BR112017011898B1 - Método para melhoramento genético de uma soja transgênica, método e kit para detectar se uma amostra de planta e/ou seus produtos é derivada da soja trangênica preparada pelo dito método e uso da planta trangênica ou progênies da mesma preparada pelo dito método - Google Patents

Abstract

SOJA TRANSGÊNICA RESISTENTE AO GLIFOSATO E O MÉTODO DE PREPARAÇÃO E APLICAÇÃO DA MESMA. A presente invenção revela uma soja transgênica resistente ao glifosato e o método de preparação e aplicação da mesma. A presente invenção fornece um método para melhoramento genético de uma soja transgênica que compreende: inserir um fragmento de DNA exógeno nas posições 7.980.527 a 7.980.541 do cromossomo 17 do genoma de soja alvo para obter a soja transgênica. A soja transgênica da presente invenção tem tolerância a uma dose elevada de glifosato e pode, ainda, ser aprimorada hibridizando-se com excelente cepa de soja para otimizar outros caracteres agronômicos, tais como rendimento, qualidade, etc. O método de detecção da presente invenção pode identificar a região de ligação do TDNA inserido e do DNA de genoma da planta e, ainda, identificar se os tecidos ou produtos de planta contêm os ingredientes da soja transgênica.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[001]A presente invenção refere-se a uma tecnologia de engenharia genética de planta ou a um campo de melhoramento genético, particularmente, a presente invenção se refere à soja transgênica e à aplicação da mesma e, mais particularmente, a presente invenção se refere à soja transgênica resistente ao glifosato e ao método de preparação e aplicação da mesma.

ANTECEDENTES

[002]Em unidades de motor resfriado a ar, como uma unidade de motor descrita na Literatura de Patente 1, a temperatura de um corpo principal de motor tende a ser mais alta do que em unidades de motor resfriado a água. Devido a isso, a detonação é mais propensa a ocorrer nas unidades de motor resfriado a ar do que nas unidades de motor resfriado a água. Com a finalidade de impedir a detonação, as unidades de motor resfriado a ar têm sido projetadas para terem uma razão de compressão um pouco menor do que as unidades de motor resfriado a água.

[003]A soja (Glycine max(L.). Merr) é originária da China, e é uma importante colheita de óleo e colheita econômica, e também é uma fonte principal de óleos vegetais comestíveis e proteínas vegetais. A erva daninha é um componente importante no sistema agroecológico, e a erva daninha compete com as colheitas por recursos, tais como luz, água, nutrientes, etc., o que resulta em falha de colheita. Portanto, o controle eficaz e a eliminação de ervas daninhas nos campos de soja são um dos fatores críticos de rendimentos altos e estáveis para a soja. A mondadura artificial tradicional compreende a remoção manual de ervas daninhas e mondadura com o uso de ferramentas agrícolas simples, etc., as mesmas são demoradas e extenuantes, de baixa eficácia e não podem controlar e eliminar em tempo hábil as ervas daninhas em grande área. O uso de herbicidas aprimora bastante a eficácia de prevenção e controle para as ervas daninhas agrícolas, mas o vestígio de herbicidas tradicionais, tais como clorimuron-etil, metsulfuron-metil, etc., no solo é grave, o que polui o ambiente, assim, o alcance utilizável é pequeno.

[004]O glifosato é um herbicida sistêmicos de amplo espectro que possui muitas vantagens, tais como mondadura de amplo espectro, alta eficácia, baixa toxicidade, baixo teor de resíduo, etc., particularmente, baixa toxicidade para seres humanos e gado, e é um dos mais amplamente aplicados e os herbicidas mais vendidos em todo o mundo. O mecanismo de glifosato serve para catalisar a via metabólica de ácido xiquímico dentro de corpos de planta e micro-organismo ligando- se de modo irreversível o glifosato à EPSPS sintase (5-enolpiruvilxiquimato-3-fosfato sintase) dentro dos corpos de planta, que perturba a via sintética de ácido xiquímico, o que resulta em perturbação do processo metabólico, interfere com a síntese de proteína, impede a formação de produtos secundários e finalmente resulta na morte das plantas. Devido a sua não seletividade, o glifosato prejudicará a soja enquanto mata as ervas daninhas, por isso é umas das formas importantes para proteger as colheitas de serem danificadas por glifosato, de modo a aprimorar a prevenção abrangente e a eficácia de controle de ervas daninhas por meio de melhoramento genético de colheitas transgênicas resistentes ao glifosato. Os resultados de estudo existentes e a história de desenvolvimento de comercialização de colheitas transgênicas demonstram que a tolerância a glifosato de herbicidas é uma característica alvo eficaz para a aplicação ao controle e à eliminação, e gerenciamento de ervas daninhas da soja.

[005]A fim de conferir tolerância a glifosato a uma colheita, os pesquisadores focaram em introduzir um gene que pode adicionar a tolerância a glifosato ao corpo de planta, tal como EPSPS, e o gene de EPSPS é geralmente derivado de microorganismo e tem resistência a glifosato, assim, sua atividade catalítica pode permanecer sob a ação de glifosato (PCT/CN03/00651). Atualmente, a maioria das colheitas transgênicas resistentes ao glifosato para plantação comercial em todo o mundo são projetadas em relação a EPSPS.

[006]Em problemas de planta, N-acetiltransferase (GAT) pode degradar de modo eficaz o glifosato através de N-acetilação para, assim, perder a atividade herbicida, e o glifosato acetilado não é um substrato eficaz para EPSPS para, assim, conferir tolerância a glifosato para a planta (ZL 2005 1 0086626.X). Portanto, o uso dos meios de N-acetilação para melhorar geneticamente as colheitas transgênicas pode possibilitar que o glifosato seja aplicado dentro de todo o ciclo de crescimento da planta, sem ser restringido pelos estágios de crescimento e desenvolvimento.

SUMÁRIO

[007]Um propósito da presente invenção é fornecer um método para melhoramento genético de soja transgênica.

[008]O método fornecido pela presente invenção é inserir um fragmento de DNA exógeno nas posições 7.980.527 a 7.980.541 do cromossomo 17 do genoma de soja alvo para substituir uma sequência de base de 13 bp nas posições 7.980.527 a 7.980.541 do cromossomo 17 para, assim, obter a soja transgênica;

[009]A resistência a glifosato da soja transgênica é mais alta que a da soja alvo;

[0010]O fragmento de DNA exógeno é uma molécula de DNA que contém o gene de 5-enolpiruvilxiquimato-3-fosfato sintase e o gene de N-acetiltransferase.

[0011]No método acima, o gene de 5-enolpiruvilxiquimato-3-fosfato sintase é G2-aroA;

[0012]O gene de N-acetiltransferase é GAT;

[0013]O fragmento de DNA exógeno é a SEQ ID NO: 10 ou nucleotídeos nas posições 6189 a 10927 da extremidade 5’ da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências. No método acima, o fragmento de flanqueamento a montante do fragmento de DNA exógeno na soja transgênica é qualquer um dentre os fragmentos de DNA com um comprimento de 0 a 5 kb obtido estendendo-se de um nucleotídeo na posição 7.980.527 no cromossomo 17 do genoma de soja alvo para sua direção a montante;

[0014]O fragmento de flanqueamento a montante é, especificamente, nucleotídeos mostrados como SEQ ID NO: 8 na Listagem de Sequências;

[0015]O fragmento de flanqueamento a jusante do fragmento de DNA exógeno na soja transgênica é qualquer um dentre os fragmentos de DNA com um comprimento de 0 a 5 kb obtido estendendo-se de um nucleotídeo na posição 7.980.541 no cromossomo 17 do genoma de soja alvo para sua direção a jusante;

[0016]O fragmento de flanqueamento a jusante é, especificamente, nucleotídeos mostrados como SEQ ID NO: 9 na Listagem de Sequências.

