CN114214443A - 可同时检测多种微生物的多重荧光定量pcr检测方法和多重荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可同时检测多种微生物的多重荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；第二步，检测扩增产物的荧光信号；第三步，以检测结果的Ct值判定样品中是否含有大肠埃希氏菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、诺如病毒GI、诺如病毒GII和轮状病毒。本发明还公开了一种可同时检测多种微生物的多重荧光定量PCR检测试剂盒，可以用于定性检测蔬菜中是否含有大肠埃希氏菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、诺如病毒GI、诺如病毒GII和轮状病毒。

Description

可同时检测多种微生物的多重荧光定量PCR检测方法和多重 荧光定量PCR检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物学技术领域，具体地说，是关于一种用于同时检测6种微生物(具体为4种细菌和2种病毒)的多重荧光定量PCR检测方法以及多重荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术
食品安全被视为一个全球性的公共卫生问题，食源性致病菌是食品安全的一个重要方面。蔬菜、果蔬是营养丰富的食品，由于蔬菜含水量高，在加工、运输过程中极易引起病原微生物的浸染，从而引起致病性疾病，危害人类健康。大肠杆菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌四种食源性致病菌、以及诺如病毒、轮状病毒为常见的蔬菜携带的病原微生物。
大肠杆菌，特别是O157血清型，是一种低剂量就能使人感染的食源性病原微生物，能够引起腹泻和肠炎，危害严重。
沙门氏菌是世界范围内第二大食源性致病菌，能够引起腹泻、高烧，严重情况下会致人死亡。据国家卫健委统计，沙门氏菌连续多年是我国食源性致病菌的首要原因。
单核细胞增生李斯特氏菌是一种能引起人畜共患病的食源性致病菌，与其他食源性致病菌相比，在食品中单核细胞增生李斯特氏菌感染相对比较少见，但比常见的沙门氏菌和大肠杆菌更为致命。由于李斯特菌可以在低温、低水分、低pH、高盐的环境中持续增长和繁殖，因此广泛存在于自然界中，食品中存在的单核细胞增生李斯特氏菌对人类的安全更具有威胁。
金黄色葡萄球菌，是常见的引起食物中毒的致病菌。金黄色葡萄球菌对高温有一定的耐受能力，在80℃以上的高温环境下30min才可以将其彻底杀死，另外金黄色葡萄球菌可以存活于高盐环境，最高可以耐受15％浓度的NaCl溶液，对环境要求不高，能在各种恶劣环境中存活下来。近几年，金黄色葡萄球菌引发的食物中毒报道层出不穷，由金黄色葡萄球菌及其肠毒素引起的食物中毒占食源性微生物食物中毒事件的25％左右。
诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染。诺如病毒具有高度传染性和快速传播能力。诺如病毒感染发病以轻症为主，最常见症状是腹泻和呕吐，其次为恶心、腹痛、头痛、发热、畏寒和肌肉酸痛等。食源性传播是通过食用被诺如病毒污染的食物进行传播，污染环节可出现在感染诺如病毒的餐饮从业人员在备餐和供餐中污染食物，也可出现食物在生产、运输和分发过程中被含有诺如病毒的人类排泄物或其它物质(如水等)所污染。牡蛎等贝类海产品和生食的蔬果类是引起爆发的常见食品。
轮状病毒(Rotavirus，简称RV)是一种双链核糖核酸病毒，结构稳定、耐热，在自然环境中稳定。轮状病毒感染从无症状、轻微发病到严重发病，严重时发生致命性胃肠炎、脱水及电解质平衡失调。轮状病毒胃肠炎的症状包括发烧、呕吐、腹痛以及无血色水样腹泻。严重者可因脱水及肺炎、中毒性心肌炎等并发症导致死亡。
蔬菜是日常生活必备的食品，蔬菜上病原微生物的污染与消费者的健康息息相关，因此，对蔬菜，特别是生食蔬菜进行病原微生物检测，对保障人民群众的健康至关重要。
实验室传统的病原学相关检查主要包括细菌培养、病毒分离、核酸与抗体检测。其中细菌培养、病毒分离为实验室检测的“金标准”，但细菌培养、病毒分离需要的时间较长，技术操作繁琐，检测灵敏度不够、还需依赖严格的样本保存和运输条件，以保持细菌、病毒的活性。随着生物技术的不断进步和发展，病原微生物的检测方法也在不断改进。聚合酶链式反应(PCR)技术能快速、灵敏地进行病原微生物的检测，且不依赖于细菌、病毒的状态，提高检出率。但是传统PCR的检测在操作过程中易污染而使得假阳性率上升，使其应用受到了限制。
多重荧光定量PCR是在实时荧光定量PCR的基础上发展出的多重联检方法，是在同一个反应管中实现多个基因序列的扩增和特异性检测，用于病原体检测时，可以同时检测一个样本中多种病原体，实现高通量快速检测。但是，在进行多种目标物同时检测时，其难度大，对引物的特异性等要求比较高。另外，目前还没有将食源性致病菌和病毒同时进行检测。
发明内容
