験に、対照標準として生長改変剤にさらされていな
いか、または相違する濃度の生長改変剤にさらされた生
長培地上の微小コロニーを含有する場合、この対照標準
生長培地の一部分を同様に電気式で撮影する。
【００３６】生長培地（１種または２種以上）およびそ
こに含有されている１個または２個以上の微小コロニー
の電気的撮影には、種々の装置を使用することができ
る。パーソナルコンピューターを用いて表示することが
できる電気的に撮影した画像ファイルを生成するデジタ
ルカメラは、実用に便利である。このデジタルカメラ
は、通常の顕微鏡に、または審査中の米国特許出願出願
番号09/255,673に記載されているもののような自動式顕
微鏡に設置することができる。微小コロニーを生長培地
に対して容易に同定することができない場合、生長培地
に対する当該微小コロニーのコントラストを助ける技術
を使用することができる。伝送照明(transillumination
s)は、微小コロニーが生長培地の大部分とは明らかに相
違する屈折率を有するという事実を利用する受け入れら
れる照明技術である。詳細に言えば、微小コロニーを通
過する光は、生長培地を通過する光とは相違して散乱
し、従って、微小コロニーは生長培地よりも暗く見え
る。光散乱物性を利用する別の技術には、狭角度の照明
法(narrow-angle illumination) または暗所検査法(dar
k-field examination)が包含される。
【００３７】微小コロニーを生長培地と区別するもう一
つの手段は、微小コロニーの染色または微小コロニーを
含有する生長培地の染色を包含する。一例として、微小
コロニーにより吸収される着色／染色剤（例えば、アク
リジンオレンジ）を生長培地に配合し、これら２種間の
コントラストを得る。別法として、これら２種間のコン
トラストは、生長している微小コロニーにより占領され
ている生長培地に、色または蛍光を付与する「ネガ」(n
egative)染色により提供することもできる。微小コロニ
ーの位置および大きさはまた、デジタル処理ソフトウエ
アーにより提供することができ、この場合、微小コロニ
ーの縁端を検出することができ、微小コロニーの内部領
域を微小コロニーの外部領域から区別して、またはその
逆の様相で、デジタル式に「ぬりつぶす」(fill)するこ
とができる。別種の電気式撮影装置（例えば、リアルタ
イム連続撮影装置）をまた、テストの性質に応じて使用
することもできる。
【００３８】上記したように、本発明の方法は、経過時
間の関数として１個または２個以上の微小コロニーの特
徴（１種または２種以上）の計測を包含する。微小コロ
ニーの特徴の一回以上の計測が必要である場合、撮影装
置は一時点またはそれ以上の時点における生長培地上の
特定の位置に設置しなければならない。この特定の位置
への設置は、種々の相違する方法で達成することができ
る。一例として、撮影装置および生長培地の一方または
両方の移動および位置は、機械的にまたは電気機械的に
制御することができる。生長培地上の位置はまた、生長
培地にほぼ密接している位置または密接している位置の
認識可能な特徴を用いることによって位置設定すること
ができる。固定パターンで生長培地上に分布されている
複数の非反応性ビーズを、生長培地上のナビゲーターブ
イ(navigation bouys)として使用することもできる。こ
のような方法は、米国特許出願出願番号第09/366,881号
に記載されている。その他の設置法またはメカニズムも
また、別法として使用することができる。
【００３９】特徴（１種または２種以上）は、当該特徴
を検査、測定または比較することによって計測すること
ができる。例えば、或る場合には、１個または２個以上
の微小コロニーの縁端の粗さを検査することによって、
有用なデータを採集することができる。別の場合、１個
または２個以上の微小コロニーの面積を測定することに
よって、有用なデータを採集することができる。さらに
また別の場合、１個または２個以上の生長改変剤にさら
された微小コロニーの面積を、生長改変剤にさらされて
いない微小コロニーの面積または相違する濃度の生長改
変剤にさらされた微小コロニーの面積と比較することに
よって、有用なデータを採集することができる。生長改
変剤にさらされたコロニーを、その作用が既知である生
