CN107430105A - 用于采集相关应用、分析和诊断的样本的设备、溶液和方法 - Google Patents

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Abstract

描述了用于在自然分泌的体液(例如唾液、痰、尿液)中保存细胞和/或细胞外成分，用于进一步的下游分析和/或用于诊断身体状况的溶液。该溶液可能相对于血液为高张溶液。描述了用于从自然分泌的体液的样本中富集细胞，和/或用于分析例如以诊断身体状况(诸如癌症、肥胖、感染、自闭症、阿尔茨海默病、杂种疾病(hetotological disorders)、心血管疾病或失调、糖尿病、易受攻击、潜伏性结核(LTBI)、HIV感染、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘慢阻肺重叠综合征(ACOS))的技术。

Description

用于采集相关应用、分析和诊断的样本的设备、溶液和方法
技术领域
本公开涉及用于采集体液或者其他物质，包括危险品和/或毒性物质，特别是自然分泌的体液(例如口腔液、尿液)的样本的设备、溶液和方法。附加地或者替代地，本公开大致涉及保存来自于这样的液体的细胞和/或细胞外成分。附加地或者替代地，本公开大致涉及功能基因组学。附加地或者替代地，本公开涉及分离和/或保存来自于这样的液体的细胞和/或细胞外成分，以供下列任一种研究使用：诊断学、遗传学、功能基因组学、表观遗传学和发现生物标记物(例如)。附加地或者替代地，本公开涉及通过使用自然分泌的体液来检测疾病或感染。
背景技术
与针对所有模型的治疗不同，个性化医疗是针对个体的定制化治疗。个性化医疗涉及根据病人的身体状态分类并专门针对该分类设计最佳治疗方案。个性化医疗的发展有赖于生物标记物的发现、验证和商业化，从而为了治疗以及筛查和疾病早期发现的诊断的发展而将人群分层。
表观遗传研究已经成为医学研究的前沿，涉及许多生理和心理疾病的病因学研究，这些疾病包括：癌症、肥胖、糖尿病、精神分裂症和阿尔茨海默病(Alika等，2010；Grant等，2010；McGowen等，2009；McGowen和Szyf，2010；Plazas-Mayorca和Vrana，2011以及Portela和Esteller，2010)。另外，表观遗传学可能在很多科学和医学领域特别有前景，这些领域包括但不限于：癌症、糖尿病、药物合成、药物有效性、儿童挑衅、自杀行为、衰老、炎症、疼痛、肥胖、精神分裂症以及其它精神疾病(Abdolmaleky等，2005；Costa等，2003；Iwamoto&Kato，2009；Kuratomi等，2007；McGowan&Kato，2007；McGowen和Szyf，2010；Peedicayil，2007；Petronis等，1999；McGowen和Szyf，2010；Plazas-Mayorca和Vrana，2011以及Zawia等，2009)。
在本领域的重大挑战包括对基于居家样本采集的合适原始材料的鉴定，其适合于大规模表观遗传研究(包括全-基因组-分析研究)。表观遗传学可能是理解基因-环境相互作用机制的关键，因为不断增加的证据表明表观遗传机制可能提供环境经历的分子记忆(Ho，2010；Kappeler和Meaney，2010；McGowen等，2009；McGowen和Szyf，2010；Portela和Esteller，2010；Richards，2008；Russo等，2010；Tsai等，2010；和Vlaanderen等，2010)。来自某些人类的初步数据表明，外周血细胞中的独特甲基化模式与包括以下在内的社会行为相关：儿童挑衅、自杀行为和老龄化(Kappeler和Meaney，2010；McGowen等，2009；McGowen和Szyf，2010；Portela和Esteller，2010；Russo等，2010；Tierling等，2010；Tsai等人，2010；和Zhang等，2011)。
至少部分地因为人类疾病的多样性，尤其是精神疾病，以及起作用的病因学因素的复杂相互作用，所以研究需要大的样本量以提供可靠的和显著的结果。然而，目前对于表观遗传研究的样本采集的研究选择不满足对“大的样本量”的这一需要。为在研究人类-环境相互作用中产生显著结果，对用于研究的大的样本量的需要同样是确切的，因为这些相互作用也具有非常复杂的特点，具有许多起作用的因素。实行大规模“群体量”(受试样本数量至少在数百至数千)表观遗传研究的能力可引入对人类-环境相互作用的新的理解并促进纵向研究的完成，便于开发对现代医学发展而言至关重要的基于表观遗传的筛选诊断学。这种表观遗传研究可导致对环境如何影响我们的表观基因组和这如何涉及个人健康结果的新的理解，这可进一步导致对被认为具有高度风险的个体进行预防性干预以及对这些健康差异的诊断学的开发，其中诊断学包括但不限于诊断。
试图定量人群中环境和其它复杂的相互作用的某些表观遗传研究采用血液作为实验的原始材料。血液可限制研究人员进行大群体量研究的能力，因为它：
1.通常需要医学监督，
2.涉及有创性的采集程序，
3.带有限制参与的烙印(stigma)，
4.采集和运送昂贵。
天然分泌的体液，例如唾液和尿液，可以是基于居家样本采集的另外或替代的合适原始材料，因为它们：
1.不需要有创性技术，
2.没有像血液那样的烙印，
3.不需要专业监督，
4.可以便宜地采集。
另外，已经证明至少唾液含有白细胞(Dos-Santos等，2009)。体液例如口腔液、尿液的使用，可使大规模“群体量”表观遗传研究成为可能。另外，基于家庭的口腔液或尿液的样本采集，可以实现更宽范围的可用研究选择，因为这能大大增加参与者数量，并可由受试者从世界的任何地方更容易地运送/运输样本。例如，当样本来自没有实验室基础设施的国家时，从世界的任何地方更容易地运送样本的能力是特别有用的。
一个生物体的基因组是固定的序列，其含有它的遗传信息并且在该生物体的每个细胞中都是相同的。相反，生物体的表观基因组在各细胞类型间有所不同，而且随该生物体一生而变化。因此，表观遗传研究可包括单个细胞类型作为样本材料来源，以控制这些差异(Johnson和Tricker，2010；Lister等，2009；和Rangwala等，2006)。例如，人的唾液含有大量细胞类型，包括上皮细胞、血液中普遍存在的细胞(即T细胞和B细胞)、细菌和碎片(Dos-Santos等，2009和Viet和Schmidt，2008)。对于表观遗传剖析(profile)而言最重要的唾液中的细胞是来自血流的那些，因为这些细胞携带来自整个机体的表观遗传信息(Kappeler和Meaney，2010；McGowen和Szyf，2010；McGowen和Szyf，2010；Righini等，2007；Rosas等，2011，Vlaanderen等，2010和Zhang等，2011)。
另外，使用全唾液DNA可能是不切实际的，因为血液中不存在的在唾液中的细胞，例如构成唾液中细胞绝大部分的上皮细胞(Dos-Santos等，2009)，通过抑制少数细胞的效应而具有“掩蔽”在T-细胞(起源于血液中的细胞)中所见的表观遗传效应的能力(DosSantos等，2009，Lister等，2009；和Tierling等，2010)。为了解决这些问题，AboGen开发出一种方法，通过利用细胞特异性标记和分离技术(例如磁力)以分离和提取体液(例如唾液)中存在的不同细胞类型。该方法采用实用量的体液(例如唾液)，以得到富集的细胞，其可用于下游生物学应用，包括大规模功能基因组研究(例如表观基因组研究)。例如，唾液样本处理技术允许将所采集的样本处理成为单一细胞类型并使它们的表观基因组得以剖析。
此外，对于下游实验，唾液(和其它体液)作为原始材料进行血细胞的细胞分离可能是个挑战，原因如下：
1.血液是运输液，而唾液是富含蛋白酶、酶和分泌物质的消化液，尿液是由不想要的废弃物组成的排泄液。
2.细胞无法在唾液中完整地长期生存。而细胞可以在血液中生存数周(对于一些种类的细胞甚至可以生存数年)，通常，细胞在唾液中的生存时间小于1小时。有报道称，细胞在唾液中生存超过15、45和90分钟的比例分别仅为约66％、33％和27％。唾液由于其生理学特性，其环境对用于分析和诊断的完整细胞保存并不友好。一些研究证实，到60分钟时，95％的细胞已不能存活(Baron等，1999)。
3.某些液体可具有宽的pH范围，而据报道，例如对于唾液的某些pH值，如果血液达到该pH值时就会导致死亡(唾液是6.2-7.4；尿液是4.5-8；血是7.35-7.45)。
4.某些液体与血液相比含有更多细菌。
5.某些液体含有非细胞物质，其在各个个体间有所不同且干扰细胞分离。
6.某些液体包含血细胞(例如T细胞)，其可在血中含量丰富，但在其它自然分泌的体液例如唾液或尿液中可能稀少，并且大大超过其它细胞类型，例如上皮细胞的数量，而不像在血液中那样。
7.某些体液(例如唾液)中的淋巴细胞亚类，与在血液中的那些细胞类型的群体有很大差异。例如，据报道仅CD4+CD8-T细胞存在在唾液中。
8.某些液体每天都在产生，例如唾液以每人每天大约0.5-1.5升的速率产生。
因此，需要新的方法用于从唾液、口腔液和其它自然分泌的体液中分离稀少细胞(即T细胞)。
为了从广泛地理分布的大量人群中采集唾液样本(实例：功能基因组研究或医疗诊断)，对于最佳的样本采集设备，可能需要满足若干要求。例如，具有将有毒保存溶液安全贮藏在密闭小室中的样本采集设备可能是有益的。另外，可将具有安全密闭的有毒溶液的样本采集设备送达供体。所述样本采集设备还可允许容易和安全地采集供体标本，例如人的唾液或尿液，而供体无需冒着暴露于有毒溶液的风险。此外，所述样本采集设备可以允许供体安全地混合有毒溶液和标本(用于标本的保存)，而供体无需冒着暴露于有毒溶液或任何其它危害的风险。所述样本采集设备还可允许供体在将所述样本采集设备安全密封之后，将样品连同所述样本采集设备送到实验室，用于通常“按照原样(as is)”进行处理。最后，所述样本采集设备可以进一步允许实验室技术人员接收所述样本采集设备并安全地打开它进行处理，而通常无需冒着暴露于任何危害的风险。
另外，纯化过程需要细胞维持它们的抗原特性，并且表观基因组剖析需要维持它们的表观基因组。为此，有必要以这样的方式处理细胞，使其能够大致维持这些特征。目前可用的处理通常不满足这一需要。例如，可将美国专利7,267,980和7,749,757理解为公开了含有赖氨酸、甘氨酸和甲醛的溶液，用于使来自血液的细胞稳定。可将美国专利6,912,932理解为公开了一种反应物，当混合时，产生多种甲醛-铵络合物，用于稳定包含血小板的血液样本。但是，这样的溶液主要处理生理环境友好的血液，而不能够处理本质不同的唾液。不应低估在唾液中完整地保存细胞和细胞外成分的难度。在目前推荐的分析和诊断方式中，上述提及的溶液不能够在生理环境不友好的唾液中保存细胞，并且特别是不能够保存稀有细胞，在足够成为有效的样本媒介的唾液量中这些稀有细胞的量已经很小。因此，需要新的溶液和方法，其能在体液，例如唾液、口腔液和其他自然分泌的体液中保存细胞的抗原性和表观基因组，以其特别能够在家采集样本。
与针对所有模型的治疗不同，个性化医疗是针对个体的定制化治疗。个性化医疗涉及根据病人的身体状态分类并专门针对该分类设计最佳治疗方案。个性化医疗的进步依赖于生物标记物的发现、确认和商业化，以为了治疗和筛查和早期检测的诊断的发展而将人群分层。
表观遗传研究成为医学研究的前沿，并且涉及大量的生理及心理疾病的病因学，包括：癌症、肥胖、糖尿病、精神分裂症和阿尔茨海默病。另外，表观遗传学在许多科学和医学领域可能具有特殊的前景，包括但不限于：癌症、糖尿病、药物合成、药物有效性、儿童挑衅、自杀行为、衰老、炎症、疼痛、肥胖、精神分裂症以及其它精神疾病。
对以上所讨论内容的相似的注意事项也可以应用于载于唾液中的细胞外成分，例如，蛋白质、病毒以及自由浮动DNA/RNA。这样的成分由于唾液不友好的环境也会迅速降解。通常，基于血液的保存技术在实践中对于唾液来说并不有效，并且，出于这种原因，迄今为止唾液没有用作研究这样的细胞外成分，特别是作为并不远的居家样本采集的可替换的媒介。例如，在现有技术中，为了研究唾液中的细胞外的成分，必须要将唾液立刻冷冻。如果没有立刻冷冻，由于诸如细胞因子等因子的降解，可能会引起这些因子的浓度变化。冷冻后仅仅唾液细胞外因子的研究实例包括蛋白质的白介素家族以及其他细胞因子。
WO2012/177656和WO2015/112496披露了用于表观遗传学研究的用于居家采集和保存唾液样本的设备、溶液和方法。这些文件的整体内容在此处通过全文引入作为参考。
发明内容
以下呈现本公开简化的概要以便提供对本发明的某些方面的基本、非限制性理解。
本公开的一些实施例建立于WO2012/177656和/或WO2015/112496的原理的基础之上。
本公开的一些实施例由附加的权利要求限定。
本公开的一些实施例提供了用于在自然分泌的体液，诸如口腔液(例如唾液或痰或肺脏吸出的液体)或尿液的样本中保存细胞和/或细胞外成分的溶液。可选地，可以将所述溶液与用于从捐献者采集的液体样本的设备一起限定。
如本文中所使用的，术语“细胞外”可指任意和/或全部成分，这些成分并不是完整细胞，也不在完整细胞内。例如，术语“细胞外”可指要除去的细胞剩余的成分。细胞外成分可以包括例如蛋白质、病毒、自由浮动的DNA和/或自由浮动的RNA的任意一种。
本公开的一些实施例提供了比血液张力更高的保存溶液(例如，与体液混合前)。
虽然不希望受任何具体理论约束，发明人领会到唾液的张力(或者重量摩尔渗透压浓度)可能是使唾液具有对细胞存活不友好的环境的重要因素。发现唾液，特别是从捐赠样本中采集的唾液相对于血液(因此相对于细胞)具有较低的张力。从血液进入人唾液的细胞经受了使液体流入细胞的毁灭性的渗透作用，引起细胞膨胀、受损，最后爆裂。这可以解释了有报道称能完整地在唾液中存活的细胞很少。实际上，唾液是天然的溶解细胞的裂解液，使得唾液成为获得存活的完整细胞样本的非直观媒介。
通过提供一种张力高于血液的溶液，当溶液与唾液样本混合时中和张力，以使其朝向等张的环境而改变(相对于血液和/或细胞)。这样的环境可以避免，或者至少显著减少施加于采集样本中的细胞的渗透压，因此能够使完整细胞的保存收率有显著的提高。
可以注意到，用于在例如唾液中保存细胞的高张、非裂解性保存溶液，相对于旨在血液样本中保存或稳定完整细胞的保存溶液，具有明显的区别。这反映了唾液与血液的张力的显著差异，即使在专注于保存血液的现有技术的教导中没有认识到。非裂解性血液保存剂应该是等张的，以使得不改变中性、等张的血液环境，并且避免增加施加于细胞的渗透应力。如果与血液混合的是高张保存溶液，这将改变血液的张力，并对细胞造成危害风险。相似地，将传统的等张血液保存剂用于在唾液样本中保存细胞，可能不会在低张的唾液环境中很好地保存细胞，所得的保存细胞的收率并不合适，正如上述的在现有技术教导中的缺陷。
在一些实施例中，自然分泌的体液可能自然对细胞低张，例如是，但不限于口腔液(例如包括唾液)，并且特别是，但不限于唾液本身。
如本文中所使用的，当液体具有一般在包括端点值的240-320毫渗透摩尔每升(mOsm/L)范围内的重量摩尔渗透压浓度时，可以认为其与血液等张。实际上血液的重量摩尔渗透压浓度一般可以在包括端点值的275-295mOsm/L的范围内，可选地约为290mOsm/L。本文中所使用的术语“等张”可因此包括不同于重量摩尔渗透压浓度的边界，因此渗透压力并不显著。当液体的重量摩尔渗透压浓度小于240mOsm/L时，认为其相对于血液为低张溶液。当液体的重量摩尔渗透压浓度大于320mOsm/L时，认为其相对于血液为高张溶液。
在本文公开的一些实施例中，可以可选地将溶液(例如，与体液混合之前)的重量摩尔渗透压浓度限定为大约，或至少(在任一种情况下)，n×240Osm/L，其中“n”是一个包括端点值的在2～15之间的自然数。例如，“n”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、13、14或15。
在本文公开的一些实施例中，可以可选地将溶液(例如，与体液混合之前)的重量摩尔渗透压浓度限定为大约，或至少(在任一种情况下)，n×275Osm/L，其中“n”是一个包括端点值的在2～15之间的自然数。例如，“n”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、13、14或15。
在本文公开的一些实施例中，可以可选地将溶液(例如，与体液混合之前)的重量摩尔渗透压浓度限定为大约，或至少(在任一种情况下)，n×290Osm/L，其中“n”是一个包括端点值的在2～15之间的自然数。例如，“n”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、13、14或15。
附加地或者替代地，溶液(例如，与体液混合之前)中的总盐离子的重量摩尔渗透压浓度可以可选地为大约，或者至少(在任一种情况下)，n×290Osm/L，其中“n”是一个包括端点值的在2～15之间的自然数。例如，“n”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
在本文公开的一些实施例中，可将溶液(例如，与体液混合之前)相对于血液的重量摩尔渗透压浓度可选地限定在大约，或者至少(在任一种情况下)，n×血液重量摩尔渗透压浓度，其中“n”是一个包括端点值的在2～15之间的自然数。例如，“n”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
附加地或者替代地，溶液(例如，与体液混合之前)中的氯化钠(NaCl)的浓度可以可选地为大约，或者至少(在任一种情况下)，n×浓度m，其中，m是一个包括端点值的在8.0～9.0克每升(g/L)之间的值，以及“n”是一个包括端点值的在2～15之间的自然数。例如，“n”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
附加地或者替代地，溶液可包含磷酸盐缓冲液(PBS)，所述磷酸盐缓冲液的浓度(例如，与体液混合之前)可选地大约为，或者至少(在任一种情况下)，n×与血液等张的PBS浓度，其中“n”是一个包括端点值的在2～15之间的自然数。例如，“n”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
在一些实施例中，用于测量液体的张力/重量摩尔渗透压浓度的技术为测量其电导率。电导率表明了离子的存在，其可与重量摩尔渗透压浓度有关。在一些实施例中，溶液具有至少为15毫西门子/厘米(mS/cm)的电导率，可选地大约为，或者至少为(在任一种情况下)，选自15.5mS/cm、16mS/cm、16.5mS/cm、17mS/cm、17.5mS/cm、18mS/cm、18.5mS/cm的值。
