KR20220034863A - 조류 무리에서 조류 병원성 이. 콜라이 (apec) 감염의 위험을 결정하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조류 무리에서 조류 병원성 이. 콜라이 (APEC) 감염의 위험을 결정하는 방법으로서, 조류 무리로부터 유래되는 풀링된 샘플에서, 이. 콜라이 참조 유전자인 ybbW (서열식별번호: 6) 또는 그의 기능적 단편의 양에 각각 대비한, 특정한 병독성 인자 (VF)의 양의 정량적 비를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 특정한 병독성 인자는 적어도 유전자 iroN (서열식별번호: 1) 및 ompT (서열식별번호: 2) 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.

Description

조류 무리에서 조류 병원성 이. 콜라이 (APEC) 감염의 위험을 결정하는 방법

본 발명은 조류 무리에서 APEC 감염의 위험을 결정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 조류 무리로부터 유래되는 풀링된 샘플에서, 이. 콜라이(E. coli) 참조 유전자의 양에 각각 대비한, 적어도 병독성 인자 iroN 및 ompT의 양의 정량적 비를 결정하는 것을 기반으로 한다.

대장균증은 전 세계적으로 가금류 생산에서 가장 큰 질환 및 사망 손실을 초래한다. 원인이 되는 병원체인 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)는 고도로 다양하기 때문에 APEC 진단 및 상기 병원체에 대한 백신 개발 둘 다가 복잡해진다. 이. 콜라이는 건강한 장내 마이크로바이옴의 필수적인 부분이며, 소위 APEC (조류 병원성 이. 콜라이)로 불리는, 특정 특성을 가진 균주만이 호흡기 문제, 난관 감염, 난황낭 염증 또는 두부 종창 증후군과 같은 다양한 임상 양상을 유발한다. 병원성 균주는 숙주에 침입하여 조직을 분해할 수 있는 병독성 인자를 가지고 있다. 이러한 병독성 인자 (VF)는 APEC 진단을 위한 잠재적 바이오마커이지만, 상이한 APEC 단리물에 따라 다양하며, 비-병원성 균주도 개별 VF를 보유할 수 있다. 따라서, APEC는 단일 VF로 진단될 수 없고, 마커 패널로 검출되어야 한다.

현행 진단 방법은 절개 후에 간, 비장 및 폐와 같은 내장 조직 중의 대장균증-전형적 병변으로부터 이. 콜라이를 선택적으로 단리하는 것을 기반으로 한다. 이어서, 단리물을 다양한 VF의 PCR-기반 검출에 의해 병원성 또는 비-병원성으로 분류한다.

그러나, 이러한 방법은 시간과 비용이 많이 소요될 뿐만 아니라, 전체 무리 APEC 상태에 대한 결론을 내릴 수가 없다. APEC와 비-APEC를 구별할 수 있게 허용하는 공지된 PCR 검정법은 일반적으로 최소 수의 VF에 대해 정의된 임계값을 가진 병독성 인자 세트의 검출에 의존한다. 이러한 방법의 예로는, 균주가 5개의 인자 중 최소 4개를 보유하게 되면 균주는 APEC인 것으로 정의되는 것인, 존슨(Johnson)에 의해 공개된 5-VF PCR이 있다 (Johnson, T. J., et al. (2008). "Identification of Minimal Predictors of Avian Pathogenic Escherichia coli Virulence for Use as a Rapid Diagnostic Tool." J Clin Microbiol 46(12): 3987-3996.).

그러나, APEC를 검출하거나 또는 APEC 위험을 결정하기 위한 신속하고 비침습적인 방법은 알려져 있지 않다. 전체 무리 평가를 위해, 풀링된 분변 무리 샘플로부터 수득된 DNA에서 APEC를 검출하는 방법이 특히 바람직할 것이다. (i) 콕시듐증은 난관염에서 두부 종창 증후군 (수막염)에 이르는 다양한 임상 증상을 유발하지만, 전형적으로는 장 염증 문제는 유발하지 않으며, 이는 분변 중 병원체의 검출을 불분명하게 만들고; (ii) 종에 대해 이루어진 부분적으로 불량한 유전적 분리로 인해 동일한 마커가 이. 콜라이 이외의 다른 여러 밀접한 관계가 있는 유기체에도 존재하는 바, APEC 병독성 인자는 일반적으로 비-순수 배양 샘플에서의 APEC 검출에는 적합하지 않기 때문에, 상기 방법을 개발하는 것이 특히 복잡하다 (Schouler, C., et al. (2012). "Diagnostic strategy for identifying avian pathogenic Escherichia coli based on four patterns of virulence genes." J Clin Microbiol 50(5): 1673-1678]; [Johnson, T. J., et al. (2008). "Identification of Minimal Predictors of Avian Pathogenic Escherichia coli Virulence for Use as a Rapid Diagnostic Tool." J Clin Microbiol 46(12): 3987-3996.). 또한, 선택된 병독성 인자는 분변 샘플에 함유된 다른 균주에도 존재할 수 있으며, 종합할 경우, 임계 수치 인자의 결과를 제공하게 된다. 따라서, 분변에서 APEC 병독성 인자의 간단한 PCR 검출을 통해서는 APEC 위험 또는 APEC 감염에 대해서 결론지을 수 없을 것이다.

상기의 관점에서, 본 발명의 목적은 저비용과 최소한의 노력으로 수행될 수 있는, 조류 무리에서의 APEC 감염 위험을 결정하기 위한, 빠르고, 신뢰할 수 있으며, 비침습적인 생체 인-프로세스 방법을 제공하는 것이었다.

본 목적은 조류 무리에서 조류 병원성 이. 콜라이 (APEC) 감염의 위험을 결정하는 방법으로서, 조류 무리로부터 유래되는 풀링된 샘플에서, 이. 콜라이 참조 유전자인 ybbW (서열식별번호(SEQ ID NO.): 6) 또는 그의 기능적 단편의 양에 각각 대비한, 특정한 병독성 인자 (VF)의 양의 정량적 비를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 특정한 병독성 인자는 적어도 유전자 iroN (서열식별번호: 1) 및 ompT (서열식별번호: 2) 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 것인 방법에 의해 해결된다.

