CN104968790A - 用于产生和选择转基因植物的方法和组合物 - Google Patents

用于产生和选择转基因植物的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了组合物和方法以用于转基因植物和植物部分的产生和选择，用于增加植物或植物部分的转化频率，以及用于调控转基因诸如除草剂耐受性多核苷酸的表达。所述方法和组合物允许延迟除草剂耐受性多核苷酸的表达直到发育的一定时间点，在所述时间点期间，除草剂选择更有效。组合物包含多核苷酸构建体和含有所述多核苷酸构建体的宿主细胞，所述多核苷酸构建体包含切除盒，所述切除盒将转基因诸如除草剂耐受性多核苷酸与其启动子分隔开。所述切除盒包含编码位点特异性重组酶且有效连接到诱导型启动子的多核苷酸，并且所述重组酶的表达导致所述切除盒的切除和所述转基因的表达。

Description

用于产生和选择转基因植物的方法和组合物
对通过EFS-WEB作为文本文件提交的序列表的引用
通过EFS-Web以电子方式将序列表的正式文本作为ASCII格式的序列表提交，该序列表创建日期为2013年3月12日，文件大小为308千字节，并且该序列表与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及植物的遗传修饰。更具体地讲，组合物和方法涉及转基因植物的产生和选择。
背景技术
当前的遗传工程技术允许产生具有所需性状的转基因植物。在一些情况下，希望延迟转基因的表达直到达到特定发育阶段或遇到特定环境条件。此类转基因可赋予所需性状或可用作选择性标记以有助于鉴定已用目标多核苷酸成功地工程改造的转基因植物。
例如，可将编码赋予对特定除草剂的耐受性的多肽的除草剂耐受性多核苷酸引入植物中，以生成除草剂耐受性植物和/或用作引入另一种目标多核苷酸的选择性标记。在转化玉蜀黍和甘蔗时，在转基因植物产生的早期阶段(即，组织增殖)期间，用除草剂诸如草甘膦和磺酰脲直接选择是相对低效的(实验实例1和未发表的数据)。玉蜀黍细胞的较大集簇可能对除草剂诸如草甘膦较不敏感，并且一些非转基因愈伤组织仍可在存在除草剂的情况下生长(Wang et al.(2009)Handbook of Maize：Genetics andGenomics，J.L.Bennetzen and S.Hake，eds.，pp.609-639(Wang等人，2009年，《玉蜀黍手册：遗传学和基因组学》，J.L.Bennetzen和S.Hake编辑，第609-639页))。然而，如在小麦中所观察到的，在再生阶段的选择更有效并且很少使逸出种再生(Zhou et al.(1995)Plant Cell Rep 15：159-163(Zhou等人，1995年，《植物细胞报告》，第15卷，第159-163页)；Hu et al.(2003)Plant Cell Rep 21：1010-1019(Hu等人，2003年，《植物细胞报告》，第21卷，第1010-1019页))。
因此，需要这样的方法和组合物，其允许转基因的延迟表达以特别是在发育期间降低对转化组织的负面影响的可能性。此类方法和组合物将尤其可用于延迟除草剂耐受性多核苷酸的表达直到除草剂选择更有效的阶段。
发明内容
提供了组合物和方法以用于转基因植物和植物部分的产生和选择，用于增加植物或植物部分的转化频率，以及用于调控转基因诸如除草剂耐受性多核苷酸的表达。所述方法和组合物通过存在将转基因(例如，除草剂耐受性多核苷酸)与驱动其表达的启动子分隔开的切除盒以及随后切除所述切除盒，而允许转基因(例如，除草剂耐受性多核苷酸)的表达延迟。切除盒的切除由位点特异性重组酶(其表达受诱导型启动子调控)介导，这导致转基因(例如，除草剂耐受性多核苷酸)与其启动子的有效连接以及转基因(例如，除草剂耐受性多核苷酸)的随后表达。这些方法和组合物可用于延迟转基因的表达，转基因的表达可能会以其他方式负面影响转化组织或植物的发育或生长。
除草剂耐受性多核苷酸可用作一种为植物或植物部分赋予除草剂耐受性的方式，和/或可充当选择性标记，从而有助于鉴定包含另一种目标多核苷酸或缺少已从切除盒切除的目标多核苷酸的转基因植物或植物部分。在这些实施例的一些中，切除盒的切除和除草剂耐受性多核苷酸的表达被延迟直到在转基因植物产生的组织增殖阶段之后，以允许更有效的除草剂选择。
在一些实施例中，调控重组酶的表达、切除盒的切除以及除草剂耐受性多核苷酸的表达的诱导型启动子是由胁迫(例如，寒冷温度、干化)或由化学品(例如，抗生素、除草剂)诱导的启动子。
组合物包含多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体包含在植物中有活性的启动子、除草剂耐受性多核苷酸和切除盒，其中切除盒包含有效连接到编码位点特异性重组酶的多核苷酸的诱导型启动子，并且其中切除盒的切除允许启动子与除草剂耐受性多核苷酸的有效连接。还提供了包含多核苷酸构建体的宿主细胞诸如植物细胞以及植物和植物部分。
本发明涵盖以下实施例。
1.一种多核苷酸构建体，包含：
a)包含表达盒A(ECA)的切除盒，所述表达盒包含：
i)启动子A(PA)，其中所述PA为诱导型启动子；以及
ii)编码位点特异性重组酶的编码多核苷酸A(CPA)；
其中所述PA有效连接到所述CPA；以及
其中所述切除盒的旁侧带有第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点会相对于彼此发生重组并且是直接重复的，并且其中所述位点特异性重组酶可在所述第一重组位点和所述第二重组位点处识别并实施重组；从而切除所述切除盒；
b)编码除草剂耐受性多肽的编码多核苷酸B(CPB)；以及
c)启动子B(PB)，其中在切除所述切除盒之后，所述PB有效连接到所述CPB；
其中所述PA和PB在植物细胞中有活性。
2.实施例1所述的多核苷酸构建体，其中所述诱导型启动子选自胁迫诱导型启动子和化学诱导型启动子。
3.实施例2所述的多核苷酸构建体，其中所述化学诱导型启动子包括包含tet操纵子的启动子。
4.实施例3所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体还包含编码磺酰脲响应性转录阻遏蛋白的编码多核苷酸F(CPF)，其中所述CPF有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。
5.实施例2所述的多核苷酸构建体，其中所述胁迫诱导型启动子可响应于寒冷、干旱、高盐度、干化或它们的组合而诱导。
6.实施例2或5所述的多核苷酸构建体，其中所述胁迫诱导型启动子是玉蜀黍rab17启动子或其活性变体或片段。
7.实施例2、5和6中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述胁迫诱导型启动子具有选自如下的核苷酸序列：
a)具有SEQ ID NO：18所示的序列的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：18所示的序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)包含SEQ ID NO：18所示的序列的至少50个连续核苷酸的核苷酸序列；
d)SEQ ID NO：18的第291-430位核苷酸所示的核苷酸序列；以及
e)与SEQ ID NO：18的第291-430位核苷酸所示的序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
8.实施例6或7所述的多核苷酸构建体，其中所述ECA还包含所述胁迫诱导型启动子与所述CPA之间的附着B(attB)位点。
9.实施例8所述的多核苷酸构建体，其中所述attB位点具有选自如下的核苷酸序列：
a)与SEQ ID NO：20所示的序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；以及
b)SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列。
10.实施例1-9中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述位点特异性重组酶选自FLP、Cre、S-CRE、V-CRE、Dre、SSV1、lambda Int、phi C31 Int、HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1和U153。
11.实施例1-10中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述CPA具有选自如下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：33或35所示的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：33或35具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)编码具有SEQ ID NO：34或36所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及
d)编码具有与SEQ ID NO：34或36具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
12.实施例1-11中任一项所述的多核苷酸构建体，其中PB是组成型启动子。
13.实施例12所述的多核苷酸构建体，其中所述PB选自泛素启动子、油质蛋白启动子、肌动蛋白启动子和紫茉莉花叶病毒(MMV)启动子。
14.实施例1-13中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述切除盒还包含编码选择性标记的编码多核苷酸C(CPC)，其中所述CPC有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。
15.实施例14所述的多核苷酸构建体，其中在切除所述切除盒之前，所述CPC有效连接到PB。
16.实施例14所述的多核苷酸构建体，其中所述切除盒还包含启动子C(PC)，其中PC有效连接到所述CPC。
17.实施例16所述的多核苷酸构建体，其中所述PC是组成型启动子。
18.实施例17所述的多核苷酸构建体，其中所述PC选自泛素启动子、油质蛋白启动子、肌动蛋白启动子和紫茉莉花叶病毒(MMV)启动子。
19.实施例14-18中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述选择性标记选自荧光蛋白、抗生素抗性多肽、除草剂耐受性多肽和代谢酶。
20.实施例19所述的多核苷酸构建体，其中所述荧光蛋白选自黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、青色荧光蛋白和绿色荧光蛋白。
21.实施例19所述的多核苷酸构建体，其中所述荧光蛋白包含香菇珊瑚(Discosoma)红色荧光蛋白。
22.实施例19所述的多核苷酸构建体，其中所述抗生素抗性多肽包含新霉素磷酸转移酶II。
23.实施例19所述的多核苷酸构建体，其中由CPC编码的所述除草剂耐受性多肽包含草丁膦乙酰转移酶。
24.实施例19所述的多核苷酸构建体，其中所述代谢酶包括磷酸甘露糖异构酶。
25.实施例14-24中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述切除盒包含不止一个编码不同选择性标记的多核苷酸，其中编码选择性标记的所述多核苷酸有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。
26.实施例25所述的多核苷酸构建体，其中所述切除盒包含编码选择性标记的至少第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸编码黄色荧光蛋白，并且其中所述第二多核苷酸编码草丁膦乙酰转移酶或新霉素磷酸转移酶II。
27.实施例1-26中任一项所述的多核苷酸构建体，其中由CPB编码的所述除草剂耐受性多肽赋予对选自如下的除草剂的耐受性：草甘膦、ALS抑制剂、乙酰辅酶A羧化酶抑制剂、合成生长素、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂除草剂、色素合成抑制剂除草剂、草丁膦乙酰转移酶、八氢番茄红素去饱和酶抑制剂、谷氨酰胺合成酶抑制剂、羟苯丙酮酸二加氧酶抑制剂、以及原卟啉原氧化酶抑制剂。
28.实施例27所述的多核苷酸构建体，其中所述ALS抑制剂选自磺酰脲、三唑并嘧啶、嘧啶基氧基(硫代)苯甲酸酯、咪唑啉酮、以及磺酰基氨基羰基三唑啉酮。
29.实施例1-28中任一项所述的多核苷酸构建体，其中由CPB编码的所述除草剂耐受性多肽包括草甘膦-N-乙酰转移酶(GLYAT)多肽或ALS抑制剂耐受性多肽。
30.实施例29所述的多核苷酸构建体，其中编码所述GLYAT多肽的所述多核苷酸具有选自如下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：47或49所示的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：47或49具有至少95％序列同一性的核苷酸序列；
c)编码具有SEQ ID NO：48或50所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及
d)编码具有与SEQ ID NO：48或50具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
31.实施例29所述的多核苷酸构建体，其中所述ALS抑制剂耐受性多肽包括乙酰乳酸合成酶的高度耐受性ALS(HRA)突变。
32.实施例1-31中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体包含不止一个编码不同除草剂耐受性多肽的多核苷酸，其中编码除草剂耐受性多肽的多核苷酸有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。
33.实施例32所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体包含编码除草剂耐受性多肽的至少第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸编码ALS抑制剂耐受性多肽并且其中所述第二多核苷酸编码GLYAT多肽。
34.实施例1-33中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述切除盒还包含编码细胞增殖因子的编码多核苷酸D(CPD)，其中所述CPD有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。
35.实施例34所述的多核苷酸构建体，其中所述细胞增殖因子选自Lec1多肽、Kn1多肽、WUSCHEL多肽、Zwille多肽、babyboom多肽、Aintegumenta多肽(ANT)、FUS3多肽、Kn1多肽、STM多肽、OSH1多肽和SbH1多肽。
36.实施例35所述的多核苷酸构建体，其中所述细胞增殖因子选自WUSCHEL多肽和babyboom多肽。
37.实施例34-36中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述babyboom多肽包含至少两个AP2结构域和下列氨基酸序列中的至少一者：
a)SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列相差一个氨基酸的氨基酸序列；以及
b)SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列相差一个氨基酸的氨基酸序列。
38.实施例34-36中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述CPD具有选自如下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：55、57、58、60、74、76、78、80、82、84、86、87、88、90、92、94、96、98、99或101所示的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：55、57、58、60、74、76、78、80、82、84、86、87、88、90、92、94、96、98、99或101具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)编码具有SEQ ID NO：56、59、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、100或102所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及
d)编码具有与SEQ ID NO：56、59、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、100或102所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
39.实施例34-38中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述切除盒还包含有效连接到所述CPD的启动子D(PD)。
40.实施例39所述的多核苷酸构建体，其中所述PD是组成型启动子。
41.实施例40所述的多核苷酸构建体，其中所述PD是泛素启动子或油质蛋白启动子。
42.实施例36-41中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述切除盒包含不止一个编码不同细胞增殖因子的编码多核苷酸D(CPD)，其中CPD有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。
43.实施例42所述的多核苷酸构建体，其中所述切除盒包含至少编码babyboom多肽的第一编码多核苷酸D(CPD1)以及编码WUSCHEL多肽的第二编码多核苷酸D(CPD2)。
44.实施例35、36、42和43中任一项所述的多核苷酸构建体，其中编码WUSCHEL多肽的所述多核苷酸具有选自如下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：103、105、107或109所示的核苷酸序列；以及
b)与SEQ ID NO：103、105、107或109具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)编码具有SEQ ID NO：104、106、108或110所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及
d)编码具有与SEQ ID NO：104、106、108或110具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
45.实施例35、36、42、43和44中任一项所述的多核苷酸构建体，其中编码WUSCHEL多肽的所述多核苷酸有效连接到玉蜀黍In2-2启动子或胭脂碱合成酶启动子。
46.实施例1-45中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体还包含编码目标多肽的编码多核苷酸E(CPE)，其中所述CPE有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。
47.实施例46所述的多核苷酸构建体，其中所述切除盒包含所述CPE。
48.实施例46所述的多核苷酸构建体，其中所述CPE在切除盒的外部。
49.实施例46-48中任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体还包含有效连接到所述CPE的启动子E(PE)。
50.实施例1所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体包含：
a)第一泛素启动子；
b)切除盒，所述切除盒的旁侧带有loxP重组位点，所述loxP重组位点会相对于彼此发生重组并且是直接重复的，其中所述切除盒包含：
i)编码草丁膦乙酰转移酶(PAT)或新霉素磷酸转移酶II(NPTII)的多核苷酸；
ii)第二泛素启动子；
iii)编码黄色荧光蛋白的多核苷酸；
iv)包含玉蜀黍rab17启动子和附着B(attB)位点的启动子；
v)编码CRE重组酶的多核苷酸；
vi)胭脂碱合成酶启动子；
vii)编码玉蜀黍Wuschel 2多肽的多核苷酸；
viii)第三泛素启动子；以及
ix)babyboom多核苷酸；以及
c)GLYAT多核苷酸；
其中所述第一泛素启动子有效连接到编码所述PAT或NPTII的所述多核苷酸，并且其中在切除所述切除盒后，所述第一泛素启动子有效连接到所述GLYAT多核苷酸；
其中所述第二泛素启动子有效连接到编码所述黄色荧光蛋白的所述多核苷酸；
其中包含所述玉蜀黍rab17启动子和所述attB位点的所述启动子有效连接到编码所述CRE重组酶的所述多核苷酸；
其中所述胭脂碱合成酶启动子有效连接到编码所述玉蜀黍Wuschel 2多肽的所述多核苷酸；
并且其中所述第三泛素启动子有效连接到所述babyboom多核苷酸。
51.实施例1所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体包含：
a)泛素启动子；
b)切除盒，所述切除盒的旁侧带有loxP重组位点，所述loxP重组位点会相对于彼此发生重组并且是直接重复的，其中所述切除盒包含：
i)编码香菇珊瑚红色荧光蛋白的多核苷酸；
ii)包含玉蜀黍rab17启动子和附着B(attB)位点的启动子；以及
iii)编码CRE重组酶的多核苷酸；以及
c)GLYAT多核苷酸；
其中所述泛素启动子有效连接到编码所述香菇珊瑚红色荧光蛋白的所述多核苷酸，并且其中在切除所述切除盒后，所述泛素启动子有效连接到所述GLYAT多核苷酸；以及
其中包含所述玉蜀黍rab17启动子和所述attB位点的所述启动子有效连接到编码所述CRE重组酶的所述多核苷酸。
52.实施例1所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体包含：
a)泛素启动子；
b)切除盒，所述切除盒的旁侧带有loxP重组位点，所述loxP重组位点会相对于彼此发生重组并且是直接重复的，其中所述切除盒包含：
i)肌动蛋白启动子；
ii)编码香菇珊瑚红色荧光蛋白的多核苷酸；
iii)包含玉蜀黍rab17启动子和附着B(attB)位点的启动子；以及
iv)编码CRE重组酶的多核苷酸；以及
c)GLYAT多核苷酸；
其中在切除所述切除盒后，所述泛素启动子有效连接到所述GLYAT多核苷酸；
其中所述肌动蛋白启动子有效连接到编码所述香菇珊瑚红色荧光蛋白的所述多核苷酸；以及
其中包含所述玉蜀黍rab17启动子和所述attB位点的所述启动子有效连接到编码所述CRE重组酶的所述多核苷酸。
53.一种宿主细胞，其包含实施例1-52中任一项所述的多核苷酸构建体。
54.一种植物细胞，其包含实施例1-52中任一项所述的多核苷酸构建体。
55.一种植物或植物部分，其包含实施例54所述的植物细胞。
56.实施例55所述的植物或植物部分，其中所述植物或植物部分是双子叶植物。
57.实施例55所述的植物或植物部分，其中所述植物或植物部分是单子叶植物。
58.实施例57所述的植物或植物部分，其中所述单子叶植物选自玉蜀黍、水稻、高粱、大麦、小麦、粟、燕麦、裸麦、黑小麦、甘蔗、柳枝稷以及草坪草/饲草。
59.实施例55-58中任一项所述的植物或植物部分，其中所述植物或植物部分是顽拗型的。
60.实施例59所述的植物或植物部分，其中所述植物或植物部分是选自CP96-1252、CP01-1372、CPCL97-2730、HoCP85-845、CP89-2143和KQ228的甘蔗品种。
61.实施例55-60中任一项所述的植物或植物部分，其中所述植物部分是种子。
62.一种用于产生转基因植物或植物部分的方法，所述方法包括将实施例1-52中任一项所述的多核苷酸构建体引入植物或植物部分中。
63.一种用于调控除草剂耐受性多核苷酸的表达的方法，其中所述方法包括：
a)提供实施例53所述的宿主细胞、实施例54所述的植物细胞、或实施例55-61中任一项所述的植物或植物部分；以及
b)诱导所述位点特异性重组酶的表达，从而从所述多核苷酸构建体切除所述切除盒并且表达所述除草剂耐受性多核苷酸。
64.一种用于选择除草剂耐受性植物细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
A)提供植物细胞群体，其中群体中的至少一个植物细胞包含多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体包含：
a)包含表达盒A(ECA)的切除盒，所述表达盒包含：
i)启动子A(PA)，其中所述PA为诱导型启动子；以及
ii)编码位点特异性重组酶的编码多核苷酸A(CPA)；
其中所述PA有效连接到所述CPA；
b)编码除草剂耐受性多肽的编码多核苷酸B(CPB)；以及
c)启动子B(PB)，其中在切除所述切除盒之后，所述PB有效连接到所述CPB；
其中所述PA和PB在植物细胞中有活性；以及
其中所述切除盒的旁侧带有第一重组位点和第二重组位点，其中所述第一重组位点和所述第二重组位点会相对于彼此发生重组并且是直接重复的，并且其中所述位点特异性重组酶可在所述第一重组位点和所述第二重组位点处识别并实施重组；从而切除所述切除盒；
B)诱导所述位点特异性重组酶的表达；以及
C)使所述植物细胞群体与所述除草剂耐受性多肽赋予对其的耐受性的除草剂接触，从而选择具有对所述除草剂的耐受性的植物细胞。
65.实施例64所述的方法，其中在所述步骤B)之前、期间或之后将所述所提供的植物细胞群体培养成植物组织群体或植物群体，并且其中所述步骤C)包括使所述植物组织群体或植物群体与所述除草剂接触。
66.实施例65所述的方法，其中在所述所提供的植物细胞群体再生为植物群体期间或之后进行所述步骤C)。
67.实施例64所述的方法，其中所述所提供的植物细胞群体是未成熟或成熟种子群体，其中所述未成熟或成熟种子群体内的至少一个未成熟或成熟种子包含所述多核苷酸构建体。
68.实施例67所述的方法，其中在所述步骤B)之前、期间或之后种植所述所提供的种子群体来产生植物群体，并且其中所述步骤C)包括使所述植物群体与所述除草剂接触。
69.实施例75所述的方法，其中所述所提供的植物细胞群体是植物组织群体，其中所述植物组织群体内的至少一个植物组织包含所述多核苷酸构建体。
70.实施例69所述的方法，其中在所述步骤B)之前、期间或之后将所述所提供的植物组织群体培养成植物群体，并且其中所述步骤C)包括使所述植物群体与所述除草剂接触。
71.实施例64所述的方法，其中所述所提供的植物细胞群体是植物群体，其中所述植物群体内的至少一个植物包含所述多核苷酸构建体。
