CN116376964A - 一种调控水稻低温发芽的基因及其应用 - Google Patents
一种调控水稻低温发芽的基因及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分子育种技术领域，具体涉及一种调控水稻低温发芽的基因及其应用。为挖掘水稻低温发芽基因，本发明利用ubiquitin启动子使水稻过表达LOC_Os09g11480后发现，转化植株种子的低温发芽率显著降低，表明该基因可以负向调控水稻抗低温胁迫的性能，有望通过基因编辑技术降低LOC_Os09g11480基因的表达，并应用于水稻的基因遗传工程育种中，最终提高水稻的发芽期耐冷性，推进直播稻的推广应用。本发明首次证明水稻基因LOC_Os09g11480是调控水稻低温发芽的功能基因，该基因的克隆和生物学功能验证对于水稻低温发芽的分子机制研究有重要的参考意义。
Description
技术领域
本发明属于分子育种技术领域，具体涉及一种调控水稻低温发芽的基因及其应用。
背景技术
水稻是最重要的粮食作物之一。水稻产业的高效、可持续发展是关乎粮食安全和经济稳定的重要物质基础。传统水稻种植一般采用育苗移栽的栽培方式，不仅费工费力、生产效率低下，还面临劳动力和水资源短缺的刚性制约。而水稻直播直接将种子播到大田，无需育苗和移栽，与传统方法相比，既省工省力又节约水资源，而且可以达到与传统育苗栽种同等的水稻产量，是一种经济效益良好的水稻栽培模式。近年来，水稻直播已在广东、安徽、湖北、江西、江苏等省份迅速推广，正成为我国水稻生产的重要方式之一。
水稻是喜温作物，起源于热带和亚热带，其整个生育期对冷害都十分敏感。华南双季稻区早稻直播和东北高寒稻区的单季稻直播的播种期往往会由于遇到春季低温天气(“倒春寒”)，而造成种子萌发不齐，缺苗断垄，产量损失严重。因此，直播稻的发展对水稻种子的低温发芽力提出了更高的要求，一般要求在11-13℃低温下种子发芽率不低于80％。而由于长期以来水稻的栽培一直都是以育秧移栽为主，不以品种的低温发芽力作为育种目标，造成大多数现代品种的低温发芽力均较差，许多高产、优质的水稻品种由于低温发芽力弱而不能用作直播稻，进而严重限制了直播稻的发展。目前，解决水稻发芽期低温冷害的根本方法是培育耐低温的水稻品种。然而，应用以往常规方法开展水稻耐低温育种非常困难，其原因在于水稻低温发芽力是由多个基因控制的数量性状，只有深入了解水稻低温发芽的分子遗传基础，开展高效、准确的分子育种，水稻耐低温发芽问题才能得到解决。但迄今，精确鉴定和克隆的水稻低温发芽基因还很少，对于水稻低温发芽相关的分子调控机理仍然不清楚。因此，挖掘和精确鉴定水稻低温发芽基因，深入了解其分子机制是水稻耐低温分子育种取得突破的关键。
近年来，随着直播稻的需求日益增大以及分子标记技术的迅猛发展，水稻耐低温发芽分子遗传基础的研究已经成为植物科学研究领域的热点，也已取得了不错的研究进展。迄今，国内外利用遗传群体(包括重组自交系、染色体片段代换系等)或自然群体已鉴定和定位了超过50个与低温发芽力相关的QTL，在12条染色体上均有分布。然而，尽管已鉴定出众多QTL，但是水稻低温发芽功能基因的分离克隆只有零星报道，其原因是水稻低温发芽是由多基因控制的数量性状，一般单个QTL的贡献都比较小，且其表达受环境影响较大，这就决定了对这些基因的分离和克隆比较困难。因此，精确鉴定出效应大、能稳定表达的低温发芽功能基因是解决水稻发芽期耐冷性分子育种的关键所在。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种水稻低温发芽基因LOC_Os09g11480，该基因可以负向调控水稻低温发芽，有助于推动水稻发芽期耐冷性分子育种技术的发展。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明第一方面提供了LOC_Os09g11480基因在调控水稻低温发芽中的应用。
应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。同时，本发明也适用于调控其他禾本科植物的低温发芽。
优选地，通过抑制或降低LOC_Os09g11480基因在水稻中的表达，从而提高水稻的发芽期耐冷性。
优选地，所述水稻为低温发芽率低的水稻品种。
优选地，所述水稻为低温发芽率低的华南栽培稻品种C36。
发明人前期通过对华南地区316份水稻核心种质(包含260份地方品种和56份育成品种)进行低温发芽力评价，筛选出26份发芽率超过80％的水稻种质。通过全基因组关联分析，在9号染色体鉴定到一个效应较大的QTL，且与前人通过遗传群体鉴定到的QTL共定位，结合基因型分析和差异表达分析，最终确定该区间内的LOC_Os09g11480基因为与低温发芽相关的候选基因，该基因来源于低温发芽率高的华南栽培稻品种C130，很有可能在水稻低温发芽中发挥了重要调控作用。为此，本发明通过利用LOC_Os09g11480过表达载体转化水稻，证实LOC_Os09g11480过表达株系在常温下(28℃)的发芽率并无差异，但在低温条件下(15℃)的发芽率显著降低，提示LOC_Os09g11480基因可以负向调控水稻低温发芽。