本发明的目的在于针对现有同时检测样本中多种食源性病原微生物难度大的问题，提供一种用于同时检测多种病原微生物的多重荧光定量PCR检测方法。为此，本发明基于蔬菜中6种食源性病原微生物设计引物、探针和内参引物、探针，开发了一种特异性好、灵敏度高、准确性好的用于同时检测多种病原微生物的多重荧光定量PCR检测方法。因此本发明的第一个目的在于提供一种用于同时检测多种微生物的多重荧光定量PCR检测方法。本发明的第二目的在于提供一种用于同时检测多种微生物的多重荧光定量PCR检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种可同时检测多种微生物的多重荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；
第二步，检测扩增产物的荧光信号；
第三步，以检测结果的Ct值判定样品中是否含有大肠埃希氏菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、诺如病毒GI、诺如病毒GII和轮状病毒；
其中，用于PCR扩增的反应体系中含有：扩增大肠埃希氏菌O157成分的特异性引物对和检测大肠埃希氏菌O157成分的特异性探针；扩增沙门氏菌成分的特异性引物对和检测沙门氏菌成分的特异性探针；扩增金黄色葡萄球菌成分的特异性引物对和检测金黄色葡萄球菌成分的特异性探针；扩增单核细胞增生李斯特氏菌成分的特异性引物对和检测单核细胞增生李斯特氏菌成分的特异性探针；扩增诺如病毒GI成分的特异性引物对和检测诺如病毒GI成分的特异性探针；扩增诺如病毒GII成分的特异性引物对和检测诺如病毒GII成分的特异性探针；扩增轮状病毒成分的特异性引物对和检测轮状病毒成分的特异性探针；以及内参引物对和探针。
根据本发明，所述扩增大肠埃希氏菌O157成分的特异性引物对的序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示，检测大肠埃希氏菌O157成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.3所示；扩增沙门氏菌成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，检测沙门氏菌成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.6所示；扩增金黄色葡萄球菌成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，检测金黄色葡萄球菌成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.9所示；扩增单核细胞增生李斯特氏菌成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，检测单核细胞增生李斯特氏菌成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.12所示；扩增诺如病毒GI成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，检测诺如病毒GI成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.15所示；扩增诺如病毒GII成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，检测诺如病毒GII成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.18所示；扩增轮状病毒成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，检测轮状病毒成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.21所示，扩增内参引物对的序列如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示，检测内参探针的序列如SEQ ID NO.24所示。
作为本发明的第二个方面，一种可同时检测多种微生物的多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括：扩增大肠埃希氏菌O157成分的特异性引物对和检测大肠埃希氏菌O157成分的特异性探针；扩增沙门氏菌成分的特异性引物对和检测沙门氏菌成分的特异性探针；扩增金黄色葡萄球菌成分的特异性引物对和检测金黄色葡萄球菌成分的特异性探针；扩增单核细胞增生李斯特氏菌成分的特异性引物对和检测单核细胞增生李斯特氏菌成分的特异性探针；扩增诺如病毒GI成分的特异性引物对和检测诺如病毒GI成分的特异性探针；扩增诺如病毒GII成分的特异性引物对和检测诺如病毒GII成分的特异性探针；扩增轮状病毒成分的特异性引物对和检测轮状病毒成分的特异性探针；以及内参引物对和探针；
