CN101233244A - 检测生存力相关分子的改进方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测样品中与一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子的方法,其包括使所述样品与酶接触的初始步骤,所述酶能够在所述与该一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子存在下在核酸分子上添加或去除化学部分。由此产生新的可检测核酸分子。下一步骤包括通过检测仅在所述与一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子存在下产生的新核酸分子来检测所述与一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子的存在。尽管也可以检测NAD,但最优选的与生存力相关分子为ATP。用于本方法的优选酶是连接酶。所述方法具有多种应用,尤其是监测细胞的生存力、毒理学测试以及确定样品中或表面上是否有污染物。本发明还提供用于实施本方法的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及检测细胞或生物生存力相关分子的领域,例如微生物检测。更具体地,本发明涉及检测样品中认为是污染物的细胞或生物的方法。本发明的方法高度灵敏,并且克服了现有技术方法的问题。
背景技术
在许多情况下,测量与细胞生存力相关的某些分子的存在情况和水平是很重要的。例如,测量ATP的水平可用于哺乳动物细胞的生长分析和毒理学目的。
这样的分子还可以在卫生学应用中作为有用标志物。检测到表面上的污染分子指示表面未清洁或者需要进行清洁以达到所需标准。
在许多领域中,就安全性和经济角度而言,生物比如细菌和酵母以及植物或动物来源的细胞对用于人类消费和使用的产品的污染都是重要的考虑因素。
例如,供水、废水、海洋环境、药物产品、化妆品、食品、饮料、临床样品(包括血和血小板样品)等都需要对潜在的有害生物及细胞的污染进行常规测试。通常,所述生物包括细菌。
在许多情况下,基于测量可能与样品中污染细胞或生物存在相关的分子的存在情况来进行测试。最经常检测的分子是三磷酸腺苷(ATP)。
测定ATP水平时常规应用的方法包括使用生物发光。该方法应用依赖于ATP的反应,其中发光的萤光素酶催化萤光素的氧化。可以应用该方法测量相对低浓度的ATP。应用生物发光的用于检测ATP的试剂盒可购自Roche、New Horizons Diagnostics Corp、Celsis等。
就生物发光检测而言还存在许多问题。例如,在存在非微生物来源的ATP的情况下,仅检测微生物ATP就可能是一个问题。这个问题已经通过使用可将细菌及非细菌来源的ATP分开从而提供更准确的信号的滤器而在某种程度上得到了解决。
此外,样品中的化学品和/或金属可能干扰生物发光反应。例如,这在应用清洁剂清洁表面之后测量表面污染的情况中特别有关系。化学清洁剂干扰萤光素酶催化的反应,从而在存在微生物或其它污染物ATP但生物发光反应无效的一些情况下导致假阴性结果。
连接酶是熟知的酶,催化核酸分子5’末端与另一核酸分子3’末端的连接。为了活化该酶,连接反应需要ATP。连接酶可以购得,并以预装了AMP分子的形式提供,这使其可以催化连接而无需通过ATP分子进行活化。
发明内容
本发明提供用于检测样品中由生物(比如细菌和酵母)或者任何来源(比如哺乳动物、其它动物或者植物来源)的细胞所引起污染的改进方法和试剂盒。所述方法和试剂盒也可用于测定生存力相关分子水平有用处的其它应用。
因此,在第一方面中,本发明提供检测样品中与一种或多种细胞或生物生存力相关的分子的方法,其包括以下步骤、基本由以下步骤组成或者由以下步骤组成:
a)使样品与酶接触,该酶在所述与一种或多种细胞或生物生存力相关的分子存在下能够在核酸分子中添加或去除化学部分,由此产生新的可检测核酸分子;和
b)通过检测仅在所述与该一种或多种细胞或生物生存力相关的分子存在下产生的新核酸分子来检测所述与一种或多种细胞或生物生存力相关的分子的存在情况。
优选地,将所述酶活化成为能够作用于所述核酸分子的形式需要有所述生存力相关分子。因此,可以通过灵敏地检测生存力相关分子来检测样品中任何来源细胞的存在情况。在本发明的一些实施方案中,可能期望测试有活力的细胞的存在情况,例如在毒性及化合物筛选测试中。在另一些实施方案中,可以利用生存力相关分子的存在情况来确定样品中某些形式污染的存在情况。本发明的方法可以有效地用于定量生存力相关分子的水平,尤其是测定ATP和/或NAD+的水平。这可用于例如监测特定细胞培养物生长的方法中。
因此,本发明提供检测样品中一种或多种有活力的细胞或生物的方法,其包括以下步骤:
a)使样品与酶接触,该酶在所述与该一种或多种细胞或生物生存力相关的分子存在下能够在核酸分子中添加或去除化学部分,由此产生新的可检测核酸分子;和
b)通过检测仅在所述与该一种或多种细胞或生物生存力相关的分子存在下产生的新核酸分子来检测所述一种或多种有活力的细胞或生物的存在情况。
所述一种或多种细胞或生物指细胞或生物的一种或多种类型、物种、株系等,而不是指样品中每种细胞或生物的实际数目。本发明的方法与现有技术方法相比提供了改进的检测灵敏度,并且能够检测来源于样品中细胞或生物的极少量分子。术语“生物”的范围包括微生物,比如细菌和酵母。所述细胞可以是对其生存力感兴趣的任何细胞类型。例如,可以有用地测量哺乳动物细胞生存力,用于确定候选药剂的毒理学情况。在表面上检测到的生存力相关分子可以指示该表面的污染,并且可以为任何来源,例如植物或者动物来源。
本方法是基于以下事实,即如果样品中存在一种或多种细胞或生物,就将存在所述生存力相关分子。这种分子活化样品中存在的酶,由此使该酶可以催化在核酸分子中添加化学部分或者去除化学部分的反应。所述部分的添加或者去除产生新的可检测(在后续方法中)核酸分子。在一个实施方案中,所述部分的添加或去除赋予核酸分子延伸的能力,例如通过聚合或者连接至另一核酸分子,由此产生新的可检测核酸分子。可以检测所述的新核酸分子,由此使得可以确定测试样品中与所述一种或多种细胞或生物生存力相关的分子的存在情况。
因此,如果在样品中不存在所述一种或多种细胞或生物,就没有与所述一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子,因此就没有化学部分的添加或者去除,这样就不产生新的可检测核酸分子。
术语“生存力相关分子”的范围包括能够作为样品中所检测的一种或多种细胞或生物生存力的指示剂的任何分子。生存力相关分子与酶相互作用,因此,在该分子存在时,所述酶能够作用于核酸分子,导致产生新的可检测核酸分子。与一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子可以活化所述酶,从而例如使其可以发挥其催化功能。在一个非常的优选实施方案中,所述生存力相关分子包括ATP、基本由ATP组成或者由ATP组成。ATP是用来指示样品中存在污染(比如微生物污染)的标准分子,并且还可以有用地用于例如毒理学测定和监测细胞培养物的生长。任何ATP来源都可以包括在本发明的范围内。例如,ATP可以由例如ATP4产生,或者通过AMP与PPi的反应产生。可以通过由磷酸转移酶(比如腺苷酸激酶(ADK))催化的反应生成ATP,例如
术语“化学部分”为本领域所熟知,包括(用于举例而非限制)磷酸基、糖基、核苷酸、核酸分子和乙酰基等。任何“化学部分”均可包括在本发明的范围中,只要其在核酸分子中的添加或去除可以在与一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子存在下由酶催化并由此生成新的可检测核酸分子即可。
本方法并不限于每个核酸分子中添加或者去除单个化学部分。因此,术语“化学部分”可以包括多拷贝的所述化学部分。
化学部分的“添加”可以包括(用于举例而非限制)核苷酸、核酸分子、乙酰基或者磷酸基的添加。添加可以发生在核酸分子的5’或者3’末端或者核酸分子内的任何点。
化学部分的“去除”可以包括但不仅限于从核酸分子的末端或者核酸分子中的任何位置去除核苷酸、核酸分子、乙酰基和磷酸基。
“延伸的”在本文定义为对核酸分子进行进一步加工时,与起始的未修饰(就化学部分的添加或去除而言)核酸分子相比在长度上的任何增加。如上所述,所述延伸导致产生新的可检测核酸分子。
可引起核酸分子延伸的“进一步加工”的实例包括(用于举例而非限制)连接和聚合,其中已向所述核酸分子添加了化学部分或者已从所述核酸分子去除了化学部分。所述进一步加工可以与化学部分的添加或者去除连续发生或者同时发生。
为了避免疑问,在此声明,所述新的可检测核酸分子将具有与原始核酸分子不同的总体结构。因此,新的可检测核酸分子可包含另外的核苷酸,以使得新的核酸分子可被独特地鉴定,例如通过扩增进行鉴定,其中使用仅能应用新核酸分子作为模板结合并产生扩增产物的引物。然而,与(原始)核酸分子相比,它可以仅延伸一条链。
产生新的可检测核酸分子和/或赋予核酸分子(在后续方法中)延伸以产生新的可检测核酸分子之能力的许多这样的化学部分添加或去除为本领域所熟知,但这并不意在对本发明进行限制。例如,在核酸分子中添加或去除化学部分可包括将核酸分子与另外的核酸分子连接,或者基本由其组成或由其组成,其中所述另外的核酸分子代表“添加的”化学部分。或者,例如,核酸分子中化学部分的添加或去除可由合适的ATP依赖性聚合酶催化。聚合产生其后可进行检测的新核酸分子。
用于本发明方法及包含在本发明试剂盒中的核酸分子必须是具有这样的序列和结构的核酸分子,所述序列和结构使得样品中的酶可在与一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子存在下引起在所述核酸分子中添加或去除化学部分,由此产生新的核酸分子。
用于本发明的适当核酸分子如SEQ ID No:1-11所示,并且在下面的实验部分中有更详细的描述。
“核酸”在本文中定义为包括任何天然核酸以及天然或者合成类似物,其能够通过在核酸分子中添加或去除化学部分而进行修饰,并由此产生新的可检测核酸分子。合适的核酸分子可由例如双链或单链DNA以及双链或单链RNA组成。部分双链和部分单链的核酸分子也在考虑范围内,并且实际上在本发明的某些实施方案中是优选的,只要所研究的酶活性可以在所述核酸分子中添加或去除化学部分即可。最优选核酸分子将包括dsDNA。术语“核酸”涵盖能够以与天然核酸类似的方式由样品中的酶进行修饰的合成类似物,例如掺入了非天然或衍生碱基的核酸类似物或者具有经修饰主链的核酸类似物。具体地,术语“双链DNA”或者“dsDNA”应解释为涵盖含有非天然碱基的dsDNA。相似地,“dsRNA”应解释为涵盖含有非天然碱基的dsRNA。