可用电导率本身限定，或者可选地与一个或多个其他用于具体说明溶液特性的经验参数组合来限定，例如，以下其一或两者：
(i)pH-例如，包括端点值的在约6.4至约8.4的范围内的值，并且在一些实施例中，在包括端点值的约7.2至约7.6之间，可选地包括端点值的在约7.3至约7.6之间；和/或
(ii)密度-例如，包括端点值的在1至1.015Kg/L的值，并且在一些实施例中，包括端点值的在1.0090至1.0112Kg/L之间。
在一些实施例中，溶液(与低张的自然分泌的体液样本混合前)具有高张性，以使得当与采集到的体液样本混合时，溶液与体液的混合物等张，其中所述张力相对于血液而限定。
在一些实施例中，溶液(与唾液样本混合前)具有张力，以使得当与采集到的唾液样本混合时，溶液与唾液的混合物等张，其中所述张力相对于血液而限定。
得到的等张溶液不仅在保存(例如固定)唾液样本期间，还在贮存待处理或待分析的保存细胞的期间具有优势。例如，保存的和/或固定的细胞可能仍然易受渗透压力的影响伤害，这可能会根据影响液体通过细胞壁的渗透压条件而导致细胞膨胀和爆裂和/或损毁和内爆。
附加或者替代上述任意内容，在一些实施例中，所述溶液能够在自然分泌的体液(例如唾液、痰、肺脏吸出液或尿液)样本中至少在预定的效力下、在以下期间内保存细胞和/或细胞外成分：至少一周、可选地为至少两周、可选地为至少三周、可选地为至少一个月、可选地为至少两个月、可选地为至少三个月。
为了本公开的这些目的，“保存”意为，例如，防止细胞的抗原降解，以使得可以基于抗原而将它们纯化或富集，并防止细胞的表观基因组有所改变。所述“表观基因组”意为通过共价修饰DNA或结合于DNA的蛋白，来改变基因组DNA的状态和模式。这样的改变示例包括在CpG二核苷酸的胞嘧啶的5位的甲基化、组蛋白的赖氨酸残基的乙酰化、以及其他不是由潜在的DNA序列的变化引起的可遗传或不可遗传的变化。
如本文中所使用的术语“效力”可意为在原始体液样本中保存了至少预定百分比的细胞。所述预定百分比可选为至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、可选地至少75％、可选地至少80％、可选地至少85％、可选地至少90％、可选地至少95％。(每单位体积细胞浓度相对于原始体液样本可能会减少，因为原始样本与保存溶液的混合会使混合物净体积增加，因此稀释了细胞浓度。)
附加地或者替代地，所述效力可指每单位体积的细胞数(例如，特定类型，例如T-细胞)。例如，细胞的数量可能至少为约5000每ml，可选至少为约10000每ml，可选至少为约12000每ml。
附加地或者替代地，在一些实施例中，所述溶液在室温下可具有至少一个月、可选地至少两个月、可选地至少三个月、可选地至少四个月的保质期。
附加地或者替代地，在一些实施例中，为了进一步区分细胞类型和细胞外成分，以及为了下游分析，提供一种用于在诸如口腔液(例如唾液和/或痰)和尿液的体液中保存细胞和/或细胞外成分(例如蛋白质、病毒、自由浮动DNA和/或RNA中的任意一种)的溶液。可选地，对于细胞，所述溶液可允许细胞在储存期间在唾液中保存它们的抗原性和细胞结构。附加地或者替代地，可选地对于细胞外成分，所述溶液可允许细胞外成分(例如，蛋白质)在保存中不被降解，和/或不保留细胞外蛋白质的生物活性。在一些实施例中，所述溶液可在唾液样本中保存细胞和细胞外成分。
所述溶液可包括至少一种化学固定剂，例如是，但不限于多聚甲醛，以及至少一种蛋白酶抑制剂。在一些实施例中，所述溶液可进一步包括，例如，以下一种或多种：至少一种的杀细菌剂、来自于人和/或其他动物物种的血清蛋白。附加地或者替代地，所述溶液可在约6.4至约8.4的pH值之间进行缓冲，并且在一些实施例中，在约7.2至约7.6的pH值之间进行缓冲。
由保存剂进行化学固定的细胞能提高细胞的机械强度，使细胞能够完整地保存，并随着时间的推移更好地耐受自然降解和渗透压力。特别地，有报道称将细胞在固定剂中贮存若干分钟以上(也称为“过固定”(over-fixing))，以增加细胞对裂解的抗性。
例如蛋白质的细胞外成分化学固定，可将蛋白质通过与其他物质交联而结合于蛋白质，例如其他蛋白质或DNA。例如，生物结合于其他物质的蛋白质通过交联可更牢固地化学连接至同样的物质。仅与其他物质近似的蛋白质可通过交联的方式结合于该物质。交联可通过强化蛋白质以防止出现碎裂成较小段(例如肽)的不期望出现的降解来保存蛋白质。
交联可以至少部分是可逆的。可逆的交联可以是，例如，成为后续下游处理的一个步骤，例如，用于诸如蛋白质的细胞外成分的分析。
附加或者替代上述任意内容，在一些实施例中，所述溶液实质上不含有去污剂。去污剂有时用于生物样本的处理过程，以促进穿过细胞物质，但是在这里可以相信，其代价为增加了细胞毁坏和细胞丢失。根据本公开的一些实施例，避免了去污剂的存在能增加所保存的细胞的数量，在考虑到感兴趣的细胞在唾液样本中的量相对稀少时，这可能有特殊的优势。
如上所述，可选地，所述溶液相对于血液为高张溶液。
附加或者替代上述任意内容，在一些实施例中，提供了包含自然分泌的体液(例如，唾液、痰或其他口腔液或尿液)的保存样本的样本采集设备，所述保存样本与血液等张。可选地，所述保存样本可以是(i)采集自然分泌的体液的样本和(ii)保存剂的混合物。
附加或者替代上述任意内容，本公开的一些实施例提供了使用高张保存溶液用于与自然分泌的低张体液混合，以使得到的混合物趋于等张，其中所述张力相对血液来限定。仅作为例子，所述体液可以是唾液或包含唾液。
在一些实施例中，根据本公开的一个和/或其他实施例，在一种或多种体液中保存细胞的方法包括将采集的细胞与溶液相接触，这允许细胞例如保存它们的抗原性和表观基因组。
在一些实施例中，根据本公开的一个和/或其他实施例，在一种或多种体液中保存细胞外成分的方法包括将体液的采集样本与溶液相接触，这允许细胞外成分，例如蛋白质，保持它们的结构，可选地不保存生物活性。
所述(多种)体液可以是自然分泌的，例如包括一种或多种：口腔液、唾液、痰、肺脏吸出物、尿液。在一些情况下，肺脏吸出物也可以是人工吸出或促进分泌得到。
在一些实施例中，在化学固定的液体(例如，唾液或其他口腔液或尿液)中从细胞分离特定的细胞外成分(例如，蛋白质、病毒、自由浮动DNA和/或自由浮动RNA中的任意一种)的方法包括将样本离心，以引起样本分离至液体形式的所述特定的细胞外成分和例如细胞的颗粒。可分别处理颗粒和液体成分。例如，可处理液体成分以分析特定的细胞外成分。附加地或者替代，可处理颗粒以分析细胞。可选地，同一样本可为分析(i)细胞和(ii)所述细胞外成分(例如，以下任意一种：蛋白质、病毒、自由浮动DNA和/或自由浮动RNA)提供材料。
在一些实施例中，用于从化学固定的在体液(例如唾液或尿液)中采集到的细胞中分离细胞的方法，并且包括将细胞离心以进行分离，例如，从细胞颗粒、细菌和碎片中分离DNA和/或其他可溶性物质，从其他颗粒内容物中富集白细胞，并且使用结合于磁珠的对细胞特定标记物靶向的抗体分离特定细胞(例如白细胞)。
在一些实施例中，用于分离特定类型的细胞的方法，例如从一种或多种体液(例如唾液和/或尿液)中分离一种白细胞(例如淋巴细胞)，并且包括一个或多个以下步骤(并且，取决于实施例，包括一些或所有的以下步骤)：提供包括化学固定细胞的体液样本，可选地，离心所述体液样本以获得包括细胞的颗粒，可选地，将该颗粒再次悬浮于缓冲液中，将该再悬浮的颗粒进行密度梯度分离以获得白细胞(包括淋巴细胞)类混合物的层，将所述类型细胞的混合物与溶液接触，所述溶液包含针对在特定类型的白细胞上发现的表位的特异结合剂，并且从白细胞类的混合物中分离出特殊类型的白细胞(包括淋巴细胞)。
在一些实施例中，所述特异结合剂可以是与抗体偶联的、对于在特定种类的白细胞上发现的表位特异性的磁珠，并且在分离步骤中可以随后包括，例如，从多种白细胞类型的混合物中磁性分离出特定类型的白细胞(包括淋巴细胞)(但是其他的细胞分离技术也在本公开的范围内)。
在一些实施例中，所述体液(例如唾液、痰(或其他口腔液)或尿液)可以与化学固定溶液混合，并且该混合物可从颗粒中移除。所述颗粒可随后再悬浮于缓冲液中。可选地，所述再悬浮的颗粒可以在缓冲液中离心及洗涤一次或多次。洗后的颗粒可以随后用于亲水多糖混合物以形成梯度。该梯度可以不同于用于血液的梯度，因为在其他体液(例如唾液、尿液)中用于保存的化学固定后的细胞的密度可能不同，这是由于所保存细胞的不同密度需要时间、温度和/或用于细胞经过密度梯度处理的该梯度密度的改变。
另外，在一些实施例中，所述白细胞在所述梯度中可形成层。所述白细胞层可从所述梯度中提取出，并置于另一离心管中，其可以在缓冲液中洗涤并再生颗粒以除去残留的梯度混合物。可随后将所述颗粒在包含抗体的缓冲液中再悬浮并再培养，所述抗体结合于磁珠并对将被分离的特定细胞类型特异的抗原特异。在一些实施例中，被分离的细胞种类为T-细胞，所述抗原为T-细胞特异抗原。在一些实施例中，所述抗原为CD4。在缓冲液中再悬浮的细胞可以由抗体结合，并经过磁场，通过磁性将这些结合于与抗体结合的磁珠的细胞吸引至离心管的一侧。残留的液体可随后从离心管中清除，所述离心管可以在缓冲液中清洗。分离出的T-细胞然后被吸至离心管的一侧，并准备进行进一步的处理，诸如冷冻以用于后续下游实验(例如)。
在一些实施例中，用于在自然分泌的体液中保存细胞和/或细胞外成分的方法包括将体液与根据公开的任意一个实施例的保存溶液相接触。
获得自然分泌的体液样本的能力保留了提供以下的可用收率：(i)稀少或稀有细胞，和/或(ii)细胞外成分(例如，任意蛋白质、病毒、自由浮动DNA和/或自由浮动RNA)可对血液样本提供一个可替换的技术，用于(i)诊断病人的身体状况，和/或(ii)监控治疗效果。当用作诊断工具用于诊断将被治疗的身体状况时，所述过程/结果在本文中有时也称为“伴随诊断”。例如，可将测量MGMT启动子甲基化的MGMT基于唾液的试验用作伴随诊断。当用作监测工具用于监测治疗效果时(例如特定的治疗是否有效，或者剂量的增减是否有效，或治疗是否会奏效)，本文中所述过程/结果可称为“伴随验证”。
这样的技术可以进一步提高了从患者或研究受试者获得样本的容易程度，并且使居家采集样本成为可能，这随之可以极大地扩展了能够参与研究、诊断或监控方案的患者或研究受试者的数量。
用于在血液样本中识别特定细胞种类或其他生物标记物的技术也可以用于(可经修正或不经修正)在自然分泌的体液中识别这样的细胞或其他生物标记物。
例如，可分析细胞或细胞外物质以指示或识别以下一种或多种：
(a)具有识别疾病复原或发展的标记物(细胞的或分子的)的细胞。所述疾病可以例如为癌症(可选地，但不限于白血病)。在所述液体为或包括痰的情况下，所述疾病可以是肺癌、肺恶性上皮瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)、肺炎或肺结核中的一种或多种。
(b)产前细胞。
(c)循环肿瘤细胞(例如转移性的或其他方式的)。
(d)正常细胞的稀有形式，例如，以下任意一种或多种：
-作为在骨髓增生异常综合征中的幼稚细胞；
-指示疾病并且不源于口腔的上皮细胞的亚种；
-郎格罕细胞(Langerhands cells)，例如(但不限于)诊断血液疾病。
(e)一种或多种指示肥胖的生物标记物。
(f)一种或多种指示细菌感染版病毒感染(用于避免不必要或不恰当的抗生素处方)的生物标记物。
(g)一种或多种指示自闭症的生物标记物。
(h)一种或多种指示阿尔茨海默病的生物标记物。
(i)一种或多种指示杂种疾病(hetotological disorders)的生物标记物。
(j)一种或多种指示心血管疾病的生物标记物。
(k)一种或多种指示糖尿病的生物标记物。
(l)一种或多种指示易受攻击(vulnerable plack)的生物标记物，例如，涉及免疫细胞活性和/或免疫细胞生物标记物。
(m)一种或多种生物标记物和/或一种或多种释放因子，其指示疾病或感染的静止的和/或休眠的和/或隐匿形式。例如，这样的疾病可能是LTBI。替代地或附加地，这样的因子可以是肽和/或细胞因子。
(n)细胞中存在HIV感染，可选地，检测细胞内HIV病毒。
(o)一种或多种指示癌症的生物标记物。
(p)一种或多种指示慢性阻塞性肺病(COPD)的生物标记物。
(q)一种或多种指示耐药性肺结核的生物标记物。
(r)一种或多种适合于复制和/或取代一种或多种以下类型的验血的生物标记物：电解质液面；血脂化验；维生素水平、肝炎化验；铁缺乏化验；肝功能化验；肾功能化验；糖尿病筛查化验；血相化验；甲状腺分析化验。
(s)一种或多种指示称为“哮喘慢阻肺重叠综合征”(ACOS)的一种COPD的生物标记物。可选地，这样的生物标记物能够对COPD的一般诊断提供伴随诊断，用于检测所述COPD是ACOS。附加地或者替代地，这样的生物标记物能够对监控治疗目标ACOS的效果提供伴随验证。附加地或者替代地，COPD的通常诊断可以是，例如，使用上文(p)中提及的生物标记物来进行，和/或COPD的通常诊断可使用其他常用的诊断性测试来进行。
在一些实施例中，用于诊断患者身体状况的技术，可选地但不仅限于在自然分泌的体液(例如唾液、痰、尿液)中的稀有细胞的诊断，可以包括以下一种或多种：
(a)流式细胞术；
(b)荧光激活细胞分选(FACS)；
(c)免疫组化；
(d)分子分析(例如，但不限于以下任意一种：表观遗传、遗传、翻译、翻译后)；
(e)细胞学检查。
(f)蛋白质水平(转录后)分析技术。
(g)RNA水平(转录)分析，以测量基因表达。
(h)DNA，例如，表观遗传，和/或包括DNA甲基化和组蛋白修饰。
值得注意的是，本文所公开的样本采集设备的一些实施例用于采集体液，其也可特别用于采集任意其他物质，包括危险的和/或有毒的液体。
虽然一些实施例涉及使用保存剂保存完整细胞和/或细胞外物质，但其他实施例可能涉及提取和保存采集到的样本中的核酸。所述核酸可以是DNA和/或RNA。
例如，可使用溶液裂解采集到的样本中的细胞来提取核酸，并保存核酸。
仅作为示例，参考附于本说明书的附件1，其全部内容作为本公开的一部分并入本文。
在不限制本公开的情况下，本公开的某些特征和/或方面的编号并逐项列出的列表如下：
项目编号
1.用于在自然分泌的体液中保存细胞和/或细胞外成分，用在进一步的下游分析和/或用于诊断身体状况的溶液，所述溶液相对于血液为高张溶液。
2.项目1的溶液，其中所述自然分泌的体液包括选自以下的一种或多种：口腔液、唾液、痰、尿液、肺脏吸出液。
3.项目1或2的溶液，其中所述自然分泌的体液为天然低张溶液。
4.项目1、2或3的溶液，其中所述溶液的重量摩尔渗透压浓度大约为，或至少，“n”×240mOsm/L，其中“n”是包括端点值的在2～15之间的自然数。
5.项目1、2、3或4的溶液，其中所述溶液的重量摩尔渗透压浓度大约为，或至少，“n”×275mOsm/L，其中“n”是包括端点值的在2～15之间的自然数。
6.项目1、2、3、4或5的溶液，其中所述溶液的重量摩尔渗透压浓度大约为，或至少，“n”×290mOsm/L，其中“n”是包括端点值的在2～15之间的自然数。
7.上述任意一项的溶液，其中，所述溶液相对于血液的张力大约为，或至少“n”倍的血液的张力，其中“n”是包括端点值的在2～15之间的自然数。
8.上述任意一项的溶液，其中，溶液中的总盐离子重量摩尔渗透压浓度大约为，或至少，“n”×290mOsm/L，其中“n”是包括端点值的在2～15之间的自然数。
9.上述任意一项的溶液，其中，溶液中的氯化钠(NaCl)浓度大约为，或至少，“n”倍的浓度“m”，其中，m是包括端点值的在8.0～9.0克每升(g/L)之间的值，以及“n”是包括端点值的在2～15之间的自然数。
10.上述任意一项的溶液，其中，溶液中包含磷酸盐缓冲液(PBS)，所述磷酸盐缓冲液的浓度大约为，或者至少，n倍的与血液等张的PBS浓度，其中“n”是包括端点值的在2～15之间的自然数。
11.上述任意一项的溶液，其中，所述溶液为高张溶液，以使得与采集到的体液样本混合时，溶液与体液的混合物通常为等张，其中，所述张力相对于血液而限定。
12.上述任意一项的溶液，其中，所述溶液具有至少15mS/cm的电导率。
13.项目12的溶液，其中所述溶液具有至少一个的以下进一步参数：
(i)在6.4至约8.4的包括端点值的范围之间的pH值；和/或
(ii)在1至1.015kg/L的包括端点值的范围之间的密度。
14.上述任意一项的溶液，其中，所述溶液在选自以下的期间内可有效保存细胞：至少两周、或者至少三周、或者至少一个月、或者至少两个月、或者至少三个月。
15.上述任意一项的溶液，其中，所述溶液可在选自以下的至少一个温度或温度范围内有效保存细胞：4℃～40℃、4℃～30℃、约为室温、约为4℃、约为30℃或约为40℃。
16.上述任意一项的溶液，其中，所述溶液具有选自以下至少一个的保质期：至少一个月、至少两个月、至少三个月、至少四个月。
17.项目11的溶液，其中，所述保质期为室温下的保质期。
18.上述任意一项的溶液，其中，所述溶液可在体液的原始样本中有效保存至少预定比例的细胞，所述预定比例选自：至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％。
19.上述任一项的溶液，其中，每毫升保存的细胞或预定种类的数量为至少约5000、或者至少约10000、或者至少约12000。
20.上述任意一项的溶液，其中，所述细胞为T-细胞。
21.上述任意一项的溶液，其中，所述溶液包括至少一种化学固定剂和至少一种蛋白酶抑制剂，在pH为约6.4～约8.4的范围内缓冲。
22.溶液，可选地根据以上任意一项，用于在自然分泌的体液中保存至少细胞外成分，以用在进一步的下游分析和/或身体状况的诊断，其中所述溶液包括至少一种化学固定剂，并可选地在pH为约6.4～约8.4的范围内缓冲。
23.根据第21或22项的溶液，其中，所述化学固定剂选自醛类。
24.根据第23项的溶液，其中，所述化学固定剂为多聚甲醛。
25.根据第21、22、23或24项的溶液，其中，所述化学固定剂的浓度为约1％(v/v)。
26.根据第21～25中任意一项的溶液，进一步包括至少一种抗菌剂中的一种或多种和至少一种来源于人和/或其他动物物种的血清蛋白中的一种或多种。
27.根据第26项的溶液，其中，所述抗菌剂选自抗细菌抗生素和抗真菌抗生素。