본 발명자들은 예상외로 조류 무리에서의 APEC 감염의 위험은 상기 조류 무리로부터 유래되는 풀링된 샘플에서, 이. 콜라이 참조 유전자인 ybbW (서열식별번호: 6)의 양에 각각 대비한, 특정한 병독성 인자 iroN (서열식별번호: 1) 및 ompT (서열식별번호: 2)의 양의 정량적 비를 기반으로 하여 결정될 수 있다는 것을 밝혀내었다.

즉, 조류 무리로부터의 풀링된 샘플에 함유된 마커 유전자 iroN/ ybbW 및 ompT/ ybbW의 양의 조합된 정량적 비는 상기 조류 무리에 대한 APEC-위험 평가를 가능하게 한다. APEC-위험 평가는 APEC 감염 동안 colV 플라스미드에 코딩된 병독성 인자를 보유하는 클로날 병원성 균주가 우세해지고, 비-병원성 공생 이. 콜라이를 앞지르게 된다는 발견을 기반으로 한다. 상기 경우, VF/ybbW의 비는 질환이 진행되는 동안 유의학[ 증가할 것이며, 비-병원성 균주 또는 이. 콜라이가 아닌 균주에서의 VF 카운트는 무시해도 될 정도가 된다.

병독성 인자, 및 그의 기능적 단편은 각각 DNA 수준에서 검출된다. 이는 이. 콜라이 참조 유전자에도 동일하게 적용된다.

특정한 병독성 인자는 hlyF (서열식별번호: 3), iss (서열식별번호: 4), iutA (서열식별번호: 5) 중 적어도 하나, 또는 그의 기능적 단편을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 실시양태에서, 본 방법은 iroN/ ybbW 및 ompT/ ybbW의 양의 정량적 비 뿐만 아니라, hlyF/ ybbW, iss/ ybbW, 및 iutA/ ybbW의 양의 비 중 적어도 하나를 결정하는 것을 수반한다.

본 발명에 따른 APEC 병독성 인자 및 이. 콜라이 참조 유전자는 하기에 요약되어 있다:

본 발명에 따른 조류 무리는 바람직하게 가금류이다. 본 발명에 따른 바람직한 가금류는 닭, 칠면조, 오리 및 거위이다. 가금류는 어린 가축 생산을 위해 최적화될 수 있다. 이러한 유형의 가금류는 또한 부모 및 조부모 동물로도 지칭된다. 따라서, 바람직한 부모 및 조부모 동물은 (조)부모 육계, (조)부모 오리, (조)부모 칠면조 및 (조)부모 거위이다.

본 발명에 따른 가금류는 또한 팬시 가금류 및 야생 조류로부터 선택될 수 있다. 바람직한 팬시 가금류 또는 야생 조류는 공작, 꿩, 자고새, 뿔닭, 메추라기, 큰뇌조, 거위, 비둘기 및 백조이다. 본 발명에 따른 추가로 바람직한 가금류는 타조 및 앵무새이다. 본 발명에 따른 가장 바람직한 가금류는 육계이다.

조류 무리로부터 유래되는 풀링된 샘플은 바람직하게 조류 무리를 하우징하는 축사에서 수집된 환경 샘플이다. "환경 샘플"이라는 용어는 조류 무리 인근의 환경을 특징화하는데 충분하고, 무리의 축사 하우징에서 비침습적 방식으로 회수되는 샘플로 이해되어야 한다.

상기 환경 샘플의 예는 배설물 물질, 깔짚재, 공기 먼지 물질 또는 그의 조합이 있다. 일반적으로, "깔짚"이라는 용어는 침구재와 조류 배설물의 혼합물로 이해되어야 한다.

본 발명과 관련하여, "공기 먼지"라는 용어는 축사 하우징 내의 조류 무리 인근의 환경에서 발견되는 공기 중 부유 입자로서 이해되어야 한다.

공기 먼지 샘플은 공기 중 부유 입자 수집 장치 (전기식 또는 비-전기식)를 적용하여 회수되며, 하기 일반 단계; 샘플 세척, 임의적 세포 용해 및 DNA 정제, PCR을 위한 주형으로서 세척액, 용해물 또는 정제된 DNA 적용에 의해 프로세싱된다. 샘플 세척은 수집 베쓸, 필터, 스왑 또는 카트리지를 물 또는 10 mM TE 버퍼와 같은 중성 pH의 멸균 수용액으로, 또는 세포를 화학적으로 파괴시키고, 용액 중 뉴클레아제로부터 핵산을 안정화시키고, 보호하기 위해 카오트로픽 염을 함유하는 용해 버퍼로 플러딩하고, 인큐베이션함으로써 수행된다. 먼지 입자의 회수를 향상시키기 위해, 세척 중 진탕을 적용한다. 용해된 샘플은 수집 장치에서 회수되고, 샘플의 품질과 순도에 따라, PCR을 위한 주형으로서 바로 적용되거나, 또는 추가로 프로세싱된다. 샘플을 추가로 프로세싱하는 경우, 가열하여 용해시키고, 비드 비팅을 가하여 파괴시킨다. DNA 정제를 위해, 용해된 샘플을 바람직하게 표준 실리카 기반 DNA 추출 키트 또는 역 크로마토그래피, 페놀 클로로포름 이소아밀알콜 추출 또는 염석과 같은 DNA 추출을 위한 다른 방법에 적용할 수 있다. DNA 용출액은 PCR을 위한 주형으로서 사용된다.

바람직하게는, 환경 샘플은 배설물 물질, 특히 분변 물질이다.

분변 물질은 무작위로 수집된 개별 분변 샘플의 복합 샘플일 수 있다.

특정한 조류 무리로부터 채취하고자 하는 배설물 샘플은 이상적으로는 전체적으로 조류 집단을 대표하는 풀링된 샘플을 수득하기 위해 동물 하우스 내의 다수의 다른 개별 장소에서 채취된다.