長改変剤にさらされた別のコロニーと比較することによ
って、有用なデータを採集することもできる。どのよう
なコロニー特徴を計測することができるかに関するさら
に詳細な例は、以下に示す。
【００４０】１種の特徴または複数の特徴を、生物体に
対する生長改変剤の作用に関して臨床的に十分な情報を
確実に得ることができるのに十分な時間にわたり計測す
る。或る状況下では、コロニーの特徴の計測は、一回で
十分である。一例として、特定の特徴（例えば、生長、
異様な微小コロニーの形態など）の存在の臨床的測定は
一回で十分である。別の状況下には、臨床的に十分な情
報の獲得には、１種の特徴または複数の特徴を複数の時
点で計測する必要があることもある。例えば、特定の作
用が経過時間にわたり存在することを確認する臨床的に
十分な情報は、１種の特徴または複数の特徴を定期的に
計測する必要がある。
【００４１】微小コロニーの検査における利点は、多く
の場合に、この動態学的技術を用いることによって、最
も早い時点における相対情報を見出すことができ、従っ
て迅速に臨床上の結果を得ることができることにある。
複数の時点において特徴を計測することによってまた、
追加の望まれる情報を得ることができる。一例として、
いずれかの抗生物質が存在する場合、かなりの生物体は
初期生長パターンを示し、次いで抗微生物剤の作用が取
り込まれるに従い、生長は遅くなり、次いで停止または
減退する。別の場合、生物体は、非常にゆっくりと生長
し、次いでこれらが最終的に抗微生物剤を突破するとそ
の生長を増進する。両方の場合、耐性パターンまたは耐
性の欠落は、数世代の生長を検査することによって明白
にすることができる。抗生物質耐性のメカニズムをま
た、微小コロニーの形状および密度の変化を検査するこ
とによって明白にすることができる。一例として、殺滅
作用というよりも、静菌作用を有する抗生物質は、ＣＦ
Ｕの持続性により見出だすことができる。これに対し
て、殺滅作用を有する抗生物質は、ＣＦＵの消滅を示す
か、または若干の生長後、微小コロニーの大きさが突然
に小さくなる。この相違は、殺滅作用がより強力であ
り、通常、短い処置期間を要することから、重要である
ことがある。
【００４２】特徴（１種または２種以上）が一度、計測
されたならば、当該生長改変剤が微小コロニーに対する
作用性を有するか否かを決定するために評価する。計測
された特徴の評価に用いられる必須条件は、当該試験、
特徴および有用なデータを提供するのに要する特異性の
度合に依存する。いくつかの場合、この評価の必須条件
は、計測される特徴が存在するかまたは存在しないかと
いう簡単なものである。特徴を計測し、その存在を特定
する。次いで当該生長改変剤が効果を有するか、または
有していないかという決定を、この特徴の存在、例えば
コロニーが生長しているか、微小コロニーの縁端が粗い
かなどの存在により仮定する。このような場合、計測さ
れた特徴それ自体が、決定を可能にする。別の場合、対
照標準から計測された特徴を評価すると好ましい場合も
ある。
【００４３】対照標準は、微小コロニーの考慮される特
徴の評価に有用なデータを提供する全部の情報源である
ことができる。例えば、接種剤が既知の生物体を含有す
る場合、この評価は、臨床上で見出されたデータなどの
ような、類似環境条件下における当該生物体の正常な生
長特徴に関連するデータを提供する対照標準を用いて行
うことができる。一例として、与えられた生物体が、或
る環境下に三十（３０）分毎に１回、倍化する速度で生
長することが知られており、これに対して実際の倍化速
度（例えばコロニー面積または容積の変化）が既知の速
度よりも遅い場合、当該生長改変剤は生物体の増殖およ
び生長を遅らせるものと推定される。別法では、この評
価は、同一接種剤が接種されており、類似条件下にイン
キュベートされているが、生長改変剤にさらされていな
いか、または相違する濃度で生長改変剤を含有する生長
培地の一区分の形態である対照標準を用いて行うことが
できる。生長培地の対照標準区分の１個または２個以上
の微小コロニーの特徴と生長培地の生長改変剤が添加さ
れた領域の１個または２個以上の微小コロニーの特徴と
を計測し、通常、比較により相互に評価する。
【００４４】上記したように、微小コロニーに対する生
長改変剤の作用を測定する本発明の方法は、現時点で利