所述扩增大肠埃希氏菌O157成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，检测大肠埃希氏菌O157成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.3所示；扩增沙门氏菌成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，检测沙门氏菌成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.6所示；扩增金黄色葡萄球菌成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，检测金黄色葡萄球菌成分的特异性探针的序列如SEQID NO.9所示；扩增单核细胞增生李斯特氏菌成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，检测单核细胞增生李斯特氏菌成分的特异性探针的序列如SEQ IDNO.12所示；扩增诺如病毒GI成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，检测诺如病毒GI成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.15所示；扩增诺如病毒GII成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，检测诺如病毒GII成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.18所示；扩增轮状病毒成分的特异性引物对的序列如SEQID NO.19和SEQ ID NO.20所示，检测轮状病毒成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.21所示，扩增内参引物对的序列如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示，检测内参探针的序列如SEQ ID NO.24所示。
根据本发明，所述多重荧光定量PCR检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照包括载有大肠埃希氏菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、诺如病毒GI、诺如病毒GII和轮状病毒的特异基因序列片段的质粒。
根据本发明，所述多重荧光定量PCR检测试剂盒采用3孔联合检测方式，每一孔包含三个荧光通道，每个通道对应一种病原体，所述病原体包括大肠埃希氏菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、诺如病毒GI/GII和轮状病毒，可以同时检测蔬菜携带的4种细菌、2种病毒共6种病原微生物，为全面检测蔬菜病原微生物，提供健康饮食提供了依据。
作为本发明的第三个方面，一种可同时检测多种微生物的多重荧光定量PCR检测试剂盒用于定性检测蔬菜中是否含有大肠埃希氏菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、诺如病毒GI/GII和轮状病毒中的应用。
本发明的可同时检测多种微生物的多重荧光定量PCR检测方法，其有益效果是：
1、采用多重荧光PCR技术，通过实时荧光PCR仪器进行核酸扩增与检测。本产品检测分3管扩增一次检测6种蔬菜携带的病原微生物，同时引入细菌的保守序列作为内参基因进行检测，可用于评估样本采集质量和PCR扩增情况，实时监测PCR扩增过程，并监控样本处理过程中产生的假阴性。
2、所有的探针Tm在65-70℃，且高于引物的Tm约8-10℃，所有引物的Tm接近，约为58-60℃，确保引物在延伸时探针保持与目标序列的结合。
本发明的可同时检测多种微生物的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其有益效果是：
1、所有的探针Tm在65-70℃，且高于引物的Tm约8-10℃，所有引物的Tm接近，约为58-60℃，确保引物在延伸时探针保持与目标序列的结合。
2、采用3孔联合检测的方式，每一孔包含三个荧光通道，每个通道对应一种病原体或者内参，可以同时检测蔬菜携带的4种细菌、2种病毒共6种病原微生物，为全面检测蔬菜病原微生物，提供健康饮食提供了依据。
3、检测灵敏度高，可检测到低于100copies的病原微生物，同时具有很高的检测特异性，抗干扰能力强。只需单次采样，便可实现6种病原微生物的同时检出，将大大节省时间，简化操作，同时也降低了检测成本。
4、检测全过程为封闭式，无需打开扩增管盖，从根本上克服了PCR开盖污染的问题。荧光探针PCR技术综合了PCR扩增的高敏感性、探针杂交的高特异性、及荧光实时检测的特性，检测结果的准确性大大提高，并且充分保证了检测结果的灵敏性。
附图说明
图1为用于6种病原微生物检测的多重荧光定量PCR试剂盒(96孔板，带竖条纹背景的为阳性对照，带圆点背景的为阴性对照，其余为待检测样本)。
图2为用于6种病原微生物检测的多重荧光定量PCR试剂盒(8联管5样本，带竖条纹背景的为阳性对照，带圆点背景的为阴性对照，其余为样本检测)。
图3为用于6种病原微生物检测的多重荧光定量PCR试剂盒(8联管2样本，带竖条纹背景的为阳性对照，带圆点背景的为阴性对照，其余为样本检测)。
图4为实施例5的29个样本的加样位置。
图5为多重PCR体系检测大肠埃希氏菌O157扩增曲线：分别为EC靶基因，李斯特菌靶基因，阳参内参基因。
图6为多重PCR体系检测大肠埃希氏菌O157——菌株浓度和检测Ct值的关系：横坐标——菌株拷贝数的对数，纵坐标——检出Ct值。
图7为多重PCR体系检测单增李斯特菌——菌株浓度和检测Ct值的关系：横坐标——菌株拷贝数的对数，纵坐标——检出Ct值。
图8为多重PCR体系检测金黄色葡萄球菌——菌株浓度和检测Ct值的关系：横坐标——菌株拷贝数的对数，纵坐标——检出Ct值。
图9为多重PCR体系检测沙门氏菌——菌株浓度和检测Ct值的关系：横坐标——菌株拷贝数的对数，纵坐标——检出Ct值。