샘플 크기 (즉, 채취하고자 하는 배설물 샘플의 수; 각 샘플은 동물 하우스 내의 특정한 장소에서 채취됨)는 실제 사육 밀도, 즉, 시험하고자 하는 조류 집단에 속하는 실제 동물 수를 고려하여 결정되어야 한다.

샘플 크기는 하기 공식을 사용하여 계산될 수 있다:

여기서

n₀은 샘플 크기 권장값이고,

Z는 95% 신뢰 수준의 경우 1.96이고,

p는 해당 속성을 가진 집단의 추정 비율이며, q는 1-p이고,

e는 십진수로 표현되는 신뢰 구간이다.

일반적으로, 대부분의 가축 조류 집단의 경우, 최소 80 내지 100개의 개별 배설물 샘플이면 충분하다. 육계는 일반적으로 한 하우스 내 > 20000마리의 조류로 이루어질 수 있는 무리로 사육된다.

한 예로서, 육계 무리가 20000마리의 동물로 이루어진 경우, 신뢰 수준이 95%일 때, 96개의 개별 샘플이 요구된다.

상기 공식은 큰 집단에 필요한 샘플 크기를 결정하는데 특히 적합하다.

더 작은 집단 (<= 100)의 경우, 상기 공식을 이용하여 구한 샘플 크기 권장값 n₀은 하기 공식에 따라 추가로 조정될 수 있다:

여기서

N은 집단 크기이고,

n은 조정된 샘플 크기이다.

단계 (a)에서 요구되는 풀링된 배설물 샘플 물질을 수득하기 위해, 여러 샘플링 방법이 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 풀링된 배설물 샘플은 체계적인 격자 샘플링 (체계적 무작위 샘플링)에 의해 수득할 수 있다. 상기 방법의 경우, 조류 집단이 사육되는 구역을 개별 배설물 샘플 수 (즉, 샘플 크기)에 기반하여 격자 패턴의 균일한 셀 또는 하위 구역으로 분할한다. 이어서, 무작위 샘플 수집 부위를 제1 격자 셀 내에서 확인하고, 제1 샘플을 상기 부위에서 채취한다. 마지막으로, 추가 샘플을 인접 셀로부터 순차적으로 - 예를 들어, 구불구불한, 각형 또는 지그재그 방식으로 - 각 셀 내의 동일한 상대 위치를 사용하여 수득한다. 무작위 개시점은 주사위 또는 난수 생성기로 얻을 수 있다.

상기 프로세스는 복제 샘플에 대해 임의적으로 반복될 수 있다. 즉, 모든 셀에서 반복되는 단일 수집 지점에 대해 새로운 무작위 위치가 확립된다. 복제 샘플을 분석함으로써, 원래 샘플에 의해 제공되는 평균 추정치의 가변성을 결정할 수 있다.

샘플 크기는 셀당 하나의 샘플을 채취하는 경우, 격자 패턴의 셀 수에 상응한다. 일반적으로, 셀당 x개의 샘플을 채취하는 경우, 샘플 크기는 셀 수를 x로 나눈 값이다.

체계적인 격자 샘플링 방법은 현장에서 쉽게 실행될 수 있다. 그렇게 함으로써, 하위 구역이 과대표시 또는 과소표시되는 것을 방지할 수 있다.

또 다른 샘플링 방법은 계층화된 무작위 샘플링 (즉, 격자 내의 무작위 샘플링)이다. 여기서 샘플은 인접한 격자 셀로부터 순차적으로 수득되지만, 각 셀 내의 샘플의 위치는 무작위이다.

대안적으로, 샘플은 동물이 사육되는 구역 전체에 걸쳐 (격자형성 없이) 무작위 위치로부터 채취되는 단순 무작위 샘플링에 의해 채취될 수 있다. 이러한 방법의 경우, 예컨대, 난수 생성기에 기반하여 무작위 샘플 위치를 결정하기 위한 공식적인 접근법이 사용되어야 한다.

샘플은 인접 격자 또는 유사한 장치를 사용하여 수동으로 수집할 수 있으며, 샘플 수집 베쓸 또는 튜브로 즉시 옮긴다.

대안적인 실시양태에서, 풀링된 배설물 샘플은 하우스의 모든 부분 또는 각 섹터에 대한 대표적인 샘플을 생성하게 되는 경로를 사용하여 하우스를 걸으면서 오버슈즈 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 상기 경로는, 예를 들어, 균일한 모양의 구불구불하거나, 또는 물결 모양의 선, 각진 선 또는 지그재그 선일 수 있다. 수분을 빨아들이기에 충분히 흡수성인 부츠 스왑이 특히 적합하다. 그러나, 튜브 거즈 삭스도 또한 허용된다.

적합한 샘플 부피는, 예를 들어, 0.1 내지 20 ml, 특히, 0.2 내지 10 ml, 바람직하게, 0.5 내지 5 ml이다. 적합한 샘플 질량은, 예를 들어, 0.1 내지 20 g, 특히, 0.2 내지 10 g, 바람직하게, 0.5 내지 5 g이다.

이렇게 수득한 샘플 물질은 사용된 사료 또는 깔짚재와 같은 이종성 성분을 포함할 수 있는 바, 균질화되어야 한다. 통상의 기술자는 적합하고, 일반적으로 사용되는 균질화 기술을 알고 있다.

균질화된 샘플 물질은 바람직하게 수성 버퍼로 희석되고, 안정화된다. 이 버퍼는 바람직하게는 버퍼 용액, 세제, 변성제 및/또는 착화제를 포함한다. 유리하게는, 상기 수성 버퍼 용액은 세포를 화학적으로 파괴시키고, 용액 중 뉴클레아제로부터 핵산을 안정화시키고, 보호하기 위해 카오트로픽 염을 포함한다. 임의적으로, 수성 버퍼 용액은 뉴클레아제 억제제를 추가로 포함한다.

희석된 샘플 물질 중에 함유된 세포 물질은 용해된다. 용해는 화학적 용해를 통해 또는 기계적 용해를 통해 수행될 수 있다. 화학적 용해 시약은, 예를 들어, 구아니디늄티오시아네이트이다. 기계적 용해는 샘플을 비드, 초음파 또는 울트라 트락스(ultra turrax)®로 처리함으로써 수행될 수 있다. 유리하게는, 용해 단계는 기계적 용해 처리 및 화학적 용해 처리 둘 다를 포함한다.