用できる方法に優る相当な利点を提供する。本発明の方
法の使用例を以下に示す。これらの例は、本発明の方法
を完全に実施できるものとすることができる。しかしな
がら、本発明は、これらの例に制限されるものではな
い。
【００４５】
【実施例】例１ 図１Ａ〜１Ｄは、エンテロバクター アエロゲネス(ent
erobacter aerogenes)が接種された固体生長培地の画像
を包含している。図１Ａは、接種直後に撮影した生長培
地の領域を示している（以下の記載において、この時間
を「Ｔ1」で表わす）。図１Ｃは、図１Ａと同一領域を
示しているが、この画像は接種して約２時間後に撮影し
たものである（以下の記載において、この時間を
「Ｔ2」で表わす）。図１Ｂおよび１Ｄは、図１Ａおよ
び図１Ｃとそれぞれ、正確に同一画像であるが、図１Ｂ
および１Ｄは、微小コロニーの特徴の計測工程を補助す
るためにデジタル処理されている。
【００４６】この例において、有用な情報を得るために
容易に計測（guantify）することができる特徴は、微小
コロニーの面積および形状である。このデジタル処理
は、問題の微生物の縁端を検知し、これらをより鮮明に
するために微小コロニーを対照色で塗りつぶすことによ
って、微小コロニーの面積および形状の計測操作を容易
化する。このデジタル処理はまた、問題の微小コロニー
の位置決定に使用することもできる。例えば、微小コロ
ニーの面積が有用な情報量に影響する場合、デジタル処
理ソフトウエアを用いて、一定の表面に等しいか、また
は一定の表面よりも大きい表面積を有する微小コロニー
のみの位置の決定に使用することができる。ソフトウエ
アパッケージの例には、スペクラム アナリティックス
オブ ビエンナ(Spectrum Analytics of Vienna)(Vir
ginia,米国) から市販されている「IPLabs Spectrum」
があり、これは微小コロニーのデジタル画像および計測
に使用することができる。
【００４７】問題の微小コロニーの面積を計測した後、
各微小コロニーの面積値を、比較評価し（Ｔ1対Ｔ2）、
生長改変剤の作用を測定する。いくつかの試験におい
て、数回の評価（すなわち、Ｔ1、Ｔ2、Ｔ3、Ｔ4など）
の実施が有用であることがある。この評価は、平均微小
コロニーの面積に基づき、もしくは微小コロニーの生長
改変剤を含有するか、または含有していない領域の分布
により行うことができる。上記第一の場合、生長改変剤
が成長速度を増加（または減少）させる場合、微小コロ
ニーの生長改変剤を含有する領域の面積は、対照標準に
おける微小コロニーの面積に比較して、広くなる（また
は狭くなる）。上記第二の場合、平均よりも急速に生長
する或る微小コロニーが存在することがあり、また平均
面積は同一であっても、コロニーの面積の分布は、生長
改変剤を含有する領域と対照標準の領域とでは相違す
る。２度以上の評価が行なわれた場合、成長速度の変化
を、一連の評価時点間の特徴を評価することによって測
定することができる。
【００４８】微小コロニーの特徴、特に微小コロニーの
生長を計測する工程および評価する工程を説明するため
に、図１Ａ〜１Ｄに示されている生長培地は、生長改変
剤にさらされていない。図１Ｃおよび１Ｄに含まれてい
る画像は、微小コロニーの生長を明白に示している。こ
の例から、微小コロニーが約３〜５ミクロン径のみであ
って、裸眼で見ることができる前の時点である２時間経
過時点で有用な情報を得ることができることが当業者に
認識されるものと見做される。容易に認識できるよう
に、生長の測定、すなわち生長改変剤の作用の測定は、
この２時間のインキュベーション期間内に行うことがで
きる。
【００４９】例ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ 図２Ａ〜２Ｄ、図３Ａ〜３Ｄおよび図４Ａ〜４Ｄは、相
違する生長改変剤にさらされた各種微生物のデジタル画
像を示している。ここでもまた、各図のパネル「Ａ」お
よび「Ｂ」に含まれている画像は、接種直後に撮影した
ものであり、また各図のパネル「Ｃ」および「Ｄ」に含
まれている画像は、約２時間のインキュベーション後に
撮影したものである。図２Ａ〜２Ｄ、図３Ａ〜３Ｄおよ
び図４Ａ〜４Ｄの画像の中で、デジタル処理することに
よって増強したものはない。各図のパネル「Ｂ」および