图10为多重PCR体系检测诺如病毒——菌株浓度和检测Ct值的关系：横坐标——菌株拷贝数的对数，纵坐标——检出Ct值。
图11为多重PCR体系检测轮状病毒——菌株浓度和检测Ct值的关系：横坐标——菌株拷贝数的对数，纵坐标——检出Ct值。
图12为多重PCR体系检测大肠杆菌ATCC25922的检测曲线：只有阳性内参扩增曲线，无靶基因扩增曲线。
图13为多重PCR体系检测大肠埃希菌O157(NCTC12900)的检测曲线：阳性内参和靶基因都有扩增。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。
本发明的序列如表1所示。
表1引物和探针序列
Figure BDA0003439174350000071
Figure BDA0003439174350000081
以下实施例的内参基因是细菌的保守基因16S。
以下实施例的多重荧光定量PCR检测试剂盒的反应液采用市售的通用反应液，包括Taq酶、KCl、MgCl2、dNTPs、ROX。其中，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP。
以下实施例的多重荧光定量PCR检测试剂盒包括7份阳性对照和1份阴性对照。其中，7份阳性对照包括EC阳性对照、SHA阳性对照、LIS阳性对照、JIN阳性对照、GI阳性对照、GII阳性对照、RV阳性对照。阴性对照为实验用超纯水。
以下实施例的所有的探针Tm在65-70℃，且高于引物的Tm约8-10℃，所有引物的Tm接近，约为58-60℃，确保引物在延伸时探针保持与目标序列的结合。
实施例1用于蔬菜中6种病原微生物检测的荧光定量PCR试剂盒
用于蔬菜中6种病原微生物检测的荧光定量PCR试剂盒，包括：EC引物对和探针、SHA引物对和探针、LIS引物对和探针、JIN引物对和探针、GI引物对和探针、GII引物对和探针、RV引物对和探针、内参引物对和探针，序列如表1所示。
本发明采用多重荧光PCR技术，通过荧光PCR仪进行核酸扩增与检测。本产品检测分3管扩增，一次检测6种蔬菜携带的病原微生物，同时引入细菌的保守序列作为内参基因进行检测，可用于评估样本采集质量和PCR扩增情况，实时监测PCR扩增过程，并监控样本处理过程中产生的假阴性。
本发明的试剂盒采用3孔联合检测的方式，每一孔包含三个荧光通道，每个通道对应一种病原体，可以同时检测蔬菜携带的4种细菌、2种病毒共6种病原微生物，为全面检测蔬菜病原微生物，提供健康饮食提供了依据。
实施例2制备用于6种病原微生物检测的多重荧光定量PCR检测试剂盒(96孔板)
本发明用于6种病原微生物检测的多重荧光定量PCR检测试剂盒(见图1)，采用96孔板进行检测，每块板可检测29个样本。检测试剂盒组成见表2。
表2多重荧光定量PCR检测试剂盒组成(96孔板)
组成成分 最小包装规格
96孔板 每孔含反应液23μL
阳性对照(6种) 10μL*6支
阴性对照 15μL*1支
96孔板密封膜(定量PCR用) 1张
本发明的试剂盒可以用于检测6种病原微生物：大肠埃希氏菌O157(EC)、沙门氏菌(SHA)、单核细胞增生李斯特氏菌(LIS)、金黄色葡萄球菌(JIN)、诺如病毒(GI/GII)、轮状病毒(RV)，使用时，只需将样本核酸2μL加入到96孔板的相应反应孔中，即可上机进行检测，每块板可同时检测29个样本。
实施例3制备用于6种病原微生物检测的多重荧光定量PCR检测试剂盒(8联管5样本)
本发明用于6种病原微生物检测的多重荧光定量PCR检测试剂盒(见图2)，采用8联管的方式，每3条8联管可检测5个样本。检测试剂盒组成见表3。
表3多重荧光定量PCR检测试剂盒组成(8联管5样本)
组成成分 最小包装规格
8联管及管盖 3条，每孔含反应液23μL
阳性对照(6种) 5μL*6支
阴性对照 15μL*1支
本发明的试剂盒可以用于检测6种病原微生物：大肠埃希氏菌O157(EC)、沙门氏菌(SHA)、单核细胞增生李斯特氏菌(LIS)、金黄色葡萄球菌(JIN)、诺如病毒(GI/GII)、轮状病毒(RV)，使用时，只需将样本核酸2μL加入到8联管的相应反应孔中，即可上机进行检测。每个最小包装含3条8联管，可检测5个样本，适用于检测样本数量较少的场景。
实施例4制备用于6种病原微生物检测的多重荧光定量PCR检测试剂盒(8联管2样本)
本发明用于6种病原微生物检测的多重荧光定量PCR检测试剂盒(见图3)，采用8联管的方式，每2条8联管可检测2个样本。检测试剂盒组成见表4。
表4多重荧光定量PCR检测试剂盒组成(8联管2样本)
组成成分 最小包装规格
8联管及管盖 2条，每孔含反应液23μL
阳性对照(6种) 5μL*6支
阴性对照 15μL*1支
本发明的试剂盒可以用于检测6种病原微生物：大肠埃希氏菌O157(EC)、沙门氏菌(SHA)、单核细胞增生李斯特氏菌(LIS)、金黄色葡萄球菌(JIN)、诺如病毒(GI/GII)、轮状病毒(RV)，使用时，只需将样本核酸2μL加入到8联管的相应反应孔中，即可上机进行检测。每个最小包装含2条8联管可检测2个样本，适用于检测样本数量少的场景。
实施例5多重荧光定量PCR试剂盒用于样本的检测
(1)取模拟蔬菜样本29份，样本10#、12#、14#添加大肠埃希氏菌O157；样本03#、05#、25#、26#、27#添加单核细胞增生李斯特菌；样本13#、18#、20#、22#、23#添加沙门氏菌；样本04#、07#、28#添加金黄色葡萄球菌；样本29#添加轮状病毒核酸。制备成29份样本核酸。