优选地，所述LOC_Os09g11480基因还包括与其相关的生物材料，所述相关的生物材料包括编码LOC_Os09g11480基因的蛋白，含有LOC_Os09g11480基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
本发明第二方面提供了一种培育耐低温水稻的方法，即利用基因编辑技术抑制或降低LOC_Os09g11480基因的表达。
优选地，所述基因编辑技术包括但不限于CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明利用ubiquitin启动子使水稻过表达LOC_Os09g11480后发现，转化植株种子的低温发芽率显著降低，但转基因植株在生长状态及农艺性状上没有明显的改变，表明该基因可以负向调控水稻抗低温胁迫的性能。说明有望通过基因编辑技术降低LOC_Os09g11480基因的表达，并应用于水稻的基因遗传工程育种中，最终提高水稻的发芽期耐冷性，推进直播稻的推广应用。本发明首次证明水稻基因LOC_Os09g11480是调控水稻低温发芽的功能基因，该基因的克隆和生物学功能验证对于水稻低温发芽的分子机制研究有重要的参考意义。
附图说明
图1为1300-Ubi-GFP载体图谱；
图2为转基因植株中LOC_Os09g11480表达水平检测结果；
图3为过表达LOC_Os09g11480转化水稻种子的低温发芽率统计结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1LOC_Os09g11480基因与水稻低温发芽率相关性的验证
LOC_Os09g11480的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)如下所示：
ATGTGTGGAGGAGCACTGATCCCGAACGACTACGGCGACAAGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAGTCGTCGGAGTGGGACGCCACAACGAAGATGAAGAAGAAGAAGAAGAAGCGTGGCGGCGGCGGCGACGACGACTGGGAGGCCGCCTTCCGGGAGTTCATCGCTGGCGACGACGACGACGACGACGGCGGCGTTTCCATGTTCCCTTCTGGTGCAGGGACGATGGAGACGACCACAGAGGTGGCGCCGGCGGCGGCGGTGGTGGAGAGGCCGCGGCGGCGGCGAAGGGTGAGGCGGAGCTACCCGTACCGCGGCGTCCGGCAGCGGCCGTGGGGGCGGTGGGCGTCGGAGATCCGCGACCCCGTCAAGGGCGCCCGCGTCTGGCTCGGCACCTTCGACACCGCCGTCGAGGCCGCGCGCGCCTACGACGCCGAGGCGCGCCGCATCCACGGCCACAAGGCAAGGACCAACTTCCCGCCCGACGAGCCTCCGCTGCCGGCGCCATCGCAGGCGCCGTTCTGCTTCCTGCTCGACGACGACGACAACGACGGCGTGGCCCGTGGAAACAGCCCGGCGTCGTCGTCGGCGCCGGACAGAGCCTCCGCTTGCACGACGTCGTCGACGGTGGCGTCCGGCGAGCGAGGCGATGAGCTCATACTGCTGGAGTGCTGCTCCGACGACGTGATGGACAGCCTCCTCGCCGGCTTCGACGTGTCCAGCGAACCACGCAGTGTTTTGGTATGGTTTCTCCAATTTTTCGTCAAATGA。
LOC_Os09g11480的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)如下所示：
MCGGALIPNDYGDKPPPPPS.SSEWDATTKMKKKKKKRGGGGDDDWEAAFREFI AGDDDDDDGGVSMFPSGAGTMETTTEVAPAAAVVERPRRRRRVRRSYPYRGVRQRPWGRWASEIRDPVKGARVWLGTFDTAVEAARAYDAEARRIHGHKARTNFPPDEPPLPAPSQAPFCFLLDDDDNDGVARGNSPASSSAPDRASACTTSSTVASGERGDELILLECCSDDVMDSLLAGFDVSSEPRSVLVWFLQFFVK。
