CN110950943A

CN110950943A - 紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34及其编码基因

Info

Publication number: CN110950943A
Application number: CN201911398635.0A
Authority: CN
Inventors: 安渊; 吕爱敏; 李姣姣; 苏连泰; 于晨
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN110950943B

Abstract

本发明公开了一种紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA‑D34及其编码基因，涉及植物基因工程领域，所述蛋白MsLEA‑D34包括如氨基酸序列SEQ ID NO：2所示的多肽，所述多肽的变异形式多肽，以及所述蛋白MsLEA‑D34的活性片段、活性衍生物，并提供了所述蛋白MsLEA‑D34的编码基因，包括如核苷酸序列SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列SEQ ID NO：1的简并序列、变异序列，以及能与所述核苷酸序列SEQ ID NO：1杂交的序列。本发明利用基因工程技术实现了MsLEA‑D34转基因植株的培育，及其开花时间的调节和抗逆性的提高，为紫花苜蓿新品种的培育和开花时间的调控及育种工作提供了重要的理论依据，具有很大的应用价值。

Description

紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34及其编码基因

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34及其编码基因。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是豆科多年生草本植物。因其绿期长、生长迅速、营养价值高，素有‘牧草之王’的美称，在畜牧业生产中具有重要作用。饲用豆科植物是世界重要的经济植物，开花时间对产量有重要影响。因此，了解其开花机制，合理调控开花时间对牧草的产量和质量都十分重要。

LEA蛋白(late embryogensis abundant proteins，LEA)在植物胚胎发育晚期高丰度表达，后来的研究发现在植物处于逆境胁迫时也会大量积累。LEA蛋白广泛存在于各种植物中，在抗逆境胁迫中起重要的作用。其中，LEA第五家族蛋白又被称为种子成熟蛋白(D34家族)，在种子后熟时大量积累，过表达该家族蛋白能够提高植物的抗旱、耐盐能力。目前，已获得多种植物的LEA-D34家族蛋白(如水稻、玉米、大豆等)，但对该类蛋白的功能研究仅限于少数植物中。目前，未有LEA蛋白与植物开花时间调控的相关报道。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种具有在非生物胁迫、尤其是时空方面存在表达特性的紫花苜蓿蛋白及其编码基因，并培育出具有抗逆性、尤其是开花时间可调控的转基因植株，为提高紫花苜蓿育种工作提供重要的理论依据。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何提供一种具有抗逆性表达、尤其是与植物开花时间调控相关的紫花苜蓿蛋白及其编码基因，并利用该蛋白表达的时空特性实现对植株开花时间的调控，为提高紫花苜蓿育种工作提供理论依据。

为实现上述目的，本发明提供了一种紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34，所述蛋白MsLEA-D34包括具有如序列SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽，所述多肽的变异形式多肽，以及所述蛋白MsLEA-D34的活性片段、活性衍生物。

进一步地，所述变异形式多肽具有与所述蛋白MsLEA-D34相同功能，包括：同源氨基酸序列多肽、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、能与所述蛋白MsLEA-D34的相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、利用所述蛋白MsLEA-D34的抗血清获得的多肽或蛋白。

进一步地，所述同源氨基酸序列多肽包括与所述序列SEQ ID NO：2相比存在1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加1～20个氨基酸而形成的多肽。

进一步地，所述保守性变异体具体为与所述氨基酸序列SEQ ID NO：2相比存在1～10个氨基酸取代而形成的多肽。

本发明还提供了一种如上所述的紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34的编码基因，所述编码基因包括如核苷酸序列SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列SEQ ID NO：1的简并序列、变异序列，以及能与所述核苷酸序列SEQ ID NO：1杂交的序列。

进一步地，所述简并序列与所述核苷酸序列SEQ ID NO：1具有至少70％的同源性。

进一步地，所述变异序列包括与所述核苷酸序列SEQ ID NO：1相比存在1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加1～60个核苷酸而形成的序列。

本发明还提供了一种如上所述的紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34的编码基因在提高紫花苜蓿耐盐、抗旱及开花时间调控中的应用。