「Ｄ」に含まれている画像は、生長培地の生長改変剤に
さらされた領域を示している。各図のパネル「Ａ」およ
び「Ｃ」に含まれている画像は、生長培地の生長改変剤
にさらされていない領域を示しており、これは対照標準
領域として使用することができる。
【００５０】ａ．例ＩＩ 図２Ａおよび２Ｂに含まれている画像は、イー・コリ
(E.coli)を接種した直後のカービイ−バウアー生長培地
の領域を示している。図２Ｃおよび２Ｄに含まれている
画像は、２時間のインキュベーション期間後の同一領域
を示している。図２Ｃに含まれている画像は、生長改変
剤の不存在下において生長させたイー・コリ(E.coli)微
小コロニーを示している。図２Ｄに含まれている画像
は、標準的臨床濃度である２μｇ／ｍｌの量で抗生物質
セホタキシム(cefotaxime)にさらされたイー・コリ(E.c
oli)微小コロニーを示している。最小抑止濃度（ＭＩ
Ｃ）を測定する場合のように、微生物感受性を見出すこ
とが望まれる場合、それぞれ或る濃度で生長改変剤を含
有する一連の別々の領域を使用することができ、これら
の分離した領域のそれぞれで相対生長を評価することが
できる。別法として、審査中の米国特許出願Ｎｏ．０９
／２５５，６８１に記載されているように、生長改変剤
を勾配濃度で使用することができ、微小コロニー生長を
連続する濃度にわたり比較することができる。図２Ｄに
示されている微小コロニーは、増大した周囲長さ／面積
比を示しており、これは当該抗生物質が微生物コロニー
内における隔膜形成（Septal formation）の抑制により
生長を抑制することを示唆している。
【００５１】ｂ．例ＩＩＩ 図３Ａおよび３Ｂに含まれている画像は、イー・ファエ
カリス(E.faecalis)を接種した直後のカービイ−バウア
ー生長培地の領域を示している。図３Ｃおよび３Ｄに含
まれている画像は、２時間のインキュベーション期間後
の同一領域を示している。図３Ｃに含まれている画像
は、生長改変剤の不存在下において生長させたイー・フ
ァエカリス(E.faecalis)微小コロニーを示している。図
３Ｄに含まれている画像は、標準的臨床濃度である２μ
ｇ／ｍｌの量で抗生物質バンコマイシン(vancomycin)に
さらされたイー・ファエカリス(E.faecalis)微小コロニ
ーを示している。図３Ｄに示されている微小コロニー
は、２時間後に、いずれの生長も示していないことは明
らかである。
【００５２】ｃ．例ＩＶ 図４Ａおよび４Ｂに含まれている画像は、イー・ファエ
シウム(E.faecium) を接種した直後のカービイ−バウア
ー生長培地の領域を示している。図４Ｃおよび４Ｄに含
まれている画像は、２時間のインキュベーション期間後
の同一領域を示している。図４Ｃに含まれている画像
は、生長改変剤の不存在下に生長させたイー・ファエシ
ウム(E.faecium) 微小コロニーを示している。図４Ｄに
含まれている画像は、標準的臨床濃度である２μｇ／ｍ
ｌの量で抗生物質バンコマイシン(vancomycin)にさらさ
れたイー・ファエシウム(E.faecium) 微小コロニーを示
している。図４Ｄに示されている微小コロニーは、検出
可能な生長を示しており、これはこの抗生物質が、使用
濃度でイー・ファエシウム(E.faecium) に対する効果的
な抑制剤ではないことを示している。
【００５３】本発明を、その詳細な態様について記載
し、また説明したが、その態様および詳細における種々
の変更を本発明の精神および範囲から逸脱することなく
なしうることは当業者に理解されるものと見做される。
例えば、上記詳細な説明は、試験領域が生長培地の第一
の部分に位置することができ、また対照標準が同一生長
培地の第二の部分に位置することができることを示して
いる。別法として、試験領域は第一の生長培地に位置す
ることができ、また対照標準は第二の生長培地に位置す
ることができる。本発明の精神および範囲から逸脱する
ことなくなしうる変更のもう一つの例には、諸工程の順
序にある。例えば、生長培地に接種剤を接種する以前お
よびこの接種剤をインキュベートする以前に、生長培地
の一部分または全部に生長改変剤を配合すると好まし
い。しかしながら、諸工程の順序は変更することがで