28.根据第21～27中任意一项的溶液，其中，蛋白酶抑制剂选自：天冬氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、苏氨酸蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、Kunitz STI蛋白酶抑制剂以及上述物质的任意组合。
29.根据第21～28中任意一项的溶液，其中，蛋白酶抑制剂选自：叠氮化钠、苯甲基磺酰氟(PMSF)、抑肽酶、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制剂、天然或合成蛋白酶抑制剂、天然和合成的蛋白酶抑制剂的混合物以及上述物质的任意组合。
30.根据第21～29中任意一项的溶液，其中，所述蛋白酶抑制剂为叠氮化钠。
31.根据上述任一项的溶液，其中，所述溶液在pH为约7.2～约7.6的范围内缓冲。
32.根据第21～31中任意一项的溶液，其中，所述缓冲液选自巴比妥、三磷酸盐、柠檬酸盐、甲次砷酸盐、其他非磷酸盐缓冲液以及上述物质的任意组合。
33.根据第21～31中任意一项的溶液，其中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
34.用于在自然分泌的体液中保存细胞和/或细胞外成分的方法，包括将所述体液与根据以上任意一项的保存溶液相接触。
35.用于在自然分泌的低张体液中保存细胞和/或细胞外成分的方法，包括将所述体液与高张保存溶液相接触，其中所述张力根据血液来限定。
36.用于采集自然分泌的体液的样本采集设备，所述样本采集设备含有根据1～33任意一项的保存溶液。
37.含有1～33任意一项所限定的溶液的样本采集试剂盒。
38.用于下游分析在液体样本中的细胞和/或细胞外成分的液体样本，所述液体样本包括混合有保存溶液的自然分泌的低张体液，其中样本液体通常为等张，并且其中所述张力相对于血液而限定。
39.项目38的液体样本，其中所述自然分泌的体液为唾液。
40.含有第38或39项所限定的样本液体的样本采集设备。
41.诊断和/或监控身体状况的方法，包括：
获得自然分泌的体液的样本；
将样本与用于在所述样本中稳定细胞和/或细胞外成分的保存溶液相接触；并且
从所述样本中分析稳定后的细胞和/或细胞外成分，以识别、诊断或监控身体状况。
42.项目41的方法，其中，所述自然分泌的体液选自以下一种或多种：口腔液、唾液、痰、尿液、肺脏吸出液。
43.项目41或42的方法，其中，所述自然分泌的体液为唾液。
44.项目41、42或43的方法，进一步包括在将样本与保存溶液接触的步骤之前，将样本与预处理剂相接触的步骤，所述预处理剂配置为刺激释放指示身体状况的一种或多种因子。
45.项目44的方法，其中，所述预处理剂包括一种或多种与身体状况相关的抗原。
46.第41～45中任意一项的方法，其中，所述方法进一步包括将至少特定细胞与至少特定的细胞外成分相分离的步骤。
47.项目46的方法，其中，所述至少特定的细胞外成分包括选自以下的一种或多种：蛋白质、病毒、自由浮动DNA和/或自由浮动RNA。
48.第41～47中任意一项的方法，进一步包括在分析步骤前富集稳定后的细胞的步骤。
49.第41～48中任意一项的方法，进一步包括在分析步骤前从稳定后的细胞中分离出一种或多种类型的细胞的步骤。
50.第41～49任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括用识别疾病复原或发展的细胞标记物或分子标记物来识别细胞和/或细胞外成分。
51.项目50的方法，其中，所述疾病选自以下一种或多种：癌症、白血病、肺癌、肺炎和/或结核病。
52.第41～51中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括识别循环肿瘤细胞。
53.第41～52中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括识别产前细胞。
54.第41～53中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括识别正常细胞的稀有形式。
55.项目54的方法，其中，所述正常细胞的稀有形式包括选自以下的一种或多种：幼稚细胞、指示骨髓增生异常综合征中的幼稚细胞、指示疾病并其不源于口腔的上皮细胞亚种和/或郎格罕细胞。
56.第41～55中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括流式细胞术。
57.第41～56中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括荧光激活细胞分选(FACS)。
58.第41～57中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括免疫组化。
59.第41～58中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括分子分析。
60.项目59的方法，其中，所述分子分析包括选自以下的任意一项或多项：表观遗传分析、基因分析、翻译分析和/或翻译后分析。
61.第41～60中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括细胞学检查。
62.第41～61中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括识别指示肥胖的生物标记物。
63.第41～62中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括识别指示细菌感染的生物标记物。
64.第41～63中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括识别指示病毒感染的生物标记物。
65.第41～64中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括识别指示自闭症的生物标记物。
66.第41～65中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括识别指示阿尔茨海默病的生物标记物。
67.第41～66中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括识别指示杂种疾病(Hetotological disorder)的生物标记物。
68.第41～67中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括识别指示心血管疾病或失调的生物标记物。
69.第41～68中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括识别指示糖尿病的生物标记物。
70.第41～69中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括识别指示易受攻击的生物标记物。
71.第41～70中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括识别指示潜伏性结核感染的生物标记物。
72.第41～70中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括在接触保存溶液的步骤之前识别通过处理具有抗原的样本而释放的因子。
73.项目72的方法，其中，所述抗原包括结核分枝杆菌的肽，以及所述因子包括干扰素γ。
74.第41～73中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括识别指示HIV感染的生物标记物。
75.第41～74中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括在样本中存在可检测到的抗体之前，识别HIV病毒感染。
76.第41～75中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括在样本中识别细胞内的HIV病毒。
77.第41～76中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括识别t-细胞内，可选为CD4+t-细胞内的HIV病毒。
78.第41～77中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括评价CD4+t-细胞的量，用于识别免疫缺陷，可选为指示HIV感染和/或AIDS。
79.第41～78中任意一项的方法，其中，所述分析步骤包括识别以下的生物标记物：(i)指示COPD；和/或(ii)指示ACOS；和/或(iii)用于辨别ACOS和非ACOS类的COPD。
80.诊断HIV感染的方法，包括：
提供经保存的由个体自然分泌的体液样本，可选为唾液；以及
识别所述样本中的细胞内的HIV病毒，以诊断在个体中的HIV感染。
81.项目80的方法，其中，所述识别细胞内的HIV病毒的步骤包括识别样本中的t-细胞内，可选为CD4+t-细胞内的HIV病毒。
82.项目81的方法，其中，所述提供步骤包括提供所述自然分泌的体液的固定样本。
附图说明
以下描述了非限制性实施例，仅作为举例，并参考附图，其中：
图1为说明用于采集和处理自然分泌的体液样本的步骤的示意性流程图。
图2为显示DNA在贮存于室温的化学固定液中的样本中0、1、2和7天后的收率的时间进程，以及一些实施例的从每个样本的T-细胞中提取的DNA。
图3为显示了细胞在接触于保存溶液的唾液样本中保存的图。
图4为第一示范性样本采集设备的示意性截面图。
图5为第二示范性样本采集设备的示意性截面图。
图6为说明每毫升起始物质(例如体液样本)中的提取的T-细胞的相对收率，与来自于血液的T-细胞的收率比较的图。
图7显示了一些实施例的每ml唾液中的分离T-细胞DNA的微克数的唾液剂量曲线。
图8为示出了根据添加的保存组合物体积的每单位体积的样本浓度变化的示意图(附件1)。
根据以下附图、具体实施例和权利要求，将更好地理解样本采集、保存、分离和分析的设备，溶液和方法。不同附图中相同的附图标记表示相同的元件。
具体实施方式
参考WO2012/177656和/或WO2015/112496的公开内容，在一些实施例中，本发明的公开内容可能基于此。
在一些实施例中，公开了用于在一种或多种自然分泌的体液，例如唾液、痰、肺部吸出液、口腔液和/或尿液中保存细胞和/或细胞外成分(例如蛋白质、病毒、自由浮动DNA和/或自由浮动RNA中的任意一种)的溶液。所述溶液可能对进一步分离细胞种类和/或细胞外成分，以及考虑到在所述体液中贮存细胞和/或细胞外成分的下游分析有帮助。可以保存细胞以维持它们的抗原性和细胞结构。可以保存细胞外成分以避免降解和分解。可以保存蛋白质但不需要保存它们的生物活性。
在一些实施例中，公开了所述溶液与样本采集设备的结合，可选地适宜家用，或者至少不需要前往医学实验室。在一些实施例中，所述溶液代指在与采集到的体液样本混合前处于“作为待供应”的状态。在一些实施例中，所述溶液代指处于与采集到的体液样本混合后的状态。
参照图1，说明了用于采集和处理自然分泌的体液的技术。作为最难的例子，描述了根据包含唾液的口腔液的处理过程。但是，应该理解，可以将相同的原理应用于采集和处理其他自然分泌的体液。对唾液的参考可替换成任意其他这样自然分泌的体液，特别是，通常为口腔液、和/或痰，和/或肺脏吸出液，和/或尿液。
参照图1，第一步骤30可以是捐献者捐献液体样本，例如唾液。可以通过吐至采集设备中进行捐赠，或者通过任意其他技术采集唾液，例如通过使用拭子条。
第二步骤32可以是将采集到的唾液样本与保存溶液接触和/或混合，所述保存溶液用于在采集到的唾液样本中保存完整细胞和/或在采集到的唾液样本中保存细胞外成分。用于保存细胞和/或细胞外成分的溶液可能对进一步分离细胞类型和/或细胞外成分，以及下游分析有帮助。作为本文以上所讨论的，唾液的生理环境对目的细胞和细胞外成分并不友好。目的细胞在采集到的样本中可能在数分钟内开始受到损害和毁坏。在一些实施例中，可在步骤30后立即实施步骤32，为了避免或减少唾液对于完整细胞和在采集到的样本中保存的细胞外成分的收率的有害影响。
如本文中所使用的，“保存细胞”意味着阻止细胞的抗原降解，这样可以基于其抗原而将它们纯化或富集，并且避免其细胞的表观基因组发生改变。所述“表观基因组”意味着通过DNA的共价修饰或结合于DNA的蛋白的共价修饰，来改变基因组DNA的状态或模式。这样的改变的例子包括在CpG二核苷酸的胞嘧啶的5位的甲基化、组蛋白的赖氨酸残基的乙酰化、以及其他不是由潜在的DNA序列的变化引起的可遗传或不可遗传的变化。附加地或者替代地，“保存细胞”意味着细胞在唾液中储存的期间内保留它们的抗原性以及细胞结构。
如本文中所使用的术语：保存的“效力”，可以意味着将预定百分比的细胞在原始体液样本中保存下来。所述预定百分比可选为至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、可选地至少75％、可选地至少80％、可选地至少85％、可选地至少90％、可选地至少95％。(每单位体积细胞浓度相对于原始体液样本可能会减少，因为原始样本与保存溶液的混合会使混合物净体积增加，因此稀释了细胞浓度。)
附加地或者替代地，所述效力可指每单位体积的细胞数(例如，特定细胞，例如T-细胞)。例如，(例如这种)细胞的数量可能至少为约5000每ml、可选至少为约10000每ml、可选至少为约12000每ml。
附加地或者替代地，保存细胞外成分，例如蛋白质，意味着阻止蛋白质分解或碎裂成小片(例如肽)。保存蛋白质可以包括固定化蛋白，通过将它们在保存之前结合至所述蛋白质能够在生物学上结合到的任意物质上，和/或在保存后结合至很相近的其他材料。可以将所述蛋白质的生物活性中和，以使得在后续的下游步骤中能够分析所述蛋白质，例如通过质谱分析。
在一些实施例中，在第二步骤32之前，可以进行可选的预处理步骤42，以将唾液和预处理剂混合，例如，一种溶液、粉末或固体试剂。在一些实施例中，所述预处理可以是生物学或非生物学的，或者生物学试剂与非生物学试剂的混合。在一些实施例中，可使用所述预处理剂来与唾液中的特定因子或因子组群的反应，和/或刺激释放和/或以其他方式引起特定因子或因子组群的产生。附加地或者替代地，所述预处理剂可以刺激唾液的生物活性反应。
这样的生物活性反应可能在将唾液例如通过固定而保存后，变得不太有效(或者可能根本无效)。
预处理剂的一个例子可以是用于刺激或诱发某些因子从这些细胞(例如淋巴细胞)中释放的抗原，以确定所述唾液是否来自于患有有关疾病和/或感染的个体。例如，所述预处理剂可以包括肽。在后述用于检测潜伏性结核(LTBI)的一个特定例子中，所述肽可以来自于结核分枝杆菌，其可以被淋巴细胞识别，并且如果唾液是来自于感染了LTBI的人，则以释放诸如干扰素γ的因子的形式刺激生物反应。可选地，所述预处理剂包括多于一种的抗原和/或多于一种的肽。
本公开的一些实施例提供了这种相对于血液高张的保存溶液(例如与体液混合之前)。
虽然不希望束缚于特定的理论，但作为上述所解释的，可以相信，唾液的张力(或重量摩尔渗透压浓度)是使唾液的环境对细胞生存不友好的重要因素。发现唾液，特别是在捐献的样本中采集到的唾液，相对于血液为低张溶液。来自于血液的细胞进入人的唾液后经受毁灭性的渗透压力，这样的渗透压使液体流入细胞，引起细胞膨胀、受到损坏并最后爆裂。这可以解释有报道称在唾液中生存的未受损的细胞的数量很低。这也可以解释为什么，例如，HIV通过唾液比通过其他体液的可传染性要低；包括感染了HIV的细胞从血液进入唾液后不能长久生存下去，因为细胞由于渗透作用而爆裂了。相似的毁坏和损害通常也可以发生于从血液进入唾液的细胞。人体通过向唾液腺供给高速率的血流来补偿这样的细胞损毁，使得能够补充在口腔里死亡的细胞。有报道称，进入唾液腺的血流是在骨骼肌松弛状态下进入骨骼肌的血流的大约100倍。进入运动中的骨骼肌的血流提高大约10倍，但是进入唾液腺的血流仍然以大约10倍的量极大地超过进入运动中的骨骼肌的血流。这进一步提供了唾液的不友好环境的证据，并且细胞在唾液中的快速死亡需要细胞持续的补给。
通过提供相对于血液高张的保存溶液，所述溶液当与唾液样本混合时可以中和唾液的低张性，并朝向等张的环境使张力得到平衡。这样的环境可以避免，或至少可显著减少作用在采集到的细胞上的渗透压力，因此使细胞能够在保存中完整的生存，并且能够显著提高用于分析或诊断的保存的细胞的收率。
得到的等张溶液不仅在保存(例如固定)唾液样本期间，还在储存待处理或待分析的保存细胞的期间具有优势。例如，保存的和/或固定的细胞可能仍然易受渗透压力的影响攻击，这可能会由于影响液体通过细胞壁的渗透压条件而导致细胞膨胀和爆裂和/或损毁和内爆。
在一些实施例中，所述自然分泌的体液可以是自然低张的类型，例如但不限于口腔液(例如包含唾液)，并且特别不限于唾液本身。
在本文公开的一些实施例中，可以可选地将溶液(例如，与体液混合之前)的重量摩尔渗透压浓度限定为大约，或至少(在任一种情况下)，n×240mOsm/L，其中“n”是包括端点值的在2～15之间的自然数。例如，“n”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、13、14或15。
在本文公开的一些实施例中，可以可选地将溶液(例如，与体液混合之前)的重量摩尔渗透压浓度限定为大约，或至少(在任一种情况下)，n×275mOsm/L，其中“n”是包括端点值的在2～15之间的自然数。例如，“n”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、13、14或15。
在本文公开的一些实施例中，可以可选地将溶液(例如，与体液混合之前)的重量摩尔渗透压浓度限定为大约，或至少(在任一种情况下)，n×290mOsm/L，其中“n”是包括端点值的在2～15之间的自然数。例如，“n”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、13、14或15。
附加地或者替代地，溶液(例如，与体液混合之前)中的总盐离子重量摩尔渗透压浓度可以可选地为大约，或者至少(在任一种情况下)，n×290mOsm/L，其中“n”是包括端点值的在2～15之间的自然数。例如，“n”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
在本文公开的一些实施例中，可以可选地将溶液(例如，与体液混合之前)的重量摩尔渗透压浓度限定为大约，或至少(在任一种情况下)，n×血液的重量摩尔渗透压浓度，其中“n”是包括端点值的在2～15之间的自然数。例如，“n”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