72.实施例64-71中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在步骤A)之前将所述多核苷酸构建体引入所述至少一个植物细胞中。
73.实施例64-72中任一项所述的方法，其中所述诱导型启动子PA选自胁迫诱导型启动子和化学诱导型启动子。
74.实施例73所述的方法，其中所述化学诱导型启动子包括包含tet操纵子的启动子。
75.实施例74所述的方法，其中所述多核苷酸构建体或所述至少一个植物细胞还包含编码磺酰脲响应性转录阻遏蛋白的编码多核苷酸F(CPF)，其中所述CPF有效连接到在植物细胞中有活性的启动子，并且其中所述诱导包括使所述植物细胞群体与磺酰脲化合物接触。
76.实施例73所述的方法，其中所述胁迫诱导型启动子响应于寒冷、干旱、干化、高盐度或它们的组合而被诱导。
77.实施例73或76所述的方法，其中所述胁迫诱导型启动子包括干旱诱导型启动子，并且其中所述诱导包括干化所述植物细胞群体。
78.实施例77所述的方法，其中所述干化在未成熟种子的成熟期间发生。
79.实施例73所述的方法，其中所述胁迫诱导型启动子是玉蜀黍rab17启动子或其活性变体或片段。
80.实施例73所述的方法，其中所述胁迫诱导型启动子具有选自如下的核苷酸序列：
a)具有SEQ ID NO：18所示的序列的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：18所示的序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)包含SEQ ID NO：18所示的序列的至少50个连续核苷酸的核苷酸序列；
d)SEQ ID NO：18的第291-430位核苷酸所示的核苷酸序列；以及
e)与SEQ ID NO：18的第291-430位核苷酸所示的序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
81.实施例79或80所述的方法，其中所述ECA还包含所述胁迫诱导型启动子与所述CPA之间的附着B(attB)位点。
82.实施例81所述的方法，其中所述attB位点具有选自如下的核苷酸序列：
a)与SEQ ID NO：20所示的序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；以及
b)SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列。
83.实施例64-82中任一项所述的方法，其中所述位点特异性重组酶选自FLP、Cre、S-CRE、V-CRE、Dre、SSV1、lambda Int、phiC31 Int、HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1和U153。
84.实施例64-83中任一项所述的方法，其中所述CPA具有选自如下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：33或35所示的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：33或35具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)编码具有SEQ ID NO：34或36所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及
d)编码具有与SEQ ID NO：34或36具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
85.实施例64-84中任一项所述的方法，其中PB是组成型启动子。
86.实施例85所述的方法，其中所述PB选自泛素启动子、油质蛋白启动子、肌动蛋白启动子和紫茉莉花叶病毒启动子。
87.实施例64-86中任一项所述的方法，其中所述切除盒还包含编码多核苷酸C(CPC)，其中所述CPC编码选择性标记，其中所述CPC有效连接到在植物细胞中有活性的启动子，并且其中所述方法还包括在步骤B)之前的选择步骤，其中鉴定包含所述选择性标记的所述植物细胞群体内的那些植物细胞，并且其中这些选择的植物细胞构成步骤B)中诱导的植物细胞群体。
88.实施例87所述的方法，其中所述CPC有效连接到PB。
89.实施例87所述的方法，其中所述切除盒还包含启动子C(PC)，其中PC有效连接到所述CPC。
90.实施例89所述的方法，其中PC是组成型启动子。
91.实施例90所述的方法，其中所述PC选自泛素启动子、油质蛋白启动子、肌动蛋白启动子和紫茉莉花叶病毒启动子。
92.实施例87-91中任一项所述的方法，其中所述选择性标记选自荧光蛋白、抗生素抗性多肽、除草剂耐受性多肽和代谢酶。
93.实施例92所述的方法，其中所述荧光蛋白选自黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、青色荧光蛋白和绿色荧光蛋白。
94.实施例92所述的方法，其中所述荧光蛋白包含香菇珊瑚红色荧光蛋白。
95.实施例92所述的方法，其中所述抗生素抗性多肽包含新霉素磷酸转移酶II。
96.实施例92所述的方法，其中由CPC编码的所述除草剂耐受性多肽包含草丁膦乙酰转移酶。
97.实施例92所述的方法，其中所述代谢酶包括磷酸甘露糖异构酶。
98.实施例87-97中任一项所述的方法，其中所述切除盒包含不止一个编码不同选择性标记的多核苷酸，其中编码选择性标记的所述多核苷酸有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。
99.实施例98所述的方法，其中所述切除盒包含编码选择性标记的至少第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸编码黄色荧光蛋白，并且其中所述第二多核苷酸编码草丁膦乙酰转移酶或新霉素磷酸转移酶II。
100.实施例64-99中任一项所述的方法，其中由CPB编码的所述除草剂耐受性多肽赋予对选自如下的除草剂的耐受性：草甘膦、ALS抑制剂、乙酰辅酶A羧化酶抑制剂、合成生长素、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂除草剂、色素合成抑制剂除草剂、草丁膦乙酰转移酶、八氢番茄红素去饱和酶抑制剂、谷氨酰胺合成酶抑制剂、羟苯丙酮酸二加氧酶抑制剂、以及原卟啉原氧化酶抑制剂。
101.实施例100所述的方法，其中所述ALS抑制剂选自磺酰脲、三唑并嘧啶、嘧啶基氧基(硫代)苯甲酸酯、咪唑啉酮、以及磺酰基氨基羰基三唑啉酮。
102.实施例64-101中任一项所述的方法，其中由CPB编码的所述除草剂耐受性多肽包括草甘膦-N-乙酰转移酶(GLYAT)多肽或ALS抑制剂耐受性多肽。
103.实施例102所述的方法，其中编码所述GLYAT多肽的所述多核苷酸具有选自如下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：47或49所示的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：47或49具有至少95％序列同一性的核苷酸序列；
c)编码具有SEQ ID NO：48或50所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及
d)编码具有与SEQ ID NO：48或50具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
104.实施例102所述的方法，其中所述ALS抑制剂耐受性多肽包括乙酰乳酸合成酶的高度耐受性ALS(HRA)突变。
105.实施例64-104中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含不止一个编码不同除草剂耐受性多肽的多核苷酸，其中编码除草剂耐受性多肽的所述多核苷酸有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。
106.实施例105所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含编码除草剂耐受性多肽的至少第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸编码ALS抑制剂耐受性多肽并且其中所述第二多核苷酸编码GLYAT多肽。
107.实施例64-106中任一项所述的方法，其中所述切除盒还包含编码多核苷酸D(CPD)，其中所述CPD编码细胞增殖因子，并且其中所述CPD有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。
108.实施例107所述的方法，其中所述细胞增殖因子选自Lec1多肽、Kn1多肽、WUSCHEL多肽、Zwille多肽、babyboom多肽、Aintegumenta多肽(ANT)、FUS3多肽、Kn1多肽、STM多肽、OSH1多肽和SbH1多肽。
109.实施例108所述的方法，其中所述细胞增殖因子选自WUSCHEL多肽和babyboom多肽。
110.实施例107-109中任一项所述的方法，其中所述babyboom多肽包含至少两个AP2结构域和下列氨基酸序列中的至少一者：
a)SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列相差一个氨基酸的氨基酸序列；以及
b)SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列相差一个氨基酸的氨基酸序列。
111.实施例107-109中任一项所述的方法，其中所述CPD具有选自如下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：55、57、58、60、74、76、78、80、82、84、86、87、88、90、92、94、96、98、99或101所示的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：55、57、58、60、74、76、78、80、82、84、86、87、88、90、92、94、96、98、99或101具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)编码具有SEQ ID NO：56、59、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、100或102所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及
d)编码具有与SEQ ID NO：56、59、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、100或102所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
112.实施例107-111中任一项所述的方法，其中所述切除盒还包含启动子D(PD)，其中所述PD有效连接到所述CPD。
113.实施例112所述的方法，其中所述PD是组成型启动子。
114.实施例112或113所述的方法，其中所述PD是泛素启动子或油质蛋白启动子。
115.实施例107-114中任一项所述的方法，其中所述切除盒包含不止一个编码不同细胞增殖因子的多核苷酸，其中编码细胞增殖因子的多核苷酸有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。
116.实施例115所述的方法，其中所述切除盒包含至少编码babyboom多肽的第一编码多核苷酸D(CPD1)以及编码WUSCHEL多肽的第二编码多核苷酸D(CPD2)。
117.实施例108、109和116中任一项所述的方法，其中编码WUSCHEL多肽的所述多核苷酸具有选自如下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：103、105、107或109所示的核苷酸序列；以及
b)与SEQ ID NO：103、105、107或109具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)编码具有SEQ ID NO：104、106、108或110所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及
d)编码具有与SEQ ID NO：104、106、108或110具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
118.实施例108、109、116和117中任一项所述的方法，其中编码WUSCHEL多肽的所述多核苷酸有效连接到玉蜀黍In2-2启动子或胭脂碱合成酶启动子。
119.实施例64-118中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸构建体还包含编码目标多肽的编码多核苷酸E(CPE)，其中CPE有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。
120.实施例119所述的方法，其中所述切除盒包含所述CPE，并且其中所述选择的除草剂耐受性植物细胞缺少所述CPE。
121.实施例119所述的方法，其中所述CPE在切除盒的外部，并且其中所述选择的除草剂耐受性植物细胞包含所述CPE。
122.实施例119-121中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸构建体还包含有效连接到所述CPE的启动子E(PE)。
123.实施例64所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含：
a)第一泛素启动子；
b)切除盒，所述切除盒的旁侧带有loxP重组位点，所述loxP重组位点会相对于彼此发生重组并且是直接重复的，其中所述切除盒包含：
i)编码草丁膦乙酰转移酶(PAT)或新霉素磷酸转移酶II(NPTII)的多核苷酸；
ii)第二泛素启动子；
iii)编码黄色荧光蛋白的多核苷酸；
iv)包含玉蜀黍rab17启动子和附着B(attB)位点的启动子；
v)编码CRE重组酶的多核苷酸；
vi)胭脂碱合成酶启动子；
vii)编码玉蜀黍Wuschel 2多肽的多核苷酸；
viii)第三泛素启动子；以及
ix)babyboom多核苷酸；以及
c)GLYAT多核苷酸；
其中所述第一泛素启动子有效连接到编码所述PAT或NPTII的所述多核苷酸，并且其中在切除所述切除盒后，所述第一泛素启动子有效连接到所述GLYAT多核苷酸；
其中所述第二泛素启动子有效连接到编码所述黄色荧光蛋白的所述多核苷酸；
其中包含所述玉蜀黍rab17启动子和所述attB位点的所述启动子有效连接到编码所述CRE重组酶的所述多核苷酸；
其中所述胭脂碱合成酶启动子有效连接到编码所述玉蜀黍Wuschel 2多肽的所述多核苷酸；
并且其中所述第三泛素启动子有效连接到所述babyboom多核苷酸。
124.实施例64所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含：
a)泛素启动子；
b)切除盒，所述切除盒的旁侧带有loxP重组位点，所述loxP重组位点会相对于彼此发生重组并且是直接重复的，其中所述切除盒包含：
i)编码香菇珊瑚红色荧光蛋白的多核苷酸；
ii)包含玉蜀黍rab17启动子和附着B(attB)位点的启动子；以及
iii)编码CRE重组酶的多核苷酸；以及
c)GLYAT多核苷酸；
其中所述泛素启动子有效连接到编码所述香菇珊瑚红色荧光蛋白的所述多核苷酸，并且其中在切除所述切除盒后，所述泛素启动子有效连接到所述GLYAT多核苷酸；以及
其中包含所述玉蜀黍rab17启动子和所述attB位点的所述启动子有效连接到编码所述CRE重组酶的所述多核苷酸。
125.实施例64所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含：
a)泛素启动子；
b)切除盒，所述切除盒的旁侧带有loxP重组位点，所述loxP重组位点会相对于彼此发生重组并且是直接重复的，其中所述切除盒包含：
i)肌动蛋白启动子；
ii)编码香菇珊瑚红色荧光蛋白的多核苷酸；
iii)包含玉蜀黍rab17启动子和附着B(attB)位点的启动子；以及
iv)编码CRE重组酶的多核苷酸；以及
c)GLYAT多核苷酸；
其中在切除所述切除盒后，所述泛素启动子有效连接到所述GLYAT多核苷酸；
其中所述肌动蛋白启动子有效连接到编码所述香菇珊瑚红色荧光蛋白的所述多核苷酸；以及
其中包含所述玉蜀黍rab17启动子和所述attB位点的所述启动子有效连接到编码所述CRE重组酶的所述多核苷酸。
126.实施例64-125中任一项所述的方法，其中所述植物细胞是双子叶的。
127.实施例64-125中任一项所述的方法，其中所述植物细胞是单子叶的。
128.实施例127所述的方法，其中所述单子叶植物细胞选自玉蜀黍、水稻、高粱、大麦、小麦、粟、燕麦、裸麦、黑小麦、甘蔗、柳枝稷以及草坪草/饲草。
129.实施例64-128中任一项所述的方法，其中所述植物细胞是顽拗型的。
130.实施例129所述的方法，其中所述顽拗型植物细胞是选自CP96-1252、CP01-1372、CPCL97-2730、HoCP85-845、CP89-2143和KQ228的甘蔗品种的细胞。
131.一种用于增加植物组织的转化频率的方法，所述方法包括如下步骤：
a)提供植物细胞群体，其中群体中的至少一个植物细胞包含权利要求1-52中任一项所述的多核苷酸构建体；
b)在不存在除草剂耐受性多肽赋予对其的除草剂抗性的除草剂的情况下，将植物细胞群体培养足以使植物细胞群体增殖的一段时间；
c)诱导位点特异性重组酶的表达，从而切除所述切除盒；
d)使来自c)的植物细胞群体与除草剂耐受性多肽赋予对其的耐受性的除草剂接触；以及
e)选择具有对除草剂的耐受性的植物细胞，其中与不包含切除盒并且直接通过除草剂选择而选择的可比植物细胞相比，转化频率得到增加。
132.实施例131所述的方法，其中所述诱导包括干化所述植物细胞群体。
133.实施例131或132所述的方法，其中在切除之前，在不存在除草剂耐受性多肽赋予对其的除草剂抗性的除草剂的情况下，将植物细胞群体培养约1小时至约6周。
附图说明
图1提供了载体PHP35648的描绘。该载体包含青色荧光蛋白(CFP)的编码序列，该编码序列的表达由泛素启动子(Ubi Pro；包含玉蜀黍泛素启动子(UBI1ZM PRO；SEQ ID NO：111)、泛素5′UTR(UBI1ZM 5UTR；SEQ ID NO：112)和泛素内含子1(UBIZM INTRON1；SEQ ID NO：113))调控。PHP35648载体包含具有附着B位点的玉蜀黍rab17启动子(Rab17 Pro)，该启动子驱动CRE位点特异性重组酶的表达。该载体还包含如下蛋白的表达盒：玉蜀黍Wuschel 2(WUS2)蛋白(该蛋白的表达由胭脂碱合成酶(Nos)启动子调控)、玉蜀黍babyboom(BBM)蛋白和玉蜀黍优化的草丁膦乙酰转移酶(moPAT)(这两种蛋白均由泛素启动子调控；该泛素启动子包含玉蜀黍泛素启动子(Ubi Pro；包含UBI1ZM PRO；SEQ ID NO：111)、泛素5′UTR(UBI1ZM 5UTR；SEQ ID NO：112)和泛素内含子1(UBIZM INTRON1；SEQ ID NO：113))。当旁侧带有LoxP重组位点的载体片段(切除盒)被CRE重组酶切除时，黄色荧光蛋白(YFP)被表达。
图2提供了载体PHP54561的描绘。该载体包含moPAT或新霉素磷酸转移酶II(nptII)的编码序列，该编码序列的表达由泛素启动子(Ubi Pro；包含玉蜀黍泛素启动子(UBI1ZM PRO；SEQ ID NO：111)、泛素5′UTR(UBI1ZM 5UTR；SEQ ID NO：112)和泛素内含子1(UBIZMINTRON1；SEQ ID NO：113))调控。泛素启动子(Ubi Pro)还调控黄色荧光蛋白(YFP)和玉蜀黍BBM蛋白的表达。PHP54561载体还包含具有附着B位点的玉蜀黍rab17启动子(Rab17 Pro)(其驱动CRE重组酶的表达)以及受到Nos启动子调控的WUS2的表达盒。当旁侧带有LoxP位点的切除盒被CRE重组酶切除时，泛素启动子(Ubi Pro)调控草甘膦-N-乙酰转移酶(GLYAT)基因的表达。
图3提供了在组织增殖/再生培养基上对已用PHP54561载体转化并干化的甘蔗品种CP01-1372(顶部)和CP88-1762(底部)的组织进行的草甘膦选择的图像。
图4提供了在再生/生根培养基上对已用PHP54561载体转化并干化的甘蔗品种CP01-1372(左)和CP88-1762(右)进行的草甘膦选择的图像。
图5提供了在包含30μM草甘膦的生根培养基上对已用PHP54561载体转化并干化的甘蔗进行的第二轮草甘膦选择的图像。
图6提供了载体PHP54353的描绘。该载体包含来自香菇珊瑚的红色荧光蛋白(dsRED)的编码序列，该编码序列的表达由泛素启动子(Ubi Pro；包含玉蜀黍泛素启动子(UBI1ZM PRO；SEQ ID NO：111)、泛素5′UTR(UBI1ZM 5UTR；SEQ ID NO：112)和泛素内含子1(UBIZMINTRON1；SEQ ID NO：113))调控。PHP54353载体包含具有附着B位点的玉蜀黍rab17启动子(Rab17 Pro)，该启动子驱动CRE位点特异性重组酶的表达。当旁侧带有LoxP位点的切除盒被CRE重组酶切除时，泛素启动子(Ubi Pro)调控草甘膦-N-乙酰转移酶(GLYAT)基因的表达。
图7提供了另一个多核苷酸构建体实施例的描绘。该载体包含来自香菇珊瑚的红色荧光蛋白(dsRED)的编码序列，该编码序列的表达由肌动蛋白启动子(Actin Pro)调控。该载体还包含具有附着B位点的玉蜀黍rab17启动子(Rab17 Pro)，该启动子驱动CRE位点特异性重组酶的表达。当旁侧带有LoxP位点的切除盒被CRE重组酶切除时，泛素启动子(Ubi Pro；包含玉蜀黍泛素启动子(UBI1ZM PRO；SEQ ID NO：111)、泛素5′UTR(UBI1ZM 5UTR；SEQ ID NO：112)和泛素内含子1(UBIZMINTRON1；SEQ ID NO：113))调控草甘膦-N-乙酰转移酶(GLYAT)基因的表达。
图8提供了载体PHP55062的描绘。该载体包含来自香菇珊瑚的红色荧光蛋白(dsRED)的编码序列，该编码序列的表达由增强型紫茉莉花叶病毒(dMMV)启动子调控。该载体还包含具有附着B位点的玉蜀黍rab17启动子(Rab17 Pro)，该启动子驱动CRE位点特异性重组酶的表达。当旁侧带有LoxP位点的切除盒被CRE重组酶切除时，单独的dMMV启动子调控潮霉素磷酸转移酶(Hyg(hpt))基因的表达并且也调控草甘膦-N-乙酰转移酶(GLYAT)基因的表达。
图9提供了本发明所公开的多核苷酸构建体的各种实施例的描绘。这些构建体都包含切除盒(旁侧带有LoxP位点)，该切除盒包含编码位点特异性重组酶的多核苷酸(CPA)，该多核苷酸的表达由诱导型启动子A(PA)调控。在PA活化并且切除所述切除盒后，启动子B(PB)有效连接到编码除草剂耐受性多肽的多核苷酸(CPB)并且产生除草剂耐受性多肽。图9b-图9g的构建体的切除盒还包含切除盒中编码选择性标记的多核苷酸(CPC)，该多核苷酸有效连接到PB或另一个启动子(PC)。图9d-图9g的构建体的切除盒还包含至少一个编码细胞增殖因子的多核苷酸(CPD1和CPD2)，每个多核苷酸均有效连接到启动子(分别为PD1或PD2)。图9g的多核苷酸构建体还包含(切除盒的外部)编码目标多肽的多核苷酸(CPE)，该多核苷酸有效连接到启动子E(PE)。
具体实施方式
本发明提供了组合物和方法以用于调控转基因诸如除草剂耐受性多核苷酸的表达，用于产生和选择转基因植物和植物部分，以及用于增加植物或植物部分的转化频率。组合物包含多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体包含切除盒、转基因(例如，除草剂耐受性多核苷酸)和启动子，在从多核苷酸构建体切除所述切除盒后，启动子被有效连接到转基因(例如，除草剂耐受性多核苷酸)。切除盒包含有效连接到编码位点特异性重组酶的多核苷酸的诱导型启动子，并且切除盒的旁侧带有第一重组位点和第二重组位点，其中第一重组位点和第二重组位点会相对于彼此发生重组并且是直接重复的，并且其中位点特异性重组酶可在第一重组位点和第二重组位点识别并实施重组，从而切除所述切除盒并允许转基因(例如，除草剂耐受性多核苷酸)与其启动子的有效连接。在一些实施例中，多核苷酸构建体还包含在切除盒之内或外部的目标多核苷酸。在某些实施例中，切除盒还包含细胞增殖因子诸如babyboom多肽或Wuschel多肽的至少一个编码多核苷酸。
在一些实施例中，多核苷酸构建体还包含至少一个选择性标记。在一些实施例中，选择性标记选自荧光蛋白、抗生素抗性多肽、除草剂耐受性多肽和代谢酶。在一些实施例中，植物或植物部分难于转化。在一些实施例中，植物或植物部分是单子叶的。在一些实施例中，植物或植物部分是玉蜀黍、水稻、小麦、大麦、高粱、燕麦、裸麦、黑小麦和甘蔗。
意图在于切除盒不受切除盒内的编码多核苷酸的数量和/或顺序的限制。据设想，切除盒可用任何数量的编码多核苷酸以任何顺序构造。还意图在于除启动子以及位于重组位点旁侧的编码除草剂耐受性多肽的多核苷酸之外，多核苷酸构建体还可包含一个或多个编码目标多肽的多核苷酸。
术语“多核苷酸”的使用并非意图将组合物局限于包含DNA的多核苷酸。多核苷酸可包含核糖核苷酸以及包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子也包括合成的类似物。多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式或多链形式、发夹结构、茎-环结构、环状质粒等。
“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质或其生物活性部分实质上或基本上不含通常在该多核苷酸或蛋白质的天然环境中存在的、与该多核苷酸或蛋白质相伴随或相互作用的成分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质，当通过重组技术产生时实质上不含其他细胞物质或培养基，或者当通过化学法合成时实质上不含化学前体或其他化学品。最佳的是，“分离的”多核苷酸不含在衍生该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的序列(即位于该多核苷酸的5′和3′末端的序列)(最佳的是蛋白质编码序列)。例如，在多个实施例中，分离的多核苷酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在衍生该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的核苷酸序列。实质上不含细胞物质的蛋白质包括具有小于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的污染性蛋白质的蛋白质制备物。当蛋白质或其生物活性部分用重组法产生时，最佳的是，培养基具有少于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的化学前体或非目标蛋白的化学品。