“样品”在本发明中定义为包括希望测试与细胞或生物的生存力相关的特定分子存在情况的任何样品。因此所述样品可以包括例如临床样品或者体外测定系统,或者由其组成或基本由其组成。样品可包括饮料或食品样品或其制备物、或者药品或化妆品比如个人护理品(包括洗发剂、护法素、保湿剂等),或者由其组成或基本由其组成,它们均例行检测微生物污染。样品可包括组织或细胞,或者由其组成或基本由其组成,并可包括如痰或者血样或者血小板样品,或者由其组成或基本由其组成。此外,本发明的方法和试剂盒可用于监测表面污染,例如在制备食品的场所。生存力相关分子的存在指示污染。污染可以为任何来源,例如微生物、植物或动物污染。此外,本发明还可用于监测环境状况比如供水、废水、海洋环境等。本发明还可用于在发酵过程中监测细菌生长,以及在医院、工业设施或生物防御应用中用于需要评估细菌或者孢子含量的空气采样。在毒理学应用中,所述样品可以包括细胞,优选哺乳动物或植物细胞,或者由其组成或基本由其组成。可以使所述细胞与测试剂接触,并使用本发明的方法测定与所述测试剂接触后细胞的生存力。
“诊断”在本文中定义为包括监测疾病的状态和发展、在治疗后检查疾病的复发以及监测特定治疗的成功性。所述测试还可具有预后价值,这包括在术语“诊断”的定义内。当所述一种或多种生物的水平仍很低并且受试者中尚未出现症状时,所述测试可在临床上检测早期微生物感染中具有价值。
术语“包含”和“具有”在本文中定义为不仅限于所提及的要素,应该与“包括”或其等价说法一致。“基本由......组成”定义为允许存在另外的要素,只要所述要素基本的新特征不因为其他要素的存在而改变即可。
本发明的优点
本发明的方法提供显著的技术优点,主要是由于作为本发明的一部分而产生新的核酸分子这一事实。与生物发光检测中迅速减弱的光产生相比,这一新核酸分子提供稳定的阳性信号以指示样品中一种或多种生物的存在。
此外,例如可以对样品中生存力相关分子存在下所产生的新核酸分子进行扩增,这为检测样品中的生存力相关分子提供了更高的灵敏度。可以在低至皮摩尔和更低的水平上实施对样品中生存力相关分子的检测。核酸扩增技术如TMA或者PCR非常强大,并且可通过市售并可靠的工具检测产物。
此外,连接酶比先前用于测定污染(如微生物污染)的萤光素酶更加稳定。因此,普遍用于其后待测试任何残留污染的表面的清洁剂如三氯乙酸和次氯酸钠(漂白剂)强烈抑制萤光素酶活性。这能引起假阴性信号,这意味着表面上仍存在污染,但却由于测定不再有效而未被检测到。通过本发明的方法和试剂盒消除了这些假信号。
此外,本发明的方法适用于大体积;例如在酶(其可以是例如连接酶)被固定的情况下,可以在大体积的流体中检测生存力相关分子如ATP,由此增强其灵敏度超越现有方法。例如,可以与固定化连接酶柱一起使用1-5ml或者在水测试的情况下为大体积如100ml的样品,并且可以获取从该体积内的细菌细胞中释放的所有ATP。
本发明的另一优点是可以清洗所述固定化酶,以去除可能影响后续检测方法的抑制性材料。这是可能的,因为酶-生存力标志物的连接或结合(优选ATP-连接酶的连接)在清洗过程中是稳定的。这是超越对抑制剂(如上述)高度敏感的现有ATP生物发光技术的一个主要优点。
此外,本发明的方法不依赖于标准技术,比如生长培养和平板接种等,这意味着本发明的方法实施起来更快、更容易。
优选实施方案
在本发明的一个非常优选的实施方案中,通过核酸分子与一种或多种另外的核酸分子连接而生成新核酸分子。所述核酸分子和另外的核酸分子可以是可经连接而形成新核酸分子的任何合适的核酸分子。优选地,将所述核酸分子和另外的核酸分子设计成使其与样品中产生待检测的生存力相关分子的一种或多种细胞或生物的基因组不具有高水平同源性。这意味着,即使在存在污染核酸分子的情况下,也只有新核酸分子可被检测到。
优选地,所述同源性为,与来自样品中产生待检测的生存力相关分子的一种或多种细胞或生物的相应核苷酸序列之间的序列同源性小于约5%、小于约10%、小于约12.5%、小于约15%、小于约20%、小于约30%、小于约40%。在一个实施方案中,在约10、20、30、40或50个连续核苷酸中与来自所述一种或多种细胞或生物的相应核苷酸序列没有序列同一性。在另一实施方案中,在约10、20、30、40或50个连续核苷酸中,与来自所述一种或多种细胞或生物的相应核苷酸序列具有小于约10%或小于约12.5%的序列同一性。
连接可以是在双链或单链核酸分子之间,这取决于所使用的连接酶。
因此,在一个实施方案中,在本发明方法中应用的酶包括连接酶,或者由其组成或基本由其组成。为了具有催化活性,连接酶需要ATP。因此,在样品中存在一种或多种细胞或生物时,样品中将存在生存力相关标志物ATP。所述ATP活化连接酶,其相应地催化所述核酸分子与一种或多种另外的核酸分子的连接。因此,随后可以检测新的连接核酸分子,其提供灵敏和可靠的信号,以指示样品中一种或多种细胞或生物的存在。不存在ATP(其与所述一种或多种细胞或生物的生存力相关)时,连接酶将不被活化,因此不能连接所述核酸分子及另外的核酸分子而产生新的可检测核酸分子。
如果所述核酸分子和另外的核酸分子是单链的,那么就可以应用适当的连接酶如T4RNA连接酶。如果所述核酸分子和另外的核酸分子是双链的,那么就可以应用适当的连接酶如T4 RNA连接酶。
如前所述,市售的连接酶倾向于以预活化形式提供,这意味着它们不需要为了具有连接酶的能力而经ATP活化。当然,这种形式的酶在本发明中没有用处,因为连接酶是用于检测ATP,其作为样品中存在一种或多种细胞或生物的指示剂,或者在某些实施方案中是样品中存在由一种或多种细胞或生物所造成污染的指示剂。因此,所述酶可能需要进行适当处理,以从连接酶中去除活化分子。因此,可以利用任何合适的脱腺苷化手段。例如,这可包括与焦磷酸(钠)孵育。在下面的实验部分中提供合适的条件。
在一个替代实施方案中,在本方法中应用的酶包括大肠杆菌DNA连接酶。与ATP相反,该酶的活性需要NAD+。因此,在这种情况下,细胞或生物生存力相关分子包括NAD+或者由其组成或基本由其组成。按照与ATP依赖性酶相同的方式进行NAD+依赖性连接酶的失活。NAD+代替ATP发挥酶的AMP供体的功能,因此活化的产物是相同的。因此,可以利用任何合适的脱腺苷化手段。例如,这可以包括与焦磷酸(钠)孵育。在下面的实验部分中提供合适的条件。
在一个非常优选的“检测”实施方案中,在样品中检测的一种或多种细胞或生物包括微生物、由微生物组成或基本由微生物组成,尤其是细菌和/或酵母,例如假丝酵母属(Candida)物种。诸如此类的微生物的水平在公众健康和卫生中关系重大。优选地,所述一种或多种生物包括细菌,或者由其组成或基本由其组成。然而,任何生存力相关分子的存在情况均可可指示污染。因此,对生存力相关分子的检测本身可以认为是污染的指示剂。所述分子可来自任何来源,比如微生物和/或植物和/或动物。
所述细菌可以是样品中可被认为是污染物的任何细菌物种。如上所述,本发明的方法具有广泛的实用性,并且在本方法中可以检测很多不同的物种和株系。当然,可以同时检测多种类型的生物,因为生存力相关标志物比如ATP是普遍存在的。
对某些细胞和生物更为特异性的检测可能需要特异性过滤,从而将待检测的细胞或生物与产生ATP的其它细胞分开。这样的滤器和过滤系统以及方法为本领域所熟知,并且可以购得(参阅如www.nhdiag.com)。
此外,通过利用能够结合细胞和生物的特异性试剂也可以选择和过滤或浓缩特定的细胞和生物。实例包括抗体及其保留特异性结合亲和力的衍生物和片段。
在一个实施方案中,细菌包括任何一种或多种葡萄球菌属(Staphylococcus)物种尤其是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)并优选为甲氧西林抗性菌株、肠球菌属(Enterococcus)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、分枝杆菌属(Mycobacterium)物种尤其是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、弧菌属(Vibrio)物种尤其是霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、沙门氏菌属(Salmonella)、大肠杆菌等,或者由其组成或基本由其组成。
如前所述,本发明的方法还可用于测定细胞样品的生长和/或存活。因此,利用本发明的方法可以监测细胞培养物的生存力。在一个实施方案中,应用本发明的方法可以实施毒理学测试。
在本发明一个特别优选的实施方案中,酶固定在固体支持物上。所述酶在固体支持物上的固定允许有效地捕获待检测的并来源于一种或多种细胞或生物的生存力相关分子。固定化酶与生存力相关分子的相互作用允许所述酶作用于所述核酸分子,从而导致产生新的核酸分子。
因此,在一个实施方案中,本发明方法所使用样品的体积大于现有技术方法。示例性样品体积可以约为1-20ml,优选约1-10ml,甚至更优选约1-5ml。例如,可以与固定化连接酶柱一起应用1-5ml的样品,并且能够获取从该体积中的细胞(例如细菌细胞)释放的所有ATP。因此,在此实施方案中优选的是,所述酶包括连接酶,或者由其组成或基本由其组成,与生存力相关的分子包括ATP,或者由其组成或基本由其组成。
可以洗涤所述固定化酶,以去除可以影响后续检测方法的抑制性材料。这是可能的,因为酶-生存力标志物的连接或结合(优选ATP-连接酶的连接)在洗涤过程中是稳定的。因此,在一个实施方案中,本方法还包括在检测新核酸分子之前洗涤的步骤,或者由其组成或基本由其组成。洗涤可以利用任何合适的缓冲液或洗涤液,并且可以包含如EDTA和Tris-HCl之类的组分。合适的洗涤液对于本领域的技术人员是众所周知的。
任何合适的固体支持物均可使用。固体支持物的性质对本发明的性能并不是关键性的,只要可将所述酶固定于其上并且不对酶活性(包括酶与所述一种或多种细胞或生物的生存力相关分子相互作用的能力)产生不利影响即可。固体支持物的非限制性实例包括任何珠,比如聚苯乙烯珠及其衍生物和顺磁珠、亲和柱、微孔板等。
相似地,固定的化学反应由本领域技术人员按常规实施。可以利用任何的固定手段,只要它对本发明的方法没有不利影响即可,尤其是对来自一种或多种细胞或生物的生存力相关分子的检测特异性及灵敏度没有影响。
优选的检测技术
在本发明的一个优选实施方案中,应用核酸扩增技术检测在所述一种或多种细胞或生物生存力相关分子存在下由所述酶活性产生的新核酸分子。
这用来使本发明的方法尽可能地灵敏。这样的扩增技术在本领域中是众所周知的,包括如PCR、NASBA(Compton,1991)、3SR(Fahy et al.1991)、滚环复制、转录介导的扩增(Transcription Mediated Amplification,TMA)、链置换扩增(Strand displacement amplification,SDA)ClinicalChemistry 45:777-784,1999,以及在US6261846(通过参考并入本文)中描述的DNA寡聚体自装配法的方法。
使用对待检测的新核酸分子的序列具有特异性的扩增引物来实现扩增。为了提供针对所述核酸分子的特异性,可以选择序列中适当区域的相应引物结合位点。技术人员会认识到,所述核酸分子也可以包含除引物结合位点以外的序列,所述序列对于检测样品中由所述酶在生存力相关分子存在下所产生的新核酸分子是必需的,例如RNA聚合酶结合位点或者启动子序列对于等温扩增技术比如NASBA、3SR和TMA是必需的。
例如,引物结合位点可以跨越核酸分子和另外的核酸分子的连接边界,以使得仅在连接已发生时产生扩增产物。