き、この変更は本発明の方法の精神の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、エンテロバクター アエロゲネス(ent
erobacter aerogenes)を接種した培地の画像を示す図で
ある。
【図２】図２は、イー・コリ(E.coli)を接種した培地の
画像を示す図である。
【図３】図３は、イー・ファエカリス(E.faecalis)を接
種した培地の画像を示す図である。
【図４】図４は、イー・ファエシウム(E.faecium) を接
種した培地の画像を示す図である。

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 １個または２個以上の微生物コロニーに
    対する生長改変剤の作用の測定方法であって、 １種の固体または半固体生長培地を用意する工程；上記
    生長培地の少なくとも一部分に生長改変剤を配合する工
    程；上記生長培地に、１個または２個以上の生存可能な
    コロニー形成性単体を含有する接種剤を接種する工程；
    上記コロニー形成性単体が上記微生物コロニーに複製さ
    れるような方法で、上記コロニー形成性単体をインキュ
    ベートする工程；上記生長改変剤にさらされた、１個ま
    たは２個以上の上記微生物コロニーの特徴の一種または
    二種以上を計測する工程；および上記特徴を評価し、上
    記微生物コロニーに対する上記生長改変剤の作用を測定
    する工程；を包含する、上記測定方法。
  2. 【請求項２】 上記生長改変剤にさらされた１個または
    ２個以上の上記微生物コロニーの特徴の一種または二種
    以上を、上記コロニー形成性単体が一度、倍化された後
    および上記コロニー形成性単体が２０度以上、倍化され
    る以前に計測する、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 上記生長改変剤にさらされた、１個また
    は２個以上の上記微生物コロニーの特徴の１種または２
    種以上を、上記コロニー形成性単体が８度、倍化される
    以前に計測する、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 上記微生物コロニーがそれぞれ、初期面
    積を有し、上記微生物コロニーの少なくとも一部分がそ
    れらの上記初期面積の２倍の面積に増加した後および上
    記微生物コロニーの主要部分の面積がそれらの上記初期
    面積の２０倍に増加する以前に上記微生物コロニーの特
    徴を計測する、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 上記微生物コロニーがそれぞれ、初期容
    積を有し、上記微生物コロニーの少なくとも一部分がそ
    れらの上記初期容積の２倍の容積に増加した後および上
    記微生物コロニーの主要部分の容積がそれらの上記初期
    容積の２０倍に増加する以前に上記微生物コロニーの特
    徴を計測する、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 上記特徴を計測するが、各微生物コロニ
    ーが特定のプロジェニター（progenitor）の微生物コロ
    ニー形成性単体の生成物である、請求項１に記載の方
    法。
  7. 【請求項７】 少なくとも一部分に生長改変剤が配合さ
    れている生長培地上に支持されている１個または２個以
    上の微生物コロニーに対する生長改変剤の作用の測定方
    法であって、 １個または２個以上の生存可能なコロニー形成性単体を
    含有する接種剤を上記生長培地に接種する工程；上記コ
    ロニー形成性単体が上記微生物コロニーに複製されるよ
    うな方法で、上記コロニー形成性単体をインキュベート
    する工程；上記生長改変剤にさらされた１個または２個
    以上の上記微生物コロニーの特徴の１種または２種以上
    を計測する工程；および上記１種または２種以上の特徴
    を対照標準と比較し、上記微生物コロニーに対する上記
    生長改変剤の作用を測定する工程；を包含する、上記測
    定方法。
  8. 【請求項８】 上記生長改変剤を、上記生長培地の第一