그 후, 핵산 물질은, 예를 들어, 자기 비드 추출에 의해 단리된다. 통상의 기술자는 추가 또는 대안적 핵산 단리 기술을 알고 있다.

병독성 인자의 검출 및 정량화는, 예를 들어, PCR, qPCR, 시퀀싱 또는 하이브리드화 기술을 통해, 바람직하게는 qPCR을 통해 수행될 수 있다.

정량화를 위해, 외부 보정 정량화 표준이 사용된다. 결과는 카피/μl (카피/g 분변)로 표시된다.

본 발명에 따른 qPCR-기반 검출 방법은 복수의 마커 또는 표적 유전자를 동시에 다중 증폭시키는 것을 포함할 수 있다. 크기가 중첩되지 않고, 동시에 분석될 수 있는 PCR 산물을 생성하기 위해 PCR 프라이머를 선택하는 것은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

본 발명은 적어도 병독성 인자 iroN, ompT 및 이. 콜라이 참조 유전자 ybbW를 증폭시키고 정량화하기 위한 올리고뉴클레오티드 (프라이머 및 프로브) 세트를 포함하는 환경 스크리닝 키트를 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 환경 스크리닝 키트는 적어도 iroN (서열식별번호: 1), ompT (서열식별번호: 2), 및 ybbW (서열식별번호: 6)를 검출하고 정량화하기 위한 프라이머를 포함하고 임의적으로 그를 위한 프로브를 포함한다. 상기 환경 스크리닝 키트는 추가로, hlyF (서열식별번호: 3), iss (서열식별번호: 4), iutA (서열식별번호: 5)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 검출하고 정량화하기 위한 프라이머를 포함할 수 있고 임의적으로 그를 위한 프로브를 포함할 수 있다. 키트는 버퍼 용액, 예컨대, PCR 버퍼; 마그네시아 염; 데옥시 뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP)를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 샘플 수집 튜브, 핵산 (DNA)을 단리하기 위한 시약, 또는 그의 사용 설명서와 같은 요소도 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 적용은, 예를 들어, (i) APEC 감염 위험 결정 또는 APEC 감염 진단을 지원하는 것, (ii) APEC 감염의 진행 또는 재발을 모니터링하는 것, 및 (iii) 치료를 받고 있거나 또는 치료가 고려되는 조류 무리에 대한 치료 효능 평가를 지원하는 것이다.

본 발명의 적용은 특히 체중 증가 및 사료 전환율과 같은 동물 성능에서의 손실을 방지하는데 도움이 된다.

도면의 간단한 설명

도 1: 이. 콜라이 돌발 무리 (레인 1.1-4.1), 건강한 무리 (레인 -K1.1- -K2.2) 및 음성 비-주형 대조군 (NTC)으로부터 수집된 분변 샘플로부터의 펜타플렉스 PCR 산물을 함유하는 아가로스 겔

도 2: 이. 콜라이 돌발 (레인 1-16), 양성 대조군 (+K, 양성 분변 DNA) 및 NTC (H2O)로부터의 분변으로부터 단리된 16개의 상이한 이. 콜라이 클론으로부터의 펜타플렉스 PCR 산물을 함유하는 아가로스 겔

도 3: 이. 콜라이 돌발 및 건강한 무리로부터의 분변 샘플에 대한 로그 개시 정량 (SQ)로 표시된 iss 및 iroN qPCR 결과 및 정량화 사이클 (Cq)로 표시된 ybbW qPCR 결과

도 4: 상이한 분변 현장 샘플, 양성 대조군 및 물 대조군 (NTC)으로부터의 펜타플렉스 PCR 산물을 함유하는 아가로스 겔

도 5: 11개의 현장 샘플 및 양성 대조군에 대한 정량화 사이클 (Cq)로 표시된 ybbW qPCR 결과

도 6: 이. 콜라이 돌발 무리 (레인 1-4), 2개의 양성 분변 샘플 (레인 5,6) 및 음성 비-주형 대조군 (NTC, 레인 7)으로부터 수집된 먼지 샘플로부터의 펜타플렉스 PCR 산물을 함유하는 아가로스 겔

하기에서, 본 발명은 비제한적인 예에 의해 및 실시양태를 예시함으로써 설명된다.

실시예

물질 및 방법

분변으로부터의 이. 콜라이의 단리

분변 샘플로부터의 이. 콜라이의 단리를 위해, 분변의 한 음영 지점을 10 ml 카세인-펩톤 소이밀-펩톱(Casein-Peptone Soymeal-Peptone) (CASO) 부이용(Bouillon)에 충전하고, 37℃에서 10 min 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 100 μl를 이. 콜라이용 선택 배지인 에오신 메틸렌 블루 (EMB) 아가에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새도록 인큐베이션하고, 이. 콜라이에 전형적인 녹색 금속 광택을 띠는 콜로니에 대해 조사하였다. 단리된 균주를 병독성 인자에 대해 스크리닝함으로써 추가로 특징화하였다 (하기 참조).

DNA 단리

분변 샘플로부터의 단리

분변 샘플을 스크린플록스(ScreenFloX)® PCR 샘플 수집 튜브 내에 충전하고, 스크린플록스 샘플 수집 튜브 및 핵산 추출 사용 설명서 (IFU)에 따라 전처리하였다. 전처리된 샘플로부터의 핵산 추출은 스크린플록스® PCR 핵산 추출 키트를 사용하여 IFU에 따라 수행하였다.

박테리아 배양물로부터의 단리

박테리아로부터의 핵산 추출은 그의 표준 배지 중 유기체의 밤새 배양물을 사용하여 수행하였다. 600 μl의 밤새 배양물을 스크린플록스® PCR 핵산 추출 키트로부터의 600 μl 용해 버퍼와 함께 70℃에서 20 min 동안 인큐베이션하였다. 500 μl의 용해된 배양물을 DNA 추출을 위해 스크린플록스® PCR 핵산 추출 키트를 사용하여 IFU에 따라 적용하였다.