如本文所用，“多核苷酸构建体”是指由具有不同功能和/或活性的各种类型的核苷酸序列构成的多核苷酸分子。例如，多核苷酸构建体可包含下列的任何一种或多种：表达盒、编码多核苷酸、调控序列(例如，增强子、启动子、终止序列)、复制起点、限制性位点、重组位点和切除盒。
本发明所公开的多核苷酸构建体可包含一个或多个表达盒，其中编码多核苷酸有效连接到调控序列。
如本文所用，“编码多核苷酸”是指编码多肽并因此包含引导核苷酸序列翻译成指定多肽的必需信息的多核苷酸。作为另一种选择，“编码多核苷酸”可指编码降低靶基因的表达的沉默多核苷酸的多核苷酸。沉默多核苷酸的非限制性例子包括小干扰RNA、微RNA、反义RNA、发夹结构等。
如本文所用，“表达盒”是指多核苷酸，所述多核苷酸包含有效连接到足以使编码多核苷酸表达的调控序列的至少一个编码多核苷酸。“有效连接”旨在意指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，编码多核苷酸和调控序列(即启动子)之间的有效连接是可使编码多核苷酸得以表达的功能性连接。有效连接的元件可以是连续的或非连续的。当用来指两个蛋白质编码区域的连接时，所谓有效连接意指所述编码区域处于相同的阅读框中。
表达盒在5′-3′转录方向上将包括在植物中有功能的转录和翻译起始区(即启动子)、编码多核苷酸及转录和翻译终止区(即终止区)。调控序列(即启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或编码多核苷酸对包含本发明所公开的多核苷酸构建体的宿主细胞而言或对彼此而言可以是天然/同功的。作为另一种选择，调控区和/或编码多核苷酸对宿主细胞而言或对彼此而言可以是异源的。如本文所用，针对序列所谓的“异源”为起源于外来物种的序列，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过有意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰的序列。异源多核苷酸在本文也称为“转基因”。例如，有效连接到异源多核苷酸的启动子来自于与得到该多核苷酸的物种不同的物种，或者如果来自于相同/类似的物种的话，一者或两者从它们的原始形式和/或基因座经实质修饰而得，或者该启动子不是该被有效连接的多核苷酸的天然启动子。虽然可优选使用异源启动子来表达序列，但可以使用天然的启动子序列。
终止区可以对于转录起始区而言是天然的，可以对于有效连接的编码多核苷酸而言是天然的，可以对于宿主细胞而言是天然的，或者可以衍自对于该启动子、该编码多核苷酸、该宿主细胞或它们的任何组合而言别的来源(即外来的或异源的)。方便的终止区可得自马铃薯蛋白酶抑制因子(PinII)基因或根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，诸如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。还可参见Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144(Guerineau等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第262卷，第141-144页)；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674(Proudfoot，1991年，《细胞》，第64卷，第671-674页)；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5：141-149(Sanfacon等人，1991年，《基因和发育》，第5卷，第141-149页)；Mogen et al.(1990)Plant Cell 2：1261-1272(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页)；Munroe et al.(1990)Gene 91：151-158(Munroe等人，1990年，《基因》，第91卷，第151-158页)；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903(Ballas等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903页)；以及Joshi et al.(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639(Joshi等人，1987年，《核酸研究》，第15卷，第9627-9639页)。在一些实施例中，有效连接到编码位点特异性重组酶的多核苷酸、编码选择性标记的多核苷酸、编码细胞增殖标记的多核苷酸、除草剂耐受性多核苷酸和目标多核苷酸中至少一者的终止序列是来自pinII基因的终止区。在这些实施例的一些中，终止区具有SEQ ID NO：1所示的序列或者能够终止植物细胞中的转录和/或翻译的活性变体或片段。
表达盒可以另外含有5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5′非编码区)(Elroy-Stein et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130(Elroy-Stein等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86页，第6126-6130页))；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie et al.(1995)Gene165(2)：233-238(Gallie等人，1995年，《基因》，第165卷，第2期，第233-238页))、MDMV前导序列(玉米矮小花叶病毒)(Virology 154：9-20(《病毒学》，第154卷，第9-20页))以及人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak et al.(1991)Nature 353：90-94(Macejak等人，1991年，《自然》，第353卷，第90-94页))；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导序列(Jobling et al.(1987)Nature325：622-625(Jobling等人，1987年，《自然》，第325卷，第622-625页))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie et al.(1989)in MolecularBiology of RNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237-256(Gallie等人，1989年，载于《RNA的分子生物学》，Cech编辑(Liss，纽约)，第237-256页))；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel et al.(1991)Virology 81：382-385(Lommel等人，1991年，《病毒学》，第81卷，第382-385页))。还可参见Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84：965-968(Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理学》，第84卷，第965-968页)。
例如，在其中除草剂耐受性多核苷酸为GLYAT多核苷酸的实施例的一些中，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S增强子区或烟草花叶病毒(TMV)omega 5′UTR翻译增强子元件包含于启动子的上游，该启动子有效连接(当切除所述切除盒时)到GLYAT多核苷酸以增强转录(参见例如美国专利No.7,928,296和No.7,622,641，所述专利的每一篇全文均以引用方式并入本文)。
在制备表达盒或多核苷酸构建体时，可对各种DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。出于这个目的，可涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、再置换(例如转换和颠换)。
表达盒包含有效连接到编码多核苷酸的启动子。如本文所用，术语“启动子”包括指涉及RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始编码序列的转录的DNA区域。启动子可为天然存在的启动子、其变体或片段、或以合成方式衍生。术语“启动子”是指引导转录必需的最小序列(最小启动子)以及包含最小启动子和任何数量的附加元件的序列，所述附加元件为诸如操纵子序列、增强子、调控因子、限制性位点、重组位点、位于最小启动子与编码序列之间的序列、以及5′-非翻译区(5′-UTR)的序列，5′-非翻译区是被转录但不被翻译成多肽的转录物的区域，并且可以或可不以所需方式影响转录水平。“植物启动子”是指从植物分离的启动子或源自其的启动子或在植物中发挥作用的异源启动子。
虽然根据本发明，驱动位点特异性重组酶的表达的启动子是诱导型启动子，但可使用各种类型的启动子来调控本发明所公开的多核苷酸构建体中的其余编码多核苷酸的表达。可基于所需结果或表达模式来选择启动子(有关植物启动子的综述，参见Potenza et al.(2004)In Vitro Cell Dev Biol40：1-22(Potenza等人，2004年，《体外细胞与发育生物学》，第40卷，第1-22页))。
组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子以及WO99/43838和美国专利No.6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell et al.(1985)Nature 313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))；水稻肌动蛋白(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2：163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第163-171页))；泛素(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588(Last等人，1991年，《理论和应用遗传学》，第81卷，第581-588页))；MAS(Velten et al.(1984)EMBO J.3：2723-2730(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)、农杆菌(Agrobacterium)胭脂碱合成酶(NOS)启动子(Bevan et al.(1983)Nucl.Acids Res.11：369-385(Bevan等人，1983年，《核酸研究》，第11卷，第369-385页))；紫茉莉花叶病毒(MMV)启动子(Dey&Maiti(1999)Plant Mol Biol 40：771-782(Dey和Maiti，1999年，《植物分子生物学》，第40卷，第771-782页)；Dey&Maiti(1999)Transgenics 3：61-70(Dey和Maiti，1999年，《转基因学》，第3卷，第61-70页))；组蛋白2B(H2B)(国际申请公布No.WO 99/43797)；香蕉条纹病毒(BSV)启动子(Remans et al.(2005)Virus Research 108：177-186(Remans等人，2005年，《病毒研究》，第108卷，第177-186页))；虎尾草条点花叶病毒(CSMV)启动子(Zhan et al.(1993)Virology 193：498-502(Zhan等人，1993年，《病毒学》，第193卷，第498-502页))；木薯叶脉花叶病毒(CSVMV)启动子(Verdaguer et al.(1998)Plant Mol Biol37：1055-1067(Verdaguer等人，1998年，《植物分子生物学》，第37卷，第1055-1067页))；玄参花叶病毒(FMV)启动子(美国专利No.6,018,100)、水稻α微管蛋白(OsTUBA1)启动子(Jeon et al.(2000)PlantPhysiol 123：1005-1014(Jeon等人，2000年，《植物生理学》，第123卷，第1005-1014页))；水稻细胞色素C(OsCC1)启动子(Jang et al.(2002)Plant Physiol 129：1473-1481(Jang等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1473-1481页))；玉蜀黍醇脱氢酶1(ZmADH1)启动子(Kyozukaet al.(1990)Maydica 35：353-357(Kyozuka等人，1990年，《玉米》，第35卷，第353-357页))；油质蛋白启动子(例如，SEQ ID NO：2或其变体或片段)等；所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文。其他组成型启动子在例如以下美国专利中有所描述：No.5,608,149、No.5,608,144、No.5,604,121、No.5,569,597、No.5,466,785、No.5,399,680、No.5,268,463、No.5,608,142、和No.6,177,611，所述专利的每一篇全文以引用方式并入本文。
在一些实施例中，可使用诱导型启动子，诸如来自病原体诱导型启动子的启动子。此类启动子包括来自病程相关蛋白(PR蛋白)的那些，该蛋白在病原体感染后被诱导；例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见例如Redolfi et al.(1983)Neth.J.Plant Pathol.89：245-254(Redolfi等人，1983年，《荷兰植物病理学杂志》，第89卷，第245-254页)；Uknes et al.(1992)Plant Cell 4：645-656(Uknes等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第645-656页)；以及Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4：111-116(Van Loon，1985年，《植物分子病毒学》，第4卷，第111-116页)。还可参见WO 99/43819，该文献以引用方式并入本文。在病原体感染位点处或附近局部表达的启动子包括例如Marineau et al.(1987)PlantMol.Biol.9：335-342(Marineau等人，1987年，《植物分子生物学》，第9卷，第335-342页)；Matton et al.(1989)Mol Plant-Microbe Interact 2：325-331(Matton等人，1989年，《分子植物与微生物相互作用》，第2卷，第325-331页)；Somsisch et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2427-2430(Somsisch等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第2427-2430页)；Somsisch et al.(1988)Mol.Gen.Genet.2：93-98(Somsisch等人，1988年，《分子遗传学与普通遗传学》，第2卷，第93-98页)；以及Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14972-14977(Yang，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第14972-14977页)。还可参见Chenet al.(1996)Plant J.10：955-966(Chen等人，1996年，《植物杂志》，第10卷，第955-966页)；Zhang et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：2507-2511(Zhang等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第2507-2511页)；Warner et al.(1993)Plant J.3：191-201(Warner等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第191-201页)；Siebertz et al.(1989)Plant Cell 1：961-968(Siebertz等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第961-968页)；美国专利No.5,750,386(线虫诱导型)；以及其中引用的参考文献。另外的启动子包括玉蜀黍PRms基因的诱导型启动子，其表达由病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导(参见例如，Corderoet al.(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41：189-200(Cordero等人，1992年，《生理与分子植物病理学》，第41卷，第189-200页))。伤口诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制因子(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28：425-449(Ryan，1990年，《植物病理学年评》，第28卷，第425-449页)；Duan et al.(1996)Nat Biotechnol 14：494-498(Duan等人，1996年，《自然-生物技术》，第14卷，第494-498页))；wun1和wun2，美国专利No.5,428,148；win1和win2(Stanford et al.(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208(Stanford等人，1989年，《分子遗传学与普通遗传学》，第215卷，第200-208页))；系统素(McGurl et al.(1992)Science 225：1570-1573(McGurl等人，1992年，《科学》，第225卷，第1570-1573页))；WIP1(Rohmeier et al.(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792(Rohmeier等人，1993年，《植物分子生物学》，第22卷，第783-792页)；Eckelkamp et al.(1993)FEBS Lett 323：73-76(Eckelkamp等人，1993年，《欧洲生物化学学会联盟快报》，第323卷，第73-76页))；MPI基因(Corderok et al.(1994)Plant J.6：141-150(Corderok等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第141-150页))等等，这些文献以引用方式并入本文。
可用于调控本发明所公开的多核苷酸构建体的任何编码序列的表达的其他诱导型启动子包括胁迫诱导型启动子，诸如本文别处所述的那些。
可将化学调节型启动子用于通过施加外源化学调节剂来调控基因在植物中的表达。该启动子可以是化学诱导型启动子，其中化学剂的施加可诱导基因表达，或者是化学阻遏型启动子，其中化学剂的施加可阻遏基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的并且包括但不限于被苯磺酰胺除草剂安全剂活化的玉蜀黍In2-2启动子(De Veylder et al.(1997)Plant CellPhysiol.38：568-77(De Veylder等人，1997年，《植物细胞生理学》，第38卷，第568-577页))、被用作萌前除草剂的疏水亲电化合物活化的玉蜀黍GST启动子(GST-II-27，WO 93/01294)、被BTH或苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸s-甲酯活化的PR-1启动子(Cao et al.(2006)Plant CellReports 6：554-60(Cao等人，2006年，《植物细胞报道》，第6卷，第554-560页))、被水杨酸活化的烟草PR-1a启动子(Ono et al.(2004)Biosci.Biotechnol.Biochem.68：803-7(Ono等人，2004年，《生物科学、生物技术与生物化学》，第68卷，第803-807页))、铜诱导型ACE1启动子(Mett et al.(1993)PNAS 90：4567-4571(Mett等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第4567-4571页))、乙醇诱导型启动子AlcA(Caddick et al.(1988)Nature Biotechnol 16：177-80(Caddick等人，1988年，《自然-生物技术》，第16卷，第177-180页))、雌二醇诱导型启动子(Bruce et al.(2000)Plant Cell 12：65-79(Bruce等人，2000年，《植物细胞》，第12卷，第65-79页))、XVE雌二醇诱导型启动子(Zao et al.(2000)Plant J 24：265-273(Zao等人，2000年，《植物杂志》，第24卷，第265-273页))、VGE甲氧虫酰肼诱导型启动子(Padidam et al.(2003)Transgenic Res 12：101-109(Padidam等人，2003年，《转基因研究》，第12卷，第101-109页))以及TGV地塞米松诱导型启动子(Bohner et al.(1999)Plant J 19：87-95(Bohner等人，1999年，《植物杂志》，第19卷，第87-95页))。其他目标化学调节启动子包括类固醇响应型启动子(参见例如，糖皮质素诱导型启动子，载于Schena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-10425(Schena等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第10421-10425页)；以及McNellis et al.(1998)Plant J.14(2)：247-257(McNellis等人，1998年，《植物杂志》，第14卷，第2期，第247-257页))，以及四环素诱导型和四环素阻遏型启动子(参见例如，Gatz et al.(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237(Gatz等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第227卷，第229-237页)；Gatz et al.(1992)Plant J 2：397-404(Gatz等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第397-404页)；以及美国专利No.5,814,618和No.5,789,156)，这些文献以引用方式并入本文。
本文别处更详细地描述并且可用于本发明所公开的组合物和方法中、特别是用以调控位点特异性重组酶的表达的其他特定化学诱导型启动子，是响应于磺酰脲的启动子，其中启动子包含能够结合到磺酰脲响应性转录阻遏因子(SuR)蛋白的操纵子序列，诸如美国申请公布No.2010/0105141和No.2011/0287936中所述的那些序列，所述申请公布的每一篇全文以引用方式并入本文。
组织偏好的启动子可用于使编码多核苷酸的增强表达靶向特定植物组织内。组织偏好的启动子包括Kawamata et al.(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803(Kawamata等人，1997年，《植物细胞生理学》，第38卷，第7期，第792-803页)；Hansen et al.(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343(Hansen等人，1997年，《分子遗传学与普通遗传学》，第254卷，第3期，第337-343页)；Russell et al.(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168(Russell等人，1997年，《转基因研究》，第6卷，第2期，第157-168页)；Rinehart et al.(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341(Rinehart等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第3期，第1331-1341页)；Van Camp et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535(Van Camp等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第525-535页)；Canevascini et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524(Canevascini等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第513-524页)；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196(Lam，1994年，《细胞变异研究结果与问题》，第20卷，第181-196页)；以及Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J.4(3)：495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页)。