用于本发明方法的合适引物如SEQ ID No 12至15所示并且在下面的实验部分有更加详细的描述。
TMA(Gen-probe Inc.)是使用两种酶(即RNA聚合酶和逆转录酶)驱动反应的RNA转录扩增系统。TMA反应是等温的,可以扩增DNA或RNA而产生RNA扩增的终产物。TMA可以与Gen-probe的杂交保护测定(Hybridization Protection Assay,HPA)检测技术结合,从而允许检测单个管中的产物。对于本发明的实施,这样的单个管检测是优选的方法。上面所列并非意在穷举。可以应用任何核酸扩增技术,只要适当的核酸产物被特异性地扩增即可。
因此,在本发明的一个优选方面中,应用核酸扩增技术实施本发明的方法,从而检测作为活化的酶添加或去除化学部分的直接结果而产生的新核酸分子,其指示样品中细胞或生物的生存力相关分子的存在。在一个优选实施方案中,所用技术选自PCR、NASBA、3SR、TMA、SDA和DNA寡聚体自装配。可以用常规方法对扩增产物进行检测,例如凝胶电泳,但优选应用实时检测方法进行。
本领域已知许多用于实时检测扩增反应产物的技术。它们包括使用嵌入荧光染料比如SYBR Green I(Sambrook and Russell,MolecularCloning-A Laboratory Manual,Third edition),其允许基于所产生的荧光量来评估扩增DNA的产量。有许多实时检测方法产生可以连续监测的荧光读出值;具体的实例包括分子信标和荧光共振能转移探针。实时技术是有利的,因为它们保持在“单个管”中反应。这意味着不需要为了获取结果而进行下游分析,使得更迅速地获得结果。此外,保持反应在“单个管”环境中降低了交叉污染的风险,并允许由本发明方法进行定量输出。在本发明中对健康和安全的关注极为重要的情况下(比如供人消费的供水等),这是尤为重要的。
可以应用系统(Applied Biosystem)实现PCR反应的实时定量,见Holland et al;Detection of specific polymerase chain reactionproduct by utilising the 5′-3′exonuclease activity of Thermus aquaticusDNA polymerase;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,7276-7280(1991),Gelminiet al.Quantitative polymerase chain reaction-based homogeneous assaywith flurogenic probes to measure C-Erb-2oncogene amplification.Clin.Chem.43,752-758(1997)和Livak et al.Towards fully automated genomewide polymorphism screening.Nat.Genet.9,341-342(1995)(通过参考并入本文)。可广泛地购得探针,系统(AppliedBiosystem)在本领域中是众所周知的。在PCR反应中,探针在上游和下游引物之间发生退火。它们含有5’-荧光团和3’-猝灭剂。在扩增期间,Taq聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性将荧光团从探针上切下。因为荧光团不再紧邻猝灭剂,所述荧光团将可以发出荧光。可以测量所产生的荧光,并且与扩增的靶序列的量成正比。
在分子信标系统中,参阅Tyagi & Kramer.Molecular beacons-probesthat fluoresce upon hybridization.Nat.Biotechnol.14,303-308(1996)和Tyagi et al.Multicolor molecular beacons for allele discrimination.Nat.Biotechnol.16,49-53(1998)(通过参考并入本文),所述信标是具有内部猝灭荧光团的发夹形探针,当与其靶标结合时,其荧光得到恢复。环部分充当探针,而在信标末端通过互补的“臂”序列形成茎。荧光团和猝灭部分附着在相对的末端,茎保持各个部分紧密相邻,使荧光团由能量转移所猝灭。当信标检测到其靶标时,它发生构象变化,使茎分开,由此使荧光团和猝灭剂分离。这引起能量转移中断,从而使荧光恢复。
任何合适的荧光团均包括在本发明的范围内。可在本发明方法中应用的荧光团包括例如FAM、HEXTM、NEDTM、ROXTM、Texas Red TM等。猝灭剂例如Dabcyl和TAMRA代表可用于本发明方法的众所周知的猝灭剂分子。然而,本发明并不限于这些具体的实例。
可以并入本发明方法的另一种基于实时荧光的系统是Zeneca的Scorpion系统,参阅Whitcombe et al.Detection of PCR products usingself-probing amplicons and fluorescence.Nature Biotechnology 17,804-807(01 Aug 1999)。该参考文献以其整体并入本申请中。该方法是基于一种具有通过接头附着于其5’末端的尾的引物,所述尾阻止5’延伸的复制。探针元件设计成仅在当通过具尾引物的延伸将靶位点掺入同样的分子时,它与其靶标杂交。这种方法产生快速和可靠的信号,因为探针-靶标结合在动力学上对链内二级结构有利。
在一个最优选的实施方案中,反应混合物将包含以下所有各项:待测试的样品、所述核酸分子和另外的核酸分子、所需的酶(尤其是连接酶)和所有试剂、缓冲剂和扩增所述新(优选经连接的)核酸分子所需的酶以及允许实时检测扩增产物所需的试剂。因此,检测与生存力相关的分子(来自一种或多种目的细胞或生物)的整个方法将发生在单个反应中,具有定量输出并且不需要任何中间的洗涤步骤。应用“单个管”反应是有利的,因为不需要为了获取结果而进行下游分析,使得更迅速地获得结果。此外,保持反应在“单个管”环境中降低了交叉污染的风险,并允许由本发明方法进行定量输出。同样地,单个管反应更适应于自动化,例如在高通量的情况下。
或者,可以以逐步方式实施本发明方法。因此,在第一步中,可能首先必须以适用于本发明方法的形式制备酶。例如,也许需要去除市售连接酶中的AMP,以使它失去活性,并且需要ATP来活化,比如由样品中任何细胞或生物(在一个实施方案中可以是污染物生物)提供的ATP。这可以使用合适的去腺苷化条件来实施,在上文中有详细描述。
此外,在实施本方法之前,可以首先将酶固定。合适的固体支持物和固定方法在本领域中是众所周知的,并且在上文有较详细的描述。
首先可以将酶加入所测试的样品,这允许样品中存在的任何与一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子与所述酶相互作用。随后,所述酶可以在所述核酸分子添加化学部分或者去除化学部分。因此,在一个实施方案中,本发明可用手浓缩生存力相关分子比如ATP。随后,浓缩的与酶结合的ATP可以在后续步骤中便利地进行检测,优选通过新核酸分子的扩增来进行。
在另一实施方案中,在添加检测所必需的试剂之前,可将所述酶(优选连接酶)失活,最优选通过扩增实现。取决于是否应用等温扩增技术,这可以影响在实施检测步骤之前是否需要使所述酶(优选连接酶)失活。如果应用实时检测,所需试剂可以与扩增阶段所需的试剂一起添加。
在本发明的方法和试剂盒中使用对待扩增的新可检测核酸分子具有特异性的引物。可指导所述新检测核酸分子的序列特异性扩增并具有最小的背景、非特异性扩增的任何引物均可使用。取决于所使用的扩增技术,引物可以包含DNA或者RNA和合成等价物。例如,对于标准PCR而言,倾向于使用短的单链DNA引物对,两种引物均在待扩增的目的区域的一侧。可用于核酸扩增技术如PCR、3SR、NASBA和TMA的各种引物类型在本领域中是众所周知的。
也可以设计在实时方法中使用的合适探针,从而使它们可以与本发明方法中的核酸分子结合使用。因此,例如,当使用技术时,所述探针可以是能够在新核酸分子上引物结合位点之间结合的序列,所述新核酸分子是由样品中与污染细胞或生物的生存力相关的分子进而引起的酶活性所导致的。相似地,可以设计分子信标探针,使其与整合进本发明方法和试剂盒的核酸序列中的相关部分结合。如果实时检测使用Scorpion探针技术,那么将需要设计探针,以使得当通过具尾引物的延伸将靶位点掺入同样的分子时,它仅与其靶标杂交。Amplifluour技术将需要对引物进行适当的设计,但是不需要单独的探针。因此,本发明还提供适用于本发明实时检测方法的探针或者经适当设计的引物。
可以使用替代技术检测核酸分子中导致生成新的可检测核酸分子的化学部分的添加或化学部分的去除。替代检测技术的实例包括质谱法(包括基质辅助激光解吸(MALDI)质谱法和MALDI-飞行时间(MALDI-TOF)质谱法)、层析和使用微阵列技术(Illumina,Affymetrix,Nanogen)。质谱法允许准确测量所述新核酸分子的预计分子量。MALDI-TOF依赖于迅速抽取离子并使其沿飞行管(flight tube)加速下落的高电压。使用飞行管末端的检测器测定从初始激光脉冲至检测到离子所经过的时间。飞行时间与离子的质量成比例。因此,在本发明的方法中核酸分子与新的可检测核酸分子相比在质量上的差异足以允许进行特异和灵敏的检测。
相似地,通过使用具有附着于固体支持物上的合适探针的微阵列,可以在下游方法中鉴定在本发明方法中产生的新核酸分子。
这些替代技术可以优选与核酸扩增技术结合使用,从而表征扩增产物。这将帮助消除所产生的扩增产物不是预期产物的假阳性结果。因此,扩增步骤提高灵敏度的优点与准确表征扩增产物的步骤结合,从而使本发明的方法更加准确。
在一个实施方案中,本发明提供首先过滤样品以浓缩所述一种或多种细胞或生物(如上所述)的方法。对某些细胞或生物进行更加特异性的检测可能需要特异性的过滤,从而将待检测的细胞或生物与其它产生ATP的细胞分开。这样的滤器和过滤系统和方法在本领域中是众所周知的并且可以购得(例如见www.nhdiag.com)。
此外,还可以通过使用能够结合特定细胞或生物的特异性试剂来选择所述细胞或生物。实例包括抗体及其保留特异结合亲和力的衍生物。
在另一实施方案中,本方法还包括裂解样品中的其它细胞,或者由其组成或基本由其组成,所述细胞不是靶细胞或生物,但是将向测定系统贡献生存力相关标志物。这种对其它细胞的裂解是这样一种手段,通过该手段可以使这些非靶细胞或生物不影响对预期细胞或生物的检测。
在一个优选实施方案中,本方法还包括从样品中去除或者消耗不是由所述一种或多种细胞或生物提供的与所述一种或多种细胞或生物的生存力相关的任何分子,或者由其组成或基本由其组成。因此,一旦非靶生物或细胞裂解,那么它们的生存力相关分子就释放到样品中。去除这些分子是有益的,因为如果它们不去除的话可导致假阳性结果。非污染细胞可以是无害细胞或希望在样品中存在的细胞,比如血小板样品中的血小板等。