펜타플렉스 PCR

샘플을 조합된 PCR 반응에서 하기 프라이머를 적용하여 문헌 [Johnson (2008)]으로부터의 방법에 따라 5개의 APEC 병원성 마커의 존재에 대해 시험하였다:

표 1 펜타플렉스 PCR을 위한 프라이머 및 앰플리콘 크기 (Johnson 2008)

푸시온 하이-피델리티 DNA 폴리머라제(Phusion High-Fidelity DNA Polymerase) (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))을 사용하여 PCR을 수행하였다. 각 반응은 하기 표에 따라 셋업하였다:

표 2 펜타플렉스 PCR을 위한 반응 셋업

표 3에 따라 써모 사이클러에서 증폭을 수행하였다:

표 3 펜타플렉스 PCR을 위한 써모 사이클링 프로그램

증폭된 샘플을 2% 아가로스 겔에서 분석하였다. 문헌 [Johnson (2008)]을 참조하여, 이. 콜라이 균주가 5개의 병독성 인자 중 적어도 4개를 보유하게 되면 이. 콜라이 균주는 APEC 균주로 분류하였다.

iss 및 iroN qPCR

2개의 APEC 표적 iss 및 iroN에 대한 정량적 실시간 PCR (qPCR)을 개발하였다. 상기 검정법 둘 다가 100-105%의 PCR 효율 및 10 내지 10⁸ 카피/μl의 선형 범위를 보여주었다. 상기 표적 둘 다를 검출하기 위해 하기 프라이머 및 프로브를 디자인하였다:

표 4 iss 및 iroN qPCR을 위한 프라이머 및 프로브

표 5에 따라 iTaq™ 유니버셜 프로브즈 슈퍼믹스(iTaq™ Universal Probes Supermix) (바이오-래드(Bio-Rad))를 사용하여 qPCR 반응을 셋업하였다:

표 5 iss 및 iroN qPCR을 위한 반응 셋업

모든 채널 검출 하에 하기 사이클링 프로토콜을 사용하여 바이오-래드 CFX96 사이클러에서 qPCR을 수행하였다:

표 6 iss 및 iroN qPCR을 위한 사이클링 프로토콜

각 실행은 10 내지 10⁴ 카피/μl 범위의 표적의 기지의 농도를 갖는 정량화 표준을 함유하였다. 표준 곡선을 사용하여 각 샘플에서 정량화 사이클 (Cq)로부터 iss 및 iroN의 농도를 계산하였다.

ybbW qPCR

이. 콜라이 ybbW 참조 유전자에 대한 qPCR은 워커(Walker) 등에 의해 공개된 방법에 따라 수행하였다 (Walker, D. I., et al. (2017). "A highly specific Escherichia coli qPCR and its comparison with existing methods for environmental waters." Water Research 126: 101-110). 하기 공개된 프라이머를 사용하였다:

표 7 ybbW qPCR을 위한 프라이머 (Walker 2017)

하기 표에 따라 iTaq™ 유니버셜 SYBR® 그린 슈퍼믹스(iTaq™ 유니버셜 SYBR® Green Supermix) (바이오-래드)를 사용하여 qPCR 반응을 셋업하였다:

표 8 iss 및 iroN qPCR을 위한 반응 셋업

SYBR 채널 검출 하에 하기 사이클링 프로토콜을 사용하여 바이오-래드 CFX96 사이클러에서 qPCR을 수행하였다:

표 9 ybbW qPCR을 위한 사이클링 프로토콜

본 검정법의 경우, 정량화 표준을 사용하지 않았으며, 따라서, 결과는 오직 정량화 사이클 (Cq)에 의해서만 해석되었다. Cq가 높을수록, 반응에서 표적의 개시 정량 (SQ)은 더 낮으며, 이에 의해, 3개 Cq의 차이는 SQ 대략 1 로그 차이와 같다.

결과 및 논의

APEC 돌발로부터의 분변 샘플

펜타플렉스 PCR

분변 샘플은 APEC 돌발로 진단을 받아 다발성 관절염 진단을 받은 독일의 상업적 육계 무리로부터 수집하고, 어떤 임상 징후도 보이지 않는, 같은 농장으로부터의 상업적 무리로부터 수집된 샘플과 비교하였다. 샘플을 APEC 펜타플렉스 PCR (Johnson, 2008)로 평가하였다. 생성된 아가로스 겔은 도 1에 도시되어 있다. 돌발 무리로부터 받은 4개의 분변 샘플 (레인 1.1-4.1)에서 5개의 모든 APEC 표적이 뚜렷이 검출되었다. 건강한 무리로부터의 샘플의 경우, 밴드는 없거나 또는 단지 매우 희미한 밴드만이 가시적이다. 음성 대조군은 어떤 PCR 증폭도 보이지 않았다.

상기 결과로부터, 공개된 APEC 병독성 인자는 비록 장 문제는 없지만, 다발성 관절염이 진단되었음에도 불구하고, 이. 콜라이 단리물의 특징화 뿐만 아니라, 감염된 조류의 분변 샘플에서 단리된 DNA의 병독성 인자 검출에도 사용될 수 있다는 것을 분명히 알 수 있다. 또한, 이 샘플 세트에 대해 감염된 무리와 건강한 무리의 분변 샘플을 명확하게 구별할 수 있다.

이. 콜라이 클론의 병독성 인자 유형분석

5개의 VF를 모두 함유하는, 돌발 무리로부터 수집된 분변 샘플을 추가로 분석하였다. 상기 샘플로부터 단리된 단일 콜로니의 VF 유형분석에 의해, 하기를 평가하였다:

전체 분변 DNA에서 발견되는 병독성 인자가 인자의 서브세트를 보유하는 상이한 균주로부터 기원한 것인지 여부, 또는

5개 인자 모두를 보유하는 단일 병원성 균주로부터 기원한 것인지 여부.