[0017]O fragmento de flanqueamento a montante é um fragmento que está imediatamente adjacente à extremidade 5’ do fragmento de DNA exógeno no genoma de soja transgênica;

[0018]O fragmento de flanqueamento a jusante é um fragmento que está imediatamente adjacente à extremidade 3’ do fragmento de DNA exógeno no genoma de soja transgênica;

[0019]No método acima, o fragmento de DNA exógeno é introduzido na soja alvo por meio de um vetor recombinante que contém o fragmento de DNA exógeno;

[0020]A sequência de nucleotídeos do vetor recombinante é, especificamente, SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências.

[0021]No método acima, a soja alvo é Zhonghuang10.

[0022]A soja transgênica é uma cepa homozigótica.

[0023]A planta transgênica é preparada através do método acima.

[0024]A planta transgênica acima é soja ZH10-6 CGMCC N° 11108 (também conhecida como cepa homozigótica de geração T2 de soja transgênica ZH10-6), que foi depositada no Centro Geral de Coleção de Culturas Microbiológicas da China (chamado de CGMCC em abreviação, Endereço: Construção N° 3, Pátio N° 1, Beichen west Road, Distrito de Chaoyang, Pequim, Instituto de Microbiologia, Academia Chinesa de Ciências, código postal: 100101) em 1° de dezembro de 2015, tinha um N° de Depósito de CGMCC N° 11108, e foi classificada e nomeada como Glycines max.

[0025]Outro propósito da presente invenção é fornecer um método para detectar ou detectar de modo auxiliar se uma amostra de planta é derivada da soja transgênica ou suas progénies preparadas através do método acima ou para detectar ou detectar de modo auxiliar se um produto contém a soja transgênica ou suas progénies preparadas através do método acima.

[0026]O método fornecido pela presente invenção compreende as seguintes etapas: detectar se o DNA de genoma da amostra de planta ou o produto contém um fragmento de DNA A,

[0027]sendo que o fragmento de DNA A é 1) ou 2) conforme a seguir:

[0028]1) é constituído pelo fragmento de flanqueamento a montante do fragmento de DNA exógeno na soja transgênica na reivindicação 3, o fragmento de DNA exógeno na reivindicação 3 e pelo fragmento de flanqueamento a jusante do fragmento de DNA exógeno na soja transgênica na reivindicação 3; ou

[0029]2) é um fragmento de DNA que tem uma homologia superior a 95% com o fragmento de DNA A conforme mostrado em 1);

[0030]Caso contenha o fragmento de DNA A, a amostra de planta é ou é candidata para a soja transgênica ou suas progênies; ou o produto contém a soja transgênica ou contém, como candidata, a soja transgênica ou suas progênies;

[0031]Caso não contenha o fragmento de DNA A, a amostra de planta não é ou não é uma candidata para a soja transgênica ou suas progênies; ou o produto não contém ou não contém, como candidata, a soja transgênica ou suas progênies.

[0032]No método acima,

[0033]o método é 1) ou 2) ou 3) conforme a seguir:

[0034]1) Sequenciar diretamente o DNA de genoma da amostra de planta, e julgar se a amostra de planta sequenciada contém o fragmento de DNA A;

[0035]2) Realizar uma amplificação por PCR com o par de iniciadores 1 ou o par de iniciadores 2, caso haja um produto de amplificação alvo, a amostra de planta ou o produto contém o fragmento de DNA A;

[0036]O par de iniciadores 1 é um par de iniciadores que pode amplificar a molécula de DNA 1 constituída pela extremidade 5’ do fragmento de DNA exógeno e fragmento parcial ou inteiro da sequência de flanqueamento a montante que é imediatamente adjacente à extremidade 5’ do fragmento de DNA exógeno; e seu produto de amplificação alvo correspondente é a molécula de DNA 1;

[0037]O par de iniciadores 2 é um par de iniciadores que pode amplificar a molécula de DNA 2 constituída pela extremidade 3’ do fragmento de DNA exógeno e fragmento parcial ou inteiro da sequência de flanqueamento a jusante que é imediatamente adjacente à extremidade 3’ do fragmento de DNA exógeno; e seu produto de amplificação alvo correspondente é a molécula de DNA 2; ou

[0038]3) Realizar a hibridização de Southern na amostra de planta ou do produto DNA a ser testado com uma sonda que pode especificamente se ligar à molécula de DNA 1 ou à molécula de DNA 2, caso as mesmas possam se hibridizar para obter um fragmento hibridizado, sendo que a amostra de planta é derivada da soja transgênica ou suas progênies ou o produto contém a soja transgênica ou suas progênies.

[0039]No método acima, o par de iniciadores 1 é constituído por uma molécula de DNA de filamento único conforme mostrado na SEQ ID NO: 11 na Listagem de Sequências e uma molécula de DNA de filamento único conforme mostrado na SEQ ID NO: 12 na Listagem de Sequências;

[0040]O tamanho do fragmento específico alvo que corresponde ao par de iniciadores 1 tem 810 bp, e a sequência de nucleotídeos do mesmo é, especificamente, a SEQ ID NO: 15;

[0041]O par de iniciadores 2 é constituído por uma molécula de DNA de filamento único conforme mostrado na SEQ ID NO: 13 na Listagem de Sequências e uma molécula de DNA de filamento único conforme mostrado na SEQ ID NO: 14 na Listagem de Sequências;

[0042]O tamanho do fragmento específico alvo que corresponde ao par de iniciadores 2 tem 1627 bp, e a sequência de nucleotídeos do mesmo é, especificamente, a SEQ ID NO: 16;

[0043]Em 3), a sequência de nucleotídeos da sonda é a SEQ ID NO: 6.

[0044]A molécula de DNA 1 é um fragmento alvo de 810 bp e a sequência de nucleotídeos do mesmo é a SEQ ID NO: 15;

[0045]A molécula de DNA 2 é um fragmento alvo de 1627 bp e a sequência de nucleotídeos do mesmo é a SEQ ID NO: 16.

[0046]No método acima, a progênie da soja transgênica é material transgênico derivado com a soja transgênica como um progenitor, que compreende uma progênie derivada obtida por mutagenização da soja transgênica ou hibridização com outras sojas, ou uma progênie derivada, ainda, da progênie mutagenizada ou hibridizada.

[0047]O terceiro propósito da presente invenção é fornecer um kit para detectar ou detectar de modo auxiliar se uma amostra de planta é derivada da soja transgênica ou suas progênies preparadas através do método acima ou para detectar ou detectar de modo auxiliar se um produto contém a soja transgênica ou suas progênies preparadas através do método acima.

[0048]O kit fornecido pela presente invenção compreende 1) o fragmento de DNA exógeno, 2) o par de iniciadores 1, 3) o par de iniciadores 2 ou 4) a sonda.

[0049]O kit acima também pode conter uma especificação que grava o método acima.

[0050]A soja transgênica preparada através do método acima tem aplicações no melhoramento genético e/ou produção e processamento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0051]A Figura 1 é uma análise por PCR de material de identificação que é a geração T0 de soja transgênica resistente a 1,5 l/hectare de glifosato aspergido no mesmo.

[0052]A Figura 2 é uma análise de número de cópias de T-DNA exógeno em soja transgênica ZH10-6.

[0053]A Figura 3 é uma identificação de resistência a glifosato de planta T1 de soja transgênica ZH10-6.

[0054]A Figura 4 é um diagrama de amplificação por PCR de planta T1 de soja transgênica ZH10-6.

[0055]A Figura 5 é a resistência da cepa resistente a homozigotos de soja transgênica ZH10-6 sob o tratamento de 12 l/hectare de sal de glifosato isopropilamina.

[0056]A Figura 6 é detecção de molécula por PCR de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6.

[0057]A Figura 7 é um diagrama esquemático que mostra o sítio de inserção e a forma de integração de T-DNA exógeno na soja transgênica ZH10-6.

[0058]A Figura 8 é um diagrama esquemático para verificar as posições de iniciadores na soja transgênica ZH10-6.

[0059]A Figura 9 é um diagrama de amplificação por PCR qualitativo das plantas de progênie de soja transgênica ZH10-6.

[0060]A Figura 10 é um diagrama de amplificação por PCR qualitativo das plantas derivadas formadas por soja transgênica ZH10-6 em melhoramento genético.