在一个实施方案中,与一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子包括ATP。优选地,通过在酶催化的反应中利用所述分子或者消耗其供应来除去一种或多种细胞或生物生存力的相关分子(优选ATP)。
在一个实施方案中,可以消耗非靶细胞或生物提供的生存力相关分子的酶包括萤光素酶、磷酸酶和焦磷酸酶中的任何一种或多种,或者由其组成或基本由其组成。可以向样品中添加这些酶以分解本发明中优选的生存力相关分子ATP。在萤光素酶的情况下,使用者易于评估不需要的ATP何时耗尽,因为发光停止产生。
优选地,一旦已在样品中消耗了非靶细胞或生物提供的生存力相关分子,本方法还包括裂解所述一种或多种细胞或生物的细胞以释放与所述一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子,或者由其组成或基本由其组成。这种裂解可能需要与用于裂解非靶(或者在一个实施方案中为非污染物)细胞的条件不同的条件,因为这提供了一定的特异性裂解水平,以使得目的细胞不与其它非靶细胞一起在开始时裂解。
上述操作也可用于去除来自其它来源(比如动物或者植物组织)的污染ATP。这在食品应用中是有关系的,例如在裂解靶细胞或生物之前需要去除ATP背景的情况。随后这提供对食品样品中(细菌)污染的度量。例如,可通过萤光素酶、或者磷酸酶或者焦磷酸酶去除ATP背景。例如,测定血小板中细菌污染的操作可包括首先使用洗涤剂裂解血小板,接着使用有效的方法比如使用远远过量的碱性磷酸酶破坏所释放的ATP,然后使用严苛的条件溶解靶标污染生物,从而引起释放量少得多的ATP用于检测。
合适的细胞溶解条件在本领域中是众所周知,包括例如但不限于使用加热、苯酚、氯仿、蛋白酶K、醇等及其组合进行处理和/或冻/融处理或者机械破坏(比如高速离心)。
本发明的方法还可包括用一种或多种核酸酶处理样品以降解与所述一种或多种细胞或生物相关的核酸分子,或者由其组成或基本由其组成。该方法用于确保在待检测的一种或多种细胞或生物中存在的核酸分子不干扰检测根据本发明方法产生的新核酸分子。可以使用能够消化所述一种或多种细胞或生物(将对其检测生存力相关分子)中存在的核酸分子的任何核酸酶,并且可以包括如内切核酸酶和/或外切核酸酶,或者由其组成或基本由其组成。许多这样的核酸酶是市售的,并且对于本领域的技术人员是众所周知的。
可以设计根据本发明方法生成新核酸分子的核酸分子和任选的另外的核酸分子,以使其免受核酸酶活性的作用。例如,可以封闭所述核酸分子的末端,从而一旦生成所述新核酸分子,其对核酸酶的作用再不敏感,从而可进行检测,以指示例如来自污染生物的生存力相关分子的存在。
在本发明的另一优选实施方案中,所述核酸分子被固定在固体支持物上。可以通过例如共价键实现直接固定。
在本领域中,将核酸和蛋白质组分与固体支持物直接共价连接的技术是已知的。例如,可以使用大量化学交联化合物的任一种将胺衍生核酸分子与固体支持物偶联。
核酸分子和/或酶与固体支持物的间接附着也在本发明的范围内。例如,“间接”附着可通过接头分子实现。合适的接头分子包括以高亲和力结合的生物结合对组分,例如生物素/链霉抗生物素蛋白或者生物素/抗生物素蛋白。
对于本发明方法的多数应用,核酸分子和/或酶将在反应开始时附着在(各自的)固体支持物上。最优选地,所述核酸分子和/或酶将以预固定在固体支持物上的形式提供,或者在单独的固定步骤中进行固定。然而,不排除其它的可能性。
在一个具体实施方案中,所述核酸分子与所述酶固定在同一支持物上。这有效地使所述核酸分子接近所述酶。因此,如果所述酶通过与来自一种或多种细胞或生物待检测的生存力相关分子相互作用而活化,它将立即能够作用于所述核酸分子以生成新的核酸分子,其随后可以被检测来指示生存力相关分子的存在,这可以指示例如在样品中存在一种或多种污染细胞或生物。
在另一实施方案中,在固体支持物上还固定另外的核酸分子。这可用来进一步增强本方法的灵敏度,这因为所述另外的核酸分子与酶和核酸分子都很接近。因此,如果通过与生存力相关分子(其作为待检测的一种或多种细胞或生物的指示剂)的相互作用而使连接酶活化,它将立即能够作用于所述的核酸分子和另外的核酸分子以产生新的核酸分子,其随后可以被检测,例如来指示样品中一种或多种污染生物的存在或者用来指示细胞培养物保持活力。优选地,在此实施方案中,与生存力相关的分子包括ATP,或者由其组成或基本由其组成。在下面参照图2和3对优选的设置进行说明。
在一个实施方案中,所述的酶和/或核酸分子和/或另外的核酸分子都可以固定在同一固体支持物上,从而确保相互作用组分的最大接近。这帮助实现对样品中一种或多种细胞或生物的生存力相关分子的高检测灵敏度水平。如上所述,可以使用任何合适的固体支持物,并且同样可以使用固定所述各个组分的任何合适的手段。
筛选方法
本发明的方法也可使用于现有治疗的微生物抗性的重要领域。目前许多细菌对目前可用的大量抗微生物治疗具有抗性,并且某些菌株(比如甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA))显示出危险的健康风险,尤其是在临床上。
因此,需要允许容易地确定针对抗微生物剂的抗性的技术和测定试剂盒。
因此,根据第二方面,本发明提供筛选样品中细胞或生物对针对所述细胞或生物的药剂的抗性的方法,该方法包括以下步骤,或者由其组成或基本由其组成:
(a)使细胞或生物接触所述药剂;
(b)使所述样品与酶接触,该酶能够在所述细胞或生物生存力的相关分子存在下在核酸分子中添加或者去除化学部分,由此产生新的可检测核酸分子;和
(c)通过检测仅在所述细胞或生物生存力相关分子存在下产生的新核酸分子来检测是否有抗性存在;
其中如果存在抗性,那么就将检测到所述新核酸分子。
也可以使用同样的方法作为筛选化合物的方法,以确定新化合物、药剂或分子对特定的一种或多种靶细胞或生物是否有影响。
由此,在第三方面中,本发明提供筛选样品中能够杀伤一种或多种细胞或生物或者防止其生长的药剂的方法,该方法包括以下步骤,或者由其组成或基本由其组成:
(a)使所述一种或多种细胞或生物接触所述药剂;
(b)使所述样品与酶接触,该酶能够在所述细胞或生物生存力的相关分子存在下在核酸分子中添加或者去除化学部分,由此产生新的可检测核酸分子;和
(c)通过检测仅在所述细胞或生物生存力相关分子存在下产生的新核酸分子来检测所述药剂是否具有杀伤所述一种或多种细胞或生物或者防止其生长的能力;
其中如果所述试剂能够杀伤所述细胞或生物或者防止其生长,那么就将检测不到所述新核酸分子。
本发明的这个方面还可用作化合物筛选中的快速生存力测试。因此,根据本方法可以筛选化合物、药剂或者分子以确定它对细胞(比如哺乳动物细胞)是否有毒。因此,就新核酸分子的检测而言,本方法的阳性结果表明所述化合物对哺乳动物或者植物细胞的毒性低。在这种情况下,合适的样品将包括哺乳动物细胞。可以实施所述筛选作为确定所述化合物、药剂或者分子是否有效杀伤致病生物、防止其生长或增殖或者防止由所述生物引起的疾病发展的序幕。
因此,在另一方面中,本发明提供在哺乳动物或者植物细胞样品中确定候选药剂或者农用试剂对哺乳动物或者植物细胞的毒性的方法,该方法包括以下步骤,或者基本由或者由以下步骤组成:
(a)使所述细胞接触所述(药用或者农用)试剂;
(b)使所述样品与酶接触,该酶能够在所述细胞或生物生存力的相关分子存在下在核酸分子中添加或者去除化学部分,由此产生新的可检测核酸分子;和
(c)通过检测仅在所述细胞或生物生存力相关分子存在下产生的新核酸分子来检测所述(药物或者农用)试剂对所述细胞是否具有毒性;
其中如果所述分子对所述细胞有毒,那么就将检测不到所述新核酸分子。
为了避免疑问,本方法通常指对分离的哺乳动物细胞样品进行的体外方法。在植物产品的情况下,可以用提供测定毒性所需细胞的任何合适的植物样品实施所述测试。因此,所述植物细胞可以来自例如植物的根、叶或茎。
所述药剂可以是用于治疗任何特定疾病的任何候选药物。在新药被用于临床之前,广泛的毒理学测试是必需的。可以证明本发明的方法可用于辅助此过程。
相似地,如果用于植物的产品(比如杀虫剂和除草剂(除莠剂))对需要提供对害虫或杂草提供保护的植物有毒,那么它们就没有多少价值。因此,可以利用本发明的方法以确保候选试剂对于意在由使用所述试剂而获益的植物无毒。
还可证明本发明的方法具有诊断效用,其中在仅存在最低水平的感染细胞或生物时可以特异和灵敏地检测早期阶段的感染。
因此,在另一方面中,本发明提供在得自受试者的样品中诊断受试者中与细胞或生物的存在相关的感染或疾病的方法,该方法包括以下步骤,或者基本由或者由以下步骤组成:
(a)使所述样品与酶接触,该酶能够在所述细胞或生物生存力的相关分子存在下在核酸分子中添加或者去除化学部分,由此产生新的可检测核酸分子;和
(b)通过检测仅在所述细胞或生物生存力相关分子存在下产生的新核酸分子来检测有活力的细胞或生物的存在情况;
其中如果检测到所述新核酸分子,则认为该受试者已被感染或者患该疾病。
在此上下文内,“样品”通常是临床样品。所用的样品将取决于所测试的病症。可以使用的但不意在限制本发明的典型样品包括采自患者、最优选人患者的全血、血清、血浆、血小板和尿样等。
在一个非常优选的实施方案中,所述测试将是在取自受试者的样品上进行的体外测试。
在另一实施方案中,上述诊断方法还可以包括从受试者获取样品的步骤。从受试者获取合适样品的方法在本领域中是众所周知的。或者,可以从分离步骤中分离自患者的样品开始来实施本方法。最优选对来自人的样品实施所述诊断方法,但是本发明的方法对许多动物都具有诊断效用。
可以使用本发明的诊断方法补充任何现有可用的诊断技术,可能作为证实初始诊断的方法。或者,本方法可以由于其自身的特性而用作初步诊断方法,因为本发明提供快捷便利的诊断手段。此外,由于它们内在的灵敏度,本发明的诊断方法只需要极少的样品,因此避免了不必要的介入手术。同样地,本发明的方法也可以有效地测试大量但未经浓缩的样品。
因此,本发明的方法具有除检测样品中污染生物之外的多种用途。上述关于本发明第一方面的描述加以必要变更后可用于本发明的其它方面,并且出于简明的原因不再重述。
在一些优选的实施方案中,所述生存力相关分子来源于细菌。
所述细菌可以是能够引起受试者(优选人受试者)感染或者疾病的任何细菌。在一个实施方案中,所述细菌包括葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌并优选为甲氧西林抗性菌株、肠球菌属物种、链球菌属物种、分枝杆菌属物种尤其是结核分枝杆菌、弧菌属物种尤其是霍乱弧菌、沙门氏菌属和/或大肠杆菌等中的一种或多种,或者由其组成或基本由其组成。
在一个实施方案中,根据本发明的第二、三和四方面,在本方法中测试的分子(测试抗性或者治疗感染的能力或者对细胞的毒性)是抗微生物化合物。在化合物筛选方法中,可以测试任何分子。实例包括抗微生物剂、核酸分子(包括siRNA分子和反义分子)、小分子、抗体和其所有衍生物(包括Fab片段、可变区片段和单结构域抗体,例如只要它们保留结合亲和力即可)等。本方法可以在高通量情况下实施,以在短时间内筛选大量分子。
在一个实施方案中,所述抗微生物剂可以是来自两种主要类型的抗微生物剂,抗生素(由微生物产生的天然物质)和化学治疗剂(化学合成的),或者可以是这两种类型的杂合体,比如半合成抗生素(经后续修饰的天然产生的抗生素)或者合成抗生素(天然抗生素的合成形式)。