이. 콜라이를 선택 배양에 의해 단리하고, 균주의 서브세트를 문헌 [Johnson (2008)]으로부터의 분류 체계에 따라 병독성 인자 유형분석에 적용하였다.

전반적으로, 16개의 분변 단리물을 스크리닝하였고, 16개의 단리물 중 단 1개 (6.25%)만이 양성 결과를 보였다 (도 2, 레인 9). 5개 마커 모두 상기의 한 단리물에서 고도로 양성인 것으로 검출되었다. 문헌 [Johnson (2008)]의 APEC 특징화에 따라, 오직 상기 클론만이 조류 병원성 균주인 것으로 정의된다. 다른 모든 단리물은 비-병원성이다.

이. 콜라이 단리물의 병독성 인자 유형분석으로부터, 전체 분변 DNA에서 검출되는 5개의 병독성 인자는 아마도 병독성 유전자 모두를 보유하고, 조류에서 감염을 유도할 수 있는 단일 병원성 균주로부터 기원하는 것일 수 있다는 것이 분명해진다. 단 3개 이하의 인자를 보유하는 균주는 없고, 그 결과, 함께 추출하였을 때 인자의 총 카운트는 5개인 것으로 나타났다. 4개 미만의 유전자를 보유하되, 함께 분석되었을 때에는 4개 이상의 양성 APEC VF인 결과를 초래하는 여러 균주로 인해 위양성 검출이 전체 분변 DNA를 평가하는데 있어 높은 위험을 제공하기 때문에, 이러한 발견은 중요하다.

iss , iroN 및 ybbW qPCR

이. 콜라이 돌발 및 건강한 무리로부터 수집된 동일한 분변 샘플을 상기 기술된 qPCR 검정법을 이용하여 그의 iss, iroN 및 ybbW 로드에 관하여 분석하였다. iss 및 iroN의 로그 개시 정량 및 ybbW의 Cq에 대한 결과가 도 3에 제시되어 있다.

iss는 오직 돌발 (1.1-4.1)로부터의 샘플에서만 검출된 반면, iroN은 모든 샘플에서 관찰되었지만, 건강한 무리 (-K1.1- -K2.2)로부터의 샘플에서 로드는 대략 100x 더 낮은 것으로 나타났다. 이. 콜라이 참조 유전자 ybbW가 검출되었는데, 2개의 샘플 기원에 걸쳐 Cq 변동은 유의적이지 않은 것으로 나타났으며 (표준 편차 1.22 Cq), 이는 상이한 샘플 중 상기 유전자의 존재비의 변동성은 낮다는 것을 시사한다.

본 qPCR 분석으로부터의 결과는 제안된 검정 디자인과 관련된 중요한 발견을 나타낸다. 이. 콜라이 참조 마커 ybbW는 건강한 무리로부터, 및 감염된 이. 콜라이 무리로부터의 분변 샘플에 유사한 존재비로 발견된 반면, APEC 병원성 인자 iss 및 iroN의 농도는 돌발 샘플에서 유의하게 증가한다. 결과적으로, 병원성 이. 콜라이 균주의 양은 APEC 발병 동안 증가하는 반면, 이. 콜라이의 전체 로드는 일정한 것으로 보인다. 분변 샘플 중의 전체 이. 콜라이에 대한 병원성 균주의 정량적 관계를 통해 APEC 감염 위험이 높은 무리를 확인할 수 있거나, 또는 성능 손실이 발생할 때, APEC 돌발을 확증할 수 있다.

현장 및 시험 샘플의 분석

살모넬라(Salmonella) 및 캄필로박터(Campylobacter) 시험으로부터의 샘플

살모넬라 및 캄필로박터 감염 시험으로부터의 분변 샘플을 APEC 펜타플렉스 PCR로 분석하였다. 각 군 (살모넬라 감염됨, 비-감염됨 및 캄필로박터 감염됨)으로부터 동일한 시험일의 단일 조류 샘플 형태로 12개의 생물학적 복제물을 펜타플렉스 PCR로 시험하였다.

본 결과는 표 10에 제시되어 있다.

전반적으로, 5개의 병독성 인자는 시험된 샘플에 매우 풍부하게 존재하였다 (샘플 중 81%가 5개 VF 모두 함유하였다). 흥미롭게도, 단 4개 이하의 VF를 함유한 샘플은 없었다. 또한, APEC 양성 조류의 더 높은 분량이 살모넬라 및 캄필로박터 감염 군에서 관찰되었다 (VF 카운트가 ≥ 4인 모든 샘플은 APEC 양성인 것으로 간주되었다).

표 10 살모넬라 및 캄필로박터 감염 시험으로부터 받은 36개의 단일 조류 분변 샘플에서 요약된 APEC VF 카운트

본 결과는 APEC 존재비와 다른 질환, 예컨대 살모넬라증 또는 캄필로박터증 사이의 관계를 나타낸다. 문헌에서는, 대장균증이 또 다른 병원체에 의한 1차 감염에 걸린 면역 억제된 조류에서 발생하는 2차 감염으로 종종 기술되어 있다 (Schouler, C., et al. (2012). "Diagnostic strategy for identifying avian pathogenic Escherichia coli based on four patterns of virulence genes." J Clin Microbiol 50(5): 1673-1678).

현장 샘플

건강 상태가 알려지지 않은 상업적 미국 육계 무리로부터의 분변 현장 샘플을 APEC 마커 존재비 뿐만 아니라, 그의 ybbW 로드에 관하여 분석하였다.

APEC 펜타플렉스 PCR로부터의 증폭물을 함유하는 생성된 아가로스 겔은 도 4에 제시되어 있다. 5개의 병독성 인자 모두 11개의 모든 샘플에서 발견되었지만, 밴드 강도의 차이로 제시되는 바와 같이 상이한 정량이 증폭되었다. ybbW 또한 모든 샘플 (도 5)에서 다소 낮은 변동으로 검출되었다. Cq의 최대 차이는 대략 3이었으며, 이는 1 로그 차이의 카피수와 같다.