(2)取实施例2的多重荧光定量PCR检测试剂盒(96孔板)一块，室温融化。
(3)将试剂盒中的6支阳性对照分别取2μL，分别加入到阳性对照孔中。
(4)将29份核酸样本，分别加入到待检孔中，每个样本加3个孔，每个孔加2μL。微生物样本的加样位置如图4所示。
(5)将阴性对照加入到3个阴性对照孔中，每个孔加2μL。
(6)盖好密封膜，离心混匀。
(7)上机运行。PCR程序为：95℃：30s；(95℃：10s；60℃：30s)45cycles。
(8)运行结束后，读取检测结果的Ct值。Ct>＝36，则检测结果为阴性；反之，则检测结果为阳性。
(9)检测结果见表5。
表5 29份样本的检测结果
Figure BDA0003439174350000101
Figure BDA0003439174350000111
结果显示：样本10#、12#、14#检出大肠埃希氏菌O157；样本03#、05#、25#、26#、27#检出单核细胞增生李斯特菌；样本13#、18#、20#、22#、23#检出沙门氏菌；样本04#、07#、28#检出金黄色葡萄球菌；样本29#检出轮状病毒。
实施例6多重荧光定量PCR试剂盒的最低检出限
以大肠埃希氏菌O157为例进行最低检测限的测定。取标准菌株(NCTC12900)，提取核酸，按照实施例4的方法进行检测。检测结果见图5和图6。从检测结果可以看出，多重PCR体系对大肠埃希氏菌O157的检出限约为100copies。样本中菌株数量低于此值时，将不能得到可靠的检测结果。
类似的，采用本发明的试剂盒对单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、诺如病毒、轮状病毒都进行了检出限测试，结果如图7-图11所示。由测试数据可以看出，在102-107copies的检测范围显示出良好的线性关系，相关系数R2均大于0.99，最低检测限可达到100copies。
实施例7多重荧光定量PCR试剂盒检测特异性和灵敏性
以大肠杆菌ATCC25922、大肠埃希氏菌O157(NCTC12900)为例进行检测特异性评价。取菌株，提取核酸，按照实施例4的方法进行检测。检测结果见图12和图13。
类似的，采用表皮葡萄球菌(CMCC(B)26069)、弗氏柠檬酸菌ATCC43864，大肠杆菌ATCC25922，产气肠杆菌ATCC13048，奇异变形杆菌ATCC49005、普通变形杆菌49027、阴沟肠杆菌ATCC35030，苏云金芽孢杆菌ATCC10792，英诺克李斯特菌ATCC33090，荧光假单胞菌、粘质沙雷氏菌ATCC14041、福氏志贺菌、宋氏志贺菌等作为干扰菌株，按照实例4的方法进行了测试。检测结果均显示了较好的特异性。结果如表6所示。
表6本发明体系检测结果的阳性符合率和阴性符合率统计
Figure BDA0003439174350000121
Figure BDA0003439174350000131
以上结果表明，本发明的检测方法和检测试剂盒的最低检出限为100copies，且特异性好，检测特异性100％，检测灵敏性100％，准确率100％，与其他微生物不存在交叉反应，符合设计要求。试剂盒的批内、批间精密度CV值均在5％以内，说明本试剂盒可大大提高病原微生物检测的准确性，并可充分保证检测结果的灵敏度及重复性。
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海市质量监督检验技术研究院
<120> 可同时检测多种微生物的多重荧光定量PCR检测方法和多重荧光定量PCR检测试剂盒
<130> 211185
<141> 2021-12-28
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcctcagcta tagggtgctt tg 22
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcgaaacaa ggccagtttt atac 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tatttttccg agtacattgg catcgtgtgg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggcgttgga gagtgata 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agcaatggaa aaagcaggat g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catttcttaa acggcggtgt ctttccct 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcttcacga ctaaataaac gctca 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtactacta aagattatca agacggct 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagaacacaa tgtttccgat ccaacgt 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgaatctca agcaaaacct ggt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcgaccgaa gccaacta 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtacgataac atccacggct ctggctgg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgctggatgc gnttccat 18