在本发明方法中在杀伤细胞或生物或者防止其生长的能力和/或对哺乳动物细胞无毒性方面获得阳性结果之后,可以对合适的候选抗微生物剂测试至少一种或多种以下特性:
(1)所述试剂对于受试者应没有毒性并且没有不良副作用,
(2)所述试剂对于受试者应为非变应性,
(3)所述试剂应不清除受试者的天然菌群,
(4)所述试剂应是稳定的,
(5)所述试剂应优选是便宜的和易于获得的/易于制备的;和
(6)所述试剂应是足够有效的,以使得不发生(任何可感知程度的)病原体抗性。可以根据本发明第二方面(上文)描述的方法测试该特征。
在一个实施方案中,可对多种合适抗微生物剂的组合测试治疗感染的能力和/或对其的抗性。
可以测试抗性并且也许还可以测试其治疗某些感染的新能力的抗生素或其衍生物可以选自以下,其作为举例而非限制:β-内酰胺如青霉素,尤其是青霉素G或者V,以及头孢菌素比如头孢噻吩,半合成青霉素比如氨苄青霉素、甲氧西林和阿莫西林、优选与半合成青霉素制剂结合使用的克拉维酸(例如clavamox或者力百汀)、单酰胺菌素比如氨曲南、羧基青霉烯(carboxypenem)比如亚胺培南、氨基糖苷类比如链霉素、卡那霉素、妥布霉素和庆大霉素、糖肽类比如万古霉素、林可霉素和克林霉素、大环内酯类比如红霉素和竹桃霉素、多肽类比如多粘菌素和杆菌肽、多烯类比如两性霉素和制霉菌素、利福霉素类比如利福平、四环素类比如四环素、半合成四环素类比如强力霉素、金霉素、氯霉素、喹诺酮类比如萘啶酸和氟喹诺酮以及竞争性抑制剂比如磺胺类,例如醋磺胺异噁唑和甲氧苄啶。
还可以使用头孢曲松和/或呋喃西林(nitroflurazone)。
本发明的试剂盒
本发明还提供试剂盒,其允许并且适于实施本发明的方法。
因此,在另一方面中,本发明提供用于检测样品中与一种或多种(有活力的)细胞或生物生存力相关的分子的试剂盒,其包括以下各项,或者由其组成或基本由其组成:
(a)核酸分子;和
(b)酶,其能够在所述与一种或多种细胞或生物生存力相关的分子存在下在核酸分子中添加或者去除化学部分,由此产生新的可检测核酸分子。
仍在另一方面中,本发明还提供用于筛选细胞或生物对针对所述细胞或生物的分子的抗性的试剂盒,该试剂盒包括以下各项,或者由其组成或基本由其组成:
(a)核酸分子;和
(b)酶,其能够在所述细胞或生物生存力相关分子存在下在核酸分子中添加或者去除化学部分,由此产生新的可检测核酸分子。
在另一方面中,本发明提供用于筛选能够杀伤细胞或生物或者阻止其生长的分子的试剂盒,该试剂盒包括以下各项,或者基本由或者由以下各项组成:
(a)核酸分子;和
(b)酶,其能够在所述细胞或生物生存力相关分子存在下在核酸分子中添加或者去除化学部分,由此产生新的可检测核酸分子。
此外,本发明还提供用于诊断受试者中与细胞或生物相关的存在相关的感染或者疾病的试剂盒,其包括以下各项,或者由其组成或基本由其组成:
(a)核酸分子;和
(b)酶,其能够在所述细胞或生物生存力相关分子存在下在核酸分子中添加或者去除化学部分,由此产生新的可检测核酸分子。
在另一方面中,本发明提供用于确定候选药剂或者农用试剂对于哺乳动物或者植物细胞毒性的试剂盒,其包括以下各项,或者由其组成或基本由其组成:
(a)核酸分子;和
(b)酶,其能够在所述细胞或生物生存力相关分子存在下在核酸分子中添加或者去除化学部分,由此产生新的可检测核酸分子。
如上所述,所述药剂可以是治疗任何特定疾病的任何候选药物。相似地,如果用于植物的产品比如杀虫剂和除莠剂对需要提供对害虫或杂草提供保护的植物有毒,那么它们就没有多少价值。因此,可以利用本发明的试剂盒以确保候选试剂对于意在由使用所述试剂而获益的植物无毒。
优选地,这些试剂盒还包括(c)另外的核酸分子,或者由其组成或基本由其组成。
本发明方法的所有方面都可用于本发明的试剂盒,因此上文的说明同样应用于此。
在一个实施方案中,通过连接形成所述新核酸分子。优选地,通过所述核酸分子与另外的核酸分子的连接生成所述新核酸分子。就本发明方法提供的描述加以必要修改后可应用于本发明的试剂盒方面。
如前所述,用于产生所述新的核酸分子的优选手段包括连接。因此,优选地,能够在细胞或生物生存力相关分子存在下在核酸分子中添加或者去除化学部分,由此产生新的可检测核酸分子的酶包括连接酶,或者由其组成或基本由其组成。
可以使用任何合适的连接酶,这取决于用于其活性的生存力相关分子(如上面定义的,例如ATP)。因此,连接酶活性与样品中(有活力的)细胞或生物的生存力相关分子的存在直接相关,因为如果有标志物存在,那么连接酶将被活化,并由此催化生成可检测的新核酸分子。连接酶合适的非限制性实例包括市售的T4DNA连接酶或者T4RNA连接酶。
优选地,如上所述,以失活形式提供所述连接酶,所以活化剂辅因子(其可以是例如ATP或者NAD+)将不存在。这意味着所述连接酶必须由来自待检测的细胞或生物的生存力相关标志物活化。或者,所述试剂盒可以提供活化形式的连接酶,但还可以提供用于在使用前使连接酶失活的手段。如何从连接酶中去除AMP分子或者NAD+的详细描述已在上面提供,并且同样地应用于本发明的试剂盒方面,例如与焦磷酸一起孵育。在下面的实验部分中提供去腺苷化的细节。
最优选的生物生存力相关分子包括ATP,或者由其组成或基本由其组成。然而,可以监测替代分子,比如NAD+。在这种情况下,可以使用大肠杆菌DNA连接酶,因为此连接酶的活性需要NAD+,而非ATP。
如上面关于本发明方法的较详细描述,ATP可以来源于任何合适的来源。
在一个最优选实施方案中,在样品中检测的一种或多种细胞或生物包括微生物,尤其是细菌和/或酵母,或者由其组成或基本由其组成。这些微生物的水平与公众健康和卫生关系重大。优选地,所述一种或多种生物包括细菌,或者由其组成或基本由其组成。
然而,本发明的试剂盒可用于检测来自所有来源(包括来自植物和动物细胞)的生存力相关分子。这可以用于比如监测细胞培养物,也可以用于确定特定的样品中是否存在任何来源的污染。
所述细菌可以是样品中认为是污染物的任何细菌物种。本发明的方法具有如上所述的广泛实用性,并且在本方法中可以检测许多不同的物种和菌株。当然,可以同时检测多种类型的细胞和生物,因为与生存力相关的标志物(比如ATP)是普遍存在的。
对某些细胞或生物更特异性的检测可能需要特异性过滤,从而使待检测的细胞或生物与其它产生ATP的细胞分开。这样的滤器和过滤系统和方法在本领域中是众所周知的并且可以购得(例如见www.nhdiag.com)。本发明的试剂盒还可整合合适的滤器或者过滤机制或系统,从而能够在确定与生存力相关分子是否存在之前分离靶细胞或生物。
此外,还可以利用能结合特定细胞或生物的特异性试剂选择所述细胞或生物。因此,本发明的试剂盒还可以包括抗体和其所有保留了特异性结合亲和力的衍生物(比如Fab片段、单结构域抗体和可变区片段),或者由其组成或基本由其组成。
在一个实施方案中,所述细菌包括葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌并优选为甲氧西林抗性菌株、肠球菌属物种、链球菌属物种、分枝杆菌属物种尤其是结核分枝杆菌、弧菌属物种尤其是霍乱弧菌、沙门氏菌属、大肠杆菌等中的一种或多种,或者由其组成或基本由其组成。
在本发明的一个特别优选的实施方案中,所述酶固定在固体支持物上。将酶固定在固体支持物上允许有效地捕获来自被检测的一种或者多种细胞或生物的生存力相关分子。固定酶与生存力相关分子的相互作用使所述酶作用于核酸分子,由此导致生成新的核酸分子。因此,本发明的试剂盒还可以包含固体支持物。所述酶可以预先加载或者可以不预先加载在固体支持物上。如果它没有预先固定在固体支持物上,在试剂盒中可以提供允许固定的合适试剂以及任选的说明书。允许固定的试剂对于本领域的技术人员是众所周知的。可以利用任何固定手段,只要它对本发明方法的实施没有不利影响即可,尤其是在检测与来自一种或多种靶细胞或生物的生存力相关分子的特异性和灵敏度方面。
在本发明的试剂盒中可以包括任何合适的固体支持物。固体支持物的性质对于本发明的性能并不是关键性的,只要所述酶可以固定于其上并且对酶活性(包括酶和与一种或多种细胞或生物的生存力相关分子相互作用的能力)没有不利影响即可。固体支持物的非限制实例包括任何的珠,比如聚苯乙烯珠和顺磁珠和其衍生物、亲和柱、微孔板等。
在另一些实施方案中,在本发明试剂盒中也可以提供固定在固体支持物上的核酸分子和/或另外的核酸分子。以上说明加以必要修正后同样适用。在一个具体实施方案中,所述核酸分子和另外的核酸分子可以彼此固定在同一支持物上。这使所述分子接近,以确保一旦连接酶被生存力相关分子所活化就有效进行连接。
在另一实施方案中,所述核酸分子和/或另外的核酸分子可以与酶固定在同一支持物上。这样,如果酶被活化(由生存力相关分子所活化,优选ATP),它将能很容易地作用于所述的核酸分子和/或另外的核酸分子。这确保了最大的检测灵敏度。
仍在另一实施方案中,本发明的试剂盒还包括核酸扩增所必需的试剂,或者由其组成或基本由其组成。优选地,所述试剂用于实施PCR、滚环扩增、NASBA、3SR和TMA中任一项。实施核酸扩增的试剂可以购得,并且在本领域中已非常充分地表征。合适试剂的实例包括设计用于扩增所述新核酸分子的引物、聚合酶如Taq聚合酶(可获得其若干变体(包括热启动变体))以及缓冲液比如KCl和(NH4)2SO4。
在一个优选实施方案中,所述试剂盒还包括用于检测实时核酸扩增产物的试剂,或者由其组成或基本由其组成。优选地,所述试剂盒包括用于实施实时扩增和检测的试剂,所述实时扩增和检测利用系统、Molecular系统、 和探针系统中的任一项。用于这些方法的合适试剂在本领域中是众所周知的,并且可以购得。
合适试剂的实例包括序列特异性探针。这些探针可以结合在用于扩增新核酸分子的引物之间,并由此可以结合于扩增的核酸分子,从而提供扩增期间所形成产物水平的直接指示剂。对于本领域技术人员来说设计这样的探针是常规的。或者,可能需要设计适当的引物,例如在允许实时检测扩增产物的Amplifiuour和Scorpion系统中。
在本发明的范围内包括任何合适的荧光团。可能包括在本发明试剂盒中的荧光团包括例如FAM、HEXTM、NEDTM、ROXTM、Texas RedTM等。相似地,本发明的试剂盒并不限于单一猝灭剂。猝灭剂例如Dabcyl和TAMRA是可在本发明方法中使用并且包括在本发明试剂盒中的众所周知的猝灭剂分子。
本发明的试剂盒还可以包括用于生成和检测除上述以外的PCR产物的其他必要组件,比如可用于检测扩增产物或者用于扩增(芯片上的扩增)和检测扩增产物的微阵列。其它的组件还可以包括如AppliedBiosystems描述的“微流体卡(micro fluid cards)”、逆杂交条(Reversedhybridization strips)比如由LIPA technology(Innogenetics,Zwijnaarde,Belgium,或者由Ulysis and ULS technology(Kreatech Biotechnologies,Amsterdam,The Netherlands)所描述的)所描述的。这样的组件在本领域中是已知的,所述列举用于举例,而非限制本发明试剂盒的包含内容。