叶偏好的启动子是本领域已知的。参见例如Yamamoto et al.(1997)Plant J.12：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第255-265页)；Kwon et al.(1994)Plant Physiol.105：357-67(Kwon等人，1994年，《植物生理学》，第105卷，第357-367页)；Yamamoto etal.(1994)Plant Cell Physiol.35：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第773-778页)；Gotor et al.(1993)Plant J.3：509-18(Gotor等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第509-518页)；Orozco et al.(1993)Plant Mol.Biol.23：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第1129-1138页)；以及Matsuoka et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第9586-9590页)。此外，还可使用cab和rubisco的启动子。参见例如Simpson et al.(1958)EMBO J 4：2723-2729(Simpson等人，1958年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第4卷，第2723-2729页)以及Timko et al.(1988)Nature 318：57-58(Timko等人，1988年，《自然》，第318卷，第57-58页)。
根偏好的启动子是已知的并且可选自可用的多种启动子。参见例如Hire et al.(1992)Plant Mol.Biol.20：207-218(Hire等人，1992年，《植物分子生物学》，第20卷，第207-218页)(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller and Baumgartner(1991)Plant Cell 3：1051-1061(Keller和Baumgartner，1991年，《植物细胞》，第3卷，第1051-1061页)(法国菜豆的GRP 1.8基因的根特异性控制元件)；Sanger et al.(1990)Plant Mol.Biol.14：433-443(Sanger等人，1990年，《植物分子生物学》，第14卷，第433-443页)(根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露氨酸合成酶(MAS)基因的根特异性启动子)；以及Miao et al.(1991)Plant Cell 3：11-22(Miao等人，1991年，《植物细胞》，第3卷，第11-22页)(编码细胞溶胶谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。还可参见Bogusz et al.(1990)Plant Cell 2：633-641(Bogusz等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第633-641页)，其中描述了从来自固氮非豆科植物榆科山黄麻(Parasponia andersonii)和相关的非固氮非豆科植物鸡屎藤山麻黄(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的高度表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参见Plant Sci(Limerick)79：69-76(《植物科学》，Limerick，第79卷，第69-76页))。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因融合，表明编码章鱼氨酸合成酶的农杆菌T-DNA基因在根尖的表皮中特别活跃，且TR2′基因在完整植物中是根特异性的并且通过叶组织中的创伤刺激(参见EMBO J.8：343-350(《欧洲分子生物学组织杂志》，第8卷，第343-350页))。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因显示了相似的特性。另外的根偏好启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster et al.(1995)Plant Mol.Biol.29：759-772(Kuster等人，1995年，《植物分子生物学》，第29卷，第759-772页))；以及rolB启动子(Capana et al.(1994)Plant Mol.Biol.25：681-691(Capana等人，1994年，《植物分子生物学》，第25卷，第681-691页))。还可参见以下美国专利：No.5,837,876、No.5,750,386、No.5,633,363、No.5,459,252、No.5,401,836、No.5,110,732和No.5,023,179。另一个根偏好的启动子包括菜豆素基因的启动子(Murai et al.(1983)Science 23：476-482(Murai等人，1983年，《科学》，第23卷，第476-482页)和Sengopta-Gopalen et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：3320-3324(Sengopta-Gopalen等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第3320-3324页))。
种子偏好的启动子包括种子发育过程中活跃的那些启动子和在种子萌发过程中活跃的启动子。参见Thompson et al.(1989)BioEssays 10：108(Thompson等人，1989年，《生物学论文集》，第10卷，第108页)，该文献以引用方式并入本文。这类种子偏好启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导信息)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米蛋白)；以及milps(肌醇-1-磷酸合成酶)；(参见WO 00/11177和美国专利No.6,225,529；所述专利以引用方式并入本文)。对于双子叶植物，种子偏好的启动子包括但不限于豆类β-菜豆素基因启动子、油菜籽蛋白基因启动子、β-伴大豆球蛋白基因启动子、大豆凝集素基因启动子、十字花科蛋白基因启动子等等。对于单子叶植物，种子偏好的启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米蛋白基因启动子、22kDa玉米蛋白基因启动子、27kDaγ-玉米蛋白基因启动子、糯性蛋白基因启动子、超甜蛋白1基因启动子、超甜蛋白2基因启动子、球蛋白1基因启动子、油质蛋白基因启动子、nuc1等。还可参见WO00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏好的启动子；该专利以引用方式并入本文。
如果需要低水平表达，则要使用弱启动子。一般来讲，所谓“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。所谓“低水平”意指处于约1/1000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平。作为另一种选择，应当认识到，弱启动子还涵盖仅在少数细胞中而不在其他细胞中表达从而造成总表达水平较低的启动子。如启动子以不可接受的高水平表达，则可缺失或者修饰启动子序列的一些部分以降低表达水平。这种弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO99/43838和美国专利No.6,072,050)、核心35S CaMV启动子等等。
在一些实施例中，下列启动子中的至少一个是组成型启动子：调控除草剂耐受性多肽的表达的启动子、有效连接到细胞增殖标记的启动子、以及驱动存在于切除盒内的选择性标记的表达的启动子。在特定实施例中，存在于本发明所公开的多核苷酸构建体的切除盒内的选择性标记有效连接到组成型启动子，使得选择性标记被组成性表达直到切除所述切除盒，并且在切除所述盒之后，相同组成型启动子随后调控除草剂耐受性多肽的表达。在这些实施例的一些中，组成型启动子是玉蜀黍泛素启动子(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen etal.(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))，其在一些实施例中包含玉蜀黍泛素启动子(UBI1ZM PRO；SEQ ID NO：111)、泛素5′UTR(UBI1ZM5UTR；SEQ ID NO：112)和泛素内含子1(UBIZM INTRON1；SEQ IDNO：113)。在其他实施例中，调控存在于切除盒内的选择性标记的表达的组成型启动子是增强型紫茉莉花叶病毒(MMV)启动子(Dey&Maiti(1999)Plant Mol Biol 40：771-782(Dey和Maiti，1999年，《植物分子生物学》，第40卷，第771-782页)；Dey&Maiti(1999)Transgenics 3：61-70(Dey和Maiti，1999年，《转基因学》，第3卷，第61-70页))。在一些实施例中，编码细胞增殖因子(例如，babyboom多肽)的多核苷酸有效连接到玉蜀黍泛素启动子(其在一些实施例中包含玉蜀黍泛素启动子(UBI1ZMPRO；SEQ ID NO：111)、泛素5′UTR(UBI1ZM 5UTR；SEQ ID NO：112)和泛素内含子1(UBIZM INTRON1；SEQ ID NO：113)或玉蜀黍油质蛋白启动子(例如，SEQ ID NO：2或其变体或片段))。
根据本发明，调控位点特异性重组酶的表达的启动子是诱导型启动子。在一些实施例中，有效连接到编码位点特异性重组酶的多核苷酸的诱导型启动子包括胁迫诱导型启动子。如本文所用，“胁迫诱导型启动子”是指在宿主细胞(例如，植物细胞)或宿主(例如，植物或植物部分)遭受胁迫(包括非生物胁迫)时起始转录的启动子。可活化胁迫诱导型启动子的条件的非限制性例子包括干旱、盐度、洪涝和亚适温。一些胁迫诱导型启动子仅被特定胁迫(例如，干旱)活化，而其他胁迫诱导型启动子可被任何类型的胁迫、尤其是任何类型的非生物胁迫活化。
胁迫诱导型启动子包括响应于干旱和高盐度(干旱诱导型启动子)和寒冷温度(寒冷诱导型启动子)而被活化的那些启动子。一些启动子既是干旱诱导型，又是寒冷诱导型。许多胁迫诱导型启动子还被脱落酸(ABA)活化，脱落酸是植物响应于干旱和高盐度胁迫而通常表达的一种植物激素。胁迫诱导型启动子可被活化的调控途径包括ABA依赖性的调控途径以及ABA非依赖性的调控途径。因此，一些胁迫诱导型启动子包含ABA响应元件(ABRE)并响应于ABA。响应于干旱、高盐度和/或寒冷温度的那些胁迫诱导型启动子中的一些包含脱水响应性(DRE)/C重复(CRT)元件。C重复结合因子(CBF)/DREB1转录因子(其表达被寒冷胁迫诱导)和DREB2转录因子(其被脱水诱导)结合于DRE/CRT元件。在一些实施例中，胁迫诱导型启动子包含下列顺式作用胁迫响应元件中的任一种：ABRE、CE1、CE3、MYB识别位点(MYBR)、MYC识别位点(MYCR)、DRE、CRT、低温响应元件(LTRE)、NAC识别位点(NACR)、锌指同源结构域识别位点(ZFHDR)以及CBF表达诱导子(ICE)识别位点。表1提供了这些顺式作用胁迫响应元件的序列。参见Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki(2005)TrendsPlant Sci 10：1360-1385(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，2005年，《植物科学趋势》，第10卷，第1360-1385页)以及Shinozaki et al.(2003)Curr Opin Plant Biol 6：410-417(Shinozaki等人，2003年，《植物生物学新见》，第6卷，第410-417页)(所述文献的每一篇全文以引用方式并入)，获取胁迫诱导型启动子及控制所述启动子的调控途径的综述。
表1.胁迫诱导型基因表达中的顺式作用调控元件。*
*转载自Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki(2005)Trends Plant Sci 10：1360-1385(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，2005年，《植物科学趋势》，第10卷，第1360-1385页)
在一些实施例中，有效连接到编码位点特异性重组酶的多核苷酸的诱导型启动子是寒冷诱导型启动子。如本文所用，“寒冷诱导型启动子”是在低于植物生长的最适温度的温度下活化的启动子。在一些实施例中，寒冷诱导型启动子是响应于低于约20℃、低于约19℃、低于约18℃、低于约17℃、低于约16℃、低于约15℃、低于约14℃、低于约13℃、低于约12℃、低于约11℃、低于约10℃、低于约9℃、低于约8℃、低于约7℃、低于约6℃、低于约5℃、低于约4℃、低于约3℃、低于约2℃、低于约1℃、或低于约0℃的温度而被诱导的启动子。
寒冷诱导型启动子可通过如下方式活化：使植物或植物部分暴露于寒冷温度约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约8周、约9周、约10周、约3个月或更长的时间段。植物或植物部分暴露于寒冷温度所需的温度或必需的时间量将根据例如启动子、植物物种、外植体类型和植物组织的尺寸而变化，并且可由本领域技术人员确定。
寒冷诱导型启动子可包含C重复(CRT)和/或低温响应元件(LTRE)，两者也包含形成DRE序列的核心的A/GCCGAC基序。寒冷诱导型启动子的非限制性例子包括玉蜀黍rab17启动子(Vilardell et al.(1990)PlantMol Biol14：423-432(Vilardell等人，1990年，《植物分子生物学》，第14卷，第423-432页))、RD29A启动子(Uno et al.(2000)PNAS 97：11632-11637(Uno等人，2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第11632-11637页))、Cor15A启动子(Baker et al.(1994)Plant Mol Biol 24：701-713(Baker等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第701-713页))、BN115启动子(Jiang et al.(1996)Plant Mol Biol 30：679-684(Jiang等人，1996年，《植物分子生物学》，第30卷，第679-684页))、以及CBF2/DREB1C启动子(Zarka et al.(2003)Plant Physiol 133：910-918(Zarka等人，2003年，《植物生理学》，第133卷，第910-918页))；所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文。
在一些实施例中，调控位点特异性重组酶的表达的诱导型启动子是春化启动子，其是响应于寒冷温度而触发植物开花的启动子。春化启动子一般需要暴露于寒冷温度延长的时间段(例如，至少2周)才能活化。在某些实施例中，春化启动子的活化需要暴露于低于约20℃、低于约19℃、低于约18℃、低于约17℃、低于约16℃、低于约15℃、低于约14℃、低于约13℃、低于约12℃、低于约11℃、低于约10℃、低于约9℃、低于约8℃、低于约7℃、低于约6℃、低于约5℃、低于约4℃、低于约3℃、低于约2℃、低于约1℃、或低于约0℃的温度至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少11周、至少12周、至少13周、至少14周、至少15周、至少16周或更长。在某些实施例中，春化启动子的活化需要暴露于约4℃的温度约2周。
在一些实施例中，春化启动子包含推定的MADS框蛋白结合位点，本文称为CarG框，其序列以SEQ ID NO：114示出。春化启动子的非限制性例子是SEQ ID NO：115所示并在如下文献中描述的一粒小麦(Triticummonococcum)VRN1/AP1启动子：Yan et al.(2003)Proc Natl Acad Sci USA100：6263-6268(Yan等人，2003年，《美国国家科学院院刊》，第100卷，第6263-6268页)和美国申请公布No.2004/0203141，所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文。
在其中调控位点特异性重组酶的表达的诱导型启动子是春化启动子的那些实施例的一些中，多核苷酸构建体的宿主细胞是芸苔属物种(Brassicasp.)、冬小麦、大麦、燕麦或裸麦。
在其他实施例中，调控位点特异性重组酶的表达的诱导型启动子是干旱诱导型启动子。如本文所用，“干旱诱导型启动子”或“干化诱导型启动子”是指响应于干旱条件、高盐度和/或植物或植物部分的干化而起始转录的启动子。干旱诱导型启动子可驱动包括但不限于如下的多种不同植物组织中的表达：根组织(例如，根内皮、根表皮或根维管组织)和叶组织(例如，表皮、叶肉或叶维管组织)。
在一些实施例中，干旱诱导型启动子包含DRE或脱水诱导早期响应基因1(ERD1)顺式作用元件(Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki(2004)Trends Plant Sci 10：1360-1385(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，2004年，《植物科学趋势》，第10卷，第1360-1385页)；以及Shinozaki et al.(2003)Curr Opin Plant Biol 6：410-417(Shinozaki等人，2003年，《植物生物学新见》，第6卷，第410-417页))。
当包含干旱诱导型启动子的植物或植物部分被干化时，该干旱诱导型启动子被活化。如本文所用，术语“干化”是指植物或植物部分的水含量减少的过程，并且可包括指种子成熟期间发生的自然干化过程。因此，在一些实施例中，在包含含有本发明所公开的多核苷酸构建体的植物细胞的种子的成熟期间，干旱诱导型启动子在该植物细胞中活化并且发生切除盒的切除。
与未被干燥的植物或植物部分相比，干化的植物或植物部分可包含约90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％、0.1％或更少的水。活化干旱诱导型启动子必需的干化量或干化植物或植物部分所需的时间量将根据例如启动子、植物物种、外植体类型和植物组织的尺寸而变化。
在一些实施例中，通过使包含干旱诱导型启动子的植物或植物部分暴露于干旱条件，而使植物或植物部分干化并使干旱诱导型启动子活化。如本文所用，“干旱”或“干旱条件”可被定义为这样的一组环境条件，在该条件下植物或植物部分将开始遭受水分剥夺的效应，诸如降低的气孔导度和光合作用、降低的生长速率、膨胀性丧失(萎蔫)或胚珠败育。出于这些原因，经历干旱胁迫的植物通常将表现出生物质和产量的显著下降。水分剥夺可由缺少降雨或有限灌溉引起。作为另一种选择，水分亏缺也可由伤害根并限制苗的水吸收的高温、低湿度、盐渍土、冻结温度或涝渍土引起。由于植物物种耐受水分亏缺的能力有差异，故而无法归纳引起干旱胁迫的精确环境条件。
干旱诱导型启动子可通过如下方式活化：使植物或植物部分暴露于干旱条件约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约2周、约3周或更长的时间段。
在一些实施例中，通过在不存在液体培养基的情况下并任选地在干燥滤纸上温育植物或植物部分，而使植物或植物部分干化并使干旱诱导型启动子活化。在一些实施例中，通过在含饱和盐溶液(例如，(NH4)2SO4)的密封容器中温育植物或植物部分，而使植物或植物部分干化。在一些实施例中，在不存在液体培养基的情况下并任选地在干燥滤纸上，并且在一些实施例中，在含饱和盐溶液的密封容器中，温育植物或植物部分约1天、约1.5天、约2天、约2.5天、约3天、约3.5天、约4天、约4.5天、约5天、约5.5天、约6天、约6.5天、约7天、约7.5天、约8天、约8.5天、约9天、约9.5天、约10天或更长以便诱导干旱诱导型启动子的表达。
干旱诱导型启动子的非限制性例子包括玉蜀黍rab17的启动子(Vilardell et al.(1990)Plant Mol Biol 14：423-432(Vilardell等人，1990年，《植物分子生物学》，第14卷，第423-432页))；水稻(Oryza sativa)Em(Guiltinan et al.(1990)Science 250：267-271(Guiltinan等人，1990年，《科学》，第250卷，第267-271页))；Rab16(Mundy et al.(1990)PNAS87：406-410(Mundy等人，1990年，《美国国家科学院院刊》，第87卷，第406-410页))；HVA1(Hobo et al.(1999)Plant J 19：679-689(Hobo等人，1999年，《植物杂志》，第19卷，第679-689页))；HVA22(Su etal.(1998)Plant Physiol 117：913-922(Su等人，1998年，《植物生理学》，第117卷，第913-922页))；RD29B和RD29A(Uno et al.(2000)PNAS97：11632-11637(Uno等人，2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第11632-11637页))；RD22(Abe et al(1997)Plant Cell 9：1859-1868(Abe等人，1997年，《植物细胞》，第9卷，第1859-1868页))；Cor15A(Baker et al.(1994)Plant Mol Biol 24：701-713(Baker等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第701-713页))；BN115(Jiang etal.(1996)Plant Mol Biol 30：679-684(Jiang等人，1996年，《植物分子生物学》，第30卷，第679-684页))；ERD1(Tran et al.(2004)Plant Cell16：2481-2498(Tran等人，2004年，《植物细胞》，第16卷，第2481-2498页))；水稻LEA3(Xiao et al.(2007)Theor Appl Genet 115：35-46(Xiao等人，2007年，《理论与应用遗传学》，第115卷，第35-46页))；水稻rab16Bj(Xiao and Xue(2001)Plant Cell Rep 20：667-73(Xiao和Xue，2001年，《植物细胞报道》，第20卷，第667-673页))；芸苔属LEA3-1(美国申请公布No.US 2008/0244793)；LEA D7、LEA D11、LEA D19、LEA d34和LEA D113(Baker et al.(1988)Plant Mol Biol 11：277-291(Baker等人，1988年，《植物分子生物学》，第11卷，第277-291页))；水稻RAB16和高粱(Sorghum bicolor)DHN2(Buchanan et al.(2004)Genetics 168：1639-1654(Buchanan等人，2004年，《遗传学》，第168卷，第1639-1654页))；水稻ASR1(Kuriakose et al.(2009)African JBiotech 8：4765-73(Kuriakose等人，2009年，《非洲生物技术杂志》，第8卷，第4765-4773页))；水稻NAC6(Nakashima et al.(2007)Plant J51：617-630(Nakashima等人，2007年，《植物杂志》，第51卷，第617-630页))；水稻SALT(Garcia et al.(1998)Planta 207：172-180(Garcia等人，1998年，《植物》，第207卷，第172-180页))；水稻LIP9(Aguan et al.(1993)Mol Gen Genet 240：1-8(Aguan等人，1993年，《分子遗传学与普通遗传学》，第240卷，第1-8页))；水稻WS1724(Takahashi et al.(1994)Plant Mol Biol 26：339-352(Takahashi等人，1994年，《植物分子生物学》，第26卷，第339-352页))；水稻WSI18(Ohet al.(2005)Plant Physiol 138：341-351(Oh等人，2005年，《植物生理学》，第138卷，第341-351页))；AREB1、AREB2和ABF3(Yoshida etal.(2010)Plant J 61：672-685(Yoshida等人，2010年，《植物杂志》，第61卷，第672-685页))；水稻DIP1、UGE1、R1G1B和RAB21启动子(Yi et al.(2010)Planta 232：743-754(Yi等人，2010年，《植物》，第232卷，第743-754页))；棉花D113(Luo et al.(2008)Plant Cell Rep 27：707-717(Luo等人，2008年，《植物细胞报道》，第27卷，第707-717页))；脱水素(dehydrin)启动子；ASI启动子；WGA启动子；P511启动子；以及HS70启动子；脱水素(dehydrin)(DHN)启动子(Robertson et al.(1995)Physiol Plant 94：470-478(Robertson等人，1995年，《植物生理学》，第94卷，第470-478页))；α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制因子(ASI)启动子(Furtado et al.(2003)Plant Mol Biol 52：787-799(Furtado等人，2003年，《植物分子生物学》，第52卷，第787-799页))；WGA启动子；以及HS70启动子；所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文。