(1)LOC_Os09g11480基因的克隆及过表达载体的构建
取水稻低温发芽率高的华南栽培稻品种C130(桂农占，粤审稻2005006)的三叶期幼苗叶片部位，用TriZolReagent(Invitrogen公司，其货号为：15596026)提取叶片总RNA，采用甲醛变性凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度(A260/A280比值一般在2.0-2.2之间)及量(一般要求大于500ng/uL)，取1μg的总RNA做起始逆转录反应，所采用的逆转录酶为PrimeScript(TAKARA公司)，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录产物为模板，采用引物(逆转录引物F：CTGATTAACAGGGATCCCCCACGATGTGTGGAGGAGCACTG，SEQID NO：3；逆转录引物R：CTGATTAACAGGGATCCCCCAAGAATATCACGATGTGTGGAGGAG，SEQ ID NO：4)进行PCR扩增，PCR所用的聚合酶为KODFX(Toyobo公司)。反应体系为50uL，按照KODFX的说明书配制PCR反应体系。反应条件为：94℃5min；94℃30sec，60℃30sec，68℃60sec，34个循环；68℃10min。PCR扩增获得约768bp的片段。采用PCR产物直接纯化的方法回收该片段后，用Sma1(Takara)对回收的片段和1300-Ubi-GFP载体(图1)分别进行单酶切，酶切后分别回收目标片段和载体片段，用ExnaseII重组酶(Vazyme公司)37℃重组连接30min，重组体系为：ExnaseII重组酶1uL，5×CEIIbuffer2uL，LOC_Os09g11480基因片段1uL(15ng)，1300-Ubi-GFP载体2uL(130ng)，灭菌水4uL。取5uL连产物，用热激法转化到大肠杆菌DH5α中，将转化产物涂布于卡那霉素抗性的LB固体培养基，37℃培养过夜，挑6个单克隆进行质粒提取，经酶切鉴定6个均能切出约768bp大小的条带，选择两个阳性克隆进行测序，结果显示是目的条带，进而获得过表达载体。
(2)构建LOC_Os09g11480过表达载体转化水稻
采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法将过表达载体转入低温发芽率低的华南栽培稻品种C36(五山丝苗，粤审稻2009031)中。所有的转化原代(T0代)转基因苗通过PCR扩增潮霉素载体片段，从DNA水平鉴定阳性转化植株。扩增潮霉素的引物序列如下：hptF：TCGTGCTTTCAGCTTCGATGTA(SEQ ID NO：5)；hptR：AGAAGAAGATGTTGGCGACCTC(SEQ ID NO：6)。
PCR扩增体系：TaqDNA聚合酶0.2μl、10×buffer2μl、dNTP(10mmol/L)0.2μl、hptR(10μmol/L)0.3μl、hptF(10μmol/L)0.3μl、1μlDNA、ddH2O16μl。PCR反应程序：94℃4min；94℃0.5min，60℃0.5min，72℃0.5min，30个循环；72℃补充10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。所得阳性植株经自交得到转基因1代(T1代)株系，每个T1株系选择5株经PCR检测为阳性的植株进行繁种，得到T2代植株，T2代株系再进行PCR检测，找到来源于不同T0代植株的T2代纯合株系3个(OE1、OE2、OE4)。对3个株系的幼苗叶片进行荧光定量PCR，检测目标基因LOC_Os09g11480的表达量，以野生型结果为对照。其中，荧光定量PCR鉴定LOC_Os09g11480基因在转基因植株中过表达效果的程序如下：
取PCR检测阳性的转基因植株的三叶期幼苗叶片通过TriZolReagent(Invitrogen公司，其货号为：15596026)进行总RNA提取，具体操作根据试剂的说明书的步骤进行，并用甲醛变性凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度及量，取1μg的总RNA做起始逆转录反应，所采用的逆转录酶为PrimeScript(Takara公司)，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明进行。以逆转录产物为模板，采用引物11480F和11480R引物对检测LOC_Os09g11480基因的表达情况，采用水稻管家基因EF1α基因的EF1αF和EF1αR引物对检测水稻EF1α基因的表达作为内参。所用引物序列如下：