附加地或者替代地，溶液(例如，与体液混合之前)中的氯化钠(NaCl)的浓度可选为大约，或者至少(在任一种情况下)，n×浓度m，其中，“m”是包括端点值的在8.0～9.0克每升(g/L)之间的值，以及“n”是包括端点值的在2～15之间的自然数。例如，“n”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
附加地或者替代地，溶液中可包含磷酸盐缓冲液(PBS)，所述磷酸盐缓冲液的浓度(例如，与体液混合之前)可选地大约为，或者至少(在任一种情况下)，n×与血液等张的PBS浓度，其中“n”是包括端点值的在2～15之间的自然数。例如，“n”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
在一些实施例中，溶液(与低张的自然分泌的体液样本混合前)具有高张性，以使得当与采集到的体液样本混合时，溶液与体液的混合物等张，其中所述张力相对于血液而限定。
在一些实施例中，溶液(与唾液样本混合前)具有张力，以使得当与采集到的唾液样本混合时，溶液与唾液的混合物等张，其中所述张力相对于血液而限定。
所述保存溶液可以包括至少一种化学固定剂，例如但不限于多聚甲醛，以及至少一种蛋白酶抑制剂。在一些实施例中，所述溶液可以进一步包括至少一种抗细菌剂，以及来自于人和/或其他动物物种的血清蛋白的一种或多种。所述溶液可在约6.4至约8.4的pH值之间进行缓冲，优选在约7.2至约7.6的pH值之间进行缓冲。
在一些实施例中，试剂在以下描述中的浓度可以是样本保存溶液本身的浓度。根据体液，并且是唾液的情况下，可以将大约等体积的溶液和体液相互混合。这优选导致来自于体液的细胞在室温下至少一周内保存它们的抗原性和DNA完整性。
在本公开的一些实施例中，设备中保有的和使用的保存溶液的体积可以在约100至约500ml之间，例如，其与用于保存尿液中的细胞有关。照此，用于尿液的保存溶液可以在相对于尿液的10倍(l0×)浓缩的溶液至1.5倍(1.5×)的溶液。
“化学固定剂”，根据一些实施例，为用于改变细胞成分的化学交联化合物，使得细胞抵抗降解。所述化学固定剂也可以用于将组蛋白和其他结合于DNA的DNA结合蛋白质进行交联。这样的试剂在本领域是已知的并且可以包括，不限于，多聚甲醛、甲醛、福尔马林、乙醛、乙醇、氧化剂、汞、苦味酸盐、肝-谷氨酸缓冲液介导的有机溶剂保护作用(HOPE)，如Zambonis固定剂的固定剂组合、醛的组合物以及合成交联试剂。在一些实施例中，所述化学固定剂为多聚甲醛。在一些实施例中，所述化学固定剂存在的浓度为约1％(v/v)。
细胞外成分，例如蛋白质的化学固定，可将蛋白质通过与其他物质交联而结合于蛋白质，例如其他蛋白质或DNA。例如，生物结合于其他物质的蛋白质通过交联可更牢固地化学连接至同样的物质。仅与其他物质近似的蛋白质可通过交联的方式结合于该物质。交联可以通过增强蛋白质以抵抗分解较小块的碎片这样不期望出现的情况，例如避免分解成肽类，来保存蛋白质。
例如，多聚甲醛的醛基与蛋白质的氮和其他原子反应。该反应在邻近的蛋白质之间形成亚甲基桥。这可以将DNA拘于“陷阱”之中(例如，由于与固定剂发生反应，固定化可导致连结于DNA(例如转录因子)的蛋白质固定到位)。不仅在这些亚甲基桥之间能够捕获DNA，也能够捕获脂质、碳水化合物、DNA和RNA。
交联可以至少部分是可逆的。反交联可以是，例如，成为后续下游处理的一个步骤，例如，用于诸如蛋白质的细胞外成分的分析。例如，细菌蛋白和人类蛋白可以相互交联或与自由浮动的DNA交联。随后在下游进行反交联以使其能够进行分析。
为了保护细胞免被体液中存在的蛋白酶降解，在一些实施例中，所述溶液可能包含至少一种蛋白酶抑制剂。在一些实施例中，所述蛋白酶抑制剂选自：天冬氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如丝氨酸的蛋白酶抑制剂)、苏氨酸蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂和Kunitz STI蛋白酶抑制剂。一些特定的、非限制性的例子包括叠氮化钠、PMSF、抑肽酶、亮抑酶肽、胃酶抑素、天然或合成的蛋白酶抑制剂以及蛋白酶抑制剂的混合物。这些抑制剂的适宜的浓度可以包括，不限于，PMSF(苯甲基磺酰氟)丝氨酸蛋白酶为约0.1-1mM，苯甲脒丝氨酸蛋白酶为约1mM，胃酶抑素A酸性蛋白酶为约1μg/ml，亮抑酶肽硫醇蛋白酶为约1g/ml，抑肽酶丝氨酸蛋白酶约5μg/ml和抗蛋白酶巯基蛋白酶为约1μg/ml。在一些实施例中，所述蛋白酶抑制剂为叠氮化钠，其浓度为约0.01％(w/v)。
为了避免来自于微生物污染的细胞损害，一些实施例中，溶液包含了至少一种抗菌剂。合适的抗菌剂包括但不限于抗细菌抗生素和抗真菌抗生素。
血清蛋白的存在可有助于对细胞结构的保存，其可以在一些实施例中可选择性加入到溶液。此外，血清蛋白可用于中和细胞和溶液之间的渗透压差。这些可以来源于人类或其他动物源。在一些实施例中，可以使用全血清。例如，可以添加小牛血清，在一些实施例中为约1％(v/v)。
附加或者替代上述任意内容，在一些实施例中，所述溶液实质上不含有去污剂。去污剂有时用于生物样本的处理过程，以促进穿过细胞物质(通过例如连接于荧光染料的抗体)，但是在这里可以相信，其代价为增加了细胞毁坏和细胞损失。根据本公开的一些实施例，避免了去污剂的存在能增加所保存的细胞的数量，在考虑到某些目的细胞在唾液样本中的量相对稀少时，这可能有特殊的优势。
根据本公开，所述溶液可以包括上述实施例的任意组合。
在本公开的一些实施例中，公开了用于在一种或多种体液中保存细胞和/或细胞外成分的方法。所述用于保存细胞和/或细胞外成分的方法可包括将体液与根据本公开的溶液相接触。所述体液可包含多种类型的细胞和/或细胞外成分，并且根据本公开可通过所述溶液来保存所述体液中的所述细胞和/或细胞外成分。虽然并非对本公开至关重要，使用的溶液相对于体液的比例通常为1:1。
下面的例子旨在进一步说明用于在体液中保存细胞和/或细胞外成分的所述溶液和方法的实施例，并且不应该理解为限制本公开的范围。
例如，可以将含有1％多聚甲醛、1％FBS以及0.01％NaN3的pH值为7.4的PBS溶液以1:1的比例加入到唾液中，然后可以纯化T-细胞和提取DNA。图2显示了这样处理的结果。这些结果证实了T-细胞的抗原性和DNA的完整性可以保持至少一星期。
如图3所示，进一步的测试证实了所述溶液在更长的持续时间里、甚至在升高的温度下、并且甚至在延长了的保质期以后保存在唾液样本中的T-细胞的效力。
在图3中，纵轴表示每毫升唾液样本中的T-细胞的数量(以千计)，由分析所确定，所述唾液样本与保存溶液以1:1的比例混合。作为以1:1的比例与保存溶液混合的结果，细胞浓度相对于原始唾液样本有效减半。
第一根(最左边的)柱表示在样本采集和与保存溶液混合后在室温下储存了数小时的三个样本中的细胞数量。第一根柱为评价其他样本中的细胞数量的基准。
第二、三和四根柱为分别三个样本的三个组中的细胞数量的比较，这三个样本在样本采集和与保存溶液混合后，在室温下分别储存了一天、两天和一个月。第二和第三根柱显示出无论互相之间还是与第一根柱之间的变化都很小。
第五、六、七和八根柱为分别十个样本的组中的细胞数量的比较，这些样本在样本采集和与保存溶液混合后，储存了三个月，分别储存在4℃、室温、30℃和40℃。使用十个样本(代替三个样本)是由于该测试关注于长期保存。第五至八根柱显示出无论互相之间还是与第一根柱之间的变化都很小。
最后一根柱重复了第二根柱的实验，使用十个样本中的样本组，并使用储存了4个月的保存溶液(使用前保质期)。如上，使用十个样本(代替三个样本)是由于该测试关注于延长的保质期。
该图表说明了所述保存溶液在延长的持续时间里、在较宽的温度范围内、甚至在延长了的保质期之后，也可以高效地保存唾液溶液中的T-细胞。所述溶液对于其他种类的细胞具有相似或相应的保存能力。可以将不同柱之间细胞数量的偏差至少通过来自于捐献样本的不同人群的细胞数量会有不同，和/或来自于同一人的不同样本之间细胞数量也会有不同来解释。每毫升的细胞数量也可明显满足准予后续的细胞分析。
再次参见图1，可以使用任意合适的仪器或设备来实施步骤30、步骤32和可选步骤42。在简单的技术中，可通过打开各自的包含所述保存溶液和/或预处理剂的单独容器来手动实施步骤32和/或步骤42，并手动添加所述保存溶液和/或预处理剂至所采集到的样本，和/或将该溶液与所采集到的样本手动混合。但是，在一些实施例中，步骤30、步骤32和可选步骤42可使用图4或5中说明的专用样本采集设备10来一起实施(在34)。所述设备10可以是适合于家用的类型，或者至少无需访问实验室的类型。所述样本采集设备10可以例如是，能够便携和/或提供给在家的使用者(例如，通过邮寄或投递)，用于使用者捐献自然分泌的体液样本。可替换地，所述样本采集设备10也可以方便地在实验室或医院使用。
图4或5中说明了采集设备10的两个可替换的例子。所述设备10通常包括具有嘴18和限定了采集区域20的第一主体16(例如管子)，所述采集区域20用于将自然分泌的体液通过嘴18导入所述设备。所述设备10可进一步包括第二主体22(例如封闭件)，所述第二主体22可连接至或在嘴18之上，以在导入所捐献的样本后密封所述设备10。可选地，将所述保存溶液12和/或预处理剂储存在所述设备的至少一个内部腔14中，并当例如使用者密封已闭合的所述设备或进行设备10的某些其他操作时，将释放所述保存溶液12和/或预处理剂与采集到的体液样本相混合。在图4的例子中，含有所述保存溶液12的所述腔14设于所述第二主体22(例如封闭件)中。在图5的例子中，含有所述保存溶液12的所述腔14设于所述第一主体16(例如管子)中。在任一个实施例中，所述腔14配置为由机构(图示为24)开启，以与所述采集区域20联通。所述开启机构24可以对将第二主体(例如封闭件)22适配于第一主体(例如管子)16，或者对设备10的一些其他数手动操作进行响应。可设想多种的机构24，包括但不限于选自以下的一种或多种：内部封闭件或帽的释放、水龙头的开启、脆性壁的破裂、内部盖的移除或取代，帽或螺母的相对旋转。
在所说明的例子中，仅对单腔14进行说明，例如用于保存溶液。若需要，也可以提供另外的腔(未示出)用于可选的若需使用的预处理剂。所述另外的腔可以配置为由上述的开启机构或者第二开启机构打开。所述另外的腔也可以例如在腔包含保存溶液之前为开启状态。在一些实施例中，连续的开启机构可以配置为在所述预处理剂先释放后只释放保存溶液。
可选地，设备10和开启机构24的示例性结构的更多细节在上述WO 2012/177656中有所提供，并通过引用并入本文。
所述设备10可以配置为采集预定样本体积“Vs”的自然分泌的体液。所述设备可以例如包括可视性填充刻度，或者填充线(例如26所显示的)或其他指示物，以指示何时达到预定的样本体积Vs。在一些实施例中，样本采集空间可具有与预定体积Vs相等的大小，或者样本采集空间在体积上可以更大。仅作为示例，在一些实施例中，所述预定体积Vs为至少约1ml、或者至少约2ml、或者至少约3ml、或者至少约4ml、或者至少约5ml或更多。仅作为示例，在一些实施例中，所述预定体积Vs不超过约5ml、或者不超过约4ml、或者不超过约3ml、或者不超过约2ml或者不超过约1ml。仅作为示例，在一些实施例中，所述预定体积Vs在一些实施例中可以为约1ml至约5ml、可选地约1ml至约4ml、可选地约1ml至约3ml、可选地约1ml至约2ml。仅作为示例，在一些实施例中，所述预定体积Vs为约1ml、或者约2ml、或者约3ml、或者约4ml或者约5ml。
在一些实施例中，保存溶液12的体积“Vc”可以基本上不大于或可选地小于预定样本体积Vs。所述保存溶液体积Vc可以与腔14的内部空间大小相同，以便填充腔14，或者保存溶液体积Vc可以更小，以部分填充腔14。
通过使保存溶液体积Vc基本上不大于或可选地小于预定样本采集体积Vs，当将保存溶液12与采集到的样本混合时，体积的增加可以等量地小。根据每单位体积的细胞浓度，体积的增加可以等于样本的稀释度。
再次参考图1，在步骤36中，所采集到的样本可以储存和/或运输至实验室以进行处理(可选地通过中间媒介)。例如，在居家捐赠样本的情况下，所述采集设备10可以通过投递或邮政服务送至实验室或中介，以继续运输。在实验室进行分析之前，用于运输和/或储存的时间可以从几分钟到数小时、数天、数周或甚至数月。保存溶液能够在较长的时间以及较宽的温度范围内稳定和保存在体液样本中的完整细胞和/或细胞外成分的能力使得可以将较宽范围的分析和诊断工具用于处理作为患者血液样本的可行性替代品的自然分泌的体液。而且，样本中所保存的细胞的收率，包括保存更稀有或稀少细胞的能力，以及细胞外成分的收率，对使用自然分泌的体液用于新医疗分析，诊断治疗监控应用开启了大门。
在可选步骤38中，可以处理保存的样本以提高细胞浓度和/或分离所选定的细胞类型和/或分离某些细胞外成分(例如，蛋白质、病毒、自由浮动DNA和/或自由浮动RNA中的任意一种)。
在本公开的一些实施例中，公开了提供一种或多种体液样本的方法，体液例如是唾液或尿液，包括化学固定的细胞和/或化学固定的细胞外成分，以及可选地将体液样本离心。离心可以从细胞颗粒中分离某些细胞外成分(例如，蛋白质、病毒、自由浮动DNA和/或自由浮动RNA中的任意一种)，包括细菌和碎片。
根据特定的目标物质，可以进一步处理或分析颗粒或液态细胞外成分，或以上两种。
例如，所述方法可以进一步包括从颗粒的其他内容物中富集白细胞，包括淋巴细胞。另外，可以使用与磁珠相连的抗体分离特定细胞，所述磁珠靶向于特定的细胞标记物。
在一些实施例中，本公开提供了一种用于从体液(即唾液、尿液等)中分离特定类型的白细胞的方法，特别地包括但不限于淋巴细胞，包括，例如一种或多种(在一些实施例中，部分或全部步骤)：提供包括化学固定的细胞的体液样本，可选地将体液样本离心以获得包括细胞的颗粒，可选地将所述颗粒再悬浮于缓冲液中，使所述再悬浮的颗粒经过密度梯度分离以获得多种白细胞型(包括淋巴细胞)混合物的层，使这些细胞类型的混合物与包含特定的结合剂的溶液相接触，所述结合剂用于在特定类型的白细胞上发现抗原，并从多种白细胞型的混合物中分离特定类型的白细胞(包括淋巴细胞)。
在一些实施例中，特定的结合剂可以包括偶联于抗体的磁珠，所述抗体特异地针对在特定类型的白细胞上发现的抗原，并且分离可包括从多种白细胞型的混合物中磁性分离特定类型的白细胞(包括淋巴细胞)，虽然用于将不同类型的细胞彼此分离的方法包括在本公开的范围内。磁性分离只是这样做的一个方法。
根据本公开，可以将所述细胞在经受所述方法前进行化学固定。可以通过例如将唾液样本与化学固定溶液相接触而将所述细胞化学固定。这样做是为了在室温下保存细胞一段时间。这也能够实现对表观基因组进行完整的研究，因为它允许从保存的体液样本研究组蛋白修饰和其他蛋白质-DNA的相互作用。组蛋白必须固定于DNA以用于研究。如果没有固定，组蛋白通常不能保持连接于DNA，并且经过一段时间蛋白质会降解。
在一些实施例中，所述缓冲液可以包括叠氮化钠，所述缓冲液可以包括磷酸盐缓冲液和叠氮化钠，在一些实施例中，所述缓冲液可以进一步包括小牛血清。在一些实施例中，所述缓冲液的pH为约7.2至约7.6。
在一些实施例中，所述细胞在缓冲液中洗涤一次。这实际上除去可溶性物质，并且在唾液的情况下可以移除被分为“口腔”的层(Dos-Santos et al,2009)。
在一些实施例中，所述白细胞的混合物在分离之前在缓冲液中洗涤一次或多次。优选进行该操作，以从多种细胞类型混合物中除去任何残留的密度梯度溶液。
在该处理中，抗体可以结合于特定类型的白细胞，因此将该特定类型的白细胞与磁珠结合。然后可以通过将磁珠置于磁场中而从任意其他种类的细胞中分离出特定类型的白细胞，并移除任何残留的液体以获得分离出的特定类型的白细胞。
在一些实施例中，所述特定类型的白细胞可以是淋巴细胞，其中所述淋巴细胞可以是T-细胞。在这样的实施例中，所使用的抗体可能对T-细胞的特异抗原特异(例如，所述抗原可以是CD4)。在一些实施例中，可以在进一步处理前，例如在表观基因分析之前将所分离的血液细胞冷冻。
下面的例子旨在进一步说明本公开的示例性的方法实施例，并且并不意图限制本公开的范围。
例1：从体液(例如唾液)中分离T-细胞。采集唾液，并将所述唾液与保存溶液混合。通过离心将所述细胞粒化，并移除所述处理溶液。将所述细胞再次悬浮于约为6ml的缓冲液中(PBS,pH 7.4)、1％FBS、0.01％NaN3)，然后在缓冲液中洗涤一次并再粒化。将所述颗粒再次悬浮于约为6ml的PBS-15FBS-0.01％NaN3中，并使用1.082-1.072g/ml的(GEHealthcare)经历密度梯度离心。将所述白细胞旋转至多糖和缓冲液的交界面，而细菌、碎片以及任意其他特定物质粒化至管底。从离心管中提取细胞并置于新管中。然后将所述细胞在Hanks平衡盐溶液中洗涤一次，然后用PBS-NaN3-FBS缓冲液洗涤一次，以除去可能在从界面提取白细胞的同时被占据的剩余密度梯度溶液。
现在所述样本包含带有极少量细菌和极少量碎片的高度富集的白细胞。该步骤也可极大地减少其他类型的细胞，例如上皮细胞。所述细胞可以在缓冲液(PBS-NaN3-FBS)中和抗体一起培养，所述抗体靶向于CD4并连接于磁珠然后将样本置于磁场中，磁珠带至管的一侧，并除去液体。液体可以包含除了通过抗体结合于磁珠以外的任何物体。由于磁场的作用，T-细胞可以结合至抗体并而没有被除去。磁珠和连接的细胞可以在缓冲液中洗涤，以除去任何非特异或弱结合的、在体液(例如唾液和尿液)中可找到的其他细胞、细菌或其他碎片。可将所述细胞冷冻用于后续下游处理和分析。T-细胞的分离可以通过光学显微镜来证实(T-细胞非常不同于上皮细胞和细菌)(参见图6)。另外，使用针对CD3、CD4和CD8的抗体的流式细胞术和F.A.C.S.分析可以证实分离细胞的视觉评价。可以自体液滴定T-细胞，以确定每单位体液(ml)的T-细胞数量，以确定包含足够用于下游实验的细胞数的体液，例如唾液或尿液的量(参见图6和7)。能够显示，分离的细胞没有出现DNA降解并适用于下游用途(参见图2)。
再次参见图1，在步骤40中，进一步处理目的样本(可选地富集，或具有从步骤38分离和/或分开的细胞类型)以用于分析或诊断。如上所述，可以对分离出的细胞或者分离出的细胞外成分实施步骤40。可选地，采集到的样本可以提供完整细胞样本和细胞外成分样本，并且可以对每个样本实施步骤40。步骤40可以包括对于每个样本的相同或相似的分析，或者可以包括不同的分析。