[0061]A Figura 11 é um diagrama de amplificação por PCR qualitativo de tecidos diferentes das plantas derivadas formadas por soja transgênica ZH10-6 em melhoramento genético.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0062]A menos que especificado de outra forma, os métodos experimentais usados nos exemplos a seguir são todos métodos convencionais.

[0063]A menos que especificado de outra forma, os materiais, reagentes, etc. usados nos exemplos a seguir podem todos estar disponíveis comercialmente.

[0064]A variedade de soja é Zhonghuang10 (Zhonghuang10, seu número de Comissão: ZDD23873), que é registrada na seguinte literatura: Chinese Soybean Varity Records, editores Qiu Lijuan, Wang Shuming, China Agriculture Press, 2007, o público pode obter a mesma no Instituto de Ciências de Colheita, Academia Chinesa de Ciências Agrícolas e o nó cotiledonar de Zhonghuang10 foi usado como material para transformação;

[0065]A cepa de agrobacterium tumefaciens é Ag10, que é registrada na seguinte literatura: Cheng Wei, Pilot Study of Ectopic Expression of AtMGT4 Gene in Rice (D), Hunan Normal University, 2012; o público por obter a mesma no Instituto de Ciências de Colheita, Academia Chinesa de Ciências Agrícolas.

[0066]O meio de cultura de tecido de soja compreende, principalmente, meios de cultura MS e B5, esterilizados a 121 °C durante 15 a 20 min.

[0067]Meio de cultura de germinação: B5 + 20 g/l de sacarose + 8 g/l de pó de ágar, pH 5,8;

[0068]Meio de cocultura: 1/10 de B5 + 30 g/l sacarose + 3,9 g/l de ácido 2- (N-morfolina)etanossulfônico (MES) + 1,67 mg/l de 6-BA + 39 mg/l de acetossiringona + 0,25 mg/l de giberelina (GA3) + 1 mmol/l de ditiotreitol + 1 mmol/l de tiossulfato de sódio + 1 mmol/l de cisteína + 5 g/l de pó de ágar, pH 5,4;

[0069]Solução de cocultura: 1/10 de B5 + 30 g/l de sacarose + 3,9 g/l de ácido 2-(N-morfolina)etanossulfônico (MES) + 1,67 mg/l de 6-BA + 39 mg/l de acetossiringona + 0,25 mg/l de giberelina (GA3);

[0070]Meio de cultura de indução de múltiplos brotos: B5 + 30 g/l de sacarose + 8 g/l de pó de ágar + 0,6 g/l de ácido 2-(N-morfolina)etanossulfônico (MES) + 1,67 mg/l de 6-BA + 150 mg/l de Cefalotina + 400 mg/l de Carbenicilina + 15 mg/l de glifosato, pH 5,7;

[0071]Meio de cultura de alongamento de broto: MS + B5 orgânicos + 30 g/l de sacarose + 8 g/l de pó de ágar + 0,6 g/l de ácido 2-(N- morfolina)etanossulfônico (MES) + 50 mg/l de ácido aspártico + 50 mg/l de glutamina + 0,3 mg/l de ácido indol-3-acético (IAA) + 0,5 mg/l de giberelina (GA3) + 150 mg/l de Cefalotina + 400 mg/l de Carbenicilina + 0,1 mg/l de zeatina (Ze) + 5 mg/l de glifosato, pH 5,7;

[0072]Meio de cultura de enraizamento: MS + B5 orgânicos + 30 g/l de sacarose + 8 g/l de pó de ágar + 0,6 g/l de ácido 2-(N-morfolina)etanossulfônico (MES) 50 mg/l de ácido aspártico + 50 mg/l de glutamina, pH 5,7;

[0073]Os meios de cultura para cultivar agrobactérias são meios de cultura YEP e LB.

[0074]Os meios de cultura de pó seco de acetossiringona, MS e B5 e a acetossiringona são produtos da Sigma Company, o ácido 2-(N- morfolina)etanossulfônico (MES), a Cefalotina, a Carbenicilina, o pó de ágar, a zeatina, o ácido aspártico, glutamina, a giberelina (GA3), e 6-benzilamino adenina (6-BA) são produtos da Biodee Company e a sacarose é um reagente doméstico.

[0075]Os exemplos a seguir descrevem, ainda, os materiais e os métodos usados quando se obtém a presente invenção e os resultados subsequentes, os mesmos são fornecidos por meio de ilustração e suas descrições não são consideradas como uma limitação das reivindicações e da presente invenção.

Exemplo 1. Transformação genética da soja transgênica 1. A obtenção de um vetor recombinante

[0076](1) Reprojetar iniciadores de PCR de acordo com a sequência sintética obtida após a otimização de A.thaliana-rbcS mais gene de G2- EPSPS(G2-aroA), em que a montante contém um sítio de restrição XbaI e a jusante contém um sítio de restrição SacI, amplificar por PCR o fragmento de rbcS- G2-EPSPS (aroA) (nucleotídeos nas 8.204 a 9.784 da extremidade 5’ na SEQ ID NO: 1), ligar o mesmo a um vetor T-A para, assim, obter um plasmídeo prbcS-G2- EPSPS (aroA) e realizar a digestão de enzima e a verificação de sequenciamento.

[0077](2) Realizar digestão de enzima dupla de pBI121 (Wang Huaxin, Cao Jiashu, Xiang Xun, etc., Rapid method to identify expression vectors and tansgenic plants based on pBI121 plasmid, Journal of Zhejiang University (Agriculture &life sciences), 2008, 34(2): 137 a 142; o público pode obter o mesmo no Instituo de Ciências de Colheita, Academia Chinesa de Ciências Agrícolas) e de pCAMBIA2300 (Gong Yuanyong, Feng Yongkun, Ni Wanchao, etc., Construction and verification of an plant expression vector pCAMBIA2300-35S- GUS-CaMVterm, China Biotechnology, 2013, 33(3): 86 a 91; o público pode obter o mesmo no Instituto de Ciências de Colheita, Academia Chinesa de Ciências Agrícolas) com HindIII/EcoRI e ligar o fragmento de 3,0 kb de pBI121 ao p35S- GUS-Nos em pCAMBIA2300, de modo a formar um vetor intermediário p35S- 2300-GUS;

[0078](3) Após a digestão de enzima do vetor p35S-2300-GUS e prbcS- G2-EPSPS (aroA) com XbaI/SacI, ligar o fragmento de 9,8 kb de cadeia principal de vetor p35S-2300-GUS ao fragmento de 1,5 kb de rbcS-G2-EPSPS (aroA) para formar um vetor intermediário p35S-2300-rbcS-G2-EPSPS (aroA), esse vetor é formado substituindo-se o fragmento de GUS no sítio de digestão de enzima correspondente de p35S-2301-GUS obtido em (2) pelo fragmento de rbcS-G2- EPSPS (aroA) em prbcS-G2-EPSPS (aroA). Uma digestão de enzima única de p35S-2300-rbcS-G2-EPSPS (aroA) foi realizada com XhoI para remover um marcador de triagem de planta, kan, e 10,4 kb de cadeia principal do vetor intermediário foram coletados. (4) De acordo com a sequência de síntese de gene GAT otimizada, a montante e a jusante do gene contém um sítio de digestão de enzima único XhoI, e o gene GAT otimizado e a cadeia principal de vetor obtidos a montante em (3) foram ligados ao vetor recombinante pKT-rGE; e sua sequência completa é a SEQ ID NO: 1.

[0079]Na SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências, os nucleotídeos nas posições 9.789 a 10.360 da extremidade 5’ são o promotor melhorado 35S de peptídeo principal Rbcs e gene resistente ao glifosato Rbcs-EPSPS (G2-aroA), os nucleotídeos nas posições 8.204 a 9.784 da extremidade 5’ são o peptídeo principal Rbcs e o gene resistente ao glifosato Rbcs-EPSPS (G2-aroA), os nucleotídeos nas posições 7.926 a 8.196 da extremidade 5’ são o terminador NOS de gene resistente ao glifosato EPSPS (G2-aroA), os nucleotídeos nas posições 6.903 a 7.673 da extremidade 5’ são o 35S melhorado de gene degradante de glifosato, gene de N-acetiltransferase, os nucleotídeos nas posições 6.456 a 6.896 da extremidade 5’ são o gene degradante de glifosato, gene de N-acetiltransferase GAT e os nucleotídeos nas posições 6.248 a 6.455 da extremidade 5’ são o terminador CaMV 35S polyA de gene de degradação de glifosato, gene de N- acetiltransferase.