在一些实施例中，驱动位点特异性重组酶的表达及切除盒的随后切除的诱导型启动子是Rab17启动子，诸如玉蜀黍rab17启动子或其活性变体或片段。玉蜀黍rab17(响应于脱落酸)基因(GenBank登录号X15994；Vilardell et al.(1990)Plant Mol Biol 14：423-432(Vilardell等人，1990年，《植物分子生物学》，第14卷，第423-432页)；Vilardell et al.(1991)Plant Mol Biol 17：985-993(Vilardell等人，1991年，《植物分子生物学》，第17卷，第985-993页)；所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文)在后期胚中表达，但其表达可通过暴露于脱落酸、寒冷温度或水胁迫而被诱导。玉蜀黍rab17启动子的序列对应于GenBank登录号X15994的第1-558位核苷酸，其在Vilardell et al.(1990)Plant Mol Biol 14：423-432(Vilardell等人，1990年，《植物分子生物学》，第14卷，第423-432页)中公开并且以SEQ ID NO：17示出。替代玉蜀黍rab17启动子在美国专利No.7,253,000和No.7,491,813中公开并且以SEQ ID NO：18示出，所述专利的每一篇全文以引用方式并入本文。rab17启动子包含四个脱落酸响应元件(ABRE)(Busk et al.(1997)Plant J 11：1285-1295(Busk等人，1997年，《植物杂志》，第11卷，第1285-1295页)，该文献全文以引用方式并入本文)。玉蜀黍rab17启动子中的ABRE元件可存在于SEQ ID NO：18的第304-309位、第348-353位、第363-368位、第369-374位、第414-419位、以及第427-432位核苷酸处。rab17启动子还包含干旱响应元件(DRE)，其核心序列与拟南芥(Arabidopsis)中的DRE(干旱响应元件)和CRT(寒冷响应元件)元件相同。玉蜀黍rab17启动子的干旱响应元件存在于SEQ ID NO：18的第233-238位、第299-304位、以及第322-327位核苷酸处。CAAT和TATAA框可分别存在于SEQ ID NO：18的第395至398位和第479至483位核苷酸处。在其中调控位点特异性重组酶的表达的诱导型启动子是rab17启动子的那些实施例中，可通过使宿主细胞(例如，植物细胞)或宿主(例如，植物或植物部分)干化或使宿主细胞或宿主暴露于干旱条件、寒冷温度或脱落酸，而诱导重组酶的表达。
在一些实施例中，本发明所公开的多核苷酸构建体的胁迫诱导型启动子具有SEQ ID NO：18所示的序列或其活性变体或片段。在其他实施例中，本发明所公开的多核苷酸构建体的胁迫诱导型启动子具有SEQ ID NO：17或19所示的序列或其活性变体或片段。
在所述方法和组合物的一些实施例中，多核苷酸构建体包含玉蜀黍rab17启动子的活性变体或片段。玉蜀黍rab17启动子的活性变体或片段(例如，SEQ ID NO：17、18、19)是保留了响应于干旱条件、干化、寒冷和/或ABA而起始转录的能力的多核苷酸变体或片段。在这些实施例的一些中，启动子包含至少一个DRE元件。在一些实施例中，玉蜀黍rab17启动子的活性片段可包含SEQ ID NO：17、18或19的至少约50、100、150、200、250、300、350、400、450或500个连续核苷酸，或者可与SEQ IDNO：17、18或19具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。在特定实施例中，所述组合物和方法的启动子包含玉蜀黍rab17启动子的从约-219位至约-102位(对应于SEQ IDNO：18的第291至408位核苷酸)。在其他实施例中，活性玉蜀黍rab17启动子片段包含玉蜀黍rab17启动子的从约-219位至约-80位(SEQ ID NO：18的第291至430位核苷酸)，其包含DRE和ABRE元件的大部分。
在一些实施例中，位点特异性重组酶的表达由包含玉蜀黍rab17启动子或其片段或变体及附着位点(诸如附着B(attB)位点)的启动子调控，如美国申请公布No.2011/0167516(该申请公布全文以引用方式并入本文)所述，并且在这些实施例的一些中，attB位点调整玉蜀黍rab17启动子的活性。
如本文所用，“调控因子”是指在存在于启动子与编码序列之间时用于增加或降低启动子的活性的多核苷酸。调控因子的非限制性例子包括重组位点、操纵子和绝缘子。
附着位点是存在于病毒和细菌基因组中的位点特异性重组位点，其有利于病毒基因组整合到其宿主基因组中或将病毒基因组从其宿主基因组切除。利用附着位点的病毒和细菌宿主系统的非限制性例子是λ噬菌体和大肠杆菌(E.coli)系统(Weisberg and Landy(1983)In Lambda II，eds.Hendrix etal.(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)pp.211-250(Weisberg和Landy，1983年，载于《Lambda II》，Hendrix等人，冷泉港实验室，纽约冷泉港，第211-250页))。玉蜀黍rab17启动子的调控因子可为大肠杆菌附着位点B(attB)位点。attB位点可为天然存在的大肠杆菌attB位点或其活性变体或片段或者合成得到的序列。合成得到的attB位点以及天然存在的attB位点的活性变体和片段是能够与λ噬菌体附着P位点重组的那些，该过程由λ噬菌体整合酶(Int)和大肠杆菌整合宿主因子(IHF)蛋白催化(Landy(1989)Ann Rev Biochem 58：913-949(Landy，1989年，《生物化学年评》，第58卷，第913-949页)，该文献全文以引用方式并入本文)。AttB位点通常具有约25个核苷酸的长度，其中15个碱基对核心序列参与实际交换事件。作为另一种选择，天然存在的attB位点的活性变体和片段是能够调节启动子活性的那些。可使用的attB位点的非限制性例子包括attB1(SEQ ID NO：20)、attB2(SEQ ID NO：21)、attB3(SEQ IDNO：22)和attB4(SEQ ID NO：23)及其变体或片段。在一些实施例中，调控因子是能够调节(即增加、降低)启动子活性、但不能与附着P位点重组的attB位点的活性变体或片段。attB位点的此类活性变体的非限制性例子包括具有SEQ ID NO：24、25或26所示的序列的那些变体。
在一些实施例中，调控因子(例如，attB位点)与启动子的距离影响调控因子调整启动子活性的能力。调控因子可与启动子和/或编码多核苷酸邻接。在其他实施例中，接头序列将启动子序列与调控因子(例如，attB位点)分隔开。如本文所用，“接头序列”是核苷酸序列，其起到将一个功能序列与另一个功能序列连接的作用，但不会促使编码多核苷酸的表达或翻译。因此，接头序列的实际序列可以改变。接头序列可以包括质粒序列、限制性位点、和/或启动子来源基因的5′-非翻译区(5′-UTR)的区域。将启动子与调控因子(例如，attB位点)分隔开的接头序列可以具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、1000个核苷酸或更大的长度。在某些实施例中，约133个核苷酸的接头序列将玉蜀黍rab17启动子与调控因子(例如，attB位点)分隔开。在一些实施例中，接头序列包含rab17 5′-UTR的片段。5′-UTR的片段可以为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个核苷酸或更大的长度。在某些实施例中，启动子包含将玉蜀黍rab17启动子与调控因子(例如，attB位点)分隔开的接头序列，该接头序列包含玉蜀黍rab17 5′-UTR的95个核苷酸。在这些实施例的一些中，该95个核苷酸序列具有SEQ ID NO：27所示的序列。在某些实施例中，玉蜀黍rab17启动子与调控因子(例如，attB位点)之间的接头序列具有SEQ ID NO：28所示的序列或其变体或片段。
在一些实施例中，启动子包含将调控因子(例如，attB位点)与编码位点特异性重组酶的多核苷酸分隔开的接头序列。该接头的长度和序列也可变化并且可以为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、1000个核苷酸或更大的长度。在某些实施例中，约61个核苷酸的接头序列将调控因子(例如，attB位点)与编码重组酶的多核苷酸分隔开。在某些实施例中，调控因子(例如，attB位点)与编码多核苷酸之间的接头序列具有SEQ ID NO：29所示的序列或其变体或片段。在其他实施例中，约25个核苷酸的接头序列将调控因子(例如，attB位点)与编码多核苷酸分隔开。在某些实施例中，调控因子(例如，attB位点)与编码多核苷酸之间的接头序列具有SEQ ID NO：30所示的序列。
在某些实施例中，调控位点特异性重组酶的表达的胁迫诱导型启动子具有SEQ ID NO：31所示的序列或其变体或片段。
在本发明所公开的组合物和方法的其他实施例中，调控位点特异性重组酶的表达的诱导型启动子是化学诱导型启动子。在这些实施例的一些中，化学诱导型启动子是磺酰脲(SU)诱导型启动子，该启动子具有能够结合于磺酰脲响应性转录阻遏因子(SuR)蛋白的至少一个操纵子序列，诸如美国申请公布No.2010/0105141和No.2011/0287936中公开的那些。
如本文所用，“磺酰脲响应性转录阻遏因子”或“SuR”是指其与操纵子序列的结合受到包含磺酰脲化合物的配体的控制的转录阻遏蛋白。可用于本发明所公开的方法和组合物的SuR蛋白包括在不存在磺酰脲配体的情况下特异性结合于操纵子序列的那些。
在一些实施例中，SuR蛋白是特异性结合于四环素操纵子的蛋白，其中所述特异性结合受到磺酰脲化合物调控。因此，在一些实施例中，磺酰脲诱导型启动子包含至少一个四环素(tet)操纵子序列。四环素操纵子序列是本领域已知的并且包括SEQ ID NO：32所示的tet操纵子序列。tet操纵子序列可位于化学调控启动子的TATA框的5□或3□的0-30个核苷酸内，包括例如TATA框的20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个核苷酸。在其他情况下，tet操纵子序列可与TATA框序列部分地重叠。在一个非限制性例子中，tet操纵子序列是SEQID NO：32或其活性变体或片段。
可用的包含tet操纵子的启动子包括例如本领域已知的那些启动子(参见例如，Matzke et al.(2003)Plant Mol Biol Rep 21：9-19(Matzke等人，2003年，《植物分子生物学导报》，第21卷，第9-19页)；Padidam(2003)Curr Op Plant Biol 6：169-177(Padidam，2003年，《植物生物学新见》，第6卷，第169-177页)；Gatz&Quail(1988)PNAS 85：1394-1397(Gatz和Quail，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第1394-1397页)；Ulmasov et al.(1997)Plant Mol Biol 35：417-424(Ulmasov等人，1997年，《植物分子生物学》，第35卷，第417-424页)；Weinmann et al.(1994)Plant J 5：559-569(Weinmann等人，1994年，《植物杂志》，第5卷，第559-569页)；所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文)。可将一个或多个tet操纵子序列添加至启动子以产生磺酰脲诱导型启动子。参见例如Weinmann et al.(1994)Plant J 5：559-569(Weinmann等人，1994年，《植物杂志》，第5卷，第559-569页)；Love et al.(2000)Plant J 21：579-588(Love等人，2000年，《植物杂志》，第21卷，第579-588页)。此外，使用在TATA框附近引入了三个tet操纵子的CaMV 35S启动子(Gatz et al.(1992)Plant J 2：397-404(Gatz等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第397-404页)；该文献全文以引用方式并入本文)(3XOpT 35S)的、经广泛测试的植物四环素调控表达系统可用作磺酰脲诱导型启动子。
因此，包含能够结合SuR的至少一个、两个、三个或更多个操纵子(包括tet操纵子，诸如SEQ ID NO：32所示的操纵子或其活性变体或片段)的SU诱导型启动子可用于调控位点特异性重组酶的表达。任何启动子均可与能够结合SuR的操纵子组合以生成SU诱导型启动子。在具体实施例中，启动子在植物细胞中有活性。启动子可以是组成型启动子或非组成型启动子。非组成型启动子包括组织偏好的启动子，诸如主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种子、胚乳或胚中表达的启动子。
在特定实施例中，启动子是植物肌动蛋白启动子、香蕉条纹病毒启动子(BSV)、MMV启动子、增强型MMV启动子(dMMV)、植物P450启动子或延伸因子1a(EF1A)启动子(美国申请公布No.20080313776，该申请公布全文以引用方式并入本文)。
在其中有效连接到编码位点特异性重组酶的多核苷酸的诱导型启动子是SU诱导型启动子的那些实施例中，宿主细胞还包含磺酰脲响应性转录阻遏因子(SuR)或者多核苷酸构建体包含编码SuR的多核苷酸。SuR多核苷酸和多肽序列的非限制性例子包括美国申请公布No.2011/0287936中公开的那些，诸如美国申请公布No.2011/0287936的SEQ ID NO：3-419所示的多肽序列和SEQ ID NO：420-836所示的多核苷酸序列，该申请公布全文以引用方式并入本文。SuR多核苷酸和多肽序列的另外非限制性例子包括美国申请公布No.2010/0105141中公开的那些，诸如美国申请公布No.2010/0105141的SEQ ID NO：3-401、1206-1213、1228-1233和1240-1243所示的多肽序列以及SEQ ID NO：434-832、1214-1221、1222-1227、1234-1239和1244-1247所示的多核苷酸序列，该申请公布全文以引用方式并入本文。
在其中本发明所公开的多核苷酸构建体还包含编码SuR的多核苷酸的那些实施例中，编码SuR的多核苷酸有效连接到在植物中有活性的启动子。启动子可为组成型或非组成型启动子，包括组织偏好的启动子。
在特定实施例中，有效连接到编码SuR的多核苷酸的启动子包含操纵子序列，这些操纵子序列能够结合于SuR，从而允许阻遏因子的自动调控和SU诱导型启动子的增强诱导及位点特异性重组酶的表达。参见例如美国申请公布No.2011/0287936。
在特定实施例中，编码SuR的多核苷酸及任选的有效连接到其上的启动子存在于本发明所公开的多核苷酸构建体的切除盒内，使得在SU诱导型启动子诱导和位点特异性重组酶表达后，所述多核苷酸被切除。
多种SU化合物可用于结合于SuR并诱导SU诱导型启动子。磺酰脲分子包含磺酰脲部分(-S(O)2NHC(O)NH(R)-)。在磺酰脲除草剂中，磺酰脲部分的磺酰基末端直接连接到典型取代的环状或无环基团或者经由氧原子或任选地取代的氨基或亚甲基基团连接到典型取代的环状或无环基团。在磺酰脲桥的相对末端处，氨基基团(其可具有取代基诸如甲基(R是CH3)而非氢)连接到杂环基团，所述杂环基团通常为具有一个或两个取代基诸如甲基、乙基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、甲氨基、二甲氨基、乙氨基和卤素的对称嘧啶或三嗪环。磺酰脲除草剂可以是游离酸或盐的形式。在游离酸形式中，桥上的磺酰胺氮未被去质子化(即，-S(O)2NHC(O)NH(R))，而在盐形式中，桥上的磺酰胺氮原子被去质子化，并且存在阳离子，通常为碱金属或碱土金属(最常见为钠或钾)的阳离子。磺酰脲化合物包括例如，诸如嘧啶基磺酰脲化合物、三嗪基磺酰脲化合物、噻二唑基脲化合物的化合物类别，和诸如抗糖尿病药的药物，以及它们的盐和其他衍生物。嘧啶基磺酰脲化合物的例子包括酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、苄嘧磺隆甲酯、氯嘧磺隆、氯嘧磺隆乙酯、环丙嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟吡磺隆、氟啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆甲酯、甲酰胺磺隆、氯吡嘧磺隆、氯吡嘧磺隆甲酯、咪唑磺隆、甲基二磺隆、甲基二磺隆甲酯、烟嘧磺隆、嘧苯胺磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟嘧磺隆甲酯、吡嘧磺隆、吡嘧磺隆乙酯、玉嘧磺隆、甲嘧磺隆、甲嘧磺隆甲酯、磺酰磺隆、三氟啶磺隆以及它们的盐和衍生物。三嗪基磺酰脲化合物的例子包括氯磺隆、醚磺隆、胺苯磺隆、胺苯磺隆甲酯、碘甲磺隆、碘甲磺隆甲酯、甲磺隆、甲磺隆甲酯、氟丙磺隆、噻吩磺隆、噻吩磺隆甲酯、醚苯磺隆、苯磺隆、苯磺隆甲酯、氟胺磺隆、氟胺磺隆甲酯、三氟甲磺隆以及它们的盐和衍生物。噻二唑基脲化合物的例子包括丁噻隆、磺噻隆、特丁噻草隆、噻氟隆、噻苯隆、嘧啶基磺酰脲化合物(例如，酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、环丙嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟吡磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、氯吡嘧磺隆、咪唑磺隆、甲基二磺隆、烟嘧磺隆、嘧苯胺磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、吡嘧磺隆、玉嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺酰磺隆和三氟啶磺隆)；三嗪基磺酰脲化合物(例如，氯磺隆、醚磺隆、胺苯磺隆、碘甲磺隆、甲磺隆、氟丙磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、氟胺磺隆和三氟甲磺隆)；或噻二唑基脲(thiadazolylurea)化合物(例如，氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺和五氟磺草胺)以及它们的盐和衍生物。抗糖尿病药的例子包括醋磺己脲、氯磺丙脲、甲苯磺丁脲、妥拉磺脲、格列吡嗪、格列齐特、格列本脲(优降糖)、格列喹酮、格列美脲以及它们的盐和衍生物。在一些系统中，SuR多肽特异性结合于不止一种磺酰脲化合物，因此可以选择哪种SU配体适用于植物。
在一些例子中，磺酰脲化合物选自氯磺隆、胺苯磺隆甲酯、甲磺隆甲酯、噻吩磺隆甲酯、甲嘧磺隆甲酯、苯磺隆甲酯、氯嘧磺隆乙酯、烟嘧磺隆和玉嘧磺隆。
在其他实施例中，磺酰脲化合物包括嘧啶基磺酰脲、三嗪基磺酰脲、噻二唑基脲(thiadazolylurea)、氯磺隆、胺苯磺隆、噻吩磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆或玉嘧磺隆化合物。
在一些实施例中，植物或植物部分可能有必要与SU接触以诱导SU诱导型启动子而具有对SU的耐受性。宿主(例如，植物或植物部分)可天然耐受SU配体，或者宿主(例如，植物或植物部分)可因人为干预例如通过使用重组构建体、植物育种或遗传工程而耐受SU配体。因此，本文所公开的各种方法中采用的宿主(例如，植物或植物部分)可包含赋予对磺酰脲化合物的耐受性的天然或异源序列。
在这些实施例的一些中，本发明所公开的多核苷酸构建体可包含编码磺酰脲耐受性多肽的多核苷酸，磺酰脲耐受性多肽是在宿主(例如，植物或植物部分)中表达时赋予对至少一种磺酰脲的耐受性的多肽。在这些实施例的一些中，编码SU耐受性多肽的多核苷酸包含于切除盒内。
在其他实施例中，在切除所述切除盒后表达的除草剂耐受性多肽是SU耐受性多肽，使得在将SU添加至植物或植物部分之前植物或植物部分不具有对SU的耐受性，但是在添加SU后，切除盒被切除并且SU耐受性多肽随后被表达，从而允许保护植物或植物部分免于因SU而受损伤。
磺酰脲除草剂通过阻断乙酰乳酸合成酶(ALS)(也称为乙酰羟酸合成酶(AHAS))来抑制高等植物的生长。因此，在一些实施例中，SU耐受性多肽是ALS抑制剂耐受性多肽，如本文别处所述。
当本发明所公开的多核苷酸构建体的诱导型启动子被活化时，位点特异性重组酶被表达，从而催化多核苷酸构建体内包含的切除盒的切除。如本文所用，“切除盒”是指旁侧带有重组位点的多核苷酸，所述重组位点会彼此发生重组并且是直接重复的，使得当通过识别重组位点的位点特异性重组酶对其作用时，重组位点内的核苷酸序列从其余多核苷酸切除。本发明所公开的多核苷酸构建体的切除盒包含第一表达盒，该表达盒包含有效连接到诱导型启动子的编码位点特异性重组酶的多核苷酸以及任选地编码选择性标记的多核苷酸、编码细胞增殖因子的多核苷酸、编码除草剂耐受性多肽的多核苷酸和目标多核苷酸中的至少一者。
位点特异性重组酶，本文也称为重组酶，是催化其相容的重组位点之间的保守位点特异性重组的多肽，包括天然多肽以及保持活性的衍生物、变体和/或片段，以及编码保持活性的重组酶的天然多核苷酸、衍生物、变体和/或片段。所述方法和组合物中所用的重组酶可以是天然重组酶或该重组酶的生物活性片段或变体。有关位点特异性重组酶及其识别位点的综述，参见Sauer(1994)Curr Op Biotechnol 5：521-527(Sauer，1994年，《生物技术新见》，第5卷，第521-527页)；以及Sadowski(1993)FASEB7：760-767(Sadowski，1993年，《美国实验生物学学会联合会杂志》，第7卷，第760-767页)，所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文。
任何重组酶系统可用于本发明所公开的方法和组合物中。位点特异性重组酶的非限制性例子包括FLP、Cre、S-CRE、V-CRE、Dre、SSV1、lambda Int、phi C31Int、HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、U153以及本领域已知的其他位点特异性重组酶，包括如Thomson and Ow(2006)Genesis 44：465-476(Thomson和Ow，2006年，《起源》，第44卷，第465-476页)中所述的那些，该文献全文以引用方式并入本文。植物中所用的位点特异性重组系统的例子可在美国专利No.5,929,301、No.6,175,056、No.6,331,661；以及国际申请公布No.WO 99/25821、No.WO 99/25855、No.WO 99/25841和No.WO 99/25840中找到，每篇专利的内容以引用方式并入本文。
在一些实施例中，重组酶是整合酶或解离酶家族的成员，包括其生物活性变体和片段。重组酶的整合酶家族具有超过一百个成员并且包括例如FLP、Cre、λ整合酶和R。有关整合酶家族的其他成员，参见例如Espositoet al.(1997)Nucleic Acids Res 25：3605-3614(Esposito等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3605-3614页)；以及Abremski et al.(1992)Protein Eng 5：87-91(Abremski等人，1992年，《蛋白质工程》，第5卷，第87-91页)；所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文。其他重组系统包括例如链霉菌(Streptomycete)噬菌体phi C31(Kuhstoss et al.(1991)J MolBiol 20：897-908(Kuhstoss等人，1991年，《分子生物学杂志》，第20卷，第897-908页))；来自芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)的SSV1位点特异性重组系统(Maskhelishvili et al.(1993)Mol Gen Genet 237：334-342(Maskhelishvili等人，1993年，《分子遗传学与普通遗传学》，第237卷，第334-342页))；以及基于逆转录病毒整合酶的整合系统(Tanaka etal.(1998)Gene 17：67-76(Tanaka等人，1998年，《基因》，第17卷，第67-76页))。在一些实施例中，重组酶不需要辅因子或超螺旋底物。此类重组酶包括Cre、FLP或其活性变体或片段。
FLP重组酶是催化这样的位点特异性反应的蛋白，该反应涉及在DNA复制过程中扩增酿酒酵母(S.cerevisiae)的两微米质粒的拷贝数。FLP重组酶催化两个FRT位点之间的位点特异性重组。FLP蛋白已被克隆和表达(Cox(1993)Proc Natl Acad Sci USA 80：4223-4227(Cox，1993年，《美国国家科学院院刊》，第80卷，第4223-4227页)，该文献全文以引用方式并入本文)。在所述方法和组合物中使用的FLP重组酶可源于酵母属(Saccharomyces)。在一些实施例中，使用经修饰而包含更多植物偏好的密码子的重组酶多核苷酸。由包含玉蜀黍偏好的密码子(FLPm)的核苷酸序列编码的、催化位点特异性重组事件的重组FLP酶是已知的(其多核苷酸和多肽序列分别以SEQ ID NO：33和34示出；参见例如美国专利5,929,301，该专利全文以引用方式并入本文)。FLP的另外功能变体和片段是已知的(Buchholz et al.(1998)Nat Biotechnol 16：657-662(Buchholz等人，1998年，《自然-生物技术》，第16卷，第657-662页)；Hartung et al.(1998)JBiol Chem 273：22884-22891(Hartung等人，1998年，《生物化学杂志》，第273卷，第22884-22891页)；Saxena et al.(1997)Biochim Biophys Acta1340：187-204(Saxena等人，1997年，《生物化学与生物物理学报》，第1340卷，第187-204页)；Hartley et al.(1980)Nature 286：860-864(Hartley等人，1980年，《自然》，第286卷，第860-864页)；Voziyanov et al.(2002)Nucleic Acids Res 30：1656-1663(Voziyanov等人，2002年，《核酸研究》，第30卷，第1656-1663页)；Zhu&Sadowski(1995)J Biol Chem270：23044-23054(Zhu和Sadowski，1995年，《生物化学杂志》，第270卷，第23044-23054页)；以及美国专利No.7,238,854，所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文)。