    の部分に配合し、また上記対照標準が上記生長培地の上
    記生長改変剤を含有していない第二の部分を包含する、
    請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 上記生長改変剤を、第一の濃度で上記生
    長培地の第一の部分に配合し、また上記対照標準が上記
    生長培地の第二の部分を包含し、および上記生長改変剤
    を、上記第一の濃度とは等しくない第二の濃度で上記生
    長培地の第二の部分に配合する、請求項７に記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】 上記第二の濃度が、上記第一の濃度よ
    りも低い、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 上記生長改変剤を、濃度勾配をもって
    配合し、この勾配は高い方の濃度限界および低い方の濃
    度限界を備えており、および上記対照標準がこの低い方
    の濃度に近い位置にある、請求項７に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 上記生長改変剤の低い方の濃度限界
    が、上記微生物コロニーに対して無効の濃度である、請
    求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 上記対照標準が、臨床的に明らかにな
    ったデータを包含する、請求項７に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 上記対照標準が、公知の生長特徴を有
    する１個または２個以上の比較微生物コロニーを包含す
    る、請求項７に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 上記対照標準が、独立した第二の生長
    培地に位置している、請求項７に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 生長改変剤が生長培地の少なくとも一
    部分に配合されている生長培地上に支持されている１個
    または２個以上の微生物コロニーに対する上記生長改変
    剤の作用の測定方法であって、 １個または２個以上の生存可能なコロニー形成性単体を
    含有する接種剤を上記生長培地に接種する工程；上記コ
    ロニー形成性単体が上記微生物コロニーに複製されるよ
    うな方法で、上記コロニー形成性単体をインキュベート
    する工程；上記生長改変剤にさらされた１個または２個
    以上の上記微生物コロニーの特徴の１種または２種以上
    を定期的に計測する工程；および上記特徴の定期的測定
    値を評価し、上記微生物コロニーに対する上記生長改変
    剤の作用を測定する工程；を包含する、上記測定方法。
  17. 【請求項１７】 １個または２個以上の上記微生物コロ
    ニーを定期的に計測する工程が、上記微生物コロニーの
    定期的撮影を包含する、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 上記評価工程が、上記定期的画像の比
    較を包含し、これにより上記微生物コロニーに対する上
    記生長改変剤の作用を測定する、請求項１７に記載の方
    法。
  19. 【請求項１９】 上記評価工程が、上記定期的画像と対
    照標準との比較を包含し、これにより上記微生物コロニ
    ーに対する上記生長改変剤の作用を測定する、請求項１
    ８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 上記生長改変剤にさらされた１個また
    は２個以上の上記微生物コロニーの特徴を、上記コロニ
    ー形成性単体が一度、倍化された後および上記コロニー
    形成性単体が２０度よりも多くまで倍化する以前に定期
    的に撮影する、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 上記微生物コロニーがそれぞれ、初期
    面積を有しており、また上記微生物コロニーの上記特徴