2. A obtenção de soja transgênica 1) A obtenção de agrobacterium tumefaciens recombinante

[0080]O vetor recombinante pKT-rGE obtido acima em 1 foi introduzido em agrobacterium tumefaciens Ag10 para obter a agrobactéria recombinante Ag10/pKT-rGE.

2) A obtenção de uma planta de soja regenerada

[0081]A agrobactéria recombinante Ag10/pKT-rGE foi transformada em explante de nó cotiledonar de soja cultivada in vitro (Glycine max), Zhonghuang10, cocultivando durante 3 dias após o explante ter sido infectado por agrobactéria, a planta transgênica foi induzida por meio de via de regeneração de órgão sob o ambiente de triagem que contém glifosato, no estágio de indução de múltiplos brotos, 15 mg/l de glifosato (Sigma Company) foram usados como o agente de triagem para induzir durante 3 a 6 semanas; no estágio de indução de alongamento de broto, 5 mg/l de glifosato (Sigma Company) foram usados como o agente de triagem para induzir durante 4 a 8 semanas; nos estágios de indução e alongamento, os meios de cultura foram substituídos uma vez a cada 2 semanas, o que resultou na regeneração de células transformadas, a fim de inibir o crescimento rápido de agrobacterium tumefaciens, 150 mg/l de Cefalotina e 400 mg/l de Carbenicilina foram adicionados nos meios de indução e alongamento, respectivamente, e quando o alongamento de broto se alongou de 4 a 6 cm, o mesmo foi transferido para os meio de cultura de enraizamento para induzir o enraizamento, de modo a obter uma planta de soja regenerada.

3) Identificação de soja transgênica (1) Triagem de glifosato

[0082]A planta regenerada foi transplantada no solo e foi continuamente cultivada em uma estufa ou uma incubadora, em que a condição de luminosidade é 16 h de luz e 8 h de escuro, e no primeiro ao terceiro estágios de folha de composto, cada transformante independente foi tratado por aspersão com sal de glifosato isopropilamina (Roundup), e uma solução aquosa de herbicida foi aplicada em uma dosagem de 1,5 l/hectare de sal de glifosato isopropilamina (Roundup) com um aspersor de calibração. 2 semanas após a aplicação de glifosato, a resposta de cada planta ao tratamento com glifosato foi investigada, em que 5 transformantes exibem forte tolerância em relação ao tratamento por aspersão de 1,5 l/hectare de sal de glifosato isopropilamina (Roundup) (numerado como ZH10-1, 2, 3, 5, 6), em que a tolerância de N° ZH10-6 é mais alta e seu crescimento é exuberante, a atividade de crescimento não é afetada e não há sintomas de amarelecimento e clorose nas folhas em comparação à planta de controle (Zhonghuang10); as plantas regeneradas numeradas como ZH10-1, 2, 3, 5, 6 são de geração T0 de soja transgênica, e a resistência a glifosato da geração T0 de soja transgênica é mais alta que a da soja de tipo selvagem, Zhanghuang10.

(2) Triagem por PCR

[0083]A reação em cadeia de polimerase (PCR) é usada para identificar a presença de genes de EPSPS (G2-aroA) e GAT, em que 20 a 50 mg de folhas novas frescas foram coletadas de geração T0 de plantas de soja transgênica numeradas como ZH10-1, 2, 3, 5, 6 e foram colocadas em um tubo de centrifugação de 2 ml para extrair o DNA de genoma da planta, e p método de extração de DNA se refere ao método introduzido por Murray e Thompson (1980). A reação PCR foi realizada com o uso de um kit de PCR EX-Taq produzido pela Takara Company de acordo com a especificação, e o sistema de reação PCR de 20 µl continha 2 µl de tampão 10*EX-Taq, 2 µl de dNTPs a 2 mM, cada 0,5 µl de 10 µM de iniciadores a montante e a jusante de gene específico, 0,2 µl de enzima EX-Taq, e a água balanceada a 20 µl; e o procedimento de reação PCR foi a 94 °C durante 4 min. (1 ciclo); 35 ciclos a 94 °C durante 30 s (desnaturação), 60 °C durante 30 s (recozimento) e 72 °C durante 45 s (extensão); e 72 °C (extensão final) durante 10 min. (1 ciclo).

[0084]O par de iniciadores de EPSPS (G2-aroA) foi amplificado, e o par de iniciadores que pode produzir 743 bp de produto foi positivo:

[0085]5’-ACCAGGAGCCTTGTACCTTGAG-3’ (SEQ ID NO: 2) e 5’- ATCGGGTTCGATCAGGTAATC-3’ (SEQ ID NO: 3)

[0086]O par de iniciadores de gene GAT foi amplificado, e o par de iniciadores que pode produzir 338 bp de produto foi positivo;

[0087]5’-CTCAGACCAAACCAGCCGATAG-3’ (SEQ ID NO: 4) e 5’- GTGTCGAATACCTCTCCCTGCTC3’ (SEQ ID NO: 5)

[0088]Os resultados de identificação por foram mostrado na Figura 1, em que M é Marcador de DNA de 100 bp; 1 é controle negativo de Zhonghuang10 do tipo selvagem; 2 é controle de água estéril; 3 é o controle positivo de plasmídeo pKT-rGE; 4, 5, 6, 7 e 8 são soja transgênica ZH10-1, 2, 3, 5 e 6, respectivamente; os resultados demonstraram que as sojas transgênicas numeradas como ZH10-1, 2, 3, 5 e 6 foram todas positivas, e as sojas transgênicas numeradas como ZH10- 1, 2, 3, 5 e 6 foram todas introduzidas com os EPSPS e GAT de genes exógenos. As sementes dessa soja transgênica foram colhidas com o uso de método de cultivo e melhoramento genético tradicional para melhorar geneticamente a soja transgênica que tem resistência a glifosato.

Exemplo 2. Análise de resistência a glifosato de soja transgênica

[0089]Após diversas gerações contínuas de análise de resistência a glifosato terem sido realizadas na geração T0 de soja transgênica ZH10-6 obtida no Exemplo 1, verificou-se que a soja transgênica ZH10-6 possui resistência mais significativa ao glifosato que o controle não transgênico, Zhonghuang10, o especificado foi conforme a seguir:

[0090]As sementes de geração T0 de soja transgênica ZH10-6 foram coletadas e semeadas para obter a geração T1 de soja transgênica ZH10-6, cada cepa das quais foi manchada com 1 µl de solução de estoque de sal de glifosato isopropilamina (Roundup) (0,3 mg a.e.µl-1de glifosato) no estágio de semeadura (um estágio no qual cotilédones são epigeais, e as folhas verdadeiras não se espalharam completamente), e a reação de fitotoxidade foi investigada após 2 semanas.

[0091]Os fenótipos das plantas que não são resistentes ao glifosato são que as folhas perdem umidade e se tornam cloróticas, as folhas se enrolam e encolhem e o meristema apical se torna necrótico, até que toda a planta morra; os fenótipos das plantas que são resistentes ao glifosato são que a tendência de crescimento é exuberante e as folhas não se tornam cloróticas, se enrolam ou encolhem.

[0092]Os resultados de identificação de geração T1 de soja transgênica ZH10-6 foram mostrados na Figura 3, 1: planta única T1 não resistente; 2: planta única T1 não tratada; 3: planta única T1 resistente, o que mostra que a tolerância de planta única T1 da soja transgênica ZH10-6 nos estágios de semeadura ao tratamento de 1 µl de solução de estoque de sal de glifosato isopropilamina (Roundup) por cepa existe segregação, três cepas foram tratadas, em que a sobrevivência indicou que a cepa tem resistência, e a morte indicou que a cepa não tem resistência, e foram duas plantas resistente, e uma planta não resistente; em comparação à geração T1 não tratada de soja transgênica ZH10-6, a geração T1 resistente de planta única foi alta em tamanho, sua tendência ao crescimento não foi inibida e as folhas não se tornaram cloróticas. Portanto, a geração T1 resistente de planta única é identificada como geração T1 resistente ao glifosato de soja transgênica ZH10-6 por manchamento.