현장 및 시험 샘플 분석으로부터의 결과는 모든 APEC VF 뿐만 아니라, ybbW 참조 유전자도 육계 분변 샘플에 매우 풍부하게 존재하지만, 특히, APEC VF의 경우, 농도 차이가 관찰된다는 것을 강조한다. 따라서, VF 세트를 정량화하지 않고, 오직 검출만 하면, VF는 적어도 낮은 농도로도 높은 유병률로 존재하기 때문에, 감염된 무리와 비-감염된 무리를 구별할 수 없다. 그러나, APEC 인자의 수치적 카운트 뿐만 아니라, 인자 농도와 전체 이. 콜라이 로드와의 관계를 허용하는 정량적 방법을 통해 무리의 APEC 위험에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.

ybbW qPCR의 포괄성 및 독점성 시험

이. 콜라이 참조 유전자로서 ybbW 유전자의 적합성을 평가하기 위해, 샘플 물질 (육계 분변)에 존재할 것으로 추정되는 간섭 유기체와의 교차 반응성을 시험하였다. 또한, PCR의 민감도를 확인하기 위해, 닭으로부터의 여러 상이한 이. 콜라이 단리물을 ybbW의 존재에 대해 시험하였다. 결과는 표 11에 열거되어 있다.

이. 콜라이 이외의 다른 유기체를 ybbW 유전자에 대해 시험하였을 때, 거의 모든 유기체의 경우, 비특이적인 증폭이 발생하였다. 용융 피크 및 서열 분석에 의해 SYBR qPCR 반응의 특이성을 평가하였다. 시험된 모든 이. 콜라이 균주는 ybbW의 특이적인 증폭을 보였다.

표 11 ybbW qPCR의 포괄성 및 독점성 시험

이러한 ybbW의 포괄성 및 독점성은 ybbW가 이. 콜라이에서만 발견되고, 살모넬라와 같은 관련 종에서는 발견되지 않는다는 문헌 [Walker (2017)]의 발견을 확증한다.

결론

선택된 5개의 APEC VF는 심지어 비-정량적 PCR 반응에서도 분변 샘플 중에 매우 풍부하게 존재하며, 민감도가 더 높은 qPCR 접근법에서는 더욱 더 우세하게 존재할 수 있는 가능성이 있다.

5개의 VF의 농도 차이는 심지어 비-정량적 펜타플렉스 PCR 경우에서도 가시적이며, 이를 통해 APEC 감염된 무리 및 건강한 무리로부터의 분변 샘플을 뚜렷이 구별할 수 있다.

APEC 감염된 무리로부터의 분변 샘플의 경우, 5개의 VF가 5개 인자 모두를 보유하는 단일 병원성 균주(들)로부터 기원하였다는 것이 확증되었다.

ybbW는 이. 콜라이 균주에서 독점적으로 발견되었고, 독일 및 미국의 상업적 육계 무리로부터의 상이한 분변 샘플 중에서 유사한 농도를 보였는 바, 이에 이. 콜라이에 적합한 참조 유전자이다.

이러한 결과를 기반으로 하여, 분변 샘플 중 APEC VF 세트의 비-정량적 검출을 통해서는 감염된 무리와 비-감염된 무리를 구별할 수 없는데, 이는 VF가 적어도 낮은 농도로도 육계 분변에 높은 유병률로 존재하기 때문이다. APEC 인자의 수치적 카운트 뿐만 아니라, 절대 VF 농도와 전체 이. 콜라이 (ybbW 형태) 로드와의 관계를 허용하는 정량적 방법을 통해 무리의 APEC 위험에 대한 통찰력을 제공할 수 있거나, 또는 성능 손실이 발생할 때, APEC 돌발을 확증할 수 있다. 상기 검정법은 육계 무리에서의 APEC 진단을 촉진시키고, 가속화하며, 전체 무리 분석을 가능하게 한다.

상이한 국가 및 기원 종으로부터의 이. 콜라이 단리물 중의 APEC VF 및 이. 콜라이 참조 유전자의 존재

APEC 병독성 인자 및 이. 콜라이 참조 유전자를 평가하는 동안, 상이한 국가로부터 기원하는 가금류 기관 또는 도체로부터 단리된 10개의 상이한 야생형 이. 콜라이 균주를 5개의 APEC 마커의 존재 및 ybbW 참조 유전자의 정량에 관하여 분석하였다 (표 13). 모든 균주는 유사한 농도/Cq 그러나 5개의 VF의 상이한 카운트를 갖는 참조 유전자를 함유하였다. 4/5 또는 3/5 APEC VF를 나타낸 모든 균주에는 ompT 유전자 또는 ompT 및 iroN 유전자가 결핍되어 있었다. 또한, 균주 5를 제외한 모든 균주는 hlyF 및 iss를 함유하였다.

표 13 상이한 국가 및 기원 종으로부터의 이. 콜라이 단리물 중의 APEC VF (펜타플렉스 PCR) 및 이. 콜라이 참조 유전자의 존재

상기 균주 서브세트에 기반하여, iroN 호출은 4/5 양성 VF와 연관이 있고, ompT 및 iroN 둘 다의 호출은 5/5 양성 VF과 연관이 있으므로, 표적 ompT 및 iroN을 분석하는 것만으로 충분하다.

공기 먼지 샘플에서의 APEC 검출

축사내 4개의 상이한 지점에 페트리 디쉬를 배치하고, 이를 그 위치에서 대략 1 h 동안 인큐베이션함으로써, 다발성 관절염 진단을 받은, APEC 돌발에 걸린 독일의 상업적 육계 무리로부터의 공기 먼지 샘플을 수집하였다. 디쉬에 모아진 먼지를 멸균 스왑으로 수집하고, 스크린플록스® PCR 핵산 추출 키트로부터 800 μl 용해 버퍼, 5개의 지르코니아 비드 (직경 2 mm) 및 1개의 유리 비드 (직경 6 mm)로 충전된 2 ml 튜브에 배치함으로써 핵산 추출에 적용하였다. 각 샘플을 70℃에서 20 min 동안 인큐베이션하고, 20 Hz로 15 min 동안 수평 혼합하고, 2000 g로 5 min 동안 원심분리하였다. 전처리된 샘플 500 μl를 DNA 추출을 위해 스크린플록스® PCR 핵산 추출 키트를 사용하여 IFU에 따라 적용한 후, 펜타플렉스 PCR로 분석하였다.