获得自然分泌体液的样本的能力，保存以提供可用收率的数量稀有或稀少细胞和/或细胞外成分，可以提供对血液样本的替代技术，其用于诊断和/或监控患者的身体状况。细胞和细胞外分析可用作伴随诊断和/或伴随验证。
用于识别血液样本中的特定类型细胞或其他生物标记物的技术也可以用于(经修正或未经修正)识别在自然分泌的体液中的这样的细胞或其他生物标记物。
例如，可以分析细胞和/或细胞外成分以诊断、指示、识别和/或监控以下一种或多种：
(a)具有识别疾病复原或发展的标记物(细胞的或分子的)的细胞。所述疾病可以例如为癌症(可选地，但不限于白血病)。在所述液体为或包括痰的情况下，所述疾病可以是肺癌、肺恶性上皮瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺炎或肺结核中的一种或多种。
(b)产前细胞。
(c)循环肿瘤细胞(例如转移性或其他方式)。
(d)正常细胞的稀有形式，例如，以下任意一种或多种：
-在骨髓增生异常综合征中的未成熟细胞；
-指示疾病并其不源于口腔的上皮细胞的亚种；
-郎格罕细胞(Langerhands cells)，例如(但不限于)诊断血液疾病。
(e)一种或多种指示肥胖的生物标记物(以下讨论)；
(f)一种或多种指示细菌感染版病毒感染(用于避免不必要或不恰当的抗生素处方)的生物标记物。例如：
·TRAIL蛋白质(TNF-相关细胞凋亡诱导配体)可以用于辨别感染(细菌v.病毒)。这对于抗击耐抗生素细菌十分有用。
·TRAIL蛋白质为由大多数细胞分泌的细胞因子，并作为配体诱导衰亡过程。
(g)一种或多种指示自闭症的生物标记物。例如：
催产素-影响亲和结合的建立。ASD中的负作用催产素与5-HT负相关。编码用于催产素受体的OXTR基因的多态性，与自闭症、成对编码、社会行为、情感倾向和ASD特性有关。
褪黑素–成熟到在昼夜节律和季节性节律中起作用，并且在免疫反应和在神经可塑性中进行调节。褪黑素由5-HT合成，其通过酶-乙酰羟色胺甲基转移酶(ASMT)转变为N-乙酰羟色胺和随后的褪黑素。其过程由白天/光所抑制。ASD患者血浆中的褪黑素的水平较低，这似乎是由于缺乏这种ASMT酶(表观遗传的(DNA、蛋白质以及适用于RNA的分析))。ASMT的基因变种与ASD相关。相同的基因还在398个ASD个体的6个(1.51％)中发生破坏性编码突变，相比之下，在对照组的437个个体中均没有发生。
自闭症的免疫学生物标记物(细胞外以及细胞内)。
-提高的IL-1(白介素1)
-提高的IFN-γ(干扰素γ)
-抗炎症因子的过量制造，IL-10(白介素10)
-T-淋巴细胞的异常后胸腺成熟，伴随有增加幼稚性和降低分化度的(例如CD4+和CD8+)T-细胞计数。
(h)一种或多种指示阿尔茨海默病的生物标记物。
(i)一种或多种指示杂种疾病(hetotological disorders)的生物标记物。
(j)一种或多种指示心血管疾病或失调的生物标记物。
(k)一种或多种指示糖尿病的生物标记物。
(l)一种或多种指示易受攻击的生物标记物，例如，涉及免疫细胞活性和/或免疫细胞生物标记物。
(m)一种或多种生物标记物和/或一种或多种释放因子，其指示疾病或感染的静止的和/或休眠的和/或隐匿形式。例如，这样的疾病可能是LTBI。附加地或者替代地，这样的因子可以是肽和/或细胞因子。
在一些例子中，可以在保存步骤前向唾液中加入(上述图1的步骤42)预处理剂。所述预处理可以例如包括所检测的疾病或感染的抗原，如果是来自于具有所述疾病或感染的个体，则用于诱发或刺激释放唾液中的某些因子。可以通过使用抗原的预处理剂(例如来自于结核分支杆菌的肽)检测到LTBI，由淋巴细胞识别，并引起感染的个体的唾液中诸如干扰素γ的因子的释放。所释放的因子，诸如干扰素γ，可以随后从保存的唾液中化验(例如，定量或定性)，并作出诊断。
附加地或者替代地，在一些例子中，可对淋巴细胞，例如T-细胞进行表观遗传学分析(包括转录和转录分析)以针对LTBI，其是基于当来自于结核分枝杆菌的肽加入到细胞时，引起细胞释放干扰素γ的变化。这可以按照包括或不包括使用预处理剂(例如抗原)的附加步骤42来进行。
(n)在细胞中存在HIV感染。
下面为关于HIV感染的非限制性讨论。以下也将进一步解释附加或可代替的例子。
使用本公开的保存技术可以有助于任何现有的基于唾液释放抗体/因子的试验。
但是，现有的基于唾液的技术具有以下缺陷：它们依赖于人类免疫系统来产生能够检测到的抗体/因子，通常这涉及一个至少6周的延迟。可以基于细胞外因子而将这样的技术归类。在这期间，现有的基于唾液的试验不能够诊断个体中存在HIV感染，这在一些情况下将导致令人误解的结果和/或可导致所述个体将感染不知不觉地散播至他人。
本公开还建议在以下时间段能够使用唾液检测HIV感染：(i)在人体免疫系统产生能够检测到的抗体/因子之前；和/或(ii)不需要个体感染后的至少6周。
在一些实施例中，本公开允许分析在唾液(或者其他自然分泌的体液)中保存的感染细胞中的HIV病毒。例如，血细胞可以将包括CD4+t-细胞的t-细胞保存和/或分离和/或分析，以确认细胞中HIV病毒的存在。因此，本公开允许在例如唾液中进行细胞内分析，使得在感染HIV病毒后的检测大大早于上述细胞外检测，例如至少提早六周或更多。
在一些实施例中，在t-细胞内可分析病毒(例如逆转录酶、蛋白酶、核糖核酸酶和整合酶中的任意一种)自带的病毒RNA或逆转录的DNA或蛋白质。
在一些实施例中，在保存例如唾液并分离CD4+t-细胞后，可以将所述细胞裂解，并获得和/或分离DNA和/或RNA和/或细胞内蛋白质。可选地，可以利用探针进行PCR，所述探针以HIV病毒的独特序列为靶点。附加地或者替代地，诊断平台在HIV感染的早期可以着眼于通常用于整合到DNA基因组中的蛋白质。这样的分析在本质上是蛋白质组学的，并且可以包括，仅举例为诸如质谱、ELISA或其他抗体介导的分析的测试。对于HIV病毒的蛋白质可以进行抗体分析(而不是那些由上述免疫细胞释放的物质)。
附加地或者替代地，样本(例如唾液)中CD4+细胞数量的测量其本身可以成为HIV感染的指示，因为HIV积极地从人体的免疫系统中消灭CD4+细胞而引起AIDS。在本公开的一些实施例中，可以评价CD4+细胞的数量，例如通过流式细胞术和/或FACS以从保存的样本中提供这样的指示。
(o)一种或多种指示癌症的生物标记物。
(p)一种或多种指示慢性阻塞性肺病(COPD)的生物标记物。
(q)一种或多种指示耐药性肺结核的生物标记物。
(q)一种或多种适用于复制和/或取代选自以下血液化验类别的一种或多种的测试的生物标记物：电解质水平、脂质化验、维生素水平、肝炎化验、铁缺乏化验、肝功能化验、肾功能化验、糖尿病筛查化验、血相化验、甲状腺功能化验。
(s)一种或多种指示称为“哮喘慢阻肺重叠综合征”(ACOS)的一种COPD的生物标记物。可选地，这样的生物标记物能够对COPD的一般诊断提供伴随诊断，用于检测所述COPD是ACOS。附加地或者替代地，这样的生物标记物能够对监控治疗目标ACOS的效果提供伴随验证。附加地或者替代地，COPD的通常诊断可以是，例如，使用上文(p)中所指的生物标记物来进行，和/或COPD的通常诊断可使用其他常用诊断性测试来进行。
关于上述(a)，现在仅举例说明关于非小细胞肺癌(NSCLC)的更多信息。大约80％的肺癌是NSCLC(5)。NSCLC的早期诊断和治疗可优化结果(12)。常规诊断的主要部分涉及在显微镜下疑似癌细胞的直接观察(6)。这是一个既定的实验室应用，涉及肺活检材料。
相比之下，使用本公开的技术的口腔液体的样本采集可以对呼吸系统的癌细胞提供更容易的取用方式。可以相信，口腔液化验可以提供能够至少支持甚至有助于当前临床实践(3、4、7)的“液体活检”。可以相信，口腔液诊断可能延伸至其他癌症(48)以及适用于这种基质的其他一些疾病(49)。
推定的癌细胞，特别是癌症干细胞(CSC)的检测和识别是当前癌症研究和患者管理的活跃部分(8)。依靠最近的科学研究数据发现，可以相信，允许NSCLC/CSC(已经诊断的患者)的识别的适当生物标记物组可能提供显着的优势。
示例性生物标记物可以包括CD133和/或EpCAM(10、11)。附加地或者替代地，示例性生物标记物可以包括EGFR和/或ALK。
例如，在保存的体液样本的完整细胞中可以检测到一些生物标记物。附加地或者替代地，可以例如在来自采集的体液的裂解细胞的保存样本中检测到一些生物标记物(例如，使用在本公开的一些实施例中可取得核酸的保存溶液-可选地参见附录1)。
CD133是与永生化(干细胞)细胞密切相关的生物标记物，EpCAM(上皮细胞粘附分子)是已知的仅在上皮和上皮衍生的肿瘤中表现出来的生物标记物。EpCAM可用作多种实体组织癌的诊断标记。它似乎在肿瘤发生和癌症的转移中起作用。照此，它也可以作为潜在的预后标记物和免疫治疗策略的潜在靶点。EpCAM捕获/检测是已经在临床实践中的全血中现有循环肿瘤细胞(CTC)化验的关键组成部分。
通过本公开的技术作为反映和监测临床测定一起使用，医师可以获得关于患者进展和预后的有价值的信息。对于任何肿瘤和主动研究(5、6、13)的受试者来说，适用于测试的这些全套额外靶点(基因重排，SNP)可以比较广泛。
优点是，本公开的技术可以使得患者样本的获得和稳定性比使用其它方法更容易实现。通过“液体活检”的方式(14)保留患者的材料可以促进后续测定。有许多可以通过反射测试进行评估的有吸引力的生物标记物(5、6、13)。例如，在诊断为NSCLC的患者中，能够确定早期药物治疗和随后的选择是非常有利的，因为很遗憾耐药性通过基因组序列突变显现，并且可能在药物治疗之前或期间的任何时间发生。
可能与患者管理相关的两种测定涉及测试在多个基因中的任意一个突变，所述基因已知涉及治疗性药物抗性和监测(5、6、15、16)。在进一步的情况下，表皮生长因子受体基因(EGFR)的突变和ALK基因中的染色体重排对于药物选择可能是重要的。在更精细的水平上，几种其他基因对于诸如VEGF的疾病治疗也是重要的，但是EGFR/ALK是治疗调节的主要的局部重点(50)。
EGFR特异性药物吉非替尼(Gefitinib)(易瑞沙(Iressa))-Astra Zeneca公司，厄洛替尼(Erlotinib)(特罗凯(Tarceva))-Genentech公司，阿法替尼(Afatinib)(Gilotrif)-Boehringer Ingelheim公司需要分析和监测EGFR序列变化。ALK关注药物Crizotinib(Xalkori)-Pfizer公司和色瑞替尼(Ceritinib)(Zykadia)-Novartis公司也需要监测患者的基因重排。
初始和持续的对患者基因序列的警戒可以实现重要的优势。可以通过肿瘤细胞询问来促进这些测试，例如使用保存的裂解体液样本(例如，使用附件1的技术)。
可以通过基于保存的完整细胞样本的更先进的细胞学方法(例如IHC、FISH)(9、18)进行测定，或者更直接地通过使用保存的裂解样本的核酸杂交测试来进行(例如，使用优化的附件1技术分离核酸(19))。
设想是使用口腔液体传代细胞的CD133/EpCAM的询问测试，可选地随后进行(但不限于)如EGFR/ALK的抗药性相关基因的反射测定。大约10％的NSCLC肿瘤将显示EGFR或ALK突变(50)。
关于上述(e)，现在仅通过举例解释更多的信息。表观遗传学(DNA甲基化和组蛋白乙酰化)的全局和基因特异性变化已经与肥胖相关。选择那些其表达可能与肥胖因果关联的基因(蛋白质和RNA水平的分析)：
·瘦蛋白(LEP)
·瘦蛋白受体(LEPR)
·脑源性神经营养因子(BDNF)
·阿黑皮素原(POMC)
·单一的同系物1(SIM1)
·2型神经营养型酪氨酸激酶受体(NTRK2)
·FTO(脂肪含量和肥胖)
选择的表观遗传生物标记物，显示与肥胖有关：
参考上述(n)，以下提供附加和/或可选的示例信息。在过去十年中，核酸的扩增、检测和测序取得了巨大进展(27、37、38综述)。存在试剂、引物序列和治疗方案并且容易获得。除了高通量和机密测试之外，在其他常规应用中仍然需要较为容易的样本处置和处理。最近已经看到了唾液和口腔液总体作为核酸测试的新基质的进展(39、40、41)。很感兴趣的是使用这种相对“用户友好”的液体用于多种基因/序列检测方法(42)。
Color Genomics公司宣布基于唾液的BRACA1基因序列(乳腺癌易感性)的测试正在开发，并将作为基于现有细胞血液测试的替代品而早期使用。基因序列平台的大多数既定提供者已经满足唾液基质的特异性方案(43)，因此有很好的理由来预期未来唾液能够用于检测其他感染剂、分析物和可核酸序列改变(44、45)。
本文提供了有关可用技术的资源链接的相关集合，供进一步参考(47、48)。
用于HIV序列检测的示例性生物标记物可以是CD4细胞，例如用于通过FISH/IHC方法进行分析。下面还讨论通过PCR的进一步的生物标记物检测。
本文公开的技术提供了唾液样本采集设备，其允许从唾液或诱导的痰中保存和分离细胞谱。这些细胞可以通过一些显微镜方法观察(9)。如上所述，对于NSCLC，该现有系统还允许通过大量免疫组化方法(IHC)询问固定细胞(18)。该分析可以包括检测显示多种HIV蛋白生物标记物中的任意一种的CD4细胞。为此目的，可商业购得大量IHC合格检测抗体(9)。本文公开的样本采集技术可以适于序列特异性核酸扩增和检测方法，例如基因特异性FISH(在原位杂交中的荧光)(51)。这是被广泛接受和重要的方法，类似于细胞学分析，允许通过常规显微镜和成像技术检测固定细胞内的DNA/RNA序列(天然基因组和病毒)。对于这种方法有着普遍接受和确认的治疗方案。针对HIV病毒的多种基因组区域的优化杂交探针和PCR引物的选择很容易理解和容易获得(52)。
特异性HIV病毒序列的检测，既作为整合的原病毒也作为病毒粒子，涉及显微镜载玻片的处理，所述显微镜载玻片包含保存的口腔液细胞，以及对已知HIV基因组序列特异性的“标记”杂交探针。特别是在CD4细胞中，最容易理解病毒的生命周期，染色体整合的“原病毒”序列将与化学标记的探针杂交，并随后可视化(53)。存在敏感的治疗方案，所述治疗方案被证实也用于低拷贝病毒负载(54)。这些探针是合成的，以匹配病毒基因组序列，并且将携带几种可用的信号产生的“标记”部分(生物素/链霉亲和素、铁蛋白、HRP酶、荧光素等)的任一种。
用于HIV序列检测的另一或替代示例性生物标记可以包括PCR。通过PCR检测HIV序列在技术上是直接的，具有许多可用的试剂系统和可用的放大检测选择。序列、探针和引物是很容易理解和可获得的。存在许多成熟的治疗方案(回顾37、38和47)。
可以在唾液中检测到HIV病毒和抗HIV抗体，为检测HIV抗体以诊断HIV感染提供了血液的替代方法(42、43)。唾液HIV抗体测试具有用于合适的唾液样本采集的专门设备，目前由美国食品药品管理局(FDA)许可(如OraSure)。这些测试用于资源有限的环境以及国内公共卫生诊所，这些场所优选快速测试和容易使用。
疾病控制中心(CDC)包括有快速和频繁的艾滋病毒检测，作为艾滋病毒预防计划的政策建议的一部分(http://www.cdc.gov/hiv/testing/clinical/)。在病毒粒子的情况下，有限的数据表明，尽管横向感染性可能较低，不过可以通过敏感的PCR“病毒载量”测定法试验检测病毒基因组序列。在感染的早期阶段，也可能在抗体首次出现的“窗口”期间，这似乎特别准确(39、40、55)。
早期研究显示，通过使用唾液基质的灵敏PCR检测，42％-91％的早期HIV感染个体是阳性的(41、55)。事实上，从开始药物联合治疗的患者中可以看到HIV RNA的急剧减少。因此，能够与格式化的HIV特异性PCR检测系统无缝结合的口腔液/唾液样本采集设备在临床和监视环境中具有提供巨大优势的潜力。
参考上述(p)，现在仅由实例解释更多的信息。COPD是复杂的呼吸道炎症疾病，非常难以明确诊断(20、21、22)。它呈现与其他呼吸综合征相似的临床症状，并导致复杂的血清生物标记物改变，其本身不具有特异性，而是作为系统范围“炎症”的指标。然而，据了解，这是世界上第四高的死因。虽然目前尚不可治愈，但有延长寿命的治疗方法。
使用本公开的原理，以下生物标记物中的一种或多种可适用于在采集的体液样本中检测COPD：VAP-1、CD44、CD11b、嗜酸性粒细胞水平(例如，口腔液嗜酸性粒细胞水平和/或痰嗜酸性粒细胞水平)。
有关治疗管理的最合适的诊断性生物标记物的选择一直处于重要的讨论之中。最近的研究数据已经确定了炎症和疾病进展的其他新的生物标记物，并且该领域正在迅速确定出可能提供更有效干预的更特异性细胞标记物，包括浸润和炎症(23、24)。本文描述的样本采集和分析技术可以提供简单的工具，使用其可直接评价呼吸衰竭的早期细胞诊断指标，并有助于早期治疗干预。
虽然目前许多呼吸/炎症疾病的生物标记物为可溶性分析物，可在血液中容易地并常规地测量，但也有新出现的数据表明侵入性的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞在气道衰竭中起到重要作用(25、26、27、28、29)。
一项最近的研究已经确认，将气道内皮细胞上存在的新型生物标记物VAP-1(30)作为分子“制动”元素，因此在粘附级联早期，负责介导和调节炎症过程中浸润性中性粒细胞。已经显示抑制该配体的实验药物在呼吸系统疾病的动物模型，特别是COPD模型中具有显著的效果。
与中性粒细胞在肺部防御中的正常功能的一体是其从微血管流出并通过组织迁移到目标部位的能力。一旦器官损伤，中性粒细胞上调特异性细胞表面受体(如CD44和CD11b共同表达及其他)的表达，随后这些生物标记物与内皮细胞上的粘附分子结合，如VAP-1(31、32、33)。使得嗜中性粒细胞通过内皮细胞内衬迁移进入下面的实体组织中对于健康是至关重要的，但是如果这个过程不受限制，则会发生不受控制的炎症。中性粒细胞PBMC上的CD44和CD11b已显示具有这种上调的行为，并且可以作为与气道嗜中性粒细胞浸润相关的COPD的早期指标，以及可能允许持续监测疾病的进展或治疗。事实上，浸润性中性粒细胞的特定亚种(例如在痰中测得)可能会传播或加剧COPD，这种观点在新型治疗中产生兴趣。
附加地或者替代地，嗜酸性粒细胞水平可以提供作为生物标记物的进一步指示，特别是对于ACOS(参见下文进一步的示例)。
关于上述(q)，现在仅以举例解释关于结核病的更多信息。在发展中国家和发达国家，结核分枝杆菌的诊断和治疗仍然是主要的健康问题。已经清楚，在过去十年中这种细菌可能对目前可用的有限装备或治疗药物产生抵抗力。此外，了解个体患者的状况，就与突变相关的耐药性的类型和频率而言，可使医师更好地治疗甚至预测新的感染因子的威胁性转变和爆发。这是涉及核酸序列分析和关于耐药性等位基因的广泛基因数据库的技术挑战。由于传染性生物体显然是呼吸道剂，所以本公开的技术，包括患者管理的容易性和安全性，可为患者管理提供重要的优势。