[0093]Na dosagem de manchamento acima, Zhonghuang10 não possui quaisquer resistências, e todas as plantas murcharam e morreram após 2 semanas. As sementes de geração T1 de planta única de soja transgênica ZH10- 6 foram coletadas através de método de melhoramento genético convencional, e semeadas para obter a geração T2 de soja transgênica ZH10-6. As identificações de aspersão de cepas diferentes de geração T2 de soja transgênica foram realizadas com 3 l/hectare e 6 l/hectare de sal de glifosato isopropilamina (Roundup), respectivamente, e duas cepas transgênicas ZH10-6 de gerações T2, cuja resistência não foi segregada, foram triadas como geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6;

[0094]O tratamento com aspersão de duas cepas homozigóticas de geração T2 de soja transgênica ZH10-6, do material transgênico tolerante a glifosato Ag4501 introduzido com CP4-EPSPS (Wang Xiurong, Liao Hong, He Yong, et al., Variations for Protein and Oil Content of Different Soybean Cultivars, Journal Of South China Agricultural University, 2006, 27(3): 9-11) e do Zhonghuang10 de controle do tipo selvagem foi realizado com 12 litros/hectare de sal de glifosato isopropilamina (Roundup).

[0095]Os resultados foram mostrados na Figura 5, 1: A geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6, não tratada; 2: geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6, aspergida com 12 l/hectare de sal de glifosato isopropilamina (Roundup); 3: material transgênico resistente ao glifosato Ag4501 introduzido com CP4-EPSPS, aspergido com 12 l/hectare de sal de glifosato isopropilamina (Roundup); 4: material transgênico resistente ao glifosato Ag4501 introduzido com CP4-EPSPS, não tratado; 5: folhas novas de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6 aspergidas com 12 l/hectare de sal de glifosato isopropilamina (Roundup) não ficaram amarelas ou se tornaram cloróticas; 6: folhas novas de material transgênico resistente ao glifosato Ag4501 introduzido com CP4-EPSPS, aspergidas com 12 l/hectare de sal de glifosato isopropilamina (Roundup) ficaram amarelas e se tornaram cloróticas; o que mostra que, em comparação ao controle não aspergido, não houve planta murcha ou morta nas duas cepas homozigóticas acima, e o crescimento das duas cepas homozigóticas acima não foi inibido, as folhas não se tornaram cloróticas ou encolheram. Além disso, sob a condição de tratamento com aspersão com uma alta concentração de 12 l/hectare de sal de glifosato isopropilamina (Roundup), em comparação ao material transgênico resistente ao glifosato introduzido com CP4- EPSPS, as folhas novas das duas cepas homozigóticas de geração T2 de soja transgênica ZH10-6 acima não ficaram amarelas ou se tornaram cloróticas, e ambas exibiram forte tolerância à identificação de aspersão com alta concentração de glifosato.

[0096]Na dosagem de aspersão acima, Zhonghuang10 não possui qualquer resistência, e todas as plantas murcharam e morreram após 2 semanas;

[0097]As duas cepas homozigóticas de geração T2 de soja transgênica ZH10-6 acima têm resistência mais alta a glifosato do que Zhonghuang10, e possui um melhor prospecto de melhoramento genético e valor de utilidade.

[0098]Após a cepa homozigótica de soja transgênica resistente ao glifosato ZH10-6 ter sido obtida, a resistência pode ser herdada de forma estável em suas progênies.

Exemplo 3. A análise de número de cópias e estabilidade de integração de molécula de DNA exógeno na soja transgênica 1. Número de cópias do T-DNA exógeno integrado

[0099]O número de cópias do fragmento de DNA exógeno integrado dentro do genoma de geração T1 resistente ao glifosato de soja transgênica ZH10-6 foi determinado através de análise de Southern blot de fragmentos de restrição que se estendem fora da sequência de borda esquerda e sequência de borda direita do vetor de transformação usado.

[00100]A sonda para análise de Southern blot é uma sonda (SEQ ID NO: 6) projetada a partir da sequência de DNA de vetor de 338 bp selecionada a partir de região de T-DNA do vetor, e uma sonda de identificação de Digoxigenina foi preparada referindo-se à instrução de operação de um kit de identificação DIG por processo de PCR produzido pela Meilaibo Medical Technology Co., Ltd. De Pequim.

[00101]De acordo com a instrução de operação do kit de hibridização de Digoxigenina produzido pela Meilaibo Medical Technology Co., Ltd. de Pequim, o plasmídeo recombinante usado pKT-rGE foi um controle positivo, e o DNA de genoma de Zhonghuang10 foi um controle negativo. O DNA de genoma de geração T1 resistente ao glifosato de soja transgênica ZH10-6 obtido no Exemplo 2 acima foi extraído, e 50 a 70 µg de DNA de genoma foi digerido em 200 µl de sistema de digestão de enzima a 37 °C durante 5 a 10 h com 5 unidade de enzimas de restrição, e o DNA digestivo foi precipitado e foi redissolvido em 25 µl de água estéril; 6 µl de 6 X tampão de carregamento foram adicionados a cada amostra e o DNA foi separado a 45V de tensão em eletroforese em gel de agarose a 0,8 a 1,0% para o DNA digestivo, controle positivo, controle negativo, marcador de peso molecular padrão (marcador de peso molecular de DNA III, identificado por Digoxigenina (Roche) e marcador ÀHind III). O DNA foi observado com o uso de brometo de etídeo, e uma régua fluorescente foi usada para fotografar e registrar. Então, o DNA foi transferido para uma membrana de náilon Hybond referindo-se à instrução de operação de Sistema de transferência Rapid Downward da Whatman Schleicher&Schuell Company, e foi hibridizado com uma sonda, e os resultados de hibridização foram exibidos através do método de exibição química (Meilaibo Medical Technology Co., Ltd. de Pequim).

[00102]A determinação do número de cópias pode ser realizada analisando-se os DNAs de genoma adjacentes à região de borda esquerda e à região de borda direita, e os DNAs de genoma foram digeridos com enzimas de restrição DraI, HindIII e XbaI.

[00103]Os resultados de hibridização de Southern blot com enzimas diferentes foram mostrados na Figura 2, 1: Marcador DIG, 2: Controle positivo de plasmídeo pKT-rGE, 3: ZH10-6-HindIII (o genoma de geração T1 resistente ao glifosato de soja transgênica ZH10-6 digerido com HindIII), 4: ZH10-6-XbaI (o genoma de geração T1 resistente ao glifosato de soja transgênica ZH10-6 diferido com XbaI), 5: ZH10-6-DraI (o genoma de geração T1 resistente ao glifosato de soja transgênica ZH10-6 digerido com DraI), 6: controle negativo de Zhonghuang10; e os resultados indicaram que o DNA exógeno integrado foi inserido em cópia única.

2. Análise por PCR de geração T1 de soja transgênica ZH10-6

[00104]O DNA de genoma de planta única de geração T1 de soja transgênica ZH10-6 no Exemplo 2 foi extraído, e amplificação por PCR foram respectivamente realizadas em 20 µl de sistema de reação PCR com o uso de cerca de 50 ng de DNA de genoma como DNA modelo e com o uso do par de iniciadores de EPSPS (G2-aroA) e do par de iniciadores de gene GAT amplificados no Exemplo 1.