用本发明试剂盒测试的样品可以是如上定义的任何合适的样品。例如,所述样品可以是临床样品或者体外测定系统。样品可以是饮料或者食品样品或者其制备物,或者药品或者化妆品比如个人护理产品比如洗发剂、护发素、保湿剂等,它们均须常规进行微生物污染测试。例如,所述样品可以包括组织或者细胞,可以是痰或者血样或者血小板样品。
如上所述,对于检测来自特定细胞或生物的生存力相关分子而言,在本发明试剂盒中整合特定的滤器或者过滤系统是有益的。
本发明的试剂盒可以包括其他裂解试剂,其裂解不是靶细胞或生物、但同样对测定系统贡献生存力相关标志物的其它细胞。优选地不裂解待检测细胞或生物的细胞的合适试剂包括例如但不限于醇类、盐等,还可能是例如蛋白酶K和氯仿的试剂,这取决于所检测细胞或生物。
本发明的试剂盒还可以包含用于从所述样品中去除或者消耗不是由所述一种或多种细胞或生物提供的与所述一种或多种细胞或生物生存力相关的任何分子的酶,或者由其组成或基本由其组成。优选地,与所述一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子包括ATP。在一个具体实施方案中,所述酶包括萤光素酶、磷酸酶和焦磷酸酶中任何一种或多种,因为所有这些酶均可用于消耗样品中源于非靶细胞或生物的ATP信号,否则其可以引起假阳性结果。
本发明的试剂盒还可以包括用于裂解待检测生存力的细胞或生物从而释放与所述一种或多种细胞或生物生存力相关分子的试剂,或者由其组成或基本由其组成。合适的试剂包括例如但不限于苯酚、氯仿和蛋白酶K。
本发明的试剂盒还可以包括用于降解与细胞或生物相关的核酸分子的一种或多种核酸酶,或者由其组成或基本由其组成,所述细胞或生物提供样品中被检测的生存力相关分子。例如,这可以有益于防止非特异性连接事件。然而这不一定是绝对需要的,因为可以设计所述核酸分子和/或另外的核酸分子,以使得它们与检测生存力的细胞或生物的核酸分子没有同源性。这在上面有详细的论述,并且对于本发明核酸分子而言的优选同源性水平同样可以应用于本发明试剂盒中包括的核酸分子。
在一个具体实施方案中,所述试剂盒具有合适的缓冲剂,其允许所有的组分在同一区室或者贮存容器中提供。因此,整个试剂盒基本上作为完整(同质)的反应混合物提供。由此,可以在单反应步骤中实施本发明的方法,单反应步骤降低了样品交叉污染的可能性并且还快速地提供结果。尤其优选的是提供实时结果的反应混合物。优选地,这样的反应混合物是水性组合物,但是例如其可以作为干粉提供而用无菌或者蒸馏水重建。
优选地,所包括的试剂允许使用等温扩增技术,比如TMA。优选地,所述试剂允许实时进行等温扩增技术比如TMA。
本发明的所有试剂盒都可以具有用于本发明任一方法的说明书。说明书可以以插入物提供,例如在试剂盒包装内提供的小册子和/或可以印刷在试剂盒的包装上。
由此,仍根据另一方面,本发明提供用于向表面施用反应混合物的喷洒装置,所述反应混合物包含实施本发明方法的所有必需组分。可以利用任何合适的喷洒装置,例如其可以是泵式喷洒装置或者喷雾装置。这样的装置在需要检测微生物或检测任何来源的任何污染细胞的许多情形中均可应用。例如,在制备食品过程中,能够确保食品制备后清洁表面之后,表面上未残留潜在的有害细胞或生物将是很有利的。这保证所述表面是“清洁的”并且可以用于其他食品制备。整合了连接酶的试剂盒对于本发明的喷洒装置是尤其优选的。还可以在卫生监测应用中使用喷洒装置检测表面上的ATP污染。由此,这种生存力相关分子的存在指示在表面上存在某种形式的污染,可以是例如植物、微生物或者动物来源。对于检测表面上的生存力相关分子(尤其是ATP)而言,使用等温DNA扩增法是尤其优选的。合适的实例参见上面的优选检测技术部分。
通过对相关附图和实施例进一步限定和理解本发明,其中,
附图说明
图1显示本发明方法的有效性。本发明的方法可以检测到极低浓度的ATP。
图2图示用于本发明方法的反应试剂的一种优选设置。
图3图示显示用于本发明方法的反应试剂的另一种优选设置。
图4表示对ATP依赖性连接酶介导的DNA链共价连接的实时PCR测量。在同一图中以不同的曲线显示在反应中使用多种ATP水平的结果。荧光读出值相对于循环数作图。
图5显示来自定量PCR的信号,通过ATP测定中不同细菌数由ATP催化的DNA底物共价连接来衡量(通过平板计数测定)。
图6显示定量PCR的结果,代表ATP催化的DNA底物链连接的量,依赖于培养基中四环素的量。
图7显示对由甲氧西林敏感性菌株产生的ATP的实时定量PCR结果,所述菌株对苯唑西林攻击无抗性。
图8显示关于甲氧西林抗性菌株的实时定量PCR结果,所述菌株对苯唑西林的攻击有抵抗性。
图9显示通过在试验中包含碱性磷酸酶来去除外源ATP的效果。
ATP检测反应试剂的优选设置的实施例
实施例1
在图2显示的实施方案中,DNA底物附着在磁珠上提供给终端用户,其中通过共价方式或者如图所示通过寡聚物5’末端上生物素(B)与已共价连接至所述珠的链霉抗生物素蛋白(S)的键合附着在磁珠上。在这种情况下,通过使链霉抗生物素蛋白与连接酶以合适的摩尔比(根据经验确定)混合来用链霉抗生物素蛋白预标记所述珠,之后均如前述与珠共价连接。在此实施方案中,通过第三桥连寡聚物以非共价形式连接形成PCR的底物的两个寡聚物,其中以箭头标出了PCR引物位点。在室温下,这种3’-寡聚物结构是稳定的。在ATP存在下通过连接酶发生连接之后,在一个寡聚物的3’末端与另一寡聚物的5’磷酸化(P)末端之间形成稳定的共价键,随后形成PCR的底物。在缺乏连接的情况下,没有PCR底物形成。连接酶和DNA底物都结合在珠上的这种形式的优点在于,连接酶与DNA底物的紧密接近。这增强了连接反应的动力学,使得对ATP的检测更加灵敏,并且还使可能是连接酶的竞争性底物的任何外源DNA(例如细菌DNA)对连接的任何干扰最小化。
用于此实施例的示例性寡聚物是:
SEQ ID NO:1
5’生物素GCCGATATCGGACAACGGCCGAACTGGGAAGGCGCACGGAGAGA 3′
SEQ ID NO:2
5’磷酸化CCACGAAGTACTAGCTGGCCGTTTGTCACCGACGCCTA 3′
SEQ ID NO:3
桥连寡聚物,
5′TAGTACTTCGTGGTCTCTCCGTGCAA 3′磷酸化。
实施例2
在图3显示的实施方案中,DNA底物附着在磁珠上提供给终端用户,其中通过共价方式或者如图所示通过寡聚物5’末端上生物素(B)与已共价连接至所述珠的链霉抗生物素蛋白(S)的键合附着在磁珠上。在这种情况下,通过使链霉抗生物素蛋白与连接酶以合适的摩尔比(根据经验确定)混合来用链霉抗生物素蛋白预标记所述珠,之后均如前述与珠共价连接。在此实施方案中,形成PCR底物的双链体寡聚物通过共价方式与珠连接,其中以箭头标出了PCR引物位点。在ATP存在下通过连接酶发生连接之后,在一个双链体寡聚物的至少一个3’末端与另一双链体寡聚物的5’磷酸化(P)末端之间形成稳定的共价键。这形成用于PCR的底物。在缺乏连接的情况下,没有PCR底物形成。连接酶和DNA底物都结合在珠上的这种形式的优点在于,连接酶与DNA底物紧密接近。这增强了连接反应的动力学,使得对ATP的检测更加灵敏,并且还使可能是连接酶的竞争性底物的任何外源DNA(例如细菌DNA)对连接的任何干扰最小化。
用于此实施例的示例性寡聚物是:
双链体1
SEQ ID NO:4
5’生物素GCCGATATCGGACAACGGCCGAACTGGGAAGGCGCACGGAGAGA 3′
SEQ ID NO:5
5’磷酸化
CGTGGTCTCTCCGTGCGCCTTCCCAGTTCGGCCGTTGTCCGATAT 3′
双链体2
SEQ ID NO:6
5’磷酸化CCACGAAGTACTAGCTGGCCGTTTGTCACCGACGCCTA 3′
SEQ ID NO:7
5’生物素TAGGCGTCGGTGACAA CGGCCAGCTAGTACTT 3′
实验1.证实使用连接酶对ATP进行高灵敏度检测
介绍
将连接酶偶联至顺磁珠并去腺苷化。使用DNA底物,用这种去腺苷化的连接酶检测ATP的连续稀释物。在ATP存在下,连接酶将两条DNA连接在一起,通过PCR和琼脂糖凝胶电泳检测这一新DNA序列。
方法
连接酶的去腺苷化和连接酶与珠的交联
1.使用磁体在PBS中洗涤500μl Dynal M270胺顺磁珠并与PBS中1mg/ml的辛二酸羟基琥珀酸酯(Sigma)一起在室温下摇动孵育30分钟。
2.室温下,在500μl体积的50mM Hepes pH 7.5、5mM焦磷酸钠、10mMDTT中使4000单位的T4DNA连接酶(New England Biolabs)去腺苷化30分钟。
3.在PBS和随后的50mM Hepes pH7.5中洗涤所述珠两次,并且向洗涤过的珠中添加连接酶混合物并在室温下摇动孵育30分钟。
4.在50mM Hepes pH 7.5、5mM焦磷酸钠、10mM DTT中洗涤固定化连接酶两次,并在500μl的这种洗涤溶液中孵育10分钟。
5.最终,用TBS、10mM DTT、10mM乙醇胺、1mM MgCl2洗涤固定化连接酶5次,并在使用之前保存在500μl的这种缓冲液中。
ATP测定
1.捕获根据上述制备的25μl的珠并去除液体。
2.将珠重悬在10μl反应物中,其含有溶于0.6×TBS的ATP稀释液、1mM MgCl2和DNA底物,所述DNA底物由各10ng的两种双链DNA组成,其具有单链互补突出端和5’磷酸基(见图1)。通过使等摩尔量的合成寡聚体退火形成每种DNA双链体。
SEQ ID NO:8
5′GCCGATATCGGACAACGCCGAACTGCGAAGGGC 3′
SEQ ID NO:9
3′CGGCTATAGCCTGTTGCGGCTTGACGCTTCCCGGTTCP 5′
SEQ ID NO:10
5′PCAAGCGTCATCAGCCGCGTGGCCTTTGTCACCGACGCCTA 3′
SEQ ID NO:11
3′GCAGTAGTCGGCGCACCGGAAACAGTGGCTGCGGAT 5′
3.在室温下连接1小时后,通过使用标准条件和以下PCR引物的PCR来分析5μl的各个反应物:
SEQ ID NO:12
5′GGACAACGCCGAACTGCGAAGGGC 3′
SEQ ID NO:13
5′TAGGCGTCGGTGACAAAGGCCACG 3′
4.25个PCR循环后,通过在3%(重量/体积)Metaphor(CambrexBio Science)琼脂糖凝胶上的凝胶电泳来分析产物。
结果
从图1中可以看出,连接酶反应物中存在的极少量ATP可以催化DNA双链体的连接或结合,形成可通过PCR扩增和检测的新分子。从图1中可以看出,在此试验中,低达0.1pmol ATP提供的信号明显强于来自未添加ATP的对照。
讨论
该实验显示连接酶可以去腺苷化,随后用作针对ATP的高灵敏度检测方法的一部分。
实验2.证实从大体积中捕获ATP并随后使用连接酶进行高灵敏度检测
介绍
如实验1所述,将连接酶偶联至顺磁珠并使其去腺苷化。使用这种去腺苷化的连接酶捕获已被稀释成大体积的ATP,随后通过连接DNA底物和PCR检测所捕获的ATP。
方法
珠的去腺苷化和连接酶与所述珠的交联如实验1中所述。
ATP的测定
1.捕获如上述制备的50μl缀合了连接酶的珠并去除液体。