例如，可以在体液样本的保存的完整细胞中检测到一些生物标记物。附加地或者替代地，可以例如在来自采集的体液的裂解细胞的保存样本中检测到一些生物标记物(例如，使用在本公开的一些实施方案中取得核酸的保存溶液-可选地参见附录1)。
关于上述(r)，迄今为止，以基于唾液的试验替代常规进行的验血是不可行的。然而，通过使用本公开的技术，大多数常规验血(大部分全血计数和许多诊断标记物的评估)现在可以通过唾液变得可行。
下表列出了许多(但不是全部)化验，这些化验通常由医生确定，需要抽血(第一列)。第一列列出了各种化验，评价血液中大部分关键因素，这些因素共同确保患者的健康和适当平衡。这些化验中的大多数不是特定的独立诊断，而是在诊断中有贡献和帮助的因素。中间列指出了目前认为使用本公开的技术和唾液样本代替血液样本实施取代和/或替代测试的可行性。根据取舍尺度和理解，右列指出目前用于遗传分析的商业唾液试剂盒是否可用于进行这些测试。
评价血液因素的类别：
电解质：安排血液电解质常规用于监测和评价患者的一般健康状况。电解质测量允许检测身体中的任何不平衡和监测酸碱不平衡。任何个别电解质的不平衡使得进行进一步的调查和监测，和/或可能表示更大的健康问题。
脂质：血液中含有的脂质被评价为心脏病危机因子评估筛查的一部分，以评估患者是否有发生心血管疾病的风险。因此，这些测试也有助于确定患者对药物和/或药物计量的变化的需要。
维生素：维生素D和维生素B12通常需要测量以确定缺乏，或者如果缺乏则足量补充。此外，经常在诊断神经病和某些贫血时检查维生素B12。
肝炎：HBsAg是乙型肝炎病毒B的表面抗原。检测血液中的这一因子可证实乙型肝炎的诊断。
铁缺乏剖析：这些化验用于评价患者身体中铁的水平，无论是太多或太少，以及用于补充的相应的需要。
肝功能化验：筛查用于检测和监测肝炎和肝脏疾病。通过这些因素和酶的波动来评价急性和慢性肝炎以及肝损伤。
肾功能：这个化验组有助于管理和诊断对具有肾脏影响的状况。这些测试可构成常规验血的一部分，仅用于确保肾脏的正常功能，或可用于筛查和/或跟踪患有或有风险发展为肾脏疾病的患者。
糖尿病筛查：安排这些测试是用于诊断患者是否患有糖尿病，以及通过评估控制血糖的水平来协助监控和管理患者的糖尿病。
血相：也已知为全血细胞计数(CBC)，是一种广泛的筛选工具，评估患者的一般健康状况，并检测许多疾病，如贫血、感染和某些癌症。CBC包括对血液的细胞成分(红细胞、白细胞、血小板及其比例)的评估以及血液中各种方面和因子的测量。
甲状腺功能：用来评估甲状腺的正常功能或诊断指示甲状腺疾病的失衡的测试组。
上述所述的表格如下：
对于上述(s)，现在仅举例说明关于“哮喘COPD重叠综合征”(ACOS)的更多信息。ACOS是当患者患有COPD和哮喘时发生的情况。如上所述(p)已经说明，“慢性阻塞性肺疾病”(COPD)是影响近5％人群并与高发病率和死亡率相关的疾病。疾病状态的特征在于患者长期气流较差，涉及肺气肿和慢性支气管炎。最近，已经发现所有患者的10-40％患有COPD的新的亚型“哮喘COPD重叠综合征”(ACOS)(Leena George,2016)。ACOS是呈现COPD和哮喘以及混合性病理的状态，所有这些都使其成为COPD的更为极端的形式。通常，ACOS的发病年龄早于其他COPD患者，并且这些患者每年的医疗费用高出三倍(哮喘患者：$2307、COPD患者：$4879、ACOS患者：$14917)(Fadia T.Shaya,2009)。
ACOS已经由GOLD(全球慢性阻塞性肺病倡议)和GINA(全球哮喘倡议)共同定义为“其特征为持续性气流受限，其中具有通常与哮喘相关的几个特征以及通常与COPD相关的几个特征”。由于这个定义的含糊性，ACOS目前不仅没有充分地定义，而且也是对基于临床表现的诊断的挑战。然而，正确的诊断是重要的，因为可以理解，患有ACOS的患者可能对通常的COPD治疗反应次优。相反，ACOS治疗是昂贵的，应针对患者病情才很可能治疗成功。
本文描述的样本采集、保存和分析技术可能特别适合于允许保存和随后的染色并计算患者嗜酸性粒细胞计数，同时允许从同一样本检测其它重要的细胞和相关的生物标记物(参见上文)。这些技术可能为临床医师提供有价值的新的诊断治疗学工具，用于评估和监控COPD患者的治疗。
随着临床数据的进一步发展，该应用也可以在例如哮喘的鉴别诊断中起作用。
已显示ACOS对某些药物治疗的反应更为积极，这可以帮助控制患者处于稳定状态，更重要的是控制和预防发作。一组这类药物治疗是吸入和口服皮质类固醇的治疗。认为类固醇是控制ACOS的广谱方法，因为它们能够减少嗜酸性粒细胞性支气管粘膜炎症(LeenaGeorge,2016)。目前正在研究用于ACOS中的其它窄谱治疗，其专门针对嗜酸性/Th-2介导的炎症(Leena George,2016)。这些治疗方法不仅具有通过控制症状和发作来改善ACOS患者的生活质量的潜力，而且有潜力降低医疗成本和归因于此的经济负担。
基于对ACOS的理解和酝酿中的治疗学，更重要的是开发足够并有效的诊断工具，其不仅可以帮助诊断ACOS，还可以作为伴随诊断和/或伴随验证，以证实治疗效果。验血和支气管镜检查这些传统选择各有其局限性和缺点。已显示痰液化验对COPD患者具有优势，这是由于炎症细胞局部浸润，由此提示痰中可能存在较高浓度的炎症细胞，如嗜酸性粒细胞。然而，痰样本难以处理，并且难以获得。口腔液已经显示为含有唾液和痰液，并且由于COPD/ACOS患者的痰液产量增加，口腔液可能对于诊断和评价许多细胞的和炎症的生物标记物来说为非侵入方式。使用本文所述的技术来保存口腔液的所有内容物，以及分离和评价嗜酸性粒细胞和关键生物标记物，可以提供迄今未实现或未设想的显著优势。
已经讨论了针对不同身体状况可检测或分析的生物标记物，现在以下的描述解释了可用于实施的不同技术，例如许多上述的内容。
在一些实施例中，用于诊断或监控患者的身体状况的技术，可选地但不仅限于对自然分泌的体液(例如唾液、痰、尿液)中稀有细胞的分析和/或细胞外成分的分析，可以包括以下中的一种或多种：
(a)流式细胞术；
(b)荧光激活细胞分选(FACS)；
(c)免疫组化；
(d)分子分析(例如，但限于以下几种中的任意一种：表观遗传学、遗传学、翻译、翻译后)
(e)细胞学检查。
(f)蛋白质水平(转录后)分析技术。
(g)RNA水平(转录)分析，以测量基因表达。
(h)DNA，例如表观遗传，和/或包括DNA甲基化和组蛋白修饰。
下面的其他例子旨在进一步说明本公开的示例性的方法实施例，并且并不意图限制本发明的范围。
例1：可以使用流式细胞术来诊断多种形式的癌症。例如这是美国癌症治疗中心(the Cancer Treatment Center of America)使用的用于诊断例如白血病和淋巴瘤的化验。也可以使用流式细胞术用于分析其他类型的细胞，例如，血液中的血小板细胞。例如，Quest Diagnostics公司使用流式细胞术来诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿液症(PNH)。
例2：可以使用FACS诊断包括那些用于癌症的多种细胞标记物。例如这是Quest公司使用的化验，其用于诊断细胞标记物，例如CD57，CD8，CD3。FACS分析也可以用在通过检查CD4化验监控HIV/AIDS治疗的状态，例如，BD Biosciences公司提供了FACSCountTM，其是设计用于依赖性CD4化验的系统。FACS分析也可以用在评价细胞死亡和线粒体损伤的形式；例如，EMD Millipore公司提供了评价细胞健康和完整性的多种测试。
例3：可以使用免疫组化诊断包括那些用于癌症和其他失调/疾病的多种细胞标记物。例如这是Quest公司使用的化验，其用于疾病所涉及的多个细胞标记物的诊断。仅作为举例，可以参考http://www.questdiagnostics.com/home/physicians/testing-services/specialists/hospitals-lab-staff/specimen-handling/immunohistochemistry.html。
也可以在癌症和一些肉瘤的诊断中通过细胞角蛋白的检测来使用免疫组化。例如，Invitrogen公司提供了用于检测细胞角蛋白的免疫组化试剂盒。
例4：分子分析(例如，但不限于以下任意一种：表观遗传、遗传、翻译、翻译后)；例如，Qiagen公司和其他公司使用分子分析通过包括亚硫酸氢盐测序和甲基化DNA沉淀(MDIP)的方法评价DNA甲基化和其他表观遗传标记物，用于诊断例如癌症的多种疾病。例如，美国癌症治疗中心使用分子分析用于在肿瘤组织样本进行分子剖析DNA中发现的多种生物标记物。这样的测试不仅能够诊断例如结肠直肠癌的癌症，也能够促进个体化治疗。
例5：可以使用细胞学检查诊断包括那些用于甲状腺癌和其他失调/疾病的多种细胞标记物。例如这是Quest公司使用的化验，其用于诊断甲状腺癌。仅作为举例，可以参考：http://www.questdiagnostics.com/testcenter/testguide.action？dc＝TG_Thyroid_Cancer
例6：蛋白质水平(转录后)。下游分析技术的例子可以包括：质谱、免疫(Western)印迹以及使用阵列的蛋白质组学生物标记物组的分析。细胞内蛋白质表达(水平)的分析可以用来分析药物、蛋白质或一系列蛋白质的化学的、非化学的抑制剂或者生物抑制剂的作用。
这包括对可以改变RNA或蛋白质或非编码DNA序列的基因的拆解/淘汰/抑制或激活效果的测量。这包括表观基因组的蛋白质/RNA(酶，例如DNA甲基化酶、DNA脱甲基酶、组蛋白甲基化酶、组蛋白脱甲基酶、组蛋白乙酰化酶以及组蛋白脱乙酰基酶等(特别是这包括酶DNMT1/2/3和所有亚种、MBD2、MeCP2以及所有组蛋白修饰的酶，例如组蛋白(脱)乙酰酶(脱)甲基酶等)并可以与表观基因下游(多个)效应的分析相结合(例如DNA甲基化或组蛋白的修饰在整体或者基因特异水平和/或者RNA和/或DNA的分析)。
例7：RNA水平(转录)上测量基因表达。在文献中识别出多个候选基因，所述文献单独或作为组使用，探测疾病/失调或用作伴随诊断或生物标记物用于多种疾病和失调的药学和/或治疗干预，包括癌症、神经病、罕见疾病以及儿童的疾病/失调。此外，可以从分离出的细胞中分析不同种类的RNA(这些包括微小RNA和信使RNA等)。所述分析技术包括PCR、全基因组阵列以及生物标记物组(以对一些技术命名)。
RNA下游应用可以包括分析细胞，其使用抑制剂例如siRNA或其他化学的和/或非化学的抑制剂用于RNA或mRNA干扰。这包括通过多种形式的PCR、表达阵列测量RNA的水平(例子包括昂飞(Affymetrix)或安捷伦(agilent)人类基因组表达阵列和定制阵列，其可以包括或不包括已知的针对特定疾病或失调的生物标记物)。
例8：DNA(包括DNA甲基化和组蛋白修饰的遗传和表观遗传学)。这可能包括诸如使用生物标记物组、亚硫酸氢盐测序分析、甲基化免疫沉淀分析和整个基因组阵列平台(agilent、affymetrix和包括那些基于基因组的定制阵列)的技术。
DNA分析可用于测量全局和基因特异性抑制甲基化和抑制去甲基化的作用。在全局抑制剂的情况下，可能包括那些生物的和化学的抑制剂(例如5azaC)。此外，它可以用于测量使用例如阵列、免疫印迹和质谱法对组蛋白的作用。
本申请中出现的出版物或其它文件，包括但不限于专利、专利申请、文章、网页、书籍等，其任何和所有引用，通过引用以其整体结合到本文中。
尽管以上已经详细描述了一些变动，但是其它修改也是可能的。例如，附图中所描绘的和本文所描述的任何逻辑流程不需要按照所示的特定顺序或序贯次序，以获得所需结果。其它实施可以在至少一些以下示例性权利要求的范围之内。
本文已经描述了设备、系统和方法的实例实施例。正如在别处所述，仅用于说明性目的而非限制性目的而描述了这些实施例。其它实施例是可能的，并且被本发明所覆盖，根据本文所含有的教导，这些实施例将是显而易见的。因此，本发明的宽度和范围应当不受任何上述实施例的限制，而应仅由本公开及其等同方案所支持的权利要求书来限定。此外，本发明的实施例可包括方法、系统和设备，其可以进一步包括任何其它公开的方法、系统和设备的任何和所有要素，包括对应于从体液(例如唾液、尿液)中细胞的采集、保存、分开和分离以及其它物质(包括有毒和/或有害物质/流体)的采集(及其组分的保存、分开和分离)的任何和所有要素。换句话说，来自一个或另一个所公开的实施例的要素与来自其它所公开的实施例的要素是可互换的。
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附件1(如上所述)下面作为本公开的一部分：
附件1
另外，本公开涉及用于采集体液或其他物质样本的设备、溶液和方法，包括危险品和/或有毒物质，并特别是自然分泌的体液(例如唾液、尿液)。附加地或者替代地，本公开涉及功能遗传学和/或从这些体液中分离和保存DNA，用于随后的遗传学研究(例如)。附加地或者替代地，本公开涉及通常适合于家用的这样的装置。
WO 2003/104251(DNA Genotek公司)描述了用于从采集到的唾液样本中保存和提取核酸的组合物和方法。所述组合物包括螯合剂、变性剂、用于维持组合物在DNA和/或RNA所期望的范围内的pH值的缓冲液。所述组合物还可以包括还原剂和/或抗菌剂。上述文件还描述了具有腔的唾液样本采集容器，所述腔内含有所述组合物，以及用于释放所述组合物的技术，其是通过当帽体配合于所述腔体时，解除分离屏障完成的。
虽然独立采集和保存设备的概念具有许多不同基因测试应用而不需要捐赠者实际访问实验室的潜力，但是这种潜力可能受到组合物的效力和保存溶液的质量的严重限制。本发明的一些非限制性方面可能寻求至少减轻这些问题。
本文参考WO 2012/177656和/或WO 2015/112496中描述的改进的样本采集设备。这些申请的内容通过引用并入本文作为参考，正如全文重现。
以下简要概述了附件1的公开内容，以便对本公开的一些方面提供基本的、非限制性的理解。
在一方面，描述了一种(例如便携式)适合于由例如不必访问实验室的样本捐赠者使用的采集设备。样本采集设备包括用于接收自然分泌的体液(例如唾液或尿液)的容器。该设备进一步包括含有用于从采集到的样本中提取和保存核酸的组合物的腔，其中所述组合物可有效地从细胞器提取和保存核酸。所述细胞器可能是线粒体(尽管相同的原理可以适用于其他细胞器)。
附加地或者替代地，在一方面，描述了一种用在样本采集设备中的组合物，所述样本采集设备用于采集自然分泌的体液样本，以及提取和保存采集的样本中的核酸，其中所述组合物可有效地从细胞器提取和保存核酸。所述细胞器可以是线粒体(尽管相同的原理可以适用于其他细胞器)。
根据需要，所述核酸可以是DNA和/或RNA。
线粒体DNA可能与细胞核DNA具有非常不同的特征：
(i)线粒体DNA与核DNA相比非常小。它具有仅36个基因编码的最小的染色体，由16600bp组成。
(ii)与细胞核DNA相比，线粒体DNA的浓度也相对较小。每个细胞可能存在约100至约10,000个线粒体DNA的单独拷贝。
(iii)线粒体DNA仅从母系继承。
(iv)线粒体DNA是圆形的。
(v)线粒体DNA对变异非常敏感。这是一个可能是使线粒体DNA成为研究和分析的兴趣所在的一个因素，因为它比核DNA更能够突变或受标记。例如，可以认为某些突变可以成为难以(或不可能)从细胞核DNA检测到的有用指示或神经疾病。
然而，迄今为止尚不知道用本文公开类型的样本采集设备提取和保存线粒体DNA。上述特征使得线粒体DNA难以提取和保存。首先，对突变的敏感性意味着线粒体DNA在用于裂解样本细胞以提取DNA的常规方法中特别容易受到损伤和突变。其次，线粒体DNA的较小的浓度和较小的体积加剧了为下游分析提供品质样本而获得足够数量的未损伤的线粒体DNA的难度。
在一些实施例中，组合物可以配置为裂解细胞器(例如线粒体)。下面描述示例组合物。
附加或者替代上述两者之一，在一方面，描述了在用于采集自然分泌的体液样本，以及在采集的样本中提取和保存核酸的样本采集设备中使用的组合物，其中(i)所述组合物比常规组合物在裂解和/或保存剂中明显更加浓缩，和/或(ii)所述组合物的体积基本上不大于旨在使用所述组合物的体液样本的体积。
在一些实施例中，所述组合物可以具有小于旨在使用所述组合物的体液样本的体积。
通过使用基本上不大于旨在使用所述组合物的体液样本的体积的组合物，当将组合物与采集到的样本混合时，增加的体积可以相当小。提供相对较小的体积可减小了体积增加对所得混合物中核酸浓度的影响和/或降低以每单位体积的DNA浓度计的组合物体积的稀释效果。
例如，在一个实施例中，组合物的体积与采集的体液样本的体积之比可以约为1:1。以这样的比例，每单位体积的提取和保存的核酸的浓度减半，因为净体积翻倍。因此，可以保持相对较高的浓度。可以相信，通过使用较小体积的组合物，可以进一步降低体积增加的影响。例如，如果组合物的体积大约是体液样本体积的一半，则可以相信每单位体积的提取和保存的核酸浓度可以是原来的三分之二，而不是一半。与1:1的实施例相比，每单位体积的浓度因此提高约33％。
使用提高浓度的裂解和/或保存剂可以弥补组合物所减小的体积。
附加地或者替代地，使用增加浓度的裂解和/或保存剂可以提供快速裂解和/或保存作用，和/或细胞内的细胞器的裂解，其中任意一种或两者都可以减少时间，而在这期间细胞器DNA(例如，线粒体DNA)可能发生突变。
附加或者替代上述任一方面，描述了在用于采集自然分泌的体液样本，以及在采集到的样本中提取和保存核酸的样本采集设备中使用的组合物，其中所述组合物包括：至少一种裂解剂和/或至少一种保存剂。
可选地，所述组合物可以包含至少两种裂解剂，可选地包含至少三种裂解剂。
附加地或者替代地，组合物可以可选地包含至少一种保存剂、至少一种化学抑制剂和/或变性剂，用于阻断蛋白质和/或DNA酶。可选地，组合物可以包含至少两种这样的化学抑制剂和/或变性剂，可选地包含至少三种这样的化学抑制剂和/或变性剂。
以下进一步解释示例组合物的细节。
附加或者替代上述任一方面，在一些实施例中，描述了包含以下一种、或者两种或全部三种的任意组合的组合物：