[00105]Os resultados foram mostrados na Figura 4, 1: marcador de DNA de 100 bp; 2, 3: controle de água estéril; 4: controle negativo de Zhonghuang10; 5: geração T1 não resistente ao glifosato de soja transgênica ZH10-6; 6, 7: geração T1 resistente ao glifosato de soja transgênica ZH10-6; e 8: controle positivo de plasmídeo pKT-rGE, pode-se observar que, a geração T1 não resistente ao glifosato de soja transgênica ZH10-6 não possui produtos alvo, e a geração T1 resistente ao glifosato de soja transgênica ZH10-6 possui produtos alvo.

3. Análise por PCR de cepa resistente homozigótica

[00106]O DNA de genoma de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6 obtido no Exemplo 2 foi extraído, e amplificações por PCR foram respectivamente realizadas em 20 µl de sistema de reação PCR com o uso de cerca de 50 ng de DNA de genoma como DNA modelo e com o uso de par de iniciadores de EPSPS (G2-aroA) e de par de iniciadores de gene GAT amplificados no Exemplo 1.

[00107]Os resultados foram mostrados na Figura 6, 1 a 19: plantas únicas diferentes de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6; 20: plasmídeo pKT-rGE como um controle positivo; 21, 22: controle de água estéril; 23, 24: controle negativo de Zhanghuang10 do tipo selvagem; M: marcador de DNA de 100 bp, o que indica que as plantas únicas de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6 foram todas PCR positivas, foram todas inserções homozigóticas confirmadas por identificação molecular e corresponderam completamente à resistência a glifosato.

Exemplo 4. A determinação de posição de inserção da molécula de DNA exógeno na soja transgênica

[00108]O DNA de genoma de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6 obtido no Exemplo 2 foi extraído com método de CTAB aprimorado, e a análise de sequenciamento da geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6 acima tomando-se o genoma de soja publicado como controle (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias =Org_Gmax; 2010). Verificou-se por meio de análise de alinhamento que na geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6, o T-DNA foi inserido em posições físicas 7.980527 a 7.980.541 do cromossomo 17 da soja, mas não foi inserido em região de codificação de gene endógeno conhecida da soja. A integração de T-DNA substitui a sequência de base de 13 bp no genoma, e a sequência substituída foi 5’ CAAATGCAAAAAT 3’ (SEQ ID NO: 7), e essa sequência substituída não destruiu a região de codificação de gene endógeno da soja.

[00109]A amplificação por PCR foi realizada na região de ligação do T- DNA exógeno e do DNA de genoma na posição de inserção para verificar a posição de inserção do T-DNA exógeno, os resultados demonstraram, ainda, a correção de posição de inserção de T-DNA. Os resultados de inserção de T-DNA de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6 foram mostrados na Figura 7 em que a sequência de flanqueamento a montante de extremidade 5’ do T-DNA exógeno inserida na geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6 foi a SEQ ID NO: 8, e a sequência de flanqueamento a jusante de extremidade 3’ do T-DNA exógeno foi a SEQ ID NO: 9.

[00110]Adicionalmente, por meio de análise de sequenciamento, pode ser sabido que a sequência de T-DNA exógeno completa inserida em geração T2 de soja transgênica ZH10-6 foi a SEQ ID NO: 10, a molécula de DNA exógeno de inserção exógena integrada tinha 4.739 bp e a integração de molécula de DNA exógeno dessa soja transgênica não continha uma sequência de cadeia principal de vetor.

[00111]Os resultados acima indicaram que a geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6 é uma planta resistente ao glifosato, que, por meio de análise de sequência de flanqueamento e sítio de inserção, é uma soja transgênica obtida inserindo-se a SEQ ID NO: 10 ou os nucleotídeos nas posições 6.189 a 10.927 de extremidade 5’ na SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências nas posições 7.980.527 a 7.980.541 do cromossomo 17 no genoma da soja Zhonghuang10, para substituir a sequência de base de 13 bp nas posições 7.980.528 a 7.980.540 do cromossomo 17, e a sequência de nucleotídeos do fragmento flanqueador a montante que está a montante do nucleotídeo na posição 7.980.527 e imediatamente adjacente ao nucleotídeo na posição 7.980.527 é a SEQ ID NO: 8, e a sequência de nucleotídeos do fragmento de flanqueamento a jusante que está a jusante do nucleotídeo na posição 7.980.541 e imediatamente adjacente ao nucleotídeo na posição 7.980.541 é a SEQ ID NO: 9; e a SEQ ID NO: 10 é uma molécula de DNA que contém o gene de 5-enolpiruvilxiquimato-3-fosfato sintase e o gene de N-acetiltransferase.

[00112]Pode-se observar que a posição de inserção e as sequências de flanqueamento em ambos os lados da molécula de DNA exógeno podem ser usadas para identificar se a mesma é ou é derivada da soja transgênica alvo (geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6).

[00113]A geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6 (chamada de ZH10-6) foi depositada no Centro Geral de Coleção de Culturas Microbiológicas da China (chamada de CGMCC em abreviação, endereço: Construção N° 3, Pátio N° 1, Beichen west Road, Distrito de Chaoyang, Pequim, Instituto de Microbiologia, Academia Chinesa de Ciências, código postal: 100101) em 1° de dezembro de 2015, tinha um N° de Depósito de CGMCC N° 11108, e foi classificada e nomeada como Glycines max.

Exemplo 5. O método para detectar soja transgênica

[00114]A fim de detectar de forma mais rápida e oportuna se a soja transgênica a ser detectada é uma geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6, de acordo com a posição de inserção da molécula de DNA exógeno e suas sequências de genes de flanqueamento a montante e a jusante no Exemplo 4, iniciadores específicos foram desenvolvidos e o método de identificação por PCR qualitativo de soja transgênica resistente ao glifosato ZH6- 10 e suas progênies para autopolinização ou hibridização foi estabelecido.

[00115]Os iniciadores ZH10P-1 e GAT-1 (par de iniciadores 1) foram projetados de acordo com a sequência de flanqueamento a montante (SEQ ID NO: 8) de DNA de genoma de soja de extremidade 5’ de T-DNA exógeno inserido e fragmento de gene GAT no T-DNA exógeno inserido (SEQ ID NO: 10); e os iniciadores G2EP-2 e ZH10P-2 (par de iniciadores 2) foram projetados de acordo com fragmento de gene EPSPS no T-DNA exógeno inserido (SEQ ID NO: 10) e a sequência de flanqueamento a jusante (SEQ ID NO: 9) de DNA de genoma de soja de extremidade 3’ do T-DNA exógeno inserido (Figura 8).

[00116]As sequências foram conforme a seguir:

[00117]Par de iniciadores 1:

[00118]Iniciador ZH10P-1: 5' TAATAGTAGAATGGGACTGGTGGAT 3' (SEQ ID NO: 11)

[00119]Iniciador GAT-1: 5' GCGGACTTGCTTTGGTGTAAT 3' (SEQ ID NO: 12).

[00120]Par de iniciadores 2:

[00121]Iniciador G2EP-2: 5' CCCGAATCATCAGGCAAACA 3' (SEQ ID NO: 13)

[00122]Iniciador ZH10P-2: 5' AACACATCATAGTATTCTAAAACGCTT 3' (SEQ ID NO: 14).

[00123]A extração de DNA de genoma de soja e a reação PCR se referiram ao método no Exemplo 1, e a amplificação por PCR foi realizada com o par de iniciadores 1 acima. Não houve banda de amplificação em água assim como planta não transgênica, as bandas alvo foram amplificadas em DNA de genoma de folhas, sementes, caules e flores de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6, e os resultados foram mostrados na Figura 9A, M, Marcador de DNA DL 2K Plus; 1, água; 2, soja não transgênica Zhonghuang10; 3, folhas de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6; 4, sementes de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6; 5, flores de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6; e 6, caules de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6, indicando que a amplificação de DNA de genoma de folhas, sementes e caules de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6 todas obtiveram fragmento alvo específico de 810 bp , e a sequência de nucleotídeos específica desse fragmento alvo foi mostrada na SEQ ID NO: 15, diferente da soja não transgênica Zhonghuang10 que não possuiu fragmento alvo.