11480F：TCATACTGCTGGAGTGCTGC(SEQ ID NO：7)；
11480R：TGGAGAAACCATACCAAAACACTT(SEQ ID NO：8)；
EF1αF：TTTCACTCTTGGTGTGAAGCAGAT(SEQ ID NO：9)；
EF1αR：GACTTCCTTCACGATTTCATCGTAA(SEQ ID NO：10)。
反应体系为：2×PCRbuffer6μL，11480F引物1μL，11480R引物1μL，cDNA模板0.5μL，灭菌水3.5μL，反应体系总体积12μL。
反应程序：95℃30s；95℃5sec,68℃30sec，40个循环。
如图2的结果所示，相对于野生型，3个株系中LOC_Os09g11480的表达量都大幅度提高200倍以上。
(3)LOC_Os09g11480过表达转基因植株水稻的低温发芽表型鉴定
将转基因植株的表型鉴定分对照组和低温处理组两组。其中，对照组为：LOC_Os09g11480过表达株系(OE1、OE2、OE4)和野生型C36的种子置于直径为6cm的塑料培养皿中，加入12mL已灭菌的去离子水，置于参数设定为黑暗、28℃、相对湿度80％的人工气候培养箱(品牌：CONVIRON，型号：PGW40)中吸水2d后，用移液枪吸除培养皿中的流动水，28℃继续培养2d，以芽长大于1mm为发芽指标，统计每个培养皿中的种子发芽数，计算常温下的发芽率。低温处理组为：LOC_Os09g11480过表达株系和野生型的种子置于直径为6cm的塑料培养皿中，加入12mL已灭菌的去离子水，置于参数设定为黑暗、28℃、相对湿度80％的人工气候培养箱(品牌：CONVIRON，型号：PGW40)中吸水2d后，用移液枪吸除培养皿中的流动水，调整人工气候培养箱温度至15℃。15℃低温处理10d后，以芽长大于1mm为发芽指标，统计每个培养皿中的种子发芽数，此为低温发芽数。统计好低温发芽数后，迅速将培养皿置于人工气候培养箱中，调整人工气候培养箱温度至28℃。28℃常温处理2d后，以芽长大于1mm为发芽指标，统计每个培养皿中的发芽数，此为总发芽数。每份材料分别设三个重复。用MicrosoftExcel2010进行数据录入和处理，并统计低温发芽率(低温发芽率＝低温发芽数/总发芽数×100％)。
如图3的结果所示，在常温条件下，LOC_Os09g11480过表达株系和野生型的种子发芽率并无显著差异，而在低温条件下，过表达株系种子的低温发芽率显著低于野生型种子，表明LOC_Os09g11480基因可以负向调控水稻低温发芽。
综上可见，本发明提供了利用ubiquitin启动子过表达LOC_Os09g11480基因的水稻转化载体，该载体转化水稻后能大幅提高LOC_Os09g11480的表达量，伴随着表达量的提高，转化植株种子的低温发芽率显著降低，但转基因植株在生长状态及农艺性状上没有明显的改变，表明该基因可以负向调控水稻抗低温胁迫的性能。因此，有望通过基因编辑技术降低LOC_Os09g11480的表达，并应用于水稻的基因遗传工程育种中，最终提高水稻的发芽期耐冷性，推进直播稻的推广应用。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.LOC_Os09g11480基因在调控水稻低温发芽中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过抑制或降低LOC_Os09g11480基因在水稻中的表达，从而提高水稻的发芽期耐冷性。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻为低温发芽率低的水稻品种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述水稻为低温发芽率低的华南栽培稻品种C36。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述LOC_Os09g11480基因还包括与其相关的生物材料，所述相关的生物材料包括编码LOC_Os09g11480基因的蛋白，含有LOC_Os09g11480基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
6.一种培育耐低温水稻的方法，其特征在于，利用基因编辑技术抑制或降低LOC_Os09g11480基因的表达。
7.根据权利要求6所述的一种培育耐低温水稻的方法，其特征在于，所述基因编辑技术包括CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术。
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