    を、上記微生物コロニーの少なくとも一部分がそれらの
    初期面積の２倍の面積に増加した後および上記微生物コ
    ロニーの主要部分の面積がそれらの初期面積の２０倍に
    まで増加する以前に定期的に撮影する、請求項１７に記
    載の方法。
  22. 【請求項２２】 上記微生物コロニーがそれぞれ、初期
    容積を有しており、また上記微生物コロニーの上記特徴
    を、上記微生物コロニーの少なくとも一部分がそれらの
    初期容積の２倍の容積に増加した後および上記微生物コ
    ロニーの大部分の容積がそれらの初期容積の２０倍にま
    で増加する以前に定期的に撮影する、請求項１７に記載
    の方法。
  23. 【請求項２３】 上記特徴が定期的画像であり、ここで
    各微生物コロニーが特定のプロジェニターのコロニー形
    成性単体の生成物である、請求項１７に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 少なくとも一部分に生長改変剤が配合
    されている生長培地上に支持されている１個または２個
    以上の微生物コロニーに対する生長改変剤の作用の測定
    方法であって、 １個または２個以上の生存可能なコロニー形成性単体を
    含有する接種剤を上記生長培地に接種する工程；上記コ
    ロニー形成性単体が上記微生物コロニーに複製されるよ
    うな方法で、上記コロニー形成性単体をインキュベート
    する工程；上記生長改変剤にさらされた１個または２個
    以上の上記微生物コロニーを定期的に撮影し、これによ
    り上記微生物コロニーの特徴を見ることができるように
    する工程；および上記特徴を評価し、上記微生物コロニ
    ーに対する上記生長改変剤の作用を測定する工程；を包
    含する、上記測定方法。
  25. 【請求項２５】 上記特徴が、微生物コロニー面積、周
    囲の長さ、周囲の長さ対面積比、縁端の粗さ、縁端の輪
    郭およびコロニー密度の均一度からなる群から選択され
    る、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 固体または半固体生長培地に接種さ
    れ、次いでインキュベートされ、これにより生物学的試
    料に存在するコロニー形成性単体から複製された微生物
    コロニーを形成する上記試料に対する生長改変剤の効果
    の測定方法であって、 上記生長培地の少なくとも一部分に、上記生長改変剤を
    配合する工程；上記生長改変剤にさらされた上記微生物
    コロニーを、上記微生物コロニーの実質的全部が相互に
    分離される時点までの期間にわたり撮影する工程；およ
    び上記微生物コロニーの特徴を評価し、上記微生物コロ
    ニーに対する上記生長改変剤の作用を測定する工程；を
    包含する、上記測定方法。
  27. 【請求項２７】 生長培地に支持されている１個または
    ２個以上の微生物コロニーに対する生長改変剤の作用メ
    カニズムを測定する方法であって、 上記生長培地に１個または２個以上の生存可能なコロニ
    ー形成性単体を接種する工程；上記生長培地の少なくと
    も一部分に上記生長改変剤を配合する工程；上記コロニ
    ー形成性単体が上記微生物コロニーに複製されるような
    方法で、上記コロニー形成性単体をインキュベートする
    工程；上記生長改変剤にさらされた１個または２個以上
    の上記微生物コロニーを定期的に撮影する工程；および
    上記定期的画像を評価し、上記生長改変剤の作用メカニ
    ズムを測定する工程；を包含する、上記測定方法。
  28. 【請求項２８】 生物体に対する生長改変剤の作用を測
    定する方法であって、 固体または半固体生長培地の少
    なくとも一部分に上記生長改変剤を配合する工程；上記
    生長培地に、上記微生物からの１個または２個以上のコ
    ロニー形成性単体を含有する接種剤を接種する工程；上
    記コロニー形成性単体が上記生物体の微小コロニーに複
    製されるような方法で、上記コロニー形成性単体をイン
    キュベートする工程；上記生長改変剤にさらされた１個