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<212> DNA
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ccttagacgc catcatcatt tac 23
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<212> DNA
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tggacaggag agcgcratct 20
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<212> DNA
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atgttcagrt ggatgagrtt ctcwga 26
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tcgacgccat cttcattcac a 21
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agcacgtggg agggcgatga 20
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<212> DNA
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ttcagctgac ggagcgacta 20
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ggctgcgcat ttgggaataa 20
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ctcatcaagt ggaacgacaa cctga 25
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acgcgaagaa ccttacctgg 20
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<212> DNA
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cccaacattt cacaacacga 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ctcacygttc ccgaaggcac att 23

Claims (5)

1.一种可同时检测多种微生物的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；
第二步，检测扩增产物的荧光信号；
第三步，以检测结果的Ct值判定样品中是否含有大肠埃希氏菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、诺如病毒GI、诺如病毒GII和轮状病毒；
其中，用于PCR扩增的反应体系中含有：扩增大肠埃希氏菌O157成分的特异性引物对和检测大肠埃希氏菌O157成分的特异性探针；扩增沙门氏菌成分的特异性引物对和检测沙门氏菌成分的特异性探针；扩增金黄色葡萄球菌成分的特异性引物对和检测金黄色葡萄球菌成分的特异性探针；扩增单核细胞增生李斯特氏菌成分的特异性引物对和检测单核细胞增生李斯特氏菌成分的特异性探针；扩增诺如病毒GI成分的特异性引物对和检测诺如病毒GI成分的特异性探针；扩增诺如病毒GII成分的特异性引物对和检测诺如病毒GII成分的特异性探针；扩增轮状病毒成分的特异性引物对和检测轮状病毒成分的特异性探针；以及内参引物对和探针；
所述扩增大肠埃希氏菌O157成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，检测大肠埃希氏菌O157成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.3所示；扩增沙门氏菌成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，检测沙门氏菌成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.6所示；扩增金黄色葡萄球菌成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，检测金黄色葡萄球菌成分的特异性探针的序列如SEQID NO.9所示；扩增单核细胞增生李斯特氏菌成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，检测单核细胞增生李斯特氏菌成分的特异性探针的序列如SEQ IDNO.12所示；扩增诺如病毒GI成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，检测诺如病毒GI成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.15所示；扩增诺如病毒GII成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，检测诺如病毒GII成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.18所示；扩增轮状病毒成分的特异性引物对的序列如SEQID NO.19和SEQ ID NO.20所示，检测轮状病毒成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.21所示，扩增内参引物对的序列如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示，检测内参探针的序列如SEQ ID NO.24所示。
2.一种可同时检测多种微生物的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：扩增大肠埃希氏菌O157成分的特异性引物对和检测大肠埃希氏菌O157成分的特异性探针；扩增沙门氏菌成分的特异性引物对和检测沙门氏菌成分的特异性探针；扩增金黄色葡萄球菌成分的特异性引物对和检测金黄色葡萄球菌成分的特异性探针；扩增单核细胞增生李斯特氏菌成分的特异性引物对和检测单核细胞增生李斯特氏菌成分的特异性探针；扩增诺如病毒GI成分的特异性引物对和检测诺如病毒GI成分的特异性探针；扩增诺如病毒GII成分的特异性引物对和检测诺如病毒GII成分的特异性探针；扩增轮状病毒成分的特异性引物对和检测轮状病毒成分的特异性探针；以及内参引物对和探针；
所述扩增大肠埃希氏菌O157成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，检测大肠埃希氏菌O157成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.3所示；扩增沙门氏菌成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，检测沙门氏菌成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.6所示；扩增金黄色葡萄球菌成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，检测金黄色葡萄球菌成分的特异性探针的序列如SEQID NO.9所示；扩增单核细胞增生李斯特氏菌成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，检测单核细胞增生李斯特氏菌成分的特异性探针的序列如SEQ IDNO.12所示；扩增诺如病毒GI成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，检测诺如病毒GI成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.15所示；扩增诺如病毒GII成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，检测诺如病毒GII成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.18所示；扩增轮状病毒成分的特异性引物对的序列如SEQID NO.19和SEQ ID NO.20所示，检测轮状病毒成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO.21所示，扩增内参引物对的序列如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示，检测内参探针的序列如SEQ ID NO.24所示。
3.如权利要求2所述的可同时检测多种微生物的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照，所述阳性对照包括载有大肠埃希氏菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、诺如病毒GI、诺如病毒GII和轮状病毒的特异基因序列片段的质粒。
4.如权利要求2所述的可同时检测多种微生物的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重荧光定量PCR检测试剂盒采用3孔联合检测方式，每一孔包含三个荧光通道，每个通道对应一种病原体，所述病原体包括大肠埃希氏菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、诺如病毒GI、诺如病毒GII和轮状病毒。
5.一种可同时检测多种微生物的多重荧光定量PCR检测试剂盒用于定性检测蔬菜中是否含有大肠埃希氏菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、诺如病毒GI、诺如病毒GII和轮状病毒中的应用。
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