CN106636126A - 水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420及其应用 - Google Patents

水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420及其应用，所述水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420是水稻种子休眠性调控基因；LOC_Os01g50420基因变异材料具有一定休眠性，在农业生产中具有抗穗发芽能力。本发明提出的水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420，调控种子休眠性，可用于解决水稻穗发芽问题，生产应用方便。本发明明确了LOC_Os01g50420调控穗发芽的功能，提供了改良穗发芽抗性的新途径。

Description

水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420及其应用
技术领域
本发明涉及水稻基因及其应用技术领域，尤其涉及一种水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420及其应用。
背景技术
穗萌或穗发芽(preharvest sprouting)，是种子在收获前遇到阴雨天气或高温潮湿环境条件时在母体植株上发芽的现象。一旦出现穗发芽，种子储存物大量消耗，直接导致减产；甚至造成加工品质、营养品质、食用品质和种子活力下降，失去商用价值。水稻是重要的粮食作物，是我国第一大粮食作物。穗发芽对水稻生产造成不同程度的危害。我国稻米主产区的长江流域和华南一带，早籼稻的收获季节正好赶上当地的梅雨季节，高温、高湿的环境条件更易导致穗发芽。据资料统计，我国水稻每年因穗发芽造成的损失率达5％以上，严重影响早稻稻谷的产量和品质。我国南方杂交稻的制种过程中，广泛使用赤霉素，削弱了种子休眠性，加上收获季节的高温高湿条件，穗发芽现象严重。因此，研究解决水稻穗发芽抗性问题对促进水稻生产、确保我国的粮食安全有重大意义。
穗发芽抗性与种子休眠性密切相关。目前通过资源筛选并进行遗传分析，已经定位了大量休眠性数量性状位点(QTL)，但只有少数几个被克隆。因此能应用于实际生产的基因非常少。现已克隆的休眠性相关基因有的影响其它农艺性状，如qSD1-2；有的功能性标记不明确，如sdr4；造成生产应用不方便。我们在研究水稻穗发芽性状时发现过表达LOC_Os01g50420基因促进水稻穗发芽，在资源材料中找到的该基因变异材料抗穗发芽。因此该基因具有调控水稻穗发芽的功能。提高种子休眠性，解决水稻穗发芽问题是水稻生产中的一个重要研究方向。基于上述问题及发现，本发明提出了水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420及其应用。
发明内容
本发明的目的：第一是提供一种水稻穗发芽调控基因LOC_Os01g50420，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；第二个是提供一种水稻穗发芽调控蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，由SEQIDNO.1编码；第三个是提供基因LOC_Os01g50420应用于改善水稻抗穗发芽能力。
水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420是水稻种子休眠性调控基因；
所述水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420变异材料，在编码区第1377位碱基由A突变为T，导致第459位氨基酸由亮氨酸突变为苯丙氨酸，休眠性分析实验表明这些材料都具有一定休眠性，生产中具有抗穗发芽能力，将发生这种突变的基因型记为LOC_Os01g50420-T，是休眠型基因，自然材料中也可能存在其它LOC_Os01g50420休眠型变异。
优选的，所述水稻基因LOC_Os01g50420包含SEQNO.1所包含的核苷酸序列或其互补序列。
优选的，所述通过功能标记辅助筛选休眠型材料的后代，选择具有休眠型LOC_Os01g50420基因的后代。
优选的，所述功能标记辅助筛选的具体操作方法为：以含LOC_Os01g50420-T基因材料作为亲本进行杂交，在后代中扩增包含编码区1377位的DNA片段，测序扩增产物；依据测序结果筛选含LOC_Os01g50420-T基因的材料，再从这些后代中选择具有优异农艺性状的材料，最后筛选具有LOC_Os01g50420-T基因的纯合材料，该材料的种子休眠性提高，具有抗穗发芽特性，也可在LOC_Os01g50420附近开发连锁标记，用连锁标记辅助筛选LOC_Os01g50420休眠型基因。
优选的，所述的水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420，通过基因编辑技术编辑LOC_Os01g50420基因，破坏LOC_Os01g50420基因功能，获得的后代具有抗穗发芽表型。
优选的，所述基因编辑技术的具体操作方法为：