    または２個以上の上記微小コロニーを撮影し、これによ
    り上記１個または２個以上の微小コロニーの経時的な
    （chronological）画像を作成する工程；および上記経
    時的な画像を評価し、上記生物体に対する上記生長改変
    剤の作用を測定する工程；を包含する、上記測定方法。
  29. 【請求項２９】 上記経時的な画像を、上記コロニー形
    成性単体が一度、倍化した後および上記コロニー形成性
    単体が２０度より多く倍化する以前に作成する、請求項
    ２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 上記経時的な画像を、上記微小コロニ
    ーの少なくとも一部分が２倍の面積に増加した後および
    上記微小コロニーの大部分の面積が２０倍にまで増加す
    る以前に作成する、請求項２８に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 上記経時的な画像を、上記微小コロニ
    ーの少なくとも一部分が２倍の容積に増加した後および
    上記微小コロニーの大部分の容積が２０倍にまで増加す
    る以前に作成する、請求項２８に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 上記経時的な画像を作成し、ここで各
    微生物コロニーは、特定のプロジェニターのコロニー形
    成性単体の生成物である、請求項２８に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 各上記微小コロニーを試験グループと
    して評価し、次いで対照標準と比較し、これにより上記
    試験グループからの特徴が上記対照標準グループの特徴
    と統計学的に相違しているか否かを測定する、請求項２
    ８に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 上記統計学的比較を用いて、上記生長
    改変剤に対する感受性の変化を予測する、請求項３３に
    記載の方法。
  35. 【請求項３５】 上記変化が、抗微生物剤に対する増加
    する耐性である、請求項３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 １個または２個以上の微生物コロニー
    に対する生長改変剤の作用の測定方法であって、 １種の固体または半固体生長培地を用意する工程；上記
    生長培地の少なくとも一部分に上記生長改変剤を配合す
    る工程；上記生長培地に、複数のコロニー形成性単体を
    含有する接種剤を接種する工程、ここでこのコロニー形
    成性単体は相互に代表的に５μよりも短くなく、かつ１
    ００μよりも長くない距離で離して、上記生長培地に配
    置させ；上記コロニー形成性単体が上記微生物コロニー
    に複製されるような方法で、上記コロニー形成性単体を
    インキュベートする工程；上記微小コロニーの主要部分
    が相互に密集体になる以前に、上記生長改変剤にさらさ
    れた１個または２個以上の上記微生物コロニーの特徴の
    １種または２種以上を計測する工程；および上記特徴を
    評価し、上記微生物コロニーに対する上記生長改変剤の
    作用を測定する工程；を包含する、上記測定方法。
  37. 【請求項３７】 試料中の生長改変剤の存在を検出する
    方法であって、 １種の固体または半固体生長培地を用意する工程；上記
    生長培地の少なくとも一部分に上記試料を配合する工
    程；上記生長培地に、生存可能なコロニー形成性単体を
    含有する接種剤を接種する工程、 上記コロニー形成性単体が１個または２個以上の微生物
    コロニーに複製されるような方法で、上記コロニー形成
    性単体をインキュベートする工程；上記試料にさらされ
    た１個または２個以上の上記微生物コロニーの特徴の１
    種または２種以上を計測する工程；および上記特徴を評
    価し、上記生長改変剤の存在を検出する工程；を包含す
    る、上記検出方法。
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