2.将珠重悬在含有ATP连续稀释液的1ml TBS、10mM DTT、1mMMgCl2中,并在室温下摇动孵育30分钟。在捕获ATP后,捕获所述珠并重悬在连接反应物中,其包含0.6×TBS、1mM MgCl2和DNA底物,所述DNA底物由各10ng的两种双链体DNA组成,如实验1中所述。
3.在室温下连接1小时后,通过如试验1中所述的PCR和metaphor凝胶分析来分析5μl的各个反应物。
结果
稀释在1ml TBS中的低达0.1pmol ATP提供的信号明显强于来自未添加ATP的对照的信号。
讨论
这个实验显示,去腺苷化的连接酶可以捕获来自大体积的少量ATP,随后可以使用连接和连接产物的PCR分析进行检测。这证明在测试之前可以使用本发明浓缩ATP。
试验3.ATP的检出限
方法
1.在100μl连接酶缓冲液(50mM Tris pH 7.5、1mM MgCl2、1mMDTT)中制备ATP的10倍稀释物。
2.添加5μl连接酶/DNA底物顺磁珠(按图3中所述制备,见上文)并在8℃孵育60分钟。
3.随后使用磁体收集所述珠并重悬在20μl连接酶缓冲液中。
4.在95℃加热5分钟后,通过PCR定量2μl洗脱的连接产物。
5.在标准条件下使用来自eurogentec.的qPCR Mastermix SYBRGreen 1-No Rox PCR mix在定量PCR仪,PTC-200,GRI上实施PCR,其中使用以下引物:
SEQ ID NO:14
5′GGACAACGGCCGAACTGGGAAGGC 3′
SEQ ID NO:15
5′TAG GCGTCGGTGA AAACGGCCAGC 3′
循环为50℃2分钟,95℃15分钟,接着是95℃10秒钟、65℃15秒钟和72℃15秒钟的40个循环。在每个72℃步骤的结束时测量SYBR Green染料的荧光(见图4)。
结果
附图显示了对ATP依赖性连接酶所介导的DNA链(随后通过PCR进行检测)共价连接的实时测量。随着在反应中存在更多的ATP,就有更多DNA链的连接,通过PCR就检测到更多的DNA。
讨论
与预计一致,随着ATP浓度的增加,如定量PCR测量所示的连接DNA产物有相关的增加,它们都大于在无ATP的对照中观察到的结果。
试验4.证实在生长的细菌中检测ATP
方法
1.在LB培养基中制备大肠杆菌的细菌培养物,并在37℃过夜生长至稳定期。
2.第二天,在LB培养基中制备10倍稀释的细菌培养物并在37℃培养3小时。
3.孵育之后,通过LB琼脂平板上涂板、过夜孵育和菌落计数来定量细菌的适当稀释率。
4.对于ATP的定量而言,在用25μl的0.1M HCL中和之前,向10μl的各个3小时培养物中添加2.5μl的1M NaOH、1%(体积/体积)Trition X-100并孵育5分钟。
5.随后添加100μl的连接酶缓冲液,接着是5μl的连接酶/DNA底物顺磁珠(按照上面实施例1中所述制备)。
6.在8℃孵育60分钟后,使用磁体收集所述珠并重悬在20μl的连接酶缓冲液中。
7.在95℃加热5分钟之后,通过PCR定量2μl洗脱的连接产物。
8.按照前述实施定量PCR。
结果
作为ATP催化的DNA底物共价连接的度量的定量PCR信号下降,与ATP测定中通过平板计数确定的细菌数的下降一致(图5)。这确定了,包含在106-104个细菌内的ATP提供的定量PCR信号大于无ATP对照提供的信号。
讨论
包括DNA链的ATP依赖性连接酶结合的ATP测定可以检测104个大肠杆菌内包含的ATP量。
实验5.使用ATP测定证明细菌对抗生素的易感性
方法
1.在LB培养基中制备大肠杆菌的四环素敏感性菌株的细菌培养物,并在37℃过夜培养至稳定期。
2.第二天,在含有和不含有四环素的LB培养基中制备稀释100倍的细菌培养物,并在37℃培养3小时。
3.对于ATP的定量而言,在用25μl的0.1M HCL中和之前,向10μl的各个3小时培养物中添加2.5μl的1M NaOH、1%(体积/体积)Trition X-100并孵育5分钟。
4.随后添加100μl的连接酶缓冲液,接着是5μl的连接酶/DNA底物顺磁珠(按照上面实施例1中所述制备)。
5.在8℃孵育60分钟后,使用磁体收集所述珠并重悬在20μl的连接酶缓冲液中。
6.在95℃加热5分钟之后,通过PCR定量2μl洗脱的连接产物。
7.按照前述实施定量PCR。
结果
从定量PCR(图6)中可以看出,ATP所催化的DNA底物链连接的量随着培养基中四环素量的增加而下降。这反映了,由于这种大肠杆菌菌株对四环素敏感,因此它在该抗生素存在下生长受到抑制,细菌的生存力下降。这进而导致细菌中的ATP减少,当从细菌中释放并测量时,在我们的测定中ATP依赖性DNA底物连接也减少。定量PCR信号的延迟反映出共价连接DNA产物的形成减少。
讨论
通过这种新的ATP测定可以清楚地证明细菌对于抗生素的易感性,其中抗生素处理引起细菌生存力的丧失,所测量ATP的量随之降低。
实验6.使用ATP测定证明金黄色葡萄球菌对于抗生素的易感性
方法
1.在营养培养基(Lab M,UK)中制备MRSA和金黄色葡萄球菌抗生素敏感性菌株临床隔离群的细菌培养物,并在37℃过夜培养至稳定期。
2.第二天,在含有及不含有60μg/ml苯唑西林的含1μl碱性磷酸酶(10单位,New England Biolabs)的相同培养基中制备100倍稀释的细菌培养物并在37℃培养3小时。
3.对于ATP的定量而言,在用25μl的0.1M HCL中和之前,向10μl的各个0(在第0分钟时移出并处理的10μl培养基)或3小时培养物中添加2.5μl的1M NaOH、1%(体积/体积)Trition X-100并孵育5分钟。
4.随后添加100μl的连接酶缓冲液,接着是5μl的连接酶/DNA底物顺磁珠(按照上面实施例2中所述制备)。
5.在8℃孵育60分钟后,使用磁体收集所述珠并重悬在20μl的连接酶缓冲液中。
6.在95℃加热5分钟之后,通过PCR定量2μl洗脱的连接产物。
7.按照前述实施定量PCR。
结果
图7显示了甲氧西林敏感性菌株的结果,所述菌株显示对苯唑西林(一种用作甲氧青霉素代用品的体外抗生素)抗生素的攻击没有抗性。与零时间点相比,在3小时之后,观察到有生长和ATP增加。当所述生物在苯唑西林存在下生长时,没有观察到这样的生长和ATP增加。该生物对这种抗生素敏感,并且通过所述生物中ATP的减少显示出所述生物生存力的降低。
图8显示甲氧西林抗性菌株的结果,所述菌株显示对苯唑西林(一种用作甲氧西林代用品的体外抗生素)抗生素的攻击具有抗性。与零时间点相比,在缺少抗生素的条件下,在3小时之后,观察到有生长和ATP增加。当所述生物在60μg/ml的苯唑西林存在下生长时,这样的生长和ATP增加有所降低但并未消失。该生物对这种抗生素不敏感,并且在这种抗生素存在下继续生长和产生ATP。
讨论
在苯唑西林存在下培养之后,MRSA和金黄色葡萄球菌敏感性临床隔离群的ATP含量有明显的差异。当在这种抗生素存在下培养时,细菌敏感性菌株丧失生存力和ATP,而抗性MRSA菌株继续保持活力并维持较高水平的ATP。
试验7.碱性磷酸酶去除外源ATP的作用的研究
方法
1.在营养培养基(Lab M,UK)中制备金黄色葡萄球菌菌株的临床隔离群并在37℃过夜培养至稳定期。
2.第二天,在含有和不含有1μl碱性磷酸酶(10单位,New EnglandBiolabs)的相同培养基中制备100倍稀释的细菌培养物并在37℃培养3小时。
3.对于ATP的定量而言,在用25μl的0.1M HCL中和之前,向10μl的各个0(在第0分钟时移出并处理的10μl培养基)或3小时培养物中添加2.5μl的1M NaOH、1%(体积/体积)Trition X-100并孵育5分钟。
4.随后添加100μl的连接酶缓冲液,接着是5μl的连接酶/DNA底物顺磁珠(按照上面实施例2中所述制备)。
5.在8℃孵育60分钟后,使用磁体收集所述珠并重悬在20μl的连接酶缓冲液中。
6.在95℃加热5分钟之后,通过PCR定量2μl洗脱的连接产物。
7.按照前述实施定量PCR。
结果
所述碱性磷酸酶导致零时间点的信号降低(见图9)。推测这是因为累积在培养基中来自生长细胞的任何ATP均已去除,在此测定中检测不到。较不明显的是,与无磷酸酶的对照相比,细胞生长期间在培养基中包含磷酸酶使3小时的信号提高。其原因尚不清楚。
讨论
在细胞生长期间包含降解ATP的酶或试剂如碱性磷酸酶可帮助去除释放自无活力或者垂死的渗漏细胞的任何ATP,并且在零对照和已生长一段时期的细胞之间给出好得多的差异信号。
本文所引用的所有参考文献在此具体并入本文,并作为本发明公开内容的一部分。
序列表
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<120>检测生存力相关分子的改进方法
<130>SCB/P79945WO00
<150>GB0513535.5
<151>2005-07-01
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<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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<212>DNA
<213>人工的
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<223>合成的寡核苷酸
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<223>5′末端碱基经生物素修饰
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gccgatatcg gacaacggcc gaactgggaa ggcgcacgga gaga 44
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taggcgtcgg tgacaaacgg ccagc 25
Claims (70)
1.一种检测样品中与一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子的方法,其包括以下步骤:
a)使所述样品与酶接触,该酶仅在所述与该一种或多种细胞或生物生存力相关的分子存在下能够在核酸分子中添加或去除化学部分,由此产生新的可检测核酸分子;和
b)通过检测仅在所述与该一种或多种细胞或生物生存力相关的分子存在下产生的新核酸分子来检测所述与一种或多种细胞或生物生存力相关的分子的存在情况。
2.根据权利要求1的方法,其中通过连接形成所述新核酸分子。
3.根据权利要求2的方法,其中通过将所述核酸分子与另外的核酸分子连接而产生所述新核酸分子。
4.根据权利要求2或3的方法,其中所述酶包括连接酶。
5.根据权利要求4的方法,其中所述连接酶包括T4DNA连接酶或T4RNA连接酶。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法,其中所述与一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子包括ATP。
7.根据权利要求4的方法,其中所述连接酶包括大肠杆菌DNA连接酶。