噬菌体重组酶Cre催化两个lox位点之间的位点特异性重组。Cre重组酶是已知的(Guo et al.(1997)Nature 389：40-46(Guo等人，1997年，《自然》，第389卷，第40-46页)；Abremski et al.(1984)J Biol Chem259：1509-1514(Abremski等人，1984年，《生物化学杂志》，第259卷，第1509-1514页)；Chen et al.(1996)Somat Cell Mol Genet 22：477-488(Chen等人，1996年，《体细胞和分子遗传学》，第22卷，第477-488页)；Shaikh et al.(1977)J Biol Chem 272：5695-5702(Shaikh等人，1977年，《生物化学杂志》，第272卷，第5695-5702页)；以及Buchholz etal.(1998)Nat Biotechnol 16：657-662(Buchholz等人，1998年，《自然-生物技术》，第16卷，第657-662页)，所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文)。Cre多核苷酸序列也可使用植物偏好的密码子来合成，例如此类序列(moCre；其多核苷酸和多肽序列分别以SEQ ID NO：35和36示出)在例如国际申请公布No.WO 99/25840中有所描述，该专利全文以引用方式并入本文。Cre重组酶的变体是已知的(参见例如美国专利No.6,890,726；Rufer&Sauer(2002)Nucleic Acids Res 30：2764-2772(Rufer和Sauer，2002年，《核酸研究》，第30卷，第2764-2772页)；Wierzbickiet al.(1987)J Mol Biol 195：785-794(Wierzbicki等人，1987年，《分子生物学杂志》，第195卷，第785-794页)；Petyuk et al.(2004)J Biol Chem279：37040-37048(Petyuk等人，2004年，《生物化学杂志》，第279卷，第37040-37048页)；Hartung&Kisters-Woike(1998)J Biol Chem273：22884-22891(Hartung和Kisters-Woike，1998年，《生物化学杂志》，第273卷，第22884-22891页)；Santoro&Schultz(2002)Proc NatlAcad Sci USA 99：4185-4190(Santoro和Schultz，2002年，《美国国家科学院院刊》，第99卷，第4185-4190页)；Koresawa et al.(2000)J Biochem(Tokyo)127：367-372(Koresawa等人，2000年，《生物化学杂志(东京)》，第127卷，第367-372页)；以及Vergunst et al.(2000)Science290：979-982(Vergunst等人，2000年，《科学》，第290卷，第979-982页)，所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文)。
在一些实施例中，重组酶是S-CRE、V-CRE重组酶(Suzuki&Nakayama(2011)Nucl Acid Res 39(8)：e49(Suzuki和Nakayama，2011年，《核酸研究》，第39卷，第8期，第e49页))或Dre重组酶(Sauer&McDermott(2004)Nucl Acid Res 32(20)：6086-6095(Sauer和McDermott，2004年，《核酸研究》，第32卷，第20期，第6086-6095页))，所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文。
在一些实施例中，重组酶是嵌合重组酶，其是能够催化源于不同重组系统的重组位点之间的位点特异性重组的重组融合蛋白。例如，如果该组重组位点包含FRT位点和LoxP位点，则可使用嵌合FLP/Cre重组酶或其活性变体或片段，或可单独提供这两种重组酶。用于产生和使用此类嵌合重组酶或其活性变体或片段的方法在例如国际申请公布No.WO 99/25840；以及Shaikh&Sadowski(2000)J Mol Biol 302：27-48(Shaikh和Sadowski，2000年，《分子生物学杂志》，第302卷，第27-48页)中有所描述，所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文。
在其他实施例中，使用变体重组酶。用于调整动力学性质、辅因子相互作用和要求、表达、最佳条件和/或识别位点特异性以及筛选重组酶和变体的活性的方法是已知的，参见例如Miller et al.(1980)Cell 20：721-9(Miller等人，1980年，《细胞》，第20卷，第721-729页)；Lange-Gustafson and Nash(1984)J Biol Chem259：12724-32(Lange-Gustafson和Nash，1984年，《生物化学杂志》，第259卷，第12724-12732页)；Christ et al.(1998)J Mol Biol 288：825-36(Christ等人，1998年，《分子生物学杂志》，第288卷，第825-836页)；Lorbach et al.(2000)J Mol Biol296：1175-81(Lorbach等人，2000年，《分子生物学杂志》，第296卷，第1175-1181页)；Vergunst et al.(2000)Science 290：979-82(Vergunst等人，2000年，《科学》，第290卷，第979-982页)；Dorgai et al.(1995)J MolBiol 252：178-88(Dorgai等人，1995年，《分子生物学杂志》，第252卷，第178-188页)；Dorgai et al.(1998)J Mol Biol 277：1059-70(Dorgai等人，1998年，《分子生物学杂志》，第277卷，第1059-1070页)；Yagu et al.(1995)J Mol Biol 252：163-7(Yagu等人，1995年，《分子生物学杂志》，第252卷，第163-167页)；Sclimente et al.(2001)Nucleic Acids Res29：5044-51(Sclimente等人，2001年，《核酸研究》，第29卷，第5044-5051页)；Santoro and Schultze(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99：4185-90(Santoro和Schultze，2002年，《美国国家科学院院刊》，第99卷，第4185-4190页)；Buchholz and Stewart(2001)Nat Biotechnol 19：1047-52(Buchholz和Stewart，2001年，《自然-生物技术》，第19卷，第1047-1052页)；Voziyanov et al.(2002)Nucleic Acids Res 30：1656-63(Voziyanov等人，2002年，《核酸研究》，第30卷，第1656-1663页)；Voziyanov etal.(2003)J Mol Biol 326：65-76(Voziyanov等人，2003年，《分子生物学杂志》，第326卷，第65-76页)；Klippel et al.(1988)EMBO J7：3983-9(Klippel等人，1988年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第7卷，第3983-3989页)；Arnold et al.(1999)EMBO J 18：1407-14(Arnold等人，1999年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第18卷，第1407-1414页)；以及国际申请公布No.WO 03/08045、No.WO 99/25840和No.WO99/25841；所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文。
所谓“重组位点”意指被目标重组酶识别的多核苷酸(天然或合成/人工)。如上文所概述，许多重组系统是本领域已知的并且技术人员将知道要与目标重组酶一起使用的适当重组位点。
重组位点的非限制性例子包括FRT位点，包括例如天然FRT位点(FRT1，SEQ ID NO：37)以及FRT的各种功能变体，包括但不限于FRT5(SEQ ID NO：38)、FRT6(SEQ ID NO：39)、FRT7(SEQ ID NO：40)、FRT12(SEQ ID NO：41)和FRT87(SEQ ID NO：42)。参见例如国际申请公布No.WO 03/054189、No.WO 02/00900和No.WO 01/23545；以及Schlake et al.(1994)Biochemistry 33：12745-12751(Schlake等人，1994年，《生物化学》，第33卷，第12745-12751页)，所述文献的每一篇以引用方式并入本文。可使用来自Cre/Lox位点特异性重组系统的重组位点。此类重组位点包括例如天然LOX位点以及LOX的各种功能变体。
在一些实施例中，重组位点是FRT位点的功能变体或LOX位点的功能变体、它们的任何组合、或已知的发生重组或不发生重组的重组位点的任何其他组合。功能变体包含嵌合重组位点，诸如融合到LOX位点的FRT位点(参见例如Luo et al.(2007)Plant Biotech J 5：263-274(Luo等人，2007年，《植物生物技术杂志》，第5卷，第263-274页)，该文献全文以引用方式并入本文)。功能变体还包含最小位点(单独或组合的FRT和/或LOX)。最小天然FRT重组位点(SEQ ID NO：37)已被表征并且包含一系列结构域，包括一对11碱基对对称元件(其为FLP结合位点)；8碱基对核心区域或间隔区域；以及多聚嘧啶区。在一些实施例中，使用至少一个经修饰的FRT重组位点。经修饰的或变体FRT重组位点是序列中具有突变诸如改变、添加或缺失的位点。修饰包括在任何位置处的序列修饰，包括但不限于在8碱基对间隔结构域、对称元件和/或多聚嘧啶区中的至少一者中的修饰。FRT变体包括最小位点(参见例如Broach et al.(1982)Cell 29：227-234(Broach等人，1982年，《细胞》，第29卷，第227-234页)；Senecoff et al.(1985)Proc Natl Acad Sci USA 82：7270-7274(Senecoff等人，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第7270-7274页)；Gronostajski&Sadowski(1985)J Biol Chem 260：12320-12327(Gronostajski和Sadowski，1985年，《生物化学杂志》，第260卷，第12320-12327页)；Senecoff et al.(1988)J Mol Biol 201：405-421(Senecoff等人，1988年，《分子生物学杂志》，第201卷，第405-421页)；以及国际申请公布No.WO99/25821)以及序列变体(参见例如Schlake&Bode(1994)Biochemistry 33：12746-12751(Schlake和Bode，1994年，《生物化学》，第33卷，第12746-12751页)；Seibler&Bode(1997)Biochemistry 36：1740-1747(Seibler和Bode，1997年，《生物化学》，第36卷，第1740-1747页)；Umlauf&Cox(1988)EMBO J 7：1845-1852(Umlauf和Cox，1988年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第7卷，第1845-1852页)；Senecoffet al.(1988)J Mol Biol 201：405-421(Senecoff等人，1988年，《分子生物学杂志》，第201卷，第405-421页)；Voziyanov et al.(2002)Nucleic AcidsRes 30：7(Voziyanov等人，2002年，《核酸研究》，第30卷，第7页)；国际申请公布No.WO 07/011733、WO 99/25854、WO 99/25840、WO99/25855、WO 99/25853和WO 99/25821；以及美国专利No.7.060,499和No.7,476,539；所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文。)
变体LOX位点的重组活性的分析示于Lee et al.(1998)Gene 216：55-65(Lee等人，1998年，《基因》，第216卷，第55-65页)和美国专利No.6,465,254中。还可参见例如Huang et al.(1991)Nucleic Acids Res 19：443-448(Huang等人，1991年，《核酸研究》，第19卷，第443-448页)；Sadowski(1995)In Progress in Nucleic Acid Research and Molecular BiologyVol.51，pp.53-91(Sadowski，1995年，载于《核酸研究与分子生物学进展》，第51卷，第53-91页)；美国专利No.6,465,254；Cox(1989)InMobile DNA，Berg and Howe(eds)American Society of Microbiology，Washington D.C.，pp.116-670(Cox，1989年，载于《移动DNA》，Berg和Howe(编辑)，美国微生物学会，华盛顿哥伦比亚特区，第116-670页)；Dixon et al.(1995)Mol Microbiol 18：449-458(Dixon等人，1995年，《分子微生物学》，第18卷，第449-458页)；Buchholz et al.(1996)Nucleic Acids Res 24：3118-3119(Buchholz等人，1996年，《核酸研究》，第24卷，第3118-3119页)；Kilby et al.(1993)Trends Genet 9：413-421(Kilby等人，1993年，《遗传学趋势》，第9卷，第413-421页)；Rossant&Geagy(1995)Nat Med 1：592-594(Rossant和Geagy，1995年，《自然-医学》，第1卷，第592-594页)；Albert et al.(1995)Plant J 7：649-659(Albert等人，1995年，《植物杂志》，第7卷，第649-659页)；Bayley et al.(1992)Plant Mol Biol 18：353-361(Bayley等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第353-361页)；Odell et al.(1990)Mol GenGenet 223：369-378(Odell等人，1990年，《分子遗传学与普通遗传学》，第223卷，第369-378页)；Dale&Ow(1991)Proc Natl Acad Sci USA88：10558-10562(Dale和Ow，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第10558-10562页)；Qui et al.(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91：1706-1710(Qui等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第1706-1710页)；Stuurman et al.(1996)Plant Mol Biol 32：901-913(Stuurman等人，1996年，《植物分子生物学》，第32卷，第901-913页)；Dale et al.(1990)Gene 91：79-85(Dale等人，1990年，《基因》，第91卷，第79-85页)；以及国际申请公布No.WO 01/111058；所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文。
天然存在的重组位点或其生物活性变体是有用的。用于确定经修饰的重组位点是否会发生重组的方法是已知的(参见例如国际申请公布No.WO07/011733，该专利全文以引用方式并入本文)。变体识别位点是已知的，参见例如Hoess et al.(1986)Nucleic Acids Res 14：2287-300(Hoess等人，1986年，《核酸研究》，第14卷，第2287-2300页)；Albert et al.(1995)Plant J 7：649-59(Albert等人，1995年，《植物杂志》，第7卷，第649-659页)；Thomson et al.(2003)Genesis 36：162-7(Thomson等人，2003年，《起源》，第36卷，第162-167页)；Huang et al.(1991)Nucleic AcidsRes 19：443-8(Huang等人，1991年，《核酸研究》，第19卷，第443-448页)；Siebler and Bode(1997)Biochemistry 36：1740-7(Siebler和Bode，1997年，《生物化学》，第36卷，第1740-1747页)；Schlake and Bode(1994)Biochemistry 33：12746-51(Schlake和Bode，1994年，《生物化学》，第33卷，第12746-12751页)；Thygarajan et al.(2001)Mol Cell Biol21：3926-34(Thygarajan等人，2001年，《分子和细胞生物学》，第21卷，第3926-3934页)；Umlauf and Cox(1988)EMBO J 7：1845-52(Umlauf和Cox，1988年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第7卷，第1845-1852页)；Lee and Saito(1998)Gene 216：55-65(Lee和Saito，1998年，《基因》，第216卷，第55-65页)；国际申请公布No.WO 01/23545、No.WO99/25851、No.WO 01/11058、No.WO 01/07572；以及美国专利No.5,888,732；所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文。
所述方法和组合物中采用的重组位点可为相同或不相似的序列，只要位点会相对于彼此发生重组即可。
所谓“发生重组”意指该组重组位点(即，不相似或对应)能够彼此重组。作为另一种选择，所谓“不发生重组”意指该组重组位点在存在适当重组酶的情况下不会彼此重组或者位点之间的重组为最低限度。因此，应当认识到，可利用任何合适组的发生重组的重组位点，包括FRT位点或其功能变体、LOX位点或其功能变体、它们的任何组合、或本领域已知的重组位点的任何其他组合。
在一些实施例中，重组位点是不对称的，并且任何两个位点相对于彼此的取向将决定重组反应产物。直接重复的重组位点是一组发生重组的重组位点中以相同取向布置的重组位点，使得这些位点之间的重组导致间插DNA序列的切除而非倒位。倒位的重组位点是一组发生重组的重组位点中以相反取向布置的重组位点，使得这些位点之间的重组导致间插DNA序列的倒位而非切除。本发明所公开的多核苷酸构建体包含重组位点，这些重组位点会彼此发生重组并且是直接重复的，从而导致切除盒的切除。
本发明所公开的组合物和方法利用赋予除草剂耐受性的至少一个多核苷酸。可通过如下方式赋予对具体除草剂的耐受性：通过工程改造将基因引入植物中，所述基因编码适当的除草剂代谢酶和/或非敏感性除草剂靶标。此类多肽称为“除草剂耐受性多肽”。在一些实施例中，这些酶及编码其的核酸源于植物。在其他实施例中，它们来源于其他生物体，诸如微生物。参见例如Padgette et al.(1996)“New weed control opportunities：Development of soybeans with a Roundupgene”(Padgette等人，1996年，“杂草防除新机遇：利用Roundup基因开发大豆”)以及Vasil(1996)“Phosphinothricin-resistant crops”(Vasil，1996年，“草丁膦抗性作物”)，这两篇文献均载于Herbicide-Resistant Crops，ed.Duke(CRCPress，Boca Raton，Florida)pp.54-84 and pp.85-91(《除草剂抗性作物》，Duke编辑(佛罗里达州博卡拉顿的CRC出版社)，第54-84页和第85-91页)。
“除草剂”是对植物造成暂时性或永久性损伤的化学品。可在本发明各种方法和组合物中采用的除草剂的非限制性例子在本文别处进行了更详细的讨论。可将除草剂掺入到植物或植物部分中，或其可作用于植物或植物部分而不掺入到植物或植物部分中。“活性成分”是除草剂配方中主要负责其植物毒性并且在产品标签上标识为活性成分的化学品。产品标签信息可从美国环境保护署(U.S.Environmental Protection Agency)获得并且在urloaspub.epa.gov/pestlabl/ppls.own上在线更新；产品标签信息也可在urlwww.cdms.net上在线获得。
在除草剂或如本文所用的其他化学处理的上下文中，“除草剂耐受性”或“耐受性”意指用特定除草剂或除草剂的类别或亚类或其他化学品或其他化学品的类别或亚类处理的植物或植物部分在进行该处理之后与适当的对照植物或植物部分相比显示出不明显的损伤或较少损伤。植物或植物部分可天然耐受特定除草剂或化学品，或者植物或植物部分可因人为干预例如育种或遗传工程而为除草剂耐受性的。“除草剂耐受性多肽”是为表达其的植物或其他生物体赋予除草剂耐受性(即，使植物或其他生物体产生除草剂耐受性)的多肽，并且“除草剂耐受性多核苷酸”是编码除草剂耐受性多肽的多核苷酸。例如，磺酰脲耐受性多肽是为表达其的植物或其他生物体赋予对磺酰脲除草剂的耐受性的多肽，咪唑啉酮耐受性多肽是为表达其的植物或其他生物体赋予对咪唑啉酮除草剂的耐受性的多肽；并且草甘膦耐受性多肽是为表达其的植物或其他生物体赋予对草甘膦的耐受性的多肽。
因此，如果与适当的对照植物或植物部分相比植物或植物部分显示出的损伤比对照植物或植物部分所表现出的损伤少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％或更多，则该植物或植物部分耐受除草剂或其他化学品。这样，与适当的对照植物或植物部分相比，耐受除草剂或其他化学品的植物或植物部分显示出“改善的耐受性”。通过评价本领域技术人员认为合适的植物生长或良好状态的任何参数来评估由除草剂或其他化学处理引起的损伤。可通过视觉检查和/或统计分析单独植物或植物部分或一组植物或植物部分的合适参数来评估损伤。因此，可通过评价例如植株高度、植株重量、叶片颜色、叶片长度、开花、育性、抽丝、产量、种子产生等参数来评估损伤。也可通过评价达到特定发育阶段(例如，抽丝、开花或花粉散发)经过的时间或在植物从用特定化学品和/或除草剂处理中恢复之前经过的时间来评估损伤。
在作出此类评估时，可为特定程度的损伤分配特定分值，以使得可进行统计分析或定量比较。使用分值的范围描述特定程度的损伤是本领域已知的，并且可使用任何合适的范围或标度。例如，可按照表2中所示分配除草剂损伤评分(也称为耐受性评分)。在该标度中，等级9指示除草剂处理对作物没有影响，即，在除草剂处理后未观察到作物减产或损伤。因此，在该标度中，等级9指示作物表现出未受到除草剂的损伤，因此作物耐受除草剂。如上文所指示，除草剂耐受性还通过该标度中的其他等级指示，其中适当的对照植物表现出该标度上的较低评分，或其中一组适当的对照植物响应于除草剂处理表现出比一组受试植物统计学上更低的评分。
表2.除草剂损伤标度(1至9标度评分系统)。
当除草剂对植物或植物部分无影响时，或当除草剂对植物或植物部分有一定影响(植物随后从中恢复)时，或当除草剂具有不利的影响但该影响例如被特定除草剂对杂草的影响所抵消时，除草剂不会“显著损伤”植物或植物部分。因此，例如，如果与适当的对照植物或植物部分(例如，未处理过的植物或植物部分)相比，植物或植物部分在指示植物健康和/或生产力的至少一个合适参数中表现出小于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的下降，则植物或植物部分未被除草剂或其他处理“显著损伤”。指示植物健康和/或生产力的合适参数包括例如植株高度、植株重量、叶片长度、达到特定发育阶段经过的时间、开花、产量、种子产生等等。可通过视觉检查和/或统计分析任何合适参数来评价参数。可通过视觉检查和/或统计分析来进行比较。因此，如果植物或植物部分在至少一个参数中表现出下降，但该下降实质上是暂时的并且植物或植物部分在1周、2周、3周、4周或6周内完全恢复，则植物或植物部分未被除草剂或其他处理“显著损伤”。
相反地，如果与适当的对照植物或植物部分相比，植物或植物部分在指示植物健康和/或生产力的至少一个合适参数中表现出超过50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、150％、170％的下降，则植物或植物部分被除草剂或其他处理显著损伤。因此，如果植物或植物部分在至少一个参数中表现出下降并且该植物或植物部分不能在1周、2周、3周、4周或6周内完全恢复，则该植物或植物部分被显著损伤。
可通过本领域技术人员视觉检查来评估并可通过合适参数的统计分析来评价由植物或植物部分的除草剂或其他化学处理所引起的损伤。进行评价的植物或植物部分称为“测试植物”或“测试植物部分”。通常，适当的对照植物或植物部分是表达与评价除草剂耐受性的植物或植物部分(即，“测试植物”)相同的除草剂耐受性多肽但未用除草剂处理过的植物或植物部分。在一些情况下，对照植物或植物部分是经受与进行评价的植物或植物部分(即，测试植物或植物部分)相同的除草剂处理但不表达测试植物或植物部分中预期会提供对目标除草剂的耐受性的酶的植物或植物部分。本领域技术人员将能够设计、执行和评价适当控制的实验，以评估目标植物或植物部分的除草剂耐受性，包括对适当测试植物或植物部分、对照植物或植物部分和处理的选择。