생성된 아가로스 겔은 도 6에 제시되어 있다. 비록 공기 먼지 샘플 (레인 1-4)이 양성 분변 샘플 (레인 5)과 비교하였을 때, 매우 희미한 PCR 산물 밴드를 나타내었지만, 4개의 먼지 샘플 중 적어도 3개 (레인 2-4)에서 더 큰 3개의 APEC 병독성 인자 iroN, ompT 및 hlyF는 가시적이고, NTC (레인 7)와 구별이 된다. 또한, 크기가 더 작은 (대략 300 bp) 산물 1 또는 2개가 감지될 수 있다.

본 실험은 비록 적용된 수집 방법으로 인해 단지 소량의 먼지만이 입력되었지만, 공기 먼지 샘플 중의 APEC VF 검출이 가능하다는 것을 보여주는 것이다. 본 접근법의 민감도는 공기 샘플 수집용으로 개발된 장치를 적용함으로써, 그 결과로 유의하게 더 많은 샘플이 입력됨에 따라 쉽게 개선될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Evonik Operations GmbH <120> Method for determining the risk of an avian pathogenic E. coli (APEC) infection in an avian flock <130> 201800130 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2178 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgagaatta acaaaatcct ctggtcgcta actgtgctcc tggttgggtt gaatagccag 60 gtatcagtag ccaaatcctc cgacgatgat aatgacgaga ctctggtggt ggaagccacc 120 gctgagcagg tattaaaaca gcagccgggc gtgtcggtta ttaccagcga ggatattaaa 180 aagacccctc cggtaaacga cctttcagat attattcgta aaatgcctgg cgtcaatctt 240 accggcaata gcgcctcggg cacacgcggt aacaaccgcc agatcgatat tcgtggtatg 300 gggccggaaa acaccttaat tttaattgat ggtgtaccgg tgacgtcacg taactccgtg 360 cgttatagct ggcgtggaga gcgtgatacc cgcggtgaca ccaactgggt gccaccggaa 420 caggttgagc gtattgaagt gatccgcggc cctgcggcgg cgcgctacgg ttcgggggca 480 gccggggggg tggtgaacat cattaccaaa cgtcccacca acgactggca cggttcgctg 540 tcgttataca ccaatcagcc ggaaagtagc gatgagggcg ctacgcgtcg cgccaatttc 600 agccttagtg ggcctctggc tggtaatgct 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ggttttaacc tcactgcgtt ttcagtaact ctggtggccg ttattttatc tcttggcggt 1320 aagtttattc actttatgga accgttatcg cgtgtttcat ggtttgtcgg cgtcatcgtc 1380 gcctttgcgg cctacgcctt attaaagaaa cgtacaacag cagaaaaaac aggagagcaa 1440 aaaaccatag gttaa 1455 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 7 aatccggcaa agagacgaac cgcct 25 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 8 gttcgggcaa cccctgcttt gacttt 26 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 9 tcatcccgga agcctccctc actactat 28 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 10 tagcgtttgc tgcactggct tctgatac 28 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 11 ggccacagtc gtttagggtg cttacc 26 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 12 ggcggtttag gcattccgat actcag 26 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 13 cagcaacccg aaccacttga tg 22 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 14 agcattgcca gagcggcaga a 21 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 15 ggctggacat catgggaact gg 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 16 cgtcgggaac gggtagaatc g 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 17 gcgcactgat ttgagaatga 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 18 cttcctctac cagcctgacg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Probe <400> 19 cgatccgcag cagagccaga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 20 cgggaattgg acaagagaaa 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 21 atatacccgg gcttccaaac 20 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Probe <400> 22 atgcagccaa aatttgtggc gg 22 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 23 tgattggcaa aatctggccg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Primer <400> 24 gaaatcgccc aaatcgccat 20

Claims (10)

1. 조류 무리에서 조류 병원성 이. 콜라이(E. coli) (APEC) 감염의 위험을 결정하는 방법으로서,
   조류 무리로부터 유래되는 풀링된 샘플에서, 이. 콜라이 참조 유전자인 ybbW (서열식별번호: 6) 또는 그의 기능적 단편의 양에 각각 대비한, 특정한 병독성 인자 (VF)의 양의 정량적 비를 결정하는 것을 포함하며,
   여기서 특정한 병독성 인자는 적어도 유전자 iroN (서열식별번호: 1) 및 ompT (서열식별번호: 2) 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 것인
   방법.
2. 제1 2항에 있어서, 특정한 병독성 인자가 hlyF (서열식별번호: 3), iss (서열식별번호: 4), iutA (서열식별번호: 5)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자, 또는 그의 기능적 단편을 추가로 포함하는 것인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조류 무리로부터 유래되는 풀링된 샘플이 조류 무리를 하우징하는 축사에서 수집된 환경 샘플인 방법.
4. 제3항에 있어서, 환경 샘플이 배설물 물질, 깔짚재, 공기 먼지 물질, 또는 그의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 환경 샘플이 배설물 물질인 방법.
6. 제5항에 있어서, 배설물 샘플 물질이 분변 물질인 방법.
7. 제6항에 있어서, 분변 물질이 무작위로 수집된 개별 분변 샘플의 복합 샘플인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 이. 콜라이 참조 유전자 및 APEC 병독성 인자가 qPCR을 통해 검출되고 정량화되는 것인 방법.
9. 적어도 iroN (서열식별번호: 1), ompT (서열식별번호: 2), 및 ybbW (서열식별번호: 6)를 검출하고 정량화하기 위한 프라이머를 포함하고 임의적으로 그를 위한 프로브를 포함하는 환경 스크리닝 키트.
10. 제9항에 있어서, hlyF (서열식별번호: 3), iss (서열식별번호: 4), iutA (서열식별번호: 5)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 검출하고 정량화하기 위한 프라이머를 추가로 포함하고 임의적으로 그를 위한 프로브를 추가로 포함하는 환경 스크리닝 키트.

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