进一步地，所述应用具体包括：构建含有所述蛋白MsLEA-D34的所述编码基因的表达载体，并转化植物宿体，培育筛选得到转基因植株。

进一步地，构建所述表达载体时，还需在所述编码基因的上游、下游分别引入BamHI与SpeI酶切位点以及特异性上游引物和特异性下游引物。

与现有技术相比，本发明主要具备以下有益的技术效果：

(1)本发明对提供的紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34及其编码基因进行了详细的测序，并发现其在包括干旱、高盐等非生物胁迫过程中具有显著上调表达，且存在一定的时空表达特性，为提高紫花苜蓿的耐盐、抗旱性、开花时间可控等新品种的选育方面提供了理论依据；

(2)本发明实现了MsLEA-D34基因表达载体的构建及过表达转基因拟南芥的培育，并发现所培养的转基因拟南芥相较于野生植株具有优异的耐盐、抗旱特性，且表现出开花时间提前、调控开花的相关基因表达量显著提高，为培育开花时间可调控的紫花苜蓿新品种提供了重要基础，具有很大的应用价值。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例的紫花苜蓿‘WL525’MsLEA-D34基因与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)和大豆(Glycine max L.)LEA蛋白序列的同源比较结果(DNAMAN)和同源基因的进化树分析，其中A为同源比较结果，B为进化树分析；

图2是本发明的一个较佳实施例的紫花苜蓿‘WL525’MsLEA-D34基因在非生物胁迫过程中的表达量变化；

图3是本发明的一个较佳实施例的紫花苜蓿‘WL525’MsLEA-D34蛋白在烟草叶片表皮细胞中的荧光定位图片；

图4是本发明的一个较佳实施例的紫花苜蓿‘WL525’MsLEA-D34蛋白在紫花苜蓿发状根细胞中的荧光定位图片；

图5是本发明的一个较佳实施例的野生型与过表达MsLEA-D34基因的拟南芥在盐胁迫下表型观察结果；

图6是本发明的一个较佳实施例的野生型与过表达MsLEA-D34基因的拟南芥在干旱胁迫下表型观察结果；

图7是本发明的一个较佳实施例的野生型与过表达MsLEA-D34基因的拟南芥提前开花表型观察结果；

图8是本发明的一个较佳实施例的野生型与MsLEA-D34转基因拟南芥中MsLEA-D34基因的相对表达量分析；

图9是本发明的一个较佳实施例的野生型与过表达MsLEA-D34基因的拟南芥调控开花基因表达量分析。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照使用试剂说明书所建议的条件。

实施例1、紫花苜蓿MsLEA-D34基因的克隆

1.植物材料的获得

取正常生长的紫花苜蓿‘WL525’的叶片组织，提取RNA；

2.RNA的抽提

用“TransZol Up植物总RNA提取试剂盒”(北京全式金)抽提总RNA，凝胶电泳鉴定RNA的完整性，分光光度计(Thermo Scientific Nanodrop 1000)测定RNA的纯度及浓度；

3.基因的全长克隆

根据蒺藜苜蓿‘A17’MTR_1g072090核酸序列及蛋白功能注释结果，获得紫花苜蓿‘WL525’MsLEA-D34基因全长。

将提取的RNA进行反转录(TransGen 1st Strand cDNA Synthesis Kit)，以第一链cDNA为模板，利用引物MsLEAD34-F(5'-ATGAGTCAAGAACAGCCACAGA-3')和MsLEA D34-R(5'-TCACCCGCTCTTCGTGTTC-3')进行PCR，扩增得到800bp片段，回收并连pMD18-T载体，用M13-47和RV-M作为通用引物，送上海生工测序。

将测序结果结合NCBI的ORF Finding(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf)预测，发现了紫花苜蓿‘WL525’MsLEA-D34基因的ORF阅读框。扩增得到795bp紫花苜蓿‘WL525’MsLEA-D34蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.1)。测序结果在NCBI网站进行BLAST比对数据库(GenBank,http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，其核酸序列及编码蛋白与已知的蒺藜苜蓿、大豆(Glycine max L.)的LEA基因的同源性很高，初步认为它是一个LEA基因。

实施例2、紫花苜蓿‘WL525’MsLEA-D34基因的序列信息与同源性分析

本发明的紫花苜蓿‘WL525’MsLEA-D34全长开放读码框序列为795bp，详细序列见SEQ ID NO.1所示序列。根据开放读码框序列推导出紫花苜蓿‘WL525’MsLEA-D34蛋白的氨基酸序列，共264个氨基酸残基，分子量为27.30kDa，等电点(pI)为4.65，详细序列见SEQ IDNO.2所示序列。