可在植物或植物部分与除草剂接触后的不同时间评估除草剂或其他化学品所引起的损伤，但在一些实施例中，在植物或植物部分生根/再生期间或之后对植物或植物部分进行除草剂耐受性评估。通常，大约在对照植物或植物部分表现出最大损伤时评估损伤。有时，在一段时间后评估损伤，在该段时间中未用除草剂处理的对照植物或植物部分与施加处理时的尺寸或阶段相比已适度生长和/或发育。可在不同时间评估损伤，例如在用除草剂处理测试植物或植物部分后12小时或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或三周、四周或更长时评估损伤。在任何时间进行评估都是合适的，只要其允许检测响应于测试和对照植物或植物部分的处理而产生的差异即可。
因此，如本文所用，“测试植物”或“测试植物部分”是已用本发明所公开的多核苷酸构建体转化的植物或植物部分，或者是从如此改变的植物或植物部分传代且包含除草剂耐受性多核苷酸的植物或植物部分。
“对照”或“对照植物”或“对照植物部分”提供测量受试植物或植物部分的表型变化的参考点，并且可以是任何合适的植物或植物部分。对照植物或植物部分可包括例如：(a)野生型植物或植物部分，即，与转化前的测试植物或植物部分相同基因型的未转化植物；(b)具有与起始材料相同的基因型但已用无效构建体(即，用对目标性状不具有已知效果的构建体，如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物部分；(c)为受试植物或植物部分的子代中的非转化分离子的植物或植物部分；(d)基因方面与受试植物或植物部分相同但不暴露于与受试植物或植物部分相同的处理(例如，除草剂处理)的植物或植物部分；(e)处于除草剂耐受性多核苷酸不被表达的条件下的受试植物或植物部分本身；或(f)处于未暴露于特定处理例如一种除草剂或多种除草剂的组合和/或其他化学品的条件下的受试植物或植物部分本身。在一些情况下，适当的对照玉蜀黍植物或植物部分包括NK603事件(Nielson et al.(2004)European Food Research and Technology219：421-427(Nielson等人，2004年，《欧洲食品研究与技术》，第219卷，第421-427页)和Ridley et al.(2002)Journal of Agriculture and FoodChemistry 50：7235-7243(Ridley等人，2002年，《农业和食品化学杂志》，第50卷，第7235-7243页))、优良坚杆自交植物、P3162植物(先锋良种国际公司(Pioneer Hi-Bred International))、39T66植物(先锋良种国际公司)或34M91植物(先锋良种国际公司)。在一些情况下，适当的对照大豆植物或植物部分是“Jack”大豆植物(伊利诺伊州尚佩恩的伊利诺伊基金种子公司(Illinois Foundation Seed，Champaign，Illinois))。
本发明所公开的组合物和方法中所用的除草剂耐受性多肽可赋予对任何相应除草剂的耐受性。在一些实施例中，除草剂耐受性多肽赋予对选自如下的除草剂的耐受性：草甘膦、ALS抑制剂(例如，磺酰脲)、乙酰辅酶A羧化酶抑制剂、合成生长素、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂除草剂、色素合成抑制剂除草剂、草丁膦乙酰转移酶或八氢番茄红素去饱和酶抑制剂、谷氨酰胺合成酶抑制剂、羟苯丙酮酸二加氧酶抑制剂、以及原卟啉原氧化酶抑制剂。
已得到广泛研究的一种除草剂是N-膦酰基甲基甘氨酸，通常称为草甘膦。草甘膦是由于5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(也称为“EPSP合成酶”或“EPSPS”)的抑制而杀死阔叶植物和草类植物的广谱除草剂，该酶是芳香族氨基酸、激素和维生素产生的生物合成途径的一部分。已产生了草甘膦抗性转基因植物，该植物由于引入了经修饰的农杆菌CP4 EPSPS而表现出商业可行水平的草甘膦抗性。该经修饰的酶靶向叶绿体，在叶绿体中，即使在存在草甘膦的情况下，也会继续从磷酸烯醇式丙酮酸(“PEP”)和莽草酸-3-磷酸合成EPSP。CP4草甘膦抗性大豆转基因植物目前已商业使用(例如，如由孟山都公司(Monsanto)以商品名“Roundup”出售)。
在一些实施例中，本发明所公开的方法和组合物利用编码赋予对草甘膦的耐受性的除草剂耐受性多肽的多核苷酸。赋予对草甘膦的耐受性的各种序列可用于本发明所公开的方法和组合物中。在一些实施例中，赋予对草甘膦的抗性的除草剂耐受性多肽具有草甘膦转移酶活性。如本文所用，“草甘膦转移酶”多肽能够将乙酰基基团从乙酰辅酶A转移到草甘膦的N，将丙酰基基团从丙酰辅酶A转移到草甘膦的N，或催化草甘膦类似物和/或草甘膦代谢物例如氨基甲基膦酸的乙酰化。分析该活性的方法公开于例如美国公布No.2003/0083480、美国公布No.2004/0082770以及美国专利No.7,405,074、WO2005/012515、WO2002/36782和WO2003/092360中。在一个实施例中，转移酶多肽包含草甘膦-N-乙酰转移酶“GLYAT”多肽。
如本文所用，GLYAT多肽或酶包含具有草甘膦-N-乙酰转移酶活性(“GLYAT”活性)，即能够催化草甘膦的乙酰化的多肽。在具体实施例中，具有草甘膦-N-乙酰转移酶活性的多肽可将乙酰基基团从乙酰辅酶A转移到草甘膦的N。此外，一些GLYAT多肽将丙酰辅酶A的丙酰基基团转移到草甘膦的N。一些GLYAT多肽也能够催化草甘膦类似物和/或草甘膦代谢物例如氨基甲基膦酸的乙酰化。GLYAT多肽的特征在于它们彼此的结构相似性，例如就GLYAT多肽彼此比对时的序列相似性而言的结构相似性。示例性GLYAT多肽及编码其的多核苷酸是本领域已知的并且具体地公开于例如美国申请公布No.2003/0083480以及美国专利No.7,462,481、No.7,531,339、No.7,622,641和No.7,405,074，所述专利的每一篇全文以引用方式并入本文。在一些实施例中，本发明所公开的方法和组合物中所用的GLYAT多肽包含以如下示出的氨基酸序列：SEQ ID NO：43、44、45、46、48或50。在一些实施例中，编码本发明所公开的方法和组合物中所用的GLYAT多肽的GLYAT多核苷酸以SEQ ID NO：47或49示出。如本文别处更详细地讨论，GLYAT多核苷酸的片段和变体、其他已知的除草剂耐受性多核苷酸以及由其编码的多肽的使用也被本发明涵盖。
SEQ ID NO：43、44、45、46、48或50的保留草甘膦N-乙酰转移酶活性的活性变体包括这样的序列，其在与SEQ ID NO中的任何一个进行最佳比对时，在使用BLOSUM62矩阵、11的空位存在罚分以及1的空位延伸罚分的情况下产生至少430的相似性评分。本发明的一些方面涉及包含氨基酸序列的GAT多肽，所述氨基酸序列可与选自SEQ ID NO：43、44、45、46、48和50的氨基酸序列最佳比对，在使用BLOSUM62矩阵、11的空位存在罚分以及1的空位延伸罚分的情况下产生至少440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755或760的相似性评分。当使用定义的氨基酸置换矩阵(如，BLOSUM62)、空位存在罚分和空位延伸罚分对两条序列进行比对使得到的相似性评分达到该对序列最高可能分数时，这两条序列是“最佳比对的”。
已用草甘膦处理的表达GLYAT的植物包含草甘膦代谢物N-乙酰草甘膦(“NAG”)。N-乙酰草甘膦的存在可用作植物中活性GLYAT基因的存在的诊断标记，并且可通过本领域已知的方法，例如通过质谱法或通过免疫测定法来评价。一般来讲，已用草甘膦处理的包含GLYAT基因的植物中的NAG水平与GLYAT基因的活性和处理植物所用的草甘膦的量相关。
编码可在本发明所公开的方法和组合物中使用的草甘膦耐受性多肽的多核苷酸包括编码草甘膦氧化还原酶的那些多核苷酸，如美国专利No.5,776,760和No.5,463,175中更充分地描述，所述专利全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
通常用于经济作物生产的其他除草剂包括草铵膦(草丁膦)和乙酰乳酸合成酶(ALS)化学品，诸如磺酰脲除草剂。草铵膦是作用于叶绿体谷氨酸合成酶的广谱除草剂。已产生草铵膦耐受性转基因植物，该植物携带来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。由bar基因编码的酶具有N-乙酰化活性并且对草铵膦修饰和解毒。草铵膦耐受性植物目前已商业使用(例如，如由拜耳公司(Bayer)以商品名“Liberty”出售)。如本文别处所述，磺酰脲除草剂通过阻断乙酰乳酸合成酶(ALS)来抑制高等植物的生长。包含ALS中的特定突变的植物耐受包括磺酰脲在内的ALS除草剂。
在一些实施例中，本发明所公开的方法和组合物中利用的除草剂耐受性多肽是ALS抑制剂耐受性多肽。如本文所用，“ALS抑制剂耐受性多肽”包括在植物中表达时赋予对至少一种ALS抑制剂的耐受性的任何多肽。多种ALS抑制剂是已知的并且包括例如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶基氧基(硫代)苯甲酸酯和/或磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂。另外的ALS抑制剂是已知的并且公开于本文别处。本领域已知的是，对于对磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶和嘧啶基(硫代)苯甲酸酯的耐受性，ALS突变分成不同的类别，包括具有下列特性的突变：(1)对所有四个这些组的广泛耐受性；(2)对咪唑啉酮和嘧啶基(硫代)苯甲酸酯的耐受性；(3)对磺酰脲和三唑并嘧啶的耐受性；以及(4)对磺酰脲和咪唑啉酮的耐受性。
可采用多种ALS抑制剂耐受性多肽。在一些实施例中，ALS抑制剂耐受性多核苷酸包含至少一个核苷酸突变，产生ALS多肽的一个氨基酸变化。在具体实施例中，该变化发生于乙酰乳酸合成酶的七个实质上保守的区域之一中。参见例如Hattori et al.(1995)Molecular Genetics and Genomes246：419-425(Hattori等人，1995年，《分子遗传学与基因组》，第246卷，第419-425页)；Lee et al.(1998)EMBO Journal 7：1241-1248(Lee等人，1998年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第7卷，第1241-1248页)；Mazur et al.(1989)Ann.Rev.Plant Phys.40：441-470(Mazur等人，1989年，《植物生理学年评》，第40卷，第441-470页)；以及美国专利No.5,605,011，所述文献的每一篇全文以引用方式并入。ALS抑制剂耐受性多肽可由例如ALS的SuRA或SuRB基因座编码。在具体实施例中，ALS抑制剂耐受性多肽包括C3ALS突变体、HRA ALS突变体、S4突变体或S4/HRA突变体或它们的任何组合。ALS中的不同突变已知能赋予对不同除草剂和多组(和/或多亚组)除草剂的耐受性；参见例如Tranel andWright(2002)Weed Science 50：700-712(Tranel和Wright，2002年，《杂草科学》，第50卷，第700-712页)。还可参见美国专利No.5,605,011、No.5,378,824、No.5,141,870、No.5,013,659和No.7,622,641，所述专利的每一篇全文以引用方式并入本文。还可参见包含大豆HRA序列的SEQ IDNO：51；包含玉蜀黍HRA序列的SEQ ID NO：52；以及包含拟南芥HRA序列的SEQ ID NO：53。ALS中的HRA突变可特别适用于本发明的一个实施例。该突变导致产生乙酰乳酸合成酶多肽，其与野生型蛋白相比，能耐受至少一种ALS抑制剂化学品。例如，表达ALS抑制剂耐受性多肽的植物可耐受磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶基氧基(硫代)苯甲酸酯和/或磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂的剂量是会造成适当对照植物损伤的除草剂的剂量的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、70、80、100、125、150、200、500或1000倍。在一些实施例中，ALS抑制剂耐受性多肽包含多个突变。
在一些实施例中，ALS抑制剂耐受性多肽赋予对磺酰脲和咪唑啉酮除草剂的耐受性。磺酰脲和咪唑啉酮除草剂通过阻断乙酰乳酸合成酶(ALS)(也称为乙酰羟酸合成酶(AHAS))来抑制高等植物的生长。例如，包含ALS中的特定突变(例如，S4和/或HRA突变)的植物耐受磺酰脲除草剂。磺酰脲耐受性植物和咪唑啉酮耐受性植物的产生更充分地描述于美国专利No.5,605,011、No.5,013,659、No.5,141,870、No.5,767,361、No.5,731,180、No.5,304,732、No.4,761,373、No.5,331,107、No.5,928,937和No.5,378,824；以及国际公布WO 96/33270，所述专利全文以引用方式并入本文以用于所有目的。在具体实施例中，ALS抑制剂耐受性多肽包含磺酰胺耐受性乙酰乳酸合成酶(另外称为磺酰胺耐受性乙酰羟酸合成酶)或咪唑啉酮耐受性乙酰乳酸合成酶(另外称为咪唑啉酮耐受性乙酰羟酸合成酶)。
通常，赋予对特定除草剂或其他化学品的耐受性的除草剂耐受性多核苷酸或者表达其的植物也将赋予对相同类别或亚类(例如，表3中所示的类别或亚类)中的其他除草剂或化学品的耐受性。
表3：HRAC除草剂分类的简化版
本发明所公开的方法和组合物可利用多个除草剂耐受性多核苷酸。也就是说，本发明所公开的多核苷酸构建体可包含除草剂耐受性多肽的不止一个编码多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸构建体包含编码相同类型的除草剂耐受性多肽的不止一个多核苷酸(即，不止一个GLYAT)。在其他实施例中，多核苷酸构建体包含不止一个除草剂耐受性编码多核苷酸，其中所述编码多核苷酸中的每一个编码不同类型的除草剂耐受性多肽(属于不同类别或亚类)。在一些实施例中，多核苷酸构建体包含编码除草剂耐受性多肽的至少第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中第一多核苷酸和第二多核苷酸编码赋予对第一除草剂和第二除草剂的耐受性的第一除草剂耐受性多肽和第二除草剂耐受性多肽，其中第一除草剂和第二除草剂具有不同的作用机制。
在其中本发明所公开的多核苷酸构建体包含至少两个除草剂耐受性多核苷酸的那些实施例的一些中，至少两个除草剂耐受性多核苷酸位于切除盒外。在其他实施例中，多核苷酸构建体包含切除盒外的除草剂耐受性多核苷酸(在切除所述切除盒后被有效连接到其启动子)和切除盒内的第二除草剂耐受性多肽。
在一些实施例中，本发明所公开的方法和组合物利用赋予对草甘膦和至少一种ALS抑制剂除草剂的耐受性的多核苷酸。在其他实施例中，本发明所公开的方法和组合物利用赋予对草甘膦和至少一种ALS抑制剂除草剂的耐受性以及对至少一种另外除草剂的耐受性的多核苷酸。
除了草甘膦和ALS抑制剂之外，本发明所公开的多核苷酸构建体可包含编码赋予对其他类型除草剂的耐受性的除草剂耐受性多肽的多核苷酸。此类另外的除草剂包括但不限于乙酰辅酶A羧化酶抑制剂诸如精喹禾灵、合成生长素诸如二氯喹啉酸、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂除草剂(诸如甲磺草胺)、色素合成抑制剂除草剂诸如羟苯丙酮酸二加氧酶抑制剂(例如，硝磺草酮或磺草酮)、草丁膦乙酰转移酶或八氢番茄红素去饱和酶抑制剂如吡氟酰草胺或色素合成抑制剂。
在一些实施例中，本发明所公开的多核苷酸构建体包含编码赋予对抑制谷氨酰胺合成酶的除草剂(诸如草丁膦或草铵膦)的耐受性的多肽的多核苷酸(例如，bar基因或pat基因)。谷氨酰胺合成酶(GS)似乎是大多数植物细胞发育和生存所必要的必需酶，并且GS的抑制剂对植物细胞有毒。已基于植物中GS的抑制所致的毒性作用，开发出了草铵膦除草剂。这些除草剂是非选择性的；也就是说，它们抑制所存在的所有不同植物物种的生长。包含外源草丁膦乙酰转移酶的植物的开发在美国专利No.5,969,213、No.5,489,520、No.5,550,318、No.5,874,265、No.5,919,675、No.5,561,236、No.5,648,477、No.5,646,024、No.6,177,616和No.5,879,903中有所描述，所述专利全文以引用方式并入本文以用于所有目的。还公开了具有此活性的突变草丁膦乙酰转移酶。在某些实施例中，使用玉蜀黍优化的PAT基因。在这些实施例的一些中，玉蜀黍优化的PAT基因具有SEQID NO：54所示的序列。在一些实施例中，PAT基因用作如本文别处所述的选择性标记并且存在于切除盒内。
在其他实施例中，本发明所公开的多核苷酸构建体包含编码赋予对抑制protox(原卟啉原氧化酶)的除草剂的耐受性的多肽的多核苷酸。Protox是叶绿素的生成所必需的，而叶绿素是所有植物存活所必需的。protox酶充当多种除草化合物的靶标。这些除草剂还抑制所存在的所有不同植物物种的生长。能抵抗这些除草剂的含有改变的protox活性的植物的开发在美国专利No.6,288,306、No.6,282,837和No.5,767,373，以及国际公布WO01/12825中有所描述，所述专利全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
在其他实施例中，本发明所公开的多核苷酸构建体可包含编码涉及除草剂抗性的其他模式的多肽的多核苷酸。例如，羟苯丙酮酸二加氧酶是催化将对羟苯丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸的反应的酶。抑制该酶并结合于该酶以抑制HPP转化为尿黑酸的分子可用作除草剂。对某些除草剂抗性更强的植物在美国专利No.6,245,968、No.6,268,549和No.6,069,115，以及国际公布WO 99/23886中有所描述，所述专利全文以引用方式并入本文以用于所有目的。还公开了具有此活性的突变羟苯丙酮酸二加氧酶。
在一些实施例中，所述方法和组合物还可包含至少一种细胞增殖因子。细胞增殖因子诸如babyboom的表达可增强其他顽拗型植物或植物部分的转化频率。可将编码细胞增殖因子的多核苷酸与本发明所公开的多核苷酸构建体共转化到植物或植物部分中。在其他实施例中，本发明所公开的多核苷酸构建体包含至少一个编码细胞增殖因子的多核苷酸。在这些实施例的一些中，所述至少一个编码细胞增殖因子的多核苷酸位于多核苷酸构建体的切除盒内，使得当位点特异性重组酶被表达时，该多核苷酸被切除。
如本文所用，“细胞增殖因子”是这样的多肽或多核苷酸，其能够刺激细胞或组织的生长，包括但不限于促进通过细胞周期的进程、抑制细胞死亡诸如细胞凋亡、刺激细胞分裂和/或刺激胚发生。多核苷酸可分成若干类别，包括但不限于细胞周期刺激多核苷酸、发育多核苷酸、抗细胞凋亡多核苷酸、激素多核苷酸、或以细胞周期阻遏因子或促凋亡因子为靶标的沉默构建体。以下作为每个类别的非限制性例子提供并且不应视为每个类别的可用多核苷酸的完整列表：1)细胞周期刺激多核苷酸，包括植物病毒复制酶基因，诸如RepA、cyclins、E2F、prolifera、cdc2和cdc25；2)发育多核苷酸，诸如Lec1、Kn1家族、WUSCHEL、Zwille、BBM、Aintegumenta(ANT)、FUS3，以及Knotted家族的成员，诸如Kn1、STM、OSH1和SbH1；3)抗细胞凋亡多核苷酸，诸如CED9、Bcl2、Bcl-X(L)、Bcl-W、A1、McL-1、Mac1、Boo和Bax抑制因子；4)激素多核苷酸，诸如IPT、TZS和CKI-1；以及5)以如下为靶标的沉默构建体：细胞周期阻遏因子，诸如Rb、CKl、prohibitin和wee1；或细胞凋亡的刺激因子，诸如APAF-1、bad、bax、CED-4和caspase-3；以及植物发育过渡的阻遏因子，诸如Pickle和WD多梳基因(包括FIE和Medea)。可通过任何已知的方法，诸如反义、RNA干扰、共抑制、嵌合修复术或转座子插入，使多核苷酸沉默。
编码细胞增殖因子的多核苷酸可以是细胞天然的或异源的。可使用多种细胞增殖因子中的任何一种。在某些实施例中，能够刺激胚发生的那些细胞增殖因子用于增强转化效率。此类细胞增殖因子在本文称为胚发生刺激多肽，并且它们包括但不限于babyboom多肽。
在一些实施例中，细胞增殖因子是AP2/ERF蛋白家族的成员。AP2/ERF蛋白家族是推定转录因子的植物特异性类别，所述推定转录因子调控多种发育过程，并且特征在于AP2 DNA结合结构域的存在，据预测，该结构域会形成结合DNA的两亲α螺旋(PFAM登录号PF00847)。已基于保守结构域的存在，将AP2/ERF蛋白细分为不同亚家族。最初，基于DNA结合结构域的数量，将该家族分为两个亚家族，其中ERF亚家族具有一个DNA结合结构域，而AP2亚家族具有2个DNA结合结构域。随着更多序列被鉴定，该家族随后被细分为五个亚家族：AP2、DREB、ERF、RAV和其他。(Sakuma et al.(2002)Biochem Biophys Res Comm 290：998-1009(Sakuma等人，2002年，《生物化学和生物物理研究通讯》，第290卷，第998-1009页))。
APETALA2(AP2)蛋白家族的成员在多种生物事件中起作用，所述生物事件包括但不限于发育、植物再生、细胞分裂、胚发生和细胞增殖(参见例如，Riechmann and Meyerowitz(1998)Biol Chem 379：633-646(Riechmann和Meyerowitz，1998年，《生物化学》，第379卷，第633-646页)；Saleh and Pagés(2003)Genetika 35：37-50(Saleh和Pagés，2003年，《遗传学》，第35卷，第37-50页)以及daft.cbi.pku.edu.cn处的拟南芥转录因子数据库)。AP2家族包括但不限于AP2、ANT、Glossy15、AtBBM、BnBBM和玉蜀黍ODP2/BBM。
全文以引用方式并入本文的美国申请公布No.2011/0167516描述了与玉蜀黍BBM序列(也称为玉蜀黍ODP2或ZmODP2，玉蜀黍BBM的多核苷酸和氨基酸序列分别以SEQ ID NO：55和56示出；另一种ZmBBM的多核苷酸和氨基酸序列分别以SEQ ID NO：58和59示出)具有同源性的五十个序列的分析。该分析鉴定了存在于所有BBM同源物中的三个基序(基序4-6；以SEQ ID NO：61-63示出)及AP2结构域(基序2和3；SEQ ID NO：64和65)和桥接AP2结构域的接头序列(基序1；SEQ ID NO：66)。因此，基序1-6将这些BBM同源物与其他含AP2结构域的蛋白(例如，WRI、AP2和RAP2.7)区分开，并且这些BBM同源物包含AP2蛋白家族的亚群，本文称为BBM/PLT亚群。在一些实施例中，用于所述方法和组合物的细胞增殖因子是含AP2结构域的多肽的BBM/PLT群体的成员。在这些实施例中，细胞增殖因子包含两个AP2结构域和基序4-6(SEQ ID NO：61-63)或其片段或变体。在这些实施例的一些中，AP2结构域具有SEQ IDNO：64和65所示的序列或其片段或变体，并且在特定实施例中，还包含SEQ ID NO：66的接头序列或其片段或变体。在其他实施例中，细胞增殖因子包含基序4-6或其片段或变体中的至少一者及两个AP2结构域，在一些实施例中，所述AP2结构域具有SEQ ID NO：64和/或65所示的序列或其片段或变体，并且在特定实施例中具有SEQ ID NO：66的接头序列或其片段或变体。根据系统进化分析，可将BBM/PLT多肽的亚群细分为BBM、AIL6/7、PLT1/2、AIL1、PLT3和ANT多肽群体。
在一些实施例中，细胞增殖因子是babyboom(BBM)多肽，其是AP2转录因子家族的成员。来自拟南芥的BBM蛋白(AtBBM)优先地在发育中的胚和种子中表达，并且已表明其在调控胚特异性途径方面起到重要作用。已表明，AtBBM的过表达会诱导籽苗上的体细胞胚及子叶状结构的自发形成。参见Boutiler et al.(2002)The Plant Cell 14：1737-1749(Boutiler等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1737-1749页)。玉蜀黍BBM蛋白还诱导胚发生并促进转化(参见美国专利No.7,579,529，其全文以引用方式并入本文)。因此，BBM多肽刺激增殖、诱导胚发生、增强植物的再生能力、增强转化，以及如本文所证实，提高靶向多核苷酸修饰率。
在一些实施例中，babyboom多肽包含两个AP2结构域以及基序7和10(分别以SEQ ID NO：67和68示出)或其变体或片段中的至少一者。在某些实施例中，AP2结构域是基序2和3(分别为SEQ ID NO：64和65)或其片段或变体，并且在特定实施例中，babyboom多肽还包含AP2结构域1与2之间的接头序列，所述接头序列具有基序1(SEQ ID NO：66)或其片段或变体。在特定实施例中，BBM多肽还包含基序4-6(SEQ ID NO 61-63)或其片段或变体。BBM多肽还可包含基序8和9(分别为SEQ ID NO：69和70)或其片段或变体，并且在一些实施例中，包含基序10(SEQ ID NO：68)或其变体或片段。在这些实施例的一些中，BBM多肽还包含基序14(以SEQ ID NO：71示出)、基序15(以SEQ ID NO：72示出)和基序19(以SEQ ID NO：73示出)或其变体或片段中的至少一者。特定氨基酸基序的变体可为与本文所公开的基序具有至少约40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性的氨基酸序列。作为另一种选择，特定氨基酸基序的变体可为与所述氨基酸基序相差1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的氨基酸序列。
可用于所述方法和组合物的babyboom多核苷酸和多肽的非限制性例子包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtBBM(SEQ ID NO：74和75)、欧洲油菜(Brassica napus)BnBBM1(SEQ ID NO：76和77)、欧洲油菜BnBBM2(SEQ ID NO：78和79)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)MtBBM(SEQ ID NO：80和81)、大豆(Glycine max)GmBBM(SEQ ID NO：82和83)、葡萄(Vitis vinifera)VvBBM(SEQ ID NO：84和85)、玉米(Zea mays)ZmBBM(SEQ ID NO：55和56以及SEQ ID NO：57所示的基因组序列；或SEQ ID NO：58和59，以及SEQ ID NO：60所示的基因组序列)以及ZmBBM2(SEQ ID NO：101和102)、水稻OsBBM(SEQ ID NO：86和87所示的多核苷酸序列；SEQ ID NO：89所示的氨基酸序列；以及SEQ ID NO：88所示的基因组序列)、OsBBM1(SEQ ID NO：90和91)、OsBBM2(SEQ ID NO：92和93)以及OsBBM3(SEQ ID NO：94和95)、高粱SbBBM(SEQ ID NO：96和97，以及SEQ ID NO：98所示的基因组序列)以及SbBBM2(SEQ ID NO：99和100)或其活性片段或变体。在特定实施例中，细胞增殖因子是玉蜀黍BBM多肽(SEQ ID NO：56、59或102)或其变体或片段，或由玉蜀黍BBM多核苷酸(SEQ ID NO：55、57、121、116或101)或其变体或片段编码。