[00124]A extração de DNA de genoma de soja e a reação PCR se referiram ao método no Exemplo 1, e a amplificação por PCR foi realizada com o par de iniciadores 2 acima. Não houve banda de amplificação em água assim como planta não transgênica, as bandas alvo foram amplificadas em DNA de genoma de folhas, sementes, flores e caules de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6, e os resultados foram mostrados na Figura 9B, M, Marcador de DNA DL 2K Plus; 1, água; 2, soja não transgênica Zhonghuang10; 3, folhas de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6; 4, sementes de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6; 5, flores de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6; e 6, caules de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6, indicando que a amplificação de DNA de genoma de folhas, flores, sementes e caules de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6 todas obtiveram fragmento alvo específico de 1627 bp , e a sequência de nucleotídeos específica desse fragmento alvo foi mostrada na SEQ ID NO: 16, diferente da soja não transgênica Zhonghuang10 que não possuiu fragmento alvo.

[00125]Pode-se observar a partir do supracitado que o DNA de genoma da amostra a ser testada foi extraído como um modelo, a amplificação por PCR foi realizada com o par de iniciadores 1 e o par de iniciadores 2 e os resultados de amplificação por PCR foram detectados:

[00126]Caso um fragmento alvo de 810 bp tenha sido obtido por amplificação com o par de iniciadores 1 e um fragmento alvo de 1.627 bp tenha sido obtido por amplificação com o par de iniciadores 2, a soja transgênica a ser detectada foi a de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6 obtida no Exemplo 4;

[00127]Caso o fragmento alvo de 810 bp não tenha sido obtido por amplificação com o par de iniciadores 1 e/ou o fragmento alvo de 1.627 bp não tenha sido obtido por amplificação com o par de iniciadores 2, a soja transgênica a ser detectada não foi a de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6 obtida no Exemplo 4.

[00128]Os experimentos demonstraram que a amplificação por PCR com as sequências de flanqueamento de soja transgênica ZH10-6 podem especificamente detectar características moleculares de soja transgênica ZH10-6 para identificar a soja transgênica acima assim como suas progênies, células, sementes, órgãos nutritivos, etc.

Exemplo 6. As aplicações do método para detectar soja transgênica

[00129]Heihe 43 (Heihe 43, seu número de Comissão ZDD24325), que é registrado na literatura a seguir: New Early Maturing Soybean Variety Heihe No. 43 with High Quality and High Yeld, Jia Hongchang, et al., Heilongjiang Agricultural Sciences, 2007, 05: 124 a 125;

[00130]Heihe38 (Heihe38, seu número de Comissão ZDD24320), que é registrado na literatura a seguir: Selection and Genetic Composition of Soybean Variety Heihe38, Wu Ji-an, Journal Of planta Genetic Resources, 2007, 3: 313 e 316;

[00131]Keshan 1 (Keshan 1, Guoshendou2009002), que [e registrado na literatura a seguir: Development of A New Soybean Variety ‘Keshan No.1’ by Using Space-induced Mutation, Zhang Yong, et al., Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2013, 27(9): 1.241 a 1.246;

[00132]Kenfeng 16 (Kenfeng 16, seu número de Comissão ZDD24344), que é registrado na literatura a seguir: Breedin and analysis of soybean variety Kenfeng 16, Yang Danxia, et al., Soybean Science & Technology, 2010, 3: 65 e 66;

[00133]Kenfeng 20 (Kenfeng 20, Heikenshendou2008004), que é registrado na literatura a seguir: Studies of Tastes of Soybean Milk from Different Soybean Varieties, Jiang Yujiu, et al., Soybean Science & Technology, 2015, 04: 11 a 13;

[00134]Kenfeng 22 (Kenfeng 22, seu número de Comissão ZDD24348), que é registrado na literatura a seguir: Breeding and culture technique for new soybean variety Kenfeng22, Yang Danxia, et al., Soybean Science & Technology, 2010, 01: 64 e 65.

[00135]As sementes de F1 foram preparadas por técnica de melhoramento genético por cruzamento convencional com as variedades de soja Heihe 43, Heihe38, Keshan 1, Kenfeng 16, Kenfeng 20, Kenfeng 22, etc. principalmente plantadas na China como progenitor fêmea e geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6 (resistente ao glifosato, doravante chamada de ZH10-6) como progenitor macho. As sementes de F1 foram colhidas e plantadas, no primeiro ao terceiro estágios de folha de composto ternamente, 200 ml/mu de glifosato foram aspergidos, as sementes de cepa única F1 híbrida, que é resistente a 200 ml/mu de glifosato aspergido, foram colhidas, e F2 foi plantado; combinações híbridas diferentes de materiais F2 foram aspergidas com 800 ml/mu de sal de glifosato isopropilamina (Roundup, Monsanto, Co).

[00136]Os resultados de identificação de tolerância de população F2 ao glifosato são mostrados na Tabela 1, que indica que a resistência é estavelmente hereditária nas progênies híbridas e está em conformidade com a taxa de segregação de 3:1, e demonstraram, ainda, que o gene exógeno tem somente um sítio de inserção no genoma de ZH10-6, que é consistente com o resultado de cópia única detectado por Southern. A Tabela 1 Análise de resistência/suscetibilidade da tolerância de população de segregação F2 derivada de ZH10-6 para glifosato

[00137]O DNA da planta de combinações híbridas diferentes de cepa única resistente de F2 assim como o DNA de raízes, caules, folhas, flores e sementes da mesma foram aleatoriamente extraídos, amplificações por PCR foram realizadas com o uso do DNA acima como modelo e o par de iniciadores 1 e o par de iniciadores 2 no Exemplo 5, e as sojas não transgênicas Heihe 43 e Heihe38, foram usados como controles negativos; os resultados de amplificação foram mostrados na Figura 10 e na Figura 11.

[00138]Os resultados de eletroforese de produtos de PCR de cepa única de F2 resistente foram mostrados na Figura 10, A: o resultado de amplificação do par de iniciadores 1; B: o resultado de amplificação do par de iniciadores 2; 1: Marcador de DNA de 200 bp; 2: controle de água estéril; 3, 4: sojas não transgênicas, Heihe 43 e Heihe38; 5 a 25: a cepa única de F2 híbrida resistente aleatoriamente selecionada; os resultados indicaram que não houve banda de amplificação na água e em plantas não transgênicas, as bandas alvo de 810 bp (Figura 10A) e 1.626 bp (Figura 10B) foram amplificadas por DNA de genoma de cepa única de geração de F2 resistente e as sequências de nucleotídeos de fragmento de 810 e de fragmento de 1.626 bp foram SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente.

[00139]Portanto, a cepa única de planta que é detectada como positiva por PCR é uma progênie híbrida de geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6.

[00140]Os resultados de eletroforese de produtos de PCR de raízes, caules, folhas, flores e sementes de cepa única de F2 resistente foram mostrados na Figura 11, A: o resultado de amplificação do par de iniciadores 1; B: o resultado de amplificação do par de iniciadores 2; 1: Marcador de DNA de 200 bp; 2: controle de água estéril; 3 a 7: raízes, caules, folhas, flores e sementes de F2 resistente; e 8 a 12: raízes, caules, folhas, flores e sementes de planta não transgênica, Heihe 43; pode-se observar que não houve bandas de amplificação na água e em planta não transgênica, as bandas alvo de 810 bp (Figura 11A) e 1.626 bp (Figura 11B) foram amplificadas por DNA de raízes, caules, folhas, flores e sementes de geração de F2 resistente, e as sequências de nucleotídeos de fragmento de 810 bp e de fragmento de 1.626 bp foram SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, respectivamente.

[00141]Portanto, pode ser detectado se essa plante é derivada da geração T2 de cepa homozigótica de soja transgênica ZH10-6, e suas progênies híbridas derivadas de quaisquer tecidos de planta, tais como raízes, caules, folhas, flores, sementes, etc.