将紫花苜蓿‘WL525’MsLEA-D34的开放读码框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在NCBI中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与蒺藜苜蓿LEA基因在氨基酸水平相似性极高，且进化树分析显示紫花苜蓿‘WL525’MsLEA-D34蛋白与其它已知物种的LEA蛋白存在较高的同源性(如图1所示)。

实施例3、紫花苜蓿‘WL525’MsLEA-D34基因在非生物胁迫的表达差异性

1.材料的获得：对紫花苜蓿‘WL525’Al、干旱、盐处理，分别于0h,0.5h,1h,3h,6h,9h,12h,24h进行取样。将样品分别用铝铂纸包好后放入液氮，然后转入-80℃超低温冰箱中贮存待用；

2.RNA的提取、RNA的完整性、纯度、浓度的测定及cDNA的获得参照实施例1；

3.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在各组织中的表达量，根据已经获得的紫花苜蓿‘WL525’MsLEA-D34基因序列，设计用于Real-time PCR中MsLEA1基因定量分析的特异性引物，引物QMsLEA-D34-F(5’-AGAGGGAGTGATTGGAGCAG-3’)，引物QMsLEA-D34-R(5’-TCGTGTTCTGGTTGAGCGT-3’)，内参基因EF-α引物为EF-F(5’-GCACCAGTGCTCGATTGC-3’)，EF-R(5’-TCGCCTGTCAATCTTGGTAACAA-3’)；

4.目的基因及内参基因的标准曲线：用ddH₂O将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-timePCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线；分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的PCR扩增产物；通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数；

5.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析：以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参照基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-time PCR反应在BIO-RAD CFX实时定量仪上进行，反应体系为20μL，反应采用三步法，94℃变性20s，接着40个循环：94℃15s；55℃15s；72℃25s；每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物的特异；

6.采用2^-△△Ct法作相对定量分析，结果表明在多种非生物胁迫下，紫花苜蓿‘WL525’MsLEA-D34表达水平显著上升(如图2所示)。

实施例4、紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1基因转化模式植物拟南芥

1.构建植物表达载体

分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物MsLEA-D34-F(5’-CGGGATCCATGAGTCAAGAACAGCCACAGA-3‘)、MsLEA-D34-R(5’-GGACTAGTCCCGCTCTTCGTGTTCTGG-3')，并在基因全长序列两侧分别引入BamHI与SpeI酶切位点，以紫花苜蓿‘WL525’cDNA为模板进行PCR扩增。回收PCR产物并连接到pMD18-T载体上，挑取单克隆PCR验证。提取阳性克隆菌液质粒。将目的片段质粒与PHB双元转化载体进行BamHI与SpeI双酶切，回收酶切后的PHB载体与MsLEA-D34片段，用T4连接酶在16℃连接过夜，并将载体转化农杆菌GV3101。

2.转化拟南芥

(1)预摇农杆菌：挑阳性单克隆至5ml含50mg/L Kan、50mg/L庆大霉素、25mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃，200rpm摇菌24h；

(2)扩培农杆菌：将预摇的农杆菌菌液以1:100扩培至含相同抗性YEP培养基中，28℃，200rpm，培养13-16h，培养至吸光度OD₆₀₀达到0.6-1.5左右于18℃，3500rpm，15min集菌；

(3)转化拟南芥：(在转化前剪去植株上所有的角果和盛开以及露白的小花)配制300mL含2％蔗糖的1/2MS溶液，用少量MS溶液将收集的农杆菌重悬，向剩余的蔗糖溶液中加入0.01％(v/v)的吐温-20，将植株茎部及花序浸泡在菌液中5mins，取出沥干菌液，放入一次性塑料袋中，密封保湿。将所有植株转化完毕后，罩上黑盒子，避光培养24h。之后取出植株，将植株直立放置，浇水，保证植株水分充足。

3.转基因阳性株系的筛选

转化后的拟南芥待角果全部成熟后收种子，干燥，之后种子除去角果，收集转基因T₀代种子并播种于穴盘中，用0.05％(v/v)Basta进行幼苗抗性筛选，获得T₁代转基因植株，持续筛选直至获得T₃代纯合体转基因植株。