用于从样本细胞中释放核酸的至少一种裂解剂，所述至少一种裂解剂包含至少一种、可选地至少两种、可选地至少三种，选自：十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton、Triton-X、Triton 100、Triton-X 100、脱氧胆酸盐(例如脱氧胆酸钠)、胆酸盐(例如胆酸钠)、月桂酰肌氨酸钠(和/或十二烷基肌氨酸钠)、麦芽糖苷(例如正十二烷基-β-D-吡喃麦芽苷和/或DDM)、糖苷(如洋地黄皂苷)、吐温(如吐温20和/或吐温80)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐(和/或CHAPS)、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(和/或Tergitol型NP-40和/或NP-40)、氯化钠(NaCl)、氯化锂(LiCl)、氯化钾(KCl)或上述任意一项的衍生物(例如商业衍生物)；
包含tris和/或乙二胺四乙酸(EDTA)的缓冲剂；
至少一种用于阻断蛋白质和/或DNA酶的化学抑制剂和/或变性剂，所述至少一种化学抑制剂和/或变性剂包含至少一种、可选地至少两种、可选地至少三种，选自：2-巯基乙醇、Ca2+离子、乙二醇四乙酸(EGTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸钠(SDS)、碘醋酸、尿素。
附加或者替代上述任一方面，在一些实施例中，还描述了组合物，包含：至少一种离子型表面活性剂(或离子型去污剂)、至少一种非离子型表面活性剂(或非离子型去污剂)和盐。所述组合物可以是用于裂解细胞和/或细胞器的溶液。
可以相信，离子和非离子表面活性剂的组合可以对胶束形成具有协同的稳定作用，并且使胶束形成耐受更高的盐浓度。这可以避免一种或多种表面活性剂即使在相对高的表面活性剂浓度和/或高盐浓度下的不期望的沉淀。使溶液具有高的胶束表面活性剂浓度和高盐浓度可以增强所述溶液裂解细胞和/或细胞器的能力。
离子型表面活性剂或去污剂的例子包括以下任意一种或多种：十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸盐(例如脱氧胆酸钠)、胆酸盐(例如胆酸钠)、月桂酰肌氨酸钠(和/或十二烷基肌氨酸钠)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐(和/或CHAPS)、上述任意一项的衍生物(例如商业衍生物)。
在一些实施例中，离子型表面活性剂(或去污剂)可以包括两性离子型表面活性剂(或去污剂)，其中CHAPS是其一个实例。在其它实施例中，离子型表面活性剂(或去污剂)可以可选地不包括两性离子型表面活性剂；例如，离子型表面活性剂(或去污剂)可以包括阴离子型或阳离子型表面活性剂(或去污剂)。
非离子型表面活性剂或去污剂的例子包括以下任意一种或多种：Triton、Triton-X、Triton100、Triton-X 100、麦芽糖苷(例如正十二烷基-β-D-吡喃麦芽苷和/或DDM)、糖苷(例如洋地黄皂苷)、吐温(例如吐温20和/或吐温80)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐(和/或CHAPS)、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(和/或Tergitol型NP-40和/或NP-40)、上述任意一项的衍生物(例如商业衍生物)。
盐的例子包括以下任意一种或多种：氯化钠(NaCl)、氯化锂(LiCl)、氯化钾(KCl)。
在另一方面，附件1公开了用于采集自然分泌的体液(例如唾液)的体液样本采集设备，包括用于提取和保存在采集到的样本中的核酸的组合物。在一些实施例中，所述组合物可有效地从细胞器提取和保存核酸。所述细胞器可以是线粒体。在一些实施例中，所述组合物组合了多种裂解剂。在一些实施例中，所述组合物包含至少一种离子型去污剂，至少一种非离子型去污剂和盐。
在不限制本公开的情况下，附件1中公开的某些特征和/或方面的编号并逐项的列表如下：
项目编号：
1.一种在用于采集自然分泌的体液样本的样本的样本采集设备中使用的组合物，所述组合物可有效提取和保存所采集到的样本中的核酸，其中所述组合物可有效地从细胞器提取和保存核酸。
2.第1项的组合物，其中所述细胞器为线粒体。
3.第1或2项的组合物，其中所述核酸包括DNA。
4.第1、2或3项的组合物，其中所述组合物包括至少一种用于裂解细胞器的裂解剂。
5.第4项的组合物，其中所述组合物包括至少两种、可选地至少三种裂解剂。
6.上述任意一项的组合物，其中所述组合物和/或裂解剂包括选自表面活性剂、去污剂、盐中的至少一种。
7.上述任意一项的组合物，其中所述组合物和/或裂解剂包括至少一种、可选地至少两种、可选地至少三种，选自：十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton、Triton-X、Triton 100、Triton-X 100、脱氧胆酸盐(例如脱氧胆酸钠)、胆酸盐(例如胆酸钠)、月桂酰肌氨酸钠(和/或十二烷基肌氨酸钠)、麦芽糖苷(例如正十二烷基-β-D-吡喃麦芽苷和/或DDM)、糖苷(例如洋地黄皂苷)、吐温(例如吐温20和/或吐温80)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐(和/或CHAPS)、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(和/或Tergitol型NP-40和/或NP-40)、氯化钠(NaCl)、氯化锂(LiCl)、氯化钾(KCl)，包括其衍生物。
8.上述任意一项的组合物，其中所述组合物包括(i)Triton或其衍生物，(ii)SDS或其衍生物，以及(iii)盐的组合。
9.上述任意一项的组合物，其中所述组合物包括至少一种化学抑制剂和/或变性剂，用于阻断蛋白质和/或DNA酶。
10.上述任意一项的组合物，其中所述组合物包括至少一种、可选地至少两种、可选地至少三种，选自：2-巯基乙醇、Ca2+离子、乙二醇四乙酸(EGTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸钠(SDS)、碘醋酸、尿素。
11.在用于采集自然分泌的体液样本的样本的样本采集设备中使用的组合物，所述组合物可有效提取和保存所采集到的样本中的核酸，其中所述组合物包括以下一种、或者两种或全部三种的任意组合：
用于从样本细胞中释放核酸的至少一种裂解剂，所述至少一种裂解剂包含至少一种、可选地至少两种、可选地至少三种，选自：十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton、Triton-X、Triton 100、Triton-X 100、脱氧胆酸盐(例如脱氧胆酸钠)、胆酸盐(例如胆酸钠)、月桂酰肌氨酸钠(和/或十二烷基肌氨酸钠)、麦芽糖苷(例如正十二烷基-β-D-吡喃麦芽苷和/或DDM)、糖苷(例如洋地黄皂苷)、吐温(例如吐温20和/或吐温80)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐(和/或CHAPS)、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(和/或Tergitol型NP-40和/或NP-40)、氯化钠(NaCl)、氯化锂(LiCl)、氯化钾(KCl)，包括其衍生物；
包括tris和/或乙二胺四乙酸(EDTA)的缓冲剂；
至少一种用于阻断蛋白质和/或DNA酶的化学抑制剂和/或变性剂，所述至少一种化学抑制剂和/或变性剂包含至少一种、可选地至少两种、可选地至少三种，选自：2-巯基乙醇、Ca2+离子、乙二醇四乙酸(EGTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸钠(SDS)、碘醋酸、尿素。
12.上述任意一项的组合物，进一步包括pH缓冲液。
13.第12项的组合物，其中所述缓冲液为或包括Tris。
14.上述任意一项的组合物，其中所述组合物具有大于约为8的pH。
15.上述任意一项的组合物，其中所述组合物进一步包括蛋白酶K。
16.上述任意一项的组合物，其中所述组合物具有大于选自以下至少一项的总盐浓度：249mM、250mM、275mM、300mM、325mM、350mM。
17.上述任意一项的组合物，其中所述组合物具有不大于选自以下至少一项的总盐浓度：300mM、2000mM、1000mM、750mM、500mM。
18.上述任意一项的组合物，其中所述组合物具有不大于选自以下至少一项的体积：5ml、4ml、3ml、2ml、1ml、750μl、500μl、250μl、100μl。
19.根据上述任意一项的组合物，包括Tris、SDS、Triton、NaCl和EDTA。
20.根据第19项的组合物，进一步包括选自蛋白酶K、脱氧胆酸钠、尿素中的一种或多种。
21.根据第19或20项的组合物，其中所述组合物中的组分的浓度由以下进行限定：
Tris：约(R+1)*10mM
SDS：约(R+1)*1％(v/v)
Triton：约(R+1)*1％(v/v)
NaCl：大于或等于约(R+1)*250mM
EDTA：(R+1)*5mM
其中：
R是Vs/V的比率；
Vs是在使用中旨在混合浓度的样本的预定体积Vs，并且
Vc是组合物的体积。
22.用于裂解细胞物质的组合物，根据上述任意一项，可选地，所述组合物包括至少一种离子型表面活性剂(或离子型去污剂)、至少一种非离子型表面活性剂(或非离子型去污剂)和盐。
23.第22项的组合物，其中所述至少一种离子型表面活性剂或去污剂选自以下任意一种或多种：十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸盐(例如脱氧胆酸钠)、胆酸盐(例如胆酸钠)、月桂酰肌氨酸钠(和/或十二烷基肌氨酸钠)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐(和/或CHAPS)、以上任意一种的衍生物。
24.第22或23项的组合物，其中所述至少一种非离子型表面活性剂或去污剂选自以下任意一种或多种：Triton、Triton-X、Triton 100、Triton-X 100、麦芽糖苷(例如正十二烷基-β-D-吡喃麦芽苷和/或DDM)、糖苷(例如洋地黄皂苷)、吐温(例如吐温20和/或吐温80)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐(和/或CHAPS)、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(和/或Tergitol型NP-40和/或NP-40)、以上任意一种的衍生物。
25.第22、23或24项的组合物，其中所述盐选自以下任意一种或多种：氯化钠(NaCl)、氯化锂(LiCl)、氯化钾(KCl)。
26.第22-25中任意一项的组合物，其中所述组合物具有大于选自以下至少一项的总盐浓度：249mM、250mM、275mM、300mM、325mM、350mM。
27.第22-26中任意一项的组合物，其中离子和非离子表面活性剂或去污剂形成混合胶束群和/或混合胶束。
28.上述任意一项的组合物，进一步包括乙醇。
29.第1-27中任意一项的组合物，其中所述组合物实质上不含有乙醇。
30.用于采集自然分泌的体液的体液样本采集设备，其包括用于容纳自然分泌的体液的容器，以及含有用于提取和保存采集到的样本中的核酸的组合物的腔，其中所述组合物由上述任意一项限定。
31.体液样本采集设备，可选地根据第30项，用于采集第一预定体积的自然分泌的体液，包括用于容纳自然分泌的体液样本的容器，以及含有第二体积的组合物的腔，所述组合物用于提取和保存采集到的样本中的核酸，其中所述第二体积并不基本上大于，可选地小于第一体积。
32.第31项的体液样本设备，其中所述第二体积由选自以下的至少一种限定：不超过所述第一体积的约100％、不超过第一体积的约90％、不超过第一体积的约80％、不超过第一体积的约70％、不超过第一体积的约60％、不超过第一体积的约50％、不超过第一体积的约40％、不超过第一体积的约30％、不超过第一体积的约20％、第一体积的约90％、第一体积的约80％、第一体积的约70％、第一体积的约60％、第一体积的约50％、第一体积的约40％、第一体积的约30％、第一体积的约20％、第一体积的约三分之一、第一体积的约四分之一。
33.第31或32项的设备，其中所述第一体积由以下的至少一种限定：约0.5ml至约2.25ml、约0.75ml至约2.25ml、约1ml至约2ml、约1ml至约1.5ml、约1ml。
34.第31、32或33项的设备，其中所述第一体积约为1ml，所述第二体积约为250μl。
35.用于采集自然分泌的体液样本的体液样本采集设备，根据第30至34项中任一项，可选地，包括用于容纳自然分泌的体液样本的容器，和含有用于提取和保存在采集的样本中的核酸的所述组合物的腔，其中组合物的体积由选自以下的至少一种限定：约100μl至约1ml、至少约100μl并小于1ml、约250μl至约750μl、至少约100μl、至少约250μl、至少约500μl、少于1ml、小于约750μl、小于约500μl、约100μl、约250μl、约500μl或约750μl。
36.在样本采集设备中使用由第1至29项中任一项限定的组合物，用于提取和保存自然分泌的体液样本中的核酸。
37.蛋白酶K在使用家用的样本采集设备提取和保存线粒体DNA的方法中的应用。
虽然上面已经突出了本公开的多个方面，但这并不限制本公开的范围。要求保护本文所述和/或附图中所示的任何新颖特征和/或想法，无论是否已经在此重点强调。
下面参考附图中的图4、5和8，描述了涉及附件1的非限制性实施例，并仅作为举例。
参见图4和图5，显示了可适合于家用或至少不需要访问实验室的类型的样本采集设备10。例如，样本采集设备10可携带和/或可以提供给在家中的用户(例如，通过邮政或投递递送)，用于用户捐赠自然分泌的体液样本。所述体液可以是例如唾液或尿液。以下描述集中于唾液，但是应当理解，相同的原理可以应用于尿液或另一种自然分泌的体液。
在附件1的所示示例中，提供组合物12用于提取和/或保存在采集到的体液样本中的核酸。在使用中，旨在将组合物与采集到的体液样本混合，例如在封闭设备以将其密封时。然后，可以将设备10返回到发送者，或者发送至采集代理或实验室进行分析，例如遗传分析。
所述组合物12的功能可以是从体液样本中提取核酸，和/或保存提取后的核酸(或所述体液样本)。所述核酸可以是DNA和/或RNA。
在一些实施例中，所述组合物12可有效地裂解细胞器(例如，线粒体)和/或保存提取后的细胞器核酸。
在一些实施例中，所述组合物12可以避免或减少采集到的样本中DNA的突变、损伤或其他降解，从而为该设备的返还以供分析提供足够的时间。所述组合物12可以在室温下有效地保存提取后的核酸或至少一周、可选地至少两周、可选地至少三周、可选地至少一个月、甚至更长的时间。
所述组合物12可以为液体，以下描述了所述化合物的进一步的细节的例子。
所述组合物12可以可选地储存在所述设备的内部的腔14中，并且当例如使用者密封所述设备或执行设备10的某些其它操作时，释放所述组合物12以与采集到的体液样本混合。
图4和图5显示了采集设备10的两个可选示例。设备10通常包括具有嘴18和限定了通过嘴18将自然分泌的体液引入到设备中的采集区域20的第一主体(例如管)16。设备10还可以包括连接到或在嘴18之上的第二主体(例如封闭件)22，以在将所捐赠的样本导入之后密封所述设备10。在图4的例子中，包含组合物12的腔14设置在第二主体(例如封闭件)22中。在图5的示例中，包含组合物的腔14设置在第一主体(例如管)16中。在任一示例中，腔14配置为通过机构(如图所示为24)打开，以与采集区域20连通。打开机构24可以响应于将第二主体(例如封闭件)22装配于第一主体(例如管)16，或者响应于设备10的一些其它的手动操作。可以设想出各种机构24，包括但不限于选自以下的一个或多个：内部封闭件或帽的释放、水龙头的开启、脆弱的墙壁破裂、内部盖的移除或移位、帽或螺母的相对旋转。
可选地，在上文提及的WO 2012/177656和WO 2015/112496中提供了设备10和打开机构24的示例性构造的进一步细节，其通过引用并入本文。
所述设备10可以配置为采集预定样本体积“Vs”的自然分泌的体液。所述设备可以例如包括可视性填充刻度、或者填充线(例如26中所显示的)或其他指示物，以指示何时达到预定的样本体积Vs。在一些实施例中，所述样本采集空间可具有与预定体积Vs相等的大小，或者样本采集空间在体积上可以更大。仅作为示例，在一些实施例中，所述预定体积Vs为至少约1ml、或者至少约2ml、或者至少约3ml、或者至少约4ml、或者至少约5ml或更多。仅作为示例，在一些实施例中，所述预定体积Vs不超过约5ml、或者不超过约4ml、或者不超过约3ml、或者不超过约2ml或者不超过约1ml。仅作为示例，在一些实施例中，所述预定体积Vs在一些实施例中可以为约1ml至约5ml、可选地约1ml至约4ml、可选地约1ml至约3ml、可选地约1ml至约2ml。仅作为示例，在一些实施例中所述预定体积Vs为约1ml、或者约2ml、或者约3ml、或者约4ml或者约5ml。
在一些实施例中，组合物12的体积“Vc”可以基本上不大于或可选地小于预定样本体积Vs。仅作为示例，在一些实施例中，组合物体积Vc可以不超过Vs的约100％、或不超过Vs的约90％、或不超过Vs的约80％、或不超过Vs的约70％、或不超过Vs的约60％、或不超过Vs的约50％、或不超过Vs的约40％、或不超过Vs的约30％、或不超过Vs的约20％。仅作为示例，在一些实施例中，组合物体积Vc可以为Vs的约100％、或约Vs的90％、或Vs的约80％、或Vs的约70％、或Vs的约60％、或Vs的约50％、或Vs的约40％、或Vs的约30％或Vs的约20％。仅作为示例，在一些实施例中，组合物体积Vc可以是Vs的约三分之一、或Vs的约四分之一。组合物体积Vc可以与腔14的内部空间相同，以便填充腔14，或者组合物体积Vc可以更小，部分填充腔14。
通过使组合物体积Vc基本上不大于或可选地小于预定样本采集体积Vs，当将组合物12与采集到的样本混合时，体积的增加可以相当小。根据每单位体积的DNA浓度，体积增加可以等于样本的稀释度。图8示意性地示出了稀释对每单位体积的DNA样本浓度的影响，这取决于组合物体积Vc。横轴表示样本体积Vs与组合物体积Vc的比R，在R＝Vs/Vc的比例在1/1至5/1(或R＝1至5)的范围内。纵轴表示与组合物体积混合后，与原始样本体积相比，每单位体积的DNA浓度分数。该值随函数Vs/(Vs+Vc)而变化，并且等于组合物体积的稀释。