8.根据权利要求7的方法,其中所述与一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子包括NAD+。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法,其中所述一种或多种细胞或生物包括细菌和/或酵母。
10.根据权利要求9的方法,其中所述一种或多种细胞或生物包括细菌。
11.根据权利要求10的方法,其中所述细菌包括葡萄球菌属(Staphylococcus)物种尤其是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)并优选为甲氧西林抗性菌株、肠球菌属(Enterococcus)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、分枝杆菌属(Mycobacterium)物种尤其是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、弧菌属(Vibrio)物种尤其是霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、沙门氏菌属(Salmonella)和/或大肠杆菌(Escherichia coli)中的一种或多种。
12.根据权利要求1-11中任一项的方法,其中所述酶固定在固体支持物上。
13.根据权利要求12的方法,其中所述固体支持物为珠、亲和柱或者微量滴定板中的任意种类。
14.根据权利要求1-13中任一项的方法,其中使用核酸扩增技术检测所述新核酸分子。
15.根据权利要求14的方法,其中所述核酸扩增技术选自PCR、滚环扩增、NASBA、3SR、TMA、链置换扩增和DNA寡聚体自装配法。
16.根据权利要求14或15的方法,其中使用实时技术检测扩增产物。
18.根据权利要求1-17中任一项的方法,其中所述样品包括饮料或食品样品或其制备物、药品或化妆品、痰或血样或血小板样品或水样品。
19.根据权利要求1-18中任一项的方法,其还包括在步骤(a)之前过滤所述样品以浓缩所述一种或多种细胞或生物。
20.根据权利要求1-19中任一项的方法,其还包括在步骤(a)之前裂解样品中的其它细胞,但不裂解待检测的所述一种或多种细胞或生物的细胞。
21.根据权利要求1-20中任一项的方法,其还包括从样品中去除或者消耗与所述一种或多种细胞或生物的生存力相关的任何分子,所述分子不是由所述一种或多种细胞或生物提供的。
22.根据权利要求21的方法,其中所述与一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子包括ATP。
23.根据权利要求22的方法,其中通过在由其他酶催化的反应中利用ATP来去除所述ATP。
24.根据权利要求23的方法,其中所述酶包括萤光素酶、磷酸酶和焦磷酸酶中的任何一种或多种。
25.根据权利要求1-24中任一项的方法,其还包括裂解所述一种或多种细胞或生物的细胞,从而释放与所述一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子。
26.根据权利要求1-25中任一项的方法,其还包括用一种或多种核酸酶处理所述样品,从而降解与所述一种或多种细胞或生物相关的核酸分子。
27.根据权利要求1-26中任一项的方法,其中所述核酸分子固定在固体支持物上。
28.根据权利要求27的方法,其中所述核酸分子与所述酶固定在相同支持物上。
29.根据权利要求1-28中任一项的方法,其中所述另外的核酸分子固定在固体支持物上。
30.一种筛选以下各项的方法:
(i)细胞或生物对针对所述细胞或生物的分子的抗性,和/或
(ii)能够杀伤细胞或生物或者阻止其生长的分子,所述方法包括:
(a)使所述细胞或生物接触所述分子;和
(b)实施权利要求1-29中任一项所定义的方法,其中如果对所述分子具有抗性和/或如果所述分子能够杀伤所述细胞或生物或者阻止其生长,则将检测到所述新核酸分子。
31.一种监测细胞培养物生长的方法,该方法包括:
(a)实施权利要求1-29中任一项所定义的方法,和
(b)测定所述新核酸分子的存在情况和/或水平,从而测定所述细胞培养物的生长。
32.一种诊断该受试者的感染或疾病的方法,所述感染或疾病与有活力的细胞或生物的存在相关,该方法包括:
(a)使所述样品与酶接触,该酶在与所述细胞或生物生存力相关的分子存在下能够在核酸分子中添加或去除化学部分,由此产生新的可检测核酸分子;和
(b)通过检测仅在与所述细胞或生物生存力相关的分子存在下产生的新核酸分子来检测所述有活力的细胞或生物的存在情况;
其中如果检测到所述新核酸分子,则认为该受试者被感染或者患有该疾病。
33.根据权利要求30-32中任一项的方法,其中所述生物为细菌。
34.根据权利要求33的方法,其中所述细菌包括葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌并优选为甲氧西林抗性菌株、肠球菌属物种、链球菌属物种、分枝杆菌属物种尤其是结核分枝杆菌、大肠杆菌等中的任意一种或多种。
35.一种测定候选药剂或者农用试剂对于哺乳动物或植物细胞的毒性的方法,其包括以下步骤,在哺乳动物或者植物细胞的样品中:
(a)使所述细胞接触所述试剂;
(b)使所述样品与酶接触,该酶在与所述细胞生存力相关的分子存在下能够在核酸分子中添加或去除化学部分,由此产生新的可检测核酸分子;和
(c)通过检测仅在与所述细胞生存力相关的分子存在下产生的新核酸分子来检测所述分子对所述细胞是否具有毒性;
其中如果所述分子对所述细胞有毒性,则将不会检测到所述新核酸分子。
36.根据权利要求30、31或33-35中任一项的方法,其中所述分子或者药剂为抗微生物化合物。
37.根据权利要求36的方法,其中所述抗微生物化合物包括β-内酰胺如青霉素,尤其是青霉素G或者V,以及头孢菌素比如头孢噻吩、半合成青霉素比如氨苄青霉素、甲氧西林和阿莫西林、优选与半合成青霉素制剂结合使用的克拉维酸例如clavamox或力百汀、单酰胺菌素比如氨曲南、羧基青霉烯比如亚胺培南、氨基糖苷类比如链霉素、卡那霉素、妥布霉素和庆大霉素、糖肽类比如万古霉素、林可霉素和克林霉素、大环内酯类比如红霉素和竹桃霉素、多肽类比如多粘菌素和杆菌肽、多烯类比如两性霉素和制霉菌素、利福霉素类比如利福平、四环素类比如四环素、半合成四环素类比如强力霉素、金霉素、氯霉素、喹诺酮类比如萘啶酸和氟喹诺酮以及竞争性抑制剂比如磺胺类,例如醋磺胺异噁唑和甲氧苄啶、头孢曲松和/或呋喃西林中的任何一种或多种。
38.根据权利要求1-37中任一项的方法,其中所述样品的体积为1至5ml。
39.根据权利要求1-38中任一项的方法,其包括检测所述新核酸分子之前的清洗步骤。
40.一种用于以下任一目的的试剂盒:
(i)检测来自样品中一种或多种细胞或生物的与生存力相关的分子,和/或
(ii)筛选一种或多种细胞或生物对针对所述细胞或生物的分子的抗性,和/或
(iii)筛选能够杀伤一种或多种细胞或生物或者阻止其生长的分子,和/或
(iv)测定候选药剂或农用试剂对于哺乳动物或植物细胞的毒性,所述试剂盒包括:
(a)核酸分子,
(b)酶,其在与所述一种或多种细胞或生物生存力相关的分子存在下能够在核酸分子中添加或去除化学部分,由此产生新的可检测核酸分子;和
(c)另外的核酸分子。
41.根据权利要求40的试剂盒,其中通过连接形成所述新核酸分子。
42.根据权利要求41的试剂盒,其中通过将所述核酸分子与该另外的核酸分子连接而产生所述新核酸分子。
43.根据权利要求40-42中任一项的试剂盒,其中所述酶包括连接酶。
44.根据权利要求43的试剂盒,其中所述连接酶包括T4DNA连接酶或T4RNA连接酶。
45.根据权利要求40-44中任一项的试剂盒,其中所述与一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子包括ATP。
46.根据权利要求43的试剂盒,其中所述连接酶包括大肠杆菌DNA连接酶。
47.根据权利要求46的试剂盒,其中所述与生物的生存力相关的分子包括NAD+。
48.根据权利要求40-47中任一项的试剂盒,其中所述一种或多种细胞或生物包括细菌和/或酵母。
49.根据权利要求48的试剂盒,其中所述一种或多种细胞或生物包括细菌。
50.根据权利要求49的试剂盒,其中所述细菌包括葡萄球菌属物种尤其是金黄色葡萄球菌并优选为甲氧西林抗性菌株、肠球菌属物种、链球菌属物种、分枝杆菌属物种尤其是结核分枝杆菌、弧菌属物种尤其是霍乱弧菌、沙门氏菌属和大肠杆菌中的任意一种或多种。
51.根据权利要求40-50中任一项的试剂盒,其中所述酶固定在固体支持物上。
52.根据权利要求51的试剂盒,其中所述固体支持物为珠、亲和柱或者微量滴定板等中的任意种类。
53.根据权利要求40-52中任一项的试剂盒,其还包括核酸扩增所必需的试剂。
54.根据权利要求53的试剂盒,其中所述试剂是用于PCR、滚环扩增、NASBA、TMA、链置换扩增和DNA寡聚体自装配法中的任一种。
55.根据权利要求53或54的试剂盒,其还包含用于实时检测核酸扩增产物的试剂。
57.根据权利要求40-56中任一项的试剂盒,其中所述样品包括饮料或食品样品或其制备物、药品或化妆品、痰或血样或血小板样品或水样品。
58.根据权利要求40-57中任一项的试剂盒,其包含滤器,以将待检测的所述一种或多种细胞或生物与其他细胞分开。
59.根据权利要求40-58中任一项的试剂盒,其还包含裂解试剂,所述裂解试剂裂解其它细胞,但不裂解待检测的细胞或生物的细胞。
60.根据权利要求40-59中任一项的试剂盒,其还包含酶,该酶用于从样品中去除或者消耗所述与一种或多种细胞或生物的生存力相关的任何分子,所述分子不是由所述一种或多种细胞或生物提供的。
61.根据权利要求60的试剂盒,其中所述与一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子包括ATP。
62.根据权利要求61的试剂盒,其中所述酶包括萤光素酶、磷酸酶和焦磷酸酶中的任何一种或多种。
63.根据权利要求40-62中任一项的试剂盒,其还包含试剂,该试剂用于裂解所述一种或多种细胞或生物的细胞,从而释放与所述一种或多种细胞或生物的生存力相关的分子。
64.根据权利要求40-63中任一项的试剂盒,其还包含一种或多种核酸酶,以降解与所述一种或多种细胞或生物相关的核酸分子。
65.根据权利要求40-64中任一项的试剂盒,其中所述核酸分子固定在固体支持物上。
66.根据权利要求65的试剂盒,其中所述核酸分子与所述酶固定在相同支持物上。
67.根据权利要求40-66中任一项的试剂盒,其中所述另外的核酸分子固定在固体支持物上。
68.根据权利要求40-67中任一项的试剂盒,所述试剂盒为均质反应混合物的形式。
69.一种用于向表面施用权利要求68所述试剂盒的喷洒装置。
70.根据权利要求69的装置,其是泵式喷洒装置或者喷雾装置。
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120829 Termination date: 20130703 |