实施例5、紫花苜蓿MsLEA-D34烟草叶片亚细胞定位分析

将经鉴定的GV3101菌株，接种于5mL YEP(含Kan 50mg/L)中，28℃震荡培养至OD₆₀₀为0.5左右；取菌液1mL加入50mL YEP液体培养基中，28℃震荡培养至OD₆₀₀为0.5左右；取5mL菌液，4000rpm/min离心10min；用MS液体培养基悬浮菌体至OD₆₀₀为0.6左右，并加入AS(终浓度为0.2mM)与MES(终浓度10mM)，室温放置3h；将P19与MS悬浮的菌液以1:1的体积混匀；注射烟草叶片，阴暗处放置48h；将农杆菌侵染的烟草叶片置于激光共聚焦显微镜下，488nm激发波长下进行观察(如图3所示)。将PHB-MsLEA-D34-YFP质粒转入发根农杆菌菌株LB9402参照付春祥方法转化紫花苜蓿，获得紫花苜蓿发状根，按上述方法观察蛋白定位(如图4所示)。

实施例6、过表达MsLEA-D34拟南芥植株盐胁迫、干旱胁迫分析

将野生型和T₃种子消毒分别点种在MS培养基(2％蔗糖)上,培养7d，移入基质(蛭石：草炭＝1:2)；放入气温22℃、光强6000lx、光周期16小时光照/8小时黑暗的人工气候箱。

1.转基因拟南芥盐胁迫表型分析

将上述生长一致、状态良好的野生型和转基因拟南芥每隔2d浇灌2L含0、200mmNaCl的营养液，持续一周，观察表型同时测定电导率和最大荧光效率(如图5所示)。

2.转基因拟南芥干旱响应分析

上述正常生长的拟南芥进行干旱胁迫处理，转基因植株叶片萎蔫程度较小，植株生长情况优于野生型拟南芥(如图6所示)。

实施例7、过表达MsLEA-D34拟南芥开花表型分析

将野生型和转基因种子消毒分别点种在MS培养基(2％蔗糖)上,培养7d，移入基质(蛭石：草炭＝1:2)；放入气温22℃、光强6000lx、光周期16小时光照/8小时黑暗的人工气候箱。拟南芥处于长日照下，观察发现转基因拟南芥比野生型提前开花约2d，同时莲座叶片数量少于野生型的(如图7所示)。进一步地，检测拟南芥中调控开花的基因表达情况，对比选择过表达MsLEA-D34的株系(如图8所示)，发现基因FT和GI表达量显著升高(如图9所示)，这就说明MsLEA-D34通过影响拟南芥FT和GI基因表达从而影响拟南芥的开花时间。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 紫花苜蓿'WL525'胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34及其编码基因

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 795

<212> DNA

<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)

<400> 1

atgagtcaag aacagccaca gagaccacaa gcagaacaat tcttcgagca agaacctatc 60

aaatatggcg acgttttcaa cgtctctgga gaattagcat cacaaccaat caaaccaaga 120

gacgcagctc tcatgcaagc aacagagaat caagccctag gtcaaaccca aaagggaact 180

ccagcctccg tgatgcaatc agcagccgca gtaaacaccg cggccggcct tgtaaaccac 240

ggcgacatct cagacatagc aaaaaaccaa ggcatgagtg tctccgaaac caaagttggt 300

gcaaaccgtg tgatcacaga atctgttggg tcacaagttg ttggacagtt tgtcgaacct 360

gatgtgccta tgaatgatcc tggtttggtt ttggacaaga atgctataac cattggcgag 420

gcgctggaag cttcggcttt gagtcaagcc ggtgataagc cgttggatca gagtgatgct 480

gctgctatac aggcagcgga aatgcgagct accggaaaga atcatactga gcctggtggg 540

ttgggtgcca tagctcagtc agcagctaca aggaatactc gtactatgcc tgatctgcag 600

aagactacat tggctgatgt cgtatcgggt gcgagggaga agctgggatc ggacaagact 660

gtaacacgag aggatgcaga gggagtgatt ggagcagagc ttagaaacaa agcggacatg 720

agaactaaac cgggcggtgt agctgcgtcg atggcagcag cagccacgct caaccagaac 780

acgaagagcg ggtga 795

<210> 2

<211> 264

<212> PRT

<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)

<400> 2

Met Ser Gln Glu Gln Pro Gln Arg Pro Gln Ala Glu Gln Phe Phe Glu

1 5 10 15

Gln Glu Pro Ile Lys Tyr Gly Asp Val Phe Asn Val Ser Gly Glu Leu

20 25 30

Ala Ser Gln Pro Ile Lys Pro Arg Asp Ala Ala Leu Met Gln Ala Thr

35 40 45

Glu Asn Gln Ala Leu Gly Gln Thr Gln Lys Gly Thr Pro Ala Ser Val

50 55 60

Met Gln Ser Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gly Leu Val Asn His