A、敲除载体构建：参照CRISPR/Cas9编辑技术，选定靶标序列，根据靶标序列合成引物，通过PCR合成表达盒DNA片段，再利用边切边接法，把表达盒插入多靶点载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H，测序验证其表达盒序列正确；
B、采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法将敲除载体转入易穗发芽材料，转化T0代，用潮霉素溶液浸泡叶片的办法进一步确认阳性单株；
C、提取阳性单株DNA，扩增靶标序列上下游300bp的区段，测序，以野生型为参照，选择LOC_Os01g50420基因突变株，繁种，自交得到T1代株系，经PCR扩增检测筛选没有潮霉素标记的植株，再测序分析靶标序列附近区段DNA，筛选LOC_Os01g50420基因变异纯合株，该材料具有抗穗发芽特性。
优选的，所述扩增操作的具体条件为：提取植株DNA，以此为模板，用引物pkF和pkR进行PCR扩增，其中pkF：5'-AGAGTTCGCGGTGATATGCC-3'，pkR：5'-GTGCGAGATCACGAGAGAGGA-3'，PCR所用的聚合酶为KODFX，反应体系为25uL，按照KODFX的说明书配制PCR反应体系，反应条件为：94℃5min；94℃30sec，59℃30sec，68℃30sec，32个循环；68℃5min，PCR扩增获得约510bp的片段。
本发明通过试验证明，LOC_Os01g50420的变异后代具有明显的种子休眠性，表现出抗穗发芽的潜力；过表达LOC_Os01g50420导致穗发芽现象增加，由此说明，本发明的基因LOC_Os01g50420是水稻穗发芽调控基因。
本发明相比于现有技术，其有益效果如下：
1.本发明提供了利用ubi启动子过表达基因LOC_Os01g50420的水稻转化载体，该载体转化水稻后能大幅提高基因LOC_Os01g50420的表达量(图1)，伴随着表达量的提高，转化植株的成熟后期穗发芽现象有明显的提高，并且转基因植株在生长状态及农艺性状上没有明显的改变，因此明确了LOC_Os01g50420调控穗发芽的生物学功能。
2.本发明首次证明了水稻基因LOC_Os01g50420是水稻穗发芽调控基因，本发明在资源材料中筛选到的LOC_Os01g50420变异材料都有明显的种子休眠性(表1)，具有抗穗发芽的能力。
附图说明
图1 LOC_Os01g50420过表达株系种子mRNA表达分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
案例一：
本发明提出的水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420，是水稻种子休眠性调控基因。统计分析3000份种质材料中LOC_Os01g50420基因的变异，其中编码区第1377位SNP可能影响其功能(把这种基因型记为LOC_Os01g50420-T)。这种类型变异材料很少，约占9.6％，这类材料大多分布于南亚地区。我们从自有的种质资源中筛选到5份LOC_Os01g50420-T型种质，这5份材料的休眠性均较强(表1)。
通过功能标记辅助筛选休眠型材料的后代，选择具有LOC_Os01g50420-T休眠型基因的后代，具体操作方法为：以含LOC_Os01g50420-T型基因作为亲本进行杂交，在后代中利用引物pkF和pkR扩增，测序；依据测序结果筛选含LOC_Os01g50420-T型基因的材料，再从这些后代中选择具有优异农艺性状的材料，最后筛选具有LOC_Os01g50420-T的纯合材料，这种材料具有抗穗发芽特性。
表1 LOC_Os01g50420-T型种质材料种子休眠性考察结果
案例二：
通过基因编辑技术编辑LOC_Os01g50420基因，破坏LOC_Os01g50420基因功能，获得的后代具有抗穗发芽表型；具体操作方法为：
A、敲除载体构建：参照CRISPR/Cas9编辑技术，合成引物Cris1u6aF和Cris1u6aR(Cris1u6aF：5'-CCAATCGGCCGCTCGGAGTcggcagccaagccag-3'，Cris1u6aR：5'-ACTCCGAGCGGCCGATTGGgttttagagctagaaat-3')，利用该引物通过PCR合成表达盒，再利用边切边接法，把表达盒导入pYLCRISPR/Cas9多靶点载体，测序验证其表达盒序列正确；
B、采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法将过表达载体转入易穗发芽材料，转化T0代，提取DNA，用引物HygBioF和HygBioR扩增(HygBioF：5'-acggtgtcgtccatcacagtttgcc-3'，HygBioR：5'-ttccggaagtgcttgacattgggga-3')，退火温度58℃，延伸时间30秒。检测扩增产物，扩增条带清晰的为阳性转化植株；
C、以阳性株DNA为模板，利用引物pkdecF和pkdecR(pkdecF：5'-CCAGGAACATCATGGTCGGC-3'，pkdecR：5'-AGCATTCGGCGTTCAGCGT-3'),扩增测序(退火温度60℃，延伸时间30秒)，以野生型为参照，选择LOC_Os01g50420基因突变株繁种，自交得到T1代株系，每个株系选择10株经PCR扩增检测筛选没有潮霉素标记的植株，再以无潮霉素标记DNA为模板，利用引物pkdecF和pkdecR扩增LOC_Os01g50420基因片段，测序筛选发生变异的单株；自交繁殖，提取叶片DNA，利用引物pkdecF和pkdecR扩增，测序，依据测序结果，筛选LOC_Os01g50420基因变异纯合株，该材料具有抗穗发芽特性。
>1
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本发明提出的水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420，调控种子休眠性，可用于解决水稻穗发芽问题，功能基因明确，生产应用方便；本发明首次证明了水稻基因LOC_Os01g50420是水稻种子休眠性调控基因，LOC_Os01g50420-T型基因促进种子休眠，育种过程中可利用分子标记辅助筛选穗发芽抗性，更为方便准确；利用基因编辑技术改变LOC_Os01g50420基因，可以直接提高现有品种的休眠性，提供了改良穗发芽抗性的新途径。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420，其特征在于，所述水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420是水稻种子休眠性调控基因；
所述水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420变异材料，在编码区第1377位碱基由A突变为T，导致第459位氨基酸由亮氨酸突变为苯丙氨酸，休眠性分析实验表明这些材料都具有一定休眠性，生产中具有抗穗发芽能力，将发生这种突变的基因型记为LOC_Os01g50420-T，是休眠型基因，自然材料中也可能存在其它LOC_Os01g50420休眠型变异。
2.根据权利要求1所述的水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420，其特征在于，所述水稻基因LOC_Os01g50420包含SEQNO.1所包含的核苷酸序列或其互补序列。
3.根据权利要求1所述的水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420，其特征在于，所述通过功能标记辅助筛选休眠型材料的后代，选择具有休眠型LOC_Os01g50420基因的后代。
4.根据权利要求3所述的通过功能标记辅助筛选休眠型材料的后代，以休眠型基因LOC_Os01g50420-T的应用为例，选择具有休眠型基因LOC_Os01g50420-T的后代，其特征在于，所述功能标记辅助筛选的具体操作方法为：以含LOC_Os01g50420-T基因材料作为亲本进行杂交，在后代中扩增包含编码区1377位的DNA片段，测序扩增产物；依据测序结果筛选含LOC_Os01g50420-T基因的材料，再从这些后代中选择具有优异农艺性状的材料，最后筛选具有LOC_Os01g50420-T基因的纯合材料，该材料的种子休眠性提高，具有抗穗发芽特性，也可在LOC_Os01g50420附近开发连锁标记，用连锁标记辅助筛选LOC_Os01g50420休眠型基因。
5.根据权利要求1所述的水稻穗发芽相关基因LOC_Os01g50420，其特征在于，通过基因编辑技术编辑LOC_Os01g50420基因，破坏LOC_Os01g50420基因功能，获得的后代具有抗穗发芽表型。
6.根据权利要求5所述的通过基因编辑技术编辑LOC_Os01g50420基因，破坏LOC_Os01g50420基因的生物学功能，获得的后代具有抗穗发芽表型，其特征在于，所述基因编辑技术的具体操作方法为：
A、敲除载体构建：参照CRISPR/Cas9编辑技术，选定靶标序列，根据靶标序列合成引物，通过PCR合成表达盒DNA片段，再利用边切边接法，把表达盒插入多靶点载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H，测序验证其表达盒序列正确；
B、采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法将敲除载体转入易穗发芽材料，转化T0代，用潮霉素溶液浸泡叶片的办法进一步确认阳性单株；
C、提取阳性单株DNA，扩增靶标序列上下游300bp的区段，测序，以野生型为参照，选择LOC_Os01g50420基因突变株，繁种，自交得到T1代株系，经PCR扩增检测筛选没有潮霉素标记的植株，再测序分析靶标序列附近区段DNA，筛选LOC_Os01g50420基因变异纯合株，该材料具有抗穗发芽特性。
7.根据权利要求4所述的基因编辑技术的具体操作方法，其特征在于，所述扩增操作的具体条件为：提取植株DNA，以此为模板，用引物pkF和pkR进行PCR扩增，其中pkF：5'-AGAGTTCGCGGTGATATGCC-3'，pkR：5'-GTGCGAGATCACGAGAGAGGA-3'，PCR所用的聚合酶为KODFX，反应体系为25uL，按照KODFX的说明书配制PCR反应体系，反应条件为：94℃5min；94℃30sec，59℃30sec，68℃30sec，32个循环；68℃5min，PCR扩增获得约510bp的片段。
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