在本文公开的一些实施例中，比率Vs/Vc可以为约1/1(或R≈1)。从图8可以看出，这种组合物体积Vc将每单位体积的DNA浓度降低到原始量的50％，这是非常令人满意的。然而，可以相信，通过使用更小的组合物体积Vc(相当于样本体积Vs与组合物体积Vc的比例更大)，与1/1比例的实施例相比，可以增加每单位体积的DNA浓度。例如，使用体积为样本体积的一半的组合物，相当于样本体积Vs与组合物体积Vc的比为2/1(R＝2)，可以相信，增加了DNA的浓度，例如，增加多达原始量的66％，与1/1比例的实施例相比，提高了30％。使用体积Vc为样本体积Vs的三分之一的组合物，相当于样本体积Vs与组合物体积Vc的比为3/1(R＝3)，可以相信增加了DNA的浓度，例如，增加多达原始数量的75％，与1/1比例的实施例相比，提高了50％。使用体积Vc为样本体积Vs的四分之一的组合物，相当于样本体积Vs与组合物体积Vc比例为4/1(R＝4)，可以相信增加了DNA的浓度，例如，增加多达原始数量的80％，与1/1比例的实施例相比，提高了60％。
实现每单位体积的理想的高DNA浓度可为下游分析提供重要的优势。首先，现代自动化测试程序倾向于使用小样本量。确保即使少量样本在提取和保存后含有较大浓度的DNA对于能够受益于自动化测试也是重要的。其次，在采集到的样本中，与更占优势的细胞核DNA相比，线粒体DNA的浓度更小。提高每单位体积的DNA总浓度有助于提高自动化测试对这些稀有DNA的敏感性。它可以有助于使用采集于相对简单的采集设备中采集到的样本的自动化测试检测线粒体DNA，这被认为是使用目前可商业购得的设备所不可能做到的。
在一个具体的例子中，预定的样本体积Vs可以为约2ml，组合物体积Vc可以为约2ml。在另一个具体的例子中，预定样本体积Vs可以为约1ml，组合物体积Vc可以为约1ml。在另一个具体的例子中，预定样本体积Vs可以为约1ml，组合物体积Vc可以为约250μl。
附加或者替代上述任一方面，仅作为示例，在一些实施例中，组合物体积Vc可以为约100μl至约1ml，并包括上述端点值(或可选地为少于1ml)。附加地或者替代地，组合物体积Vc可以可选地为至少约100μl、可选地为至少约250μl、可选地为至少约500μl。附加地或者替代地，组合物体积可以可选地为约1ml、可选地为小于1ml、可选地为小于约750μl、可选地为小于约500mL。仅作为示例，在一些实施例中，组合物体积Vc可以为约100μl、或约250μl、或约500μl或约750μl。
组合物12的活性成分的浓度可以适当地变化以补偿使用较小的组合物体积Vc。例如，当使用的组合物体积Vc约为基准的一半的时，组合物12的活性成分的浓度与基准组合物12的活性成分的浓度相比可以增加一倍或更多。虽然组合物体积Vc较小，但改变活性成分的组合物可以提供至少相同(或更好)的提取和保存能力。后面将讨论成分浓度的更详细的解释。
附加或替代通过使用较小体积Vc(例如基本上不大于或者可选地小于样本体积Vs)的组合物来降低稀释的上述特征，本发明的进一步特征可涉及组合物12的组分。可能用到涉及所述组分的这些特征，而无需考虑样本体积Vs与组合物体积Vc的比例，虽然该比例可用于确定组合物中组分的合适浓度。
在一些实施例中，所述组合物可以包括选自以下的一种或多种：
(i)用于裂解细胞和/或细胞器以从其中释放核酸的至少一种细胞和/或细胞器裂解剂。合适的裂解剂可以包括一种或多种表面活性剂，和/或一种或多种去污剂，和/或一种或多种盐。示例性表面活性剂可以为十二烷基硫酸钠(SDS)，虽然可以附加地或替代地使用其它表面活性剂。示例性去污剂可以是Triton(例如Triton 100、Triton-X、Triton-X100)；和/或脱氧胆酸盐(例如脱氧胆酸钠)，但是也可以附加地或替代地使用其它去污剂。示例性的盐可以选自：氯化钠(NaCl)、和/或氯化锂(LiCl)、和/或氯化钾(KCl)，虽然可以附加地或替代地使用其它盐。下面进一步描述另外的表面活性剂和/或去污剂。为了避免疑问，在上下文允许的情况下，术语“表面活性剂”和“去污剂”可以互换使用，并且旨在可互换地阅读。此外，当以名称提及表面活性剂或去污剂时，其范围旨在覆盖任何等同的衍生物(例如商业衍生物)。
表面活性剂和/或去污剂可溶解细胞和膜成分以破坏细胞膜。盐可以调节容量渗透摩尔浓度。
在一些实施例中，至少两种裂解剂(例如选自以上)可以联合使用，可选地联合使用至少三种裂解剂(例如选自以上)。
在一些实施例中，盐浓度(在组合物12中和/或当组合物12与样本混合时的组合)可以至少为250mM、可选地大于250mM。该盐浓度可以是总盐浓度，或至少一种或多种主要盐组分的浓度。在一些实施例中，该盐浓度可以是至少300mM、可选地在300-750mM的范围内。这种浓度高于常规使用，并且可能有助于组合物12裂解细胞器的能力。
在一些实施例中，可以相信，使用非离子型表面活性剂和/或去污剂(例如Triton)与离子型表面活性剂和/或去污剂(例如SDS)组合是有益的。离子和非离子型表面活性剂和/或去污剂可以彼此缓冲，并且即使在相对高的盐浓度下(例如，如前面段落中)，也可稳定表面活性剂的聚集以形成期望的胶束。例如，Triton可对SDS具有稳定作用，防止或降低SDS沉淀的风险，否则可能会在相对较高的盐浓度下发生沉淀。附加地或者替代地，例如，即使在相对高的盐浓度的存在下，SDS也可稳定Triton胶束的形成。
可以相信，组合使用离子和非离子表面活性剂和/或去污剂的稳定效果可以通过以下来解释，尽管这并不意图以任何方式限制本公开的范围。在一些实施例中，组合物可以包括(i)表面活性剂/去污剂和(ii)盐组分。去污剂为表面活性剂，它们用于破坏细胞膜，从而有助于细胞裂解并促进细胞内物质以可溶形式释放。去污剂会破坏蛋白质-蛋白质、蛋白质-脂质和脂质-脂质的关联。此外，去污剂使蛋白质和各种其他大分子变性，并防止免疫化学测定的非特异性结合和蛋白质结晶化。
溶解在溶液中的表面活性剂/去污剂可倾向于聚集形成所谓的胶束。所有特定浓度的去污剂都将形成胶束，该浓度称为临界胶束浓度(CMC)。一旦达到CMC，去污剂单体就形成胶束。在浓度高于CMC的情况下，胶束和单体都存在于溶液中，还有其他可能不溶于水的非胶束相。
离子型表面活性剂/去污剂(例如SDS)形成离子型胶束。当这些胶束(如果独自地)暴露于高盐浓度时，所述胶束破裂，并且SDS沉淀从溶液中析出，在溶液中不具有所需的效果。
Triton X是另一种去污剂，但SDS是离子型的，triton-x是非离子型的。当SDS和triton都溶解在溶液中时，胶束群是离子型胶束(SDS)和非离子型胶束(triton)之一，并且认为是混合胶束群。这种混合胶束群对盐浓度具有更高的耐受性，并且非离子胶束缓冲剂可以缓冲盐对离子胶束的影响。
温度、pH和盐浓度可各自影响溶液的CMC(详见下文的分别说明)。因此，改变上述任意一种可能导致沉淀的形成。形成胶束所需的去污剂浓度是特定的。本文公开的缓冲液例子含有NaCl形式的额外的钠，其降低了临界胶束浓度，因此明显超过CMC，并且如果不存在互补离子/非离子表面活性剂有可能使SDS析出沉淀。
SDS和Triton X的组合在降低CMC和导致形成较大的混合离子/非离子胶束方面是协同的。两种去污剂的浓度和比例在确定胶束的稳定性方面起作用。因此，这些混合去污剂胶束在高盐缓冲液中可能更稳定，从而防止任何SDS沉淀。SDS和Triton-X的组合可能形成具有增强了稳定性的更大的混合胶束，以及更大的水分子缔合(由于NaCl浓度)，并且一起有助于减少SDS沉淀。
通过降低CMC，增加所形成的胶束的大小，以及更大量与胶束非特异性结合的水分子，NaCl的存在也可以协同影响Triton X的胶束形成。可以相信，这可以通过将与本文所公开的原理相一致的混合胶束群(即添加离子胶束)来缓冲。
可以使用并且不改变生物活性的其他去污剂，包括2％吐温-20、NP40、0.1-1％脱氧胆酸盐。
下面为示例性去污剂的两个非限制性表格：表1列出了去污剂的种类，以及表2列出了本文所述的每个去污剂的示例性应用。表1：
类型 化学物质
离子型 十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸盐、胆酸盐、十二烷基肌氨酸钠
非离子型 triton X-100、DDM、洋地黄皂苷、吐温20、吐温80、NP-40
表2:
(ii)缓冲剂，例如，包括或由Tris和/或乙二胺四乙酸(EDTA)组成。Tris和EDTA的组合可以缓冲所述溶液，并消除镁(抑制DNA酶)。所述组合也提供基本的DNA储存缓冲液。所述EDTA可降解所述RNA(如果需要的话)。
在一些实施例中，样本和组合物的pH在混合后可轻微偏碱性，例如，约为7.4至约为8。单独组合物12(例如与所述样本混合前)的pH值可能更高。单独组合物12的pH值可以至少约为8、可选地大于8，例如约为8.3。
(iii)至少一种化学抑制剂和/或变性剂，以阻断蛋白质和/或DNA酶。适宜的抑制剂/或变性剂可包括选自以下的一种或多种：2-巯基乙醇、Ca2+离子、乙二醇四乙酸(EGTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸钠(SDS)、碘醋酸、尿素。
如上面提及的，EDTA是二价阳离子例如Mg2+的络合剂，Mg2+为DNA酶核酸酶的辅助因子。在一些实施例中，EDTA同时作为缓冲剂和/或变性剂。
(iv)蛋白酶K，用于消除蛋白质。蛋白酶K与SDS组合使用可能更有效。例如，蛋白酶K对已经变性的蛋白质的效力多达大约10倍，而SDS作为蛋白质变性剂起作用。蛋白酶K可以避免被溶液中的SDS或EDTA或其他化学物质以及蛋白质抑制剂所抑制。在一些例子中，当蛋白酶K的长期稳定性被认为是一个问题，这通常可以通过提高组合物12中的蛋白酶K的量而克服，因此预先补偿预期的在一段时间内的部分损失。仅作为示例，蛋白酶K在组合物12和/或组合物12与样本混合后的组合中的量，可在约30～70mg/ml之间、可选地在40～60mg/ml之间、可选地为约50mg/ml。
在一些实施例中，总盐浓度可以小于约3000mM、可选地小于约2000mM、可选地小于约1000mM、可选地小于约750mM、可选地小于约500mM。盐浓度在组合物12(例如包括EDTA)中的所有盐组分中可以是附加的。过高的总盐浓度可限制在采集和保存样本用于遗传分析的后续过程中分离DNA的能力。盐浓度可以是当与唾液混合时，或者在分离中的组合物的盐浓度。
组合物12的一个特定的例子可包括Tris、SDS、Triton、NaCl和EDTA。可选地，所述组合物可以包括选自以下的一种或多种：蛋白酶K、脱氧胆酸钠、尿素。在一个例子中，由组合物12和唾液样本混合得到的组合决定的各成分的相对浓度可如下面表3所示：
表3：
各自和独立地，在这个特定例子的范围内，浓度变化可以多达5％、可选地多达10％、可选地多达20％。
如以上提及的，所述浓度为包含所述组合物12和唾液样本的溶液的所需浓度。组合物12中各组分的浓度依据本文中所述的样本体积Vs与组合物体积Vc的比值R(R＝Vs/Vc)。所述浓度可以根据浓度乘以(R+1)或((Vs/Vc)+1)而变化。下面的表4中说明了通常值和一些特定例：
表4：
又一次，各自和独立地，在这些特定例子的范围内，浓度变化可以多达5％、可选地多达10％、可选地多达20％。
本公开在其范围内预期：
(a)改变SDS的百分比，包括低至0％(省略SDS)。
(b)改变triton的百分比，包括低至0％(省略Triton)。
(c)添加KCl和/或LiCl(维持缓冲液离子强度的盐)，或者作为NaCl的替代(省略NaCl)，或者作为补助物与NaCl联合使用。
(d)改变各自和/或总盐浓度。
(e)添加例如以上述的量的蛋白酶K。
(f)添加0.1-1％的脱氧胆酸钠，其为能够溶解膜和细胞成分的生物去污剂，并且可增加细胞裂解。脱氧胆酸钠可用于取代SDS和/或Triton，或用于与这两者联合。SDS和/或triton的相对百分比也可以所有变化。(例如，上述引用的范围是指与唾液混合的组合物。浓度可以只在组合物中根据上述的因子R+1增加。)
(g)添加尿素。尿素可增加蛋白质变性和增加细胞裂解。SDS和/或triton和/或其他变性剂的浓度可以有所变化。
(h)在SDS和/或triton之外，或作为对它们的替代，使用一种或多种其他离子型和/或非离子型表面活性剂和/或去污剂。
如果需要，根据目的用途，所述组合物12可进一步包括乙醇。可替代地，如果需要，所述组合物12可基本上不包括乙醇。
在一些实施例中，组合物12可有效从细胞器中提取和保存核酸。所述细胞器可以是，例如线粒体。
已知提取和保存线粒体DNA是困难的。通过使用传统裂解技术，线粒体DNA对突变高度敏感，并且相比较细胞核DNA，线粒体DNA在浓度上非常小。这导致很难不受损地足量提取和保存这样的DNA，所述足量是指足够用于下游分析，特别是使用家用类型的样本采集设备时。在不同于家用的样本采集设备的实验室环境下，通常的用于获得线粒体DNA的方法为十分缓慢且精细地在受控条件下裂解细胞，这样不会有显著的环境因素的影响，以减少损坏线粒体DNA的风险。
本公开的一些实施例展现了不同的方法。通过使用合用的多种裂解剂，每种均在建议使用范围内的高阈值，例如，至少两种裂解剂、可选地至少三种裂解剂或更多，可以相信，不仅是细胞膜，连细胞器的膜也可以裂解，以从细胞器中迅速释放核酸，因此减少了裂解损害可能发生的时间段。
附加地或者替代地，通过联合使用多种化学抑制剂和/或变性剂，每种均在建议使用范围内的高阈值，例如，至少两种这样的试剂、可选地至少三种这样的试剂，可以相信，可以很快保护提取的核酸免遭周围环境物质的损害，因此减少了损坏的细胞器DNA的量。
与受控条件下的缓慢且精细的常规实验室方法相比，上述两种技术提供了令人惊奇的优点，不对细胞器DNA产生显著的环境影响。组合使用上述技术可以提供出人意料的效力。
可以发现本文所述的组合物用于许多不同的应用，旨在裂解细胞物质以提取细胞成分。在DNA提取的内容中描述了优选的实施例，例如细胞器DNA提取，但所述组合物不仅限于这种用途。

Claims (20)

1.诊断和/或监控身体状况的方法，包括：
获得自然分泌的体液的样本；
将样本与用于在所述样本中稳定细胞和/或细胞外成分的保存溶液相接触；以及
从所述样本中分析稳定后的细胞和/或细胞外成分，以识别、诊断或监控身体状况。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述自然分泌的体液选自以下一种或多种：口腔液、唾液、痰、尿液、肺脏吸出液。
3.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在将样本与保存溶液接触的步骤之前，将样本与预处理剂相接触的步骤，所述预处理剂配置为刺激释放指示身体状况的一种或多种因子。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括将至少特定细胞与至少特定的细胞外成分相分离的步骤。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析步骤包括流式细胞术。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析步骤包括荧光激活细胞分选(FACS)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析步骤包括免疫组化。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析步骤包括分子分析。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析步骤包括在样本中存在能够检测到的抗体前，识别HIV病毒感染。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析步骤包括识别t-细胞内，可选为CD4+t-细胞内的HIV病毒。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析步骤包括评价CD4+t-细胞的量，用于识别免疫缺陷，可选为指示HIV感染和/或AIDS。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析步骤包括识别以下的生物标记物：(i)指示COPD；和/或(i)指示ACOS；和/或(iii)用于辨别ACOS和非-ACOS类的COPD。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析步骤包括实施以下至少一种：电解质测定、脂质测定、维生素测定、肝炎检测、铁缺乏剖析测定、肝功能化验、肾功能测定、糖尿病筛查化验、血相测定、甲状腺功能测定。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述保存溶液相对于血液为高张溶液。
15.根据权利要求1所述的方法，其中将所述样本与保存溶液接触的步骤后，所述样本与所述保存溶液混合的组合物通常为等张，并且所述张力相对于血液而限定。
16.用于在自然分泌的体液中保存细胞和/或细胞外成分，用于进一步的下游分析和/或用于诊断身体状况的溶液，所述溶液相对于血液为高张溶液。
17.根据权利要求1所述的溶液，其中所述自然分泌的体液选自以下一种或多种：口腔液、唾液、痰、尿液、肺脏吸出液。
18.用于在液体样本中的细胞和/或细胞外成分的下游分析的液体样本，所述液体样本包括与保存溶液混合的自然分泌的低张体液，其中样本液体通常为等张，并且所述张力相对于血液而限定。
19.用于采集自然分泌的体液样本的样本采集设备，所述样本采集设备包含或包括用于保存在自然分泌的体液中的细胞和/或细胞外成分的溶液，所述溶液相对于血液为高张溶液。
20.包含样本液体的样本采集装置，所述样本液体为自然分泌的低张体液与保存溶液混合而得，其中所述样本液体通常为等张，并且其中所述张力相对于血液而限定。
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Zala et al. Functional precision oncology for follicular lymphoma with patient-derived xenograft in avian embryos

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