APLICAÇÕES INDUSTRIAIS

[00142]Os experimentos da presente invenção demonstraram que a presente invenção obtém uma soja transgênica que contém fragmento de DNA exógeno inserindo-se o fragmento de DNA exógeno nas posições 7.980.527 a 7.980.541 no cromossomo 17 da soja; o fragmento de DNA exógeno compreende o gene de resistência a glifosato G2-aroA e o gene degradante de glifosato de gene de N-acetiltransferase, gene GAT; a resistência de soja transgênica ao glifosato é mais alta que a da soja não transgênica do tipo selvagem. Essa soja transgênica tem tolerância a alta dosagem de glifosato, e pode ser aprimorada, ainda, por mutagênese ou hibridização com boas cepas de soja para otimizar outras características agronômicas, tais como rendimento, qualidade, etc. Essa soja introduzida com fragmento de DNA exógeno coexpressa gene EPSPS de resistência a glifosato (G2-aroA) e gene de N-acetiltransferase de gene degradante de glifosato (GAT), no estádio de semeadura (um estágio no qual cotilédones são epigeais, e as folhas verdadeiras não se espalharam completamente), a cepa única tem tolerância ao tratamento com solução de estoque de 1 a 1,5 µl de sal de glifosato isopropilamina (Roundup), e no campo tem tolerância ao tratamento de cerca de 3 a 12 litros/hectare de sal de glifosato isopropilamina (Roundup). A medida padrão total obtida de bom controle de ervas daninhas varia entre 3 a 6 litros/hectare, que depende da pressão de ervas daninhas. Quando a soja transgênica da presente invenção for tratada sob essas concentrações ou até mesmo concentrações mais altas (12 litros/hectare), o tratamento com herbicida não produz quaisquer efeitos mensuráveis nas características, tais como vitalidade de plantas, permanência do verde das folhas, etc.

Claims (8)

1. Método para melhoramento genético de uma soja transgênica CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: inserir um fragmento de DNA exógeno nas posições 7.980.527 a 7.980.541 do cromossomo 17 do genoma da soja alvo para substituir a sequência de base de 13 bp nas posições 7.980.527 a 7.980.541 do cromossomo 17 para, assim, obter a soja transgênica; a resistência a glifosato da soja transgênica é mais alta que a da soja alvo; o fragmento de DNA exógeno é uma molécula de DNA que contém o gene de 5-enolpiruvilxiquimato-3-fosfato sintase e o gene de N-acetiltransferase; o gene de 5-enolpiruvilxiquimato-3-fosfato sintase é G2-aroA; o gene de N-acetiltransferase é GAT; e o fragmento de DNA exógeno é SEQ ID NO: 10 ou nucleotídeos nas posições 6189 a 10927 da extremidade 5’ da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que: um fragmento de flanqueamento a montante do fragmento de DNA exógeno na soja transgênica é qualquer um dentre os fragmentos de DNA com um comprimento de 0 a 5 kb obtidos pela extensão de um nucleotídeo na posição 7.980.527 no cromossomo 17 do genoma de soja alvo para sua direção a montante; e um fragmento de flanqueamento a jusante do fragmento de DNA exógeno na soja transgênica é qualquer um dentre os fragmentos de DNA com um comprimento de 0 a 5 kb obtidos pela extensão de um nucleotídeo na posição 7.980.541 no cromossomo 17 do genoma de soja alvo para sua direção a jusante, o fragmento de flanqueamento a montante é nucleotídeos apresentados como na SEQ ID NO: 8 na Listagem de Sequências; e o fragmento de flanqueamento a jusante é nucleotídeos apresentados como na SEQ ID NO: 9 na Listagem de Sequências.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que: o fragmento de DNA exógeno é introduzido na soja alvo por meio de um vetor recombinante que contém o fragmento de DNA exógeno; a sequência de nucleotídeos do vetor recombinante é SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências; e a soja alvo é Zhonghuang10.

4. Método para detectar ou detectar de modo auxiliar se uma amostra de planta e/ou seus produtos é derivada da soja transgênica preparada pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou progênies da mesma, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as seguintes etapas: detectar se o DNA do genoma da amostra de planta e/ou seus produtos contém fragmento de DNA A, o fragmento de DNA A é constituído por um fragmento de flanqueamento a montante do fragmento de DNA exógeno na soja transgênica, como definido na reivindicação 1, o fragmento de DNA exógeno, como definido na reivindicação 1, e o fragmento de flanqueamento a jusante do fragmento de DNA exógeno na soja transgênica, como definido na reivindicação 1; caso contenha o fragmento de DNA A, a amostra de planta e/ou seus produtos é ou é uma candidata para a soja transgênica ou progênies da mesma; caso não contenha o fragmento de DNA A, a amostra de planta e/ou seus produtos não é ou não é uma candidata para a soja transgênica ou progênies da mesma; em que o fragmento de flanqueamento a montante é nucleotídeos apresentados como na SEQ ID NO: 8 na Listagem de Sequências; o fragmento de flanqueamento a jusante é nucleotídeos apresentados como na SEQ ID NO: 9 na Listagem de Sequências; e o fragmento de DNA exógeno é como na SEQ ID NO: 10 ou nucleotídeos nas posições 6189 a 10927 da extremidade 5’ da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que: o método é 1) ou 2) ou 3) conforme a seguir: 1) sequenciar diretamente o DNA do genoma da amostra de planta e/ou seus produtos, e julgar se a amostra de planta sequenciada e/ou seus produtos contém o fragmento de DNA A; 2) realizar amplificação por PCR com o par de iniciadores 1 ou o par de iniciadores 2, caso haja produto de amplificação alvo, a amostra de planta e/ou seus produtos contém o fragmento de DNA A; o par de iniciadores 1 é um par de iniciadores que pode amplificar a molécula de DNA 1 constituída pela extremidade 5’ do fragmento de DNA exógeno e fragmento parcial ou inteiro da sequência de flanqueamento a montante que é imediatamente adjacente à extremidade 5’ do fragmento de DNA exógeno; e seu produto de amplificação alvo correspondente é a molécula de DNA 1; o par de iniciadores 2 é um par de iniciadores que pode amplificar a molécula de DNA 2 constituída pela extremidade 3’ do fragmento de DNA exógeno e fragmento parcial ou inteiro da sequência de flanqueamento a jusante que é imediatamente adjacente à extremidade 3’ do fragmento de DNA exógeno; e seu produto de amplificação alvo correspondente é a molécula de DNA 2; ou 3) realizar a hibridização de Southern da amostra de planta e/ou seus produtos de DNA a ser testado com uma sonda que pode especificamente se ligar à molécula de DNA 1 ou à molécula de DNA 2, caso as mesmas possam se hibridizar para obter um fragmento hibridizado, a amostra de planta é derivada da soja transgênica ou progênies da mesma; em que o fragmento de flanqueamento a montante é nucleotídeos apresentados como na SEQ ID NO: 8 na Listagem de Sequências; o fragmento de flanqueamento a jusante é nucleotídeos apresentados como na SEQ ID NO: 9 na Listagem de Sequências; e o fragmento de DNA exógeno é como na SEQ ID NO: 10 ou nucleotídeos nas posições 6189 a 10927 da extremidade 5’ da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que: em 2), o par de iniciadores 1 é constituído por uma molécula de DNA de filamento único conforme apresentada na SEQ ID NO: 11 na Listagem de Sequências e uma molécula de DNA de filamento único conforme apresentada na SEQ ID NO: 12 na Listagem de Sequências; o par de iniciadores 2 é constituído por uma molécula de DNA de filamento único conforme apresentada na SEQ ID NO: 13 na Listagem de Sequências e uma molécula de DNA de filamento único conforme apresentada na SEQ ID NO: 14 na Listagem de Sequências; em 3), a sequência de nucleotídeos da sonda é a SEQ ID NO: 6.

7. Kit para detectar se uma amostra de planta e/ou seus produtos é derivada da soja transgênica preparada pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou progênies da mesma, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: 1) o fragmento de DNA exógeno, como definido na reivindicação 4, 2) o par de iniciadores 1, como definido na reivindicação 5, 3) o par de iniciadores 2, como definido na reinvindicação 5, ou 4) a sonda, como definida na reivindicação 5; o kit também contém uma especificação que grava o método, como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 6.

8. Uso da planta transgênica ou progênies da mesma, preparada pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é para melhoramento genético e/ou produção e processamento.