65 70 75 80

Gly Asp Ile Ser Asp Ile Ala Lys Asn Gln Gly Met Ser Val Ser Glu

85 90 95

Thr Lys Val Gly Ala Asn Arg Val Ile Thr Glu Ser Val Gly Ser Gln

100 105 110

Val Val Gly Gln Phe Val Glu Pro Asp Val Pro Met Asn Asp Pro Gly

115 120 125

Leu Val Leu Asp Lys Asn Ala Ile Thr Ile Gly Glu Ala Leu Glu Ala

130 135 140

Ser Ala Leu Ser Gln Ala Gly Asp Lys Pro Leu Asp Gln Ser Asp Ala

145 150 155 160

Ala Ala Ile Gln Ala Ala Glu Met Arg Ala Thr Gly Lys Asn His Thr

165 170 175

Glu Pro Gly Gly Leu Gly Ala Ile Ala Gln Ser Ala Ala Thr Arg Asn

180 185 190

Thr Arg Thr Met Pro Asp Leu Gln Lys Thr Thr Leu Ala Asp Val Val

195 200 205

Ser Gly Ala Arg Glu Lys Leu Gly Ser Asp Lys Thr Val Thr Arg Glu

210 215 220

Asp Ala Glu Gly Val Ile Gly Ala Glu Leu Arg Asn Lys Ala Asp Met

225 230 235 240

Arg Thr Lys Pro Gly Gly Val Ala Ala Ser Met Ala Ala Ala Ala Thr

245 250 255

Leu Asn Gln Asn Thr Lys Ser Gly

260

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

atgagtcaag aacagccaca ga 22

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

tcacccgctc ttcgtgttc 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

agagggagtg attggagcag 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

tcgtgttctg gttgagcgt 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

gcaccagtgc tcgattgc 18

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

tcgcctgtca atcttggtaa caa 23

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

cgggatccat gagtcaagaa cagccacaga 30

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

ggactagtcc cgctcttcgt gttctgg 27

Claims

1.一种紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34，其特征在于，所述蛋白MsLEA-D34包括具有如序列SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽，所述多肽的变异形式多肽，以及所述蛋白MsLEA-D34的活性片段、活性衍生物。

2.如权利要求1所述的紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34，其特征在于，所述变异形式多肽具有与所述蛋白MsLEA-D34相同功能，包括：同源氨基酸序列多肽、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、能与所述蛋白MsLEA-D34的相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、利用所述蛋白MsLEA-D34的抗血清获得的多肽或蛋白。

3.如权利要求2所述的紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34，其特征在于，所述同源氨基酸序列多肽包括与所述序列SEQ ID NO：2相比存在1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加1～20个氨基酸而形成的多肽。

4.如权利要求2所述的紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34，其特征在于，所述保守性变异体具体为与所述氨基酸序列SEQ ID NO：2相比存在1～10个氨基酸取代而形成的多肽。

5.一种编码如权利要求1～4任一项所述的紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34的编码基因，其特征在于，所述编码基因包括如核苷酸序列SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列SEQ ID NO：1的简并序列、变异序列，以及能与所述核苷酸序列SEQID NO：1杂交的序列。

6.如权利要求5所述的紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34的编码基因，其特征在于，所述简并序列与所述核苷酸序列SEQ ID NO：1具有至少70％的同源性。

7.如权利要求5所述的紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34的编码基因，其特征在于，所述变异序列包括与所述核苷酸序列SEQ ID NO：1相比存在1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加1～60个核苷酸而形成的序列。

8.一种如权利要求5～7任一项所述的紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34的编码基因在提高紫花苜蓿耐盐、抗旱及开花时间调控中的应用。

9.如权利要求8所述的紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34的编码基因在提高紫花苜蓿耐盐、抗旱及开花时间调控中的应用，其特征在于，所述应用具体包括：构建含有所述蛋白MsLEA-D34的所述编码基因的表达载体，并转化植物宿体，培育筛选得到转基因植株。

10.如权利要求8所述的紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34的编码基因在提高紫花苜蓿耐盐、抗旱及开花时间调控中的应用，其特征在于，构建所述表达载体时，还需在所述编码基因的上游、下游分别引入BamHI与SpeI酶切位点以及特异性上游引物和特异性下游引物。