因此，在一些实施例中，编码细胞增殖因子的多核苷酸具有与SEQ IDNO：82、96、84、80、55、101、86、90、92、94、74、76、78、99、57、60、88、87、58或98所示的核苷酸序列具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性的核苷酸序列，或者细胞增殖因子具有与SEQ ID NO：83、97、85、81、56、102、89、91、93、95、75、77、79、59或100所示的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性的氨基酸序列。在这些实施例的一些中，细胞增殖因子在babyboom多肽的相应氨基酸残基位置处具有基序7和10(分别为SEQ ID NO：67和68)或其变体或片段中的至少一者。在其他实施例中，细胞增殖因子在babyboom多肽的相应氨基酸残基位置处还包含基序14(以SEQ ID NO：71示出)、基序15(以SEQ ID NO：72示出)以及基序19(以SEQ ID NO：73示出)或其变体或片段中的至少一者。
在其他实施例中，其他细胞增殖因子诸如Lec1、Kn1家族、WUSCHEL(例如，WUS1，其多核苷酸和氨基酸序列以SEQ ID NO：103和104示出；WUS2，其多核苷酸和氨基酸序列以SEQ ID NO：105和106示出；WUS2alt，其多核苷酸和氨基酸序列以SEQ ID NO：107和108示出；WUS3，其多核苷酸和氨基酸序列以SEQ ID NO：109和110示出)、Zwille以及Aintegumeta(ANT)可单独使用或结合babyboom多肽或其他细胞增殖因子使用。参见例如美国申请公布No.2003/0135889、国际申请公布No.WO 03/001902和美国专利No.6,512,165，所述专利的每一篇以引用方式并入本文。
在一些实施例中，多核苷酸构建体包含编码Wuschel多肽的多核苷酸(参见国际申请公布No.WO 01/23575和美国专利No.7,256,322，所述专利的每一篇全文以引用方式并入本文)。在某些实施例中，编码Wuschel多肽的多核苷酸具有SEQ ID NO：103、105、107或109(分别为WUS1、WUS2、WUS2 alt或WUS3)所示的序列或其活性变体或片段。在特定实施例中，Wuschel多肽具有SEQ ID NO：104、106、108或110(分别为WUS1、WUS2、WUS2 alt或WUS3)所示的序列或其活性变体或片段。在这些实施例的一些中，编码Wuschel多肽的多核苷酸有效连接到在植物中有活性的启动子，包括但不限于玉蜀黍In2-2启动子或胭脂碱合成酶启动子。
当使用多个细胞增殖因子时，或当babyboom多肽连同任何上述多肽一起使用时，编码各因子的多核苷酸可存在于相同表达盒上或存在于单独的表达盒上。当两个或更多个因子被单独的表达盒编码时，可将表达盒同时或顺序地提供给植物。在一些实施例中，多核苷酸构建体包含切除盒内的编码babyboom多肽的多核苷酸和编码Wuschel多肽的多核苷酸，使得细胞增殖因子增强多核苷酸构建体的转化频率，但是随后在转化的植物细胞/组织干化时被切除。
在一些实施例中，除草剂耐受性多核苷酸可用作选择性标记，以便鉴定还包含目标多核苷酸的植物或植物部分。因此，在某些实施例中，本发明所公开的多核苷酸构建体还可包含目标多核苷酸。在一些实施例中，目标多核苷酸有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。有效连接到目标多核苷酸的启动子可为组成型启动子、诱导型启动子或组织偏好的启动子。
在某些实施例中，目标多核苷酸和任选地有效连接的启动子位于多核苷酸构建体上的切除盒外部。在其他实施例中，目标多核苷酸和任选地其有效连接的启动子位于切除盒内，并且除草剂耐受性多核苷酸用作选择性标记以鉴定从其切除了目标多核苷酸的那些植物或植物部分。
目标多核苷酸可赋予生物体(尤其是植物)中的各种变化，包括但不限于植物中脂肪酸组成的调整、改变植物的氨基酸含量、改变病原体抗性等等。这些结果可通过提供异源产物的表达、植物中内源产物的增强表达、或植物中内源产物的抑制表达来实现。
目标多核苷酸的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(如锌指)、涉及通信的那些基因(如激酶)、涉及生物合成途径的那些基因和涉及看家的那些基因(如热休克蛋白)。转基因的更具体类别例如包括编码农艺学、昆虫抗性、病害抗性、不育性、谷粒特性、油、淀粉、碳水化合物、植酸、蛋白、营养物质、代谢、消化性、籽粒大小、蔗糖装载和商业产品的重要性状的序列。
除了使用传统育种方法之外，还可在遗传学上改变性状诸如油、淀粉和蛋白含量。修饰包括增加油酸、饱和油和不饱和油的含量、增加赖氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸，以及淀粉的修饰。改变氨基酸水平的蛋白修饰在美国专利No.5,703,049、No.5,885,801、No.5,885,802和No.5,990,389以及WO 98/20122中有所描述，所述专利以引用方式并入本文。
昆虫抗性基因可编码针对害虫(如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等)的抗性。这类基因包括例如苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白基因(美国专利No.5,366,892、No.5,747,450、No.5,737,514、No.5,723,756、No.5,593,881，以及Geiser et al.(1986)Gene 48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页))；凝集素(Van Damme et al.(1994)Plant Mol.Biol.24：825(Van Damme等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第825页))；等等。
编码病害抗性性状的基因包括解毒基因，如对伏马毒素(fumonosin)的解毒基因(美国专利No.5,792,931)；无毒力(avr)和病害抗性(R)基因(Jones et al.(1994)Science 266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martin et al.(1993)Science 262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)；以及Mindrinos et al.(1994)Cell78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页))；等等。
不育基因也可编码在表达盒中，为物理去雄提供另选方案。以这种方式使用的基因的例子包括雄性组织偏好的基因和具有雄性不育表型的基因(如QM)，如美国专利No.5,583,210中所述。其他基因包括激酶和编码对雄性或雌性配子体发育有毒的化合物的那些。
还可在一种或多种基因上编码商业性状，所述基因可例如增加用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质的表达。
虽然除草剂耐受性多核苷酸可用作选择性标记以有助于鉴定包含目标多核苷酸或缺少目标多核苷酸的转基因植物，但另外的选择性标记可存在于本发明所公开的多核苷酸构建体的切除盒中，从而有助于在大多数除草剂选择系统不太有效的发育早期时间点选择转基因植物或植物部分。一般来讲，存在于切除盒内的选择性标记是允许在植物发育和产生的早期阶段(例如，在转基因植物产生的组织增殖阶段期间)进行有效选择的选择性标记。例如，荧光蛋白的表达可用于在组织增殖期间或之前选择包含本发明所公开的多核苷酸构建体的植物或植物部分。在使组织再生为植物之前，通常有必要使组织增殖到一定质量。然后，在除草剂选择前诱导位点特异性重组酶的表达，除草剂选择一般在所提供的细胞或组织再生为植物期间或之后进行。
植物细胞的“再生”是从植物细胞(例如，植物原生质体、愈伤组织或外植体)长成植物的过程。
可存在于切除盒内的标记基因包括编码提供对于有毒化合物的抗性(例如，抗生素抗性)的产物的多核苷酸，诸如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO或nptII)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些多核苷酸，以及赋予对除草剂化合物诸如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的抗性的基因，包括但不限于选择性标记基因草丁膦乙酰转移酶(PAT)(Wohlleben et al.(1988)Gene70：25-37(Wohlleben等人，1988年，《基因》，第70卷，第25-37页)，该基因赋予对除草剂双丙氨膦的抗性。在某些实施例中，存在于切除盒内的选择性标记不是除草剂耐受性多核苷酸。
如本文所用，“抗生素抗性多肽”是指为包含或分泌该多肽的宿主细胞赋予对抗生素化合物的抗性或耐受性的多肽。
另外的编码选择性标记的多核苷酸包括编码可易于鉴定的产物的那些多核苷酸，所述可易于鉴定的产物包括但不限于表型标记诸如β-半乳糖苷酶，以及可视化标记诸如荧光蛋白。如本文所用，“荧光蛋白”或“荧光多肽”是指能够吸收一个波长处的辐射(例如，可见光谱内的某波长的光)并发射作为不同波长的光的辐射的多肽。荧光蛋白的非限制性例子包括绿色荧光蛋白(GFP)(Su et al.(2004)Biotechnol Bioeng 85：610-9(Su等人，2004年，《生物技术和生物工程》，第85卷，第610-619页)以及Fetter et al.(2004)Plant Cell 16：215-28(Fetter等人，2004年，《植物细胞》，第16卷，第215-228页))、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte et al.(2004)J.Cell Science 117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页)以及Kato et al.(2002)Plant Physiol129：913-42(Kato等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第913-942页))、红色荧光蛋白和黄色荧光蛋白(来自Evrogen公司的PhiYFPTM，参见Bolte et al.(2004)J.Cell Science 117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页))。对于另外的选择性标记，通常参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511(Yarranton，1992年，《生物技术新见》，第3卷，第506-511页)；Christopherson et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Yao et al.(1992)Cell 71：63-72(Yao等人，1992年，《细胞》，第71卷，第63-72页)；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422(Reznikoff，1992年，《分子微生物学》，第6卷，第2419-2422页)；Barkley et al.(1980)in TheOperon，pp.177-220(Barkley等人，1980年，载于《操纵子》，第177-220页)；Hu et al.(1987)Cell 48：555-566(Hu等人，1987年，《细胞》，第48卷，第555-566页)；Brown et al.(1987)Cell49：603-612(Brown等人，1987年，《细胞》，第49卷，第603-612页)；Figge et al.(1988)Cell 52：713-722(Figge等人，1988年，《细胞》，第52卷，第713-722页)；Deuschleet al.(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA 86：5400-5404(Deuschle等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第5400-5404页)；Fuerst et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553(Fuerst等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第2549-2553页)；Deuschle et al.(1990)Science 248：480-483(Deuschle等人，1990年，《科学》，第248卷，第480-483页)；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg(Gossen，1993年，海德尔堡大学博士论文)；Reines et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921(Reines等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第1917-1921页)；Labow et al.(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356(Labow等人，1990年，《分子细胞生物学》，第10卷，第3343-3356页)；Zambretti et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-3956(Zambretti等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第3952-3956页)；Baim et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076(Baim等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第5072-5076页)；Wyborski et al.(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653(Wyborski等人，1991年，《核酸研究》，第19卷，第4647-4653页)；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162(Hillenand-Wissman，1989年，《分子和结构生物学专题》，第10卷，第143-162页)；Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595(Degenkolb等人，1991年，《抗微生物剂和化学治疗》，第35卷，第1591-1595页)；Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry 27：1094-1104(Kleinschnidt等人，1988年，《生物化学》，第27卷，第1094-1104页)；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University ofHeidelberg(Bonin，1993年，海德尔堡大学博士论文)；Gossen et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(Gossen等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第5547-5551页)；Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919(Oliva等人，1992年，《抗微生物剂和化学治疗》，第36卷，第913-919页)；Hlavka et al.(1985)Handbook ofExperimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)(Hlavka等人，1985年，《实验药理学手册》，第78卷，斯普林格出版社，柏林)；Gill etal.(1988)Nature 334：721-724(Gill等人，1988年，《自然》，第334卷，第721-724页)。这些公开内容以引用方式并入本文。
本发明提供的方法和组合物还可利用代谢酶作为选择性标记。术语“代谢酶”在涉及选择性标记时是指为细胞赋予选择性代谢优势的酶。然后可针对代谢并利用特定化合物的能力来阳性选择表达代谢酶的细胞，该特定化合物不能被不含该酶的其他细胞代谢或利用。用作选择性标记的代谢酶的非限制性例子包括D-氨基氧化酶(由doa1基因编码)，该酶催化各种D-氨基酸的氧化脱氨(参见例如Erikson et al.(2004)NatureBiotechnology 22：455-458(Erikson等人，2004年，《自然-生物技术》，第22卷，第455-458页)，该文献全文以引用方式并入本文)；氰酰胺水合酶(由cah基因编码)，该酶将氰酰胺转化为尿素作为肥料源(参见例如美国专利No.6,268,547，该专利全文以引用方式并入本文)；以及磷酸甘露糖异构酶(由pmi基因编码)，该酶催化甘露糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸的可逆相互转化，从而允许植物细胞利用甘露糖作为碳源(参见例如Joersboet al.(1998)Molecular Breeding 4：11-117(Joersbo等人，1998年，《分子育种》，第4卷，第11-117页)，该文献全文以引用方式并入本文)。
在一些实施例中，切除盒包含不止一个编码选择性标记的多核苷酸。在这些实施例的一些中，切除盒包含可视化标记和抗生素抗性或除草剂耐受性选择性标记。在这些实施例的一些中，切除盒包含玉蜀黍优化的编码PAT的多核苷酸(诸如SEQ ID NO：54所示的序列)或编码新霉素磷酸转移酶II(NEO或nptII)的多核苷酸，以及编码荧光蛋白诸如黄色荧光蛋白的多核苷酸。
切除盒内编码选择性标记的多核苷酸有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。该启动子可存在于切除盒之内或之外。在其中有效连接到编码选择性标记的多核苷酸的启动子在切除盒之外的实施例的一些中，在切除所述切除盒后，该相同启动子会被有效连接到除草剂耐受性多核苷酸。
在某些实施例中，有效连接到存在于切除盒内的编码选择性标记的多核苷酸的启动子是组成型启动子，使得在切除所述切除盒之前选择性标记将在植物或植物部分中组成性地表达。在这些实施例的一些中，组成型启动子是玉蜀黍泛素启动子，在一些实施例中，其包含玉蜀黍泛素启动子(UBI1ZM PRO；SEQ ID NO：111)、泛素5′UTR(UBI1ZM 5UTR；SEQID NO：112)和泛素内含子1(UBIZM INTRON1；SEQ ID NO：113)。
在对表达存在于切除盒内的选择性标记的植物或植物部分进行选择期间，可在存在选择剂的情况下培养植物或植物部分。如本文所用，“选择剂”是指当与植物或植物部分接触时允许阳性或阴性地鉴定表达选择性标记的植物或植物部分的化合物。例如，抗生素抗性多核苷酸的选择剂是该多核苷酸赋予对其的抗性的抗生素。作为又一个非限制性例子，代谢酶选择性标记的选择剂是可仅被表达该选择性标记的细胞代谢和利用的化合物。
在其中多核苷酸构建体被设计用于玉蜀黍的转化的特定实施例中，多核苷酸构建体在切除盒外包含GLYAT多肽和ALS抑制剂耐受性多肽的表达盒，如存在于美国专利No.7,928,296中所述的质粒PHP24279的T-DNA区中，该专利全文以引用方式并入本文。在这些实施例中，多核苷酸构建体包含glyat4621基因，该基因来源于土壤细菌地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)并且通过基因改组过程合成以优化GLYAT4621酶的乙酰转移酶活性(Castle et al.(2004)Science 304：1151-1154(Castle等人，2004年，《科学》，第304卷，第1151-1154页))。多核苷酸构建体还包含ZM-HRA表达盒，该表达盒包含经修饰的玉蜀黍乙酰乳酸合成酶基因zm-hra(玉米高度抗性等位基因)，其编码赋予对一系列ALS抑制性除草剂诸如磺酰脲的耐受性的ZM-HRA蛋白。在这些实施例中，glyat4621基因盒和zm-hra基因盒处于相反取向。glyat4621基因的表达受到来自玉蜀黍的泛素调控区(ubiZM1启动子(SEQ ID NO：111)、5’UTR(SEQ ID NO：112)和内含子(SEQ ID NO：112)(Christensen等人，1992年)和pinII终止子的控制(An et al.(1989)Plant Cell 1：115-122(An等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第115-122页))。zm-hra基因的表达受到天然玉蜀黍乙酰乳酸合成酶启动子(zm-als启动子)的控制(Fang等人，2000年)。zm-hra基因的终止子是来自马铃薯(Solanum tuberosum)的蛋白酶抑制因子II基因的3’终止子序列(pinII终止子)。这两个盒的上游是来自花椰菜花叶病毒的三个拷贝增强子区(CaMV 35S增强子，美国申请No.11/508,045，其以引用方式并入本文)，从而提供对两个盒的表达增强。
在其中多核苷酸构建体被设计用于大豆(Glycine max)的转化的某些实施例中，多核苷酸构建体在切除盒外包含GLYAT多肽和ALS抑制剂耐受性多肽的表达盒，如存在于美国专利No.7,622,641中所述的质粒PHP20163的Not I-Asc I片段中，该专利全文以引用方式并入本文。在这些实施例中，多核苷酸构建体包含来源于地衣芽孢杆菌的草甘膦乙酰转移酶(glyat)基因以及大豆乙酰乳酸合成酶基因的修饰形式(zm-hra)。glyat基因通过基因改组过程以优化使除草剂草甘膦乙酰化的草甘膦乙酰转移酶(GLYAT)活性的动力学，而在功能上得到改善。glyat基因受到SCP1启动子和烟草花叶病毒(TMV)omega 5′UTR翻译增强子元件及来自马铃薯的蛋白酶抑制因子II(pinII)终止子的控制。znm-hra基因受到均来自大豆的S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶(SAMS)启动子和乙酰乳酸合成酶(gm-als)终止子的控制。
在其中多核苷酸构建体被设计用于芸苔属(Brassica)的转化的其他实施例中，多核苷酸构建体包含GLYAT多肽的表达盒，如存在于美国申请公布No.2012/0131692中所述的质粒PHP28181中，该专利全文以引用方式并入本文。在这些实施例中，多核苷酸构建体包含glyat4621基因，该基因来源于土壤细菌地衣芽孢杆菌并且通过基因改组过程合成以优化GLYAT4621酶的乙酰转移酶活性(Castle，et al.，(2004)Science 304：1151-1154(Castle等人，2004年，《科学》，第304卷，第1151-1154页))。glyat4621基因的表达受到来自拟南芥的UBQ10调控区及pinII终止子的控制。在这些实施例的一些中，多核苷酸构建体还包含ALS抑制剂耐受性多肽的表达盒。
本发明所公开的组合物和方法可利用已知多核苷酸或多肽序列的片段或变体。所谓“片段”，意指多核苷酸的一部分或由其编码的氨基酸序列从而由其编码的蛋白质的一部分。多核苷酸的片段可保留天然多核苷酸的生物活性并且例如具有启动子活性(启动子片段)，或者能够刺激增殖、诱导胚发生、调整植物的再生能力(细胞增殖因子片段)，能够赋予除草剂耐受性(除草剂耐受性多肽片段)或催化位点特异性重组(位点特异性重组酶片段)。在其中多核苷酸编码多肽的那些实施例中，多核苷酸的片段可编码保留天然蛋白的生物活性的蛋白片段。作为另一种选择，可用作杂交探针的多核苷酸的片段一般不保留生物活性或不编码保留生物活性的片段蛋白。因此，核苷酸序列的片段可在至少约20、50、100、150、200、250、300、400、500个核苷酸或更大的范围内。
编码细胞增殖因子的生物活性部分的多核苷酸的片段例如将编码至少15、25、30、50、100、150、200、250、300、400、500个连续氨基酸或最多至存在于全长细胞增殖因子中的氨基酸总数。可用作杂交探针或PCR引物的编码多核苷酸的片段一般不必编码多肽的生物活性部分。
“变体”旨在意指实质上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在5′和/或3′端具有缺失；在天然多核苷酸的一个或多个内部位点缺失和/或添加一个或多个核苷酸；和/或在天然多核苷酸的一个或多个位点置换一个或多个核苷酸的多核苷酸。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于编码多肽的多核苷酸，保守变体包括由于遗传密码的简并性而编码多肽(例如，细胞增殖因子)的氨基酸序列的那些序列。诸如这些的天然存在的变体可用熟知的分子生物学技术进行鉴定，例如用聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成法获得的多核苷酸，如那些例如通过使用定点诱变生成的多核苷酸。一般来讲，通过序列比对程序和参数测定，特定变体将与该特定多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
编码多肽的特定多核苷酸的变体还可通过比较变体多核苷酸所编码的多肽与该特定多核苷酸所编码的多肽之间的序列同一性百分数来进行评价。任何两条多肽之间的序列同一性百分数可用序列比对程序和参数来计算。若任何给定的多核苷酸对是通过比较它们编码的两条多肽所具有的序列同一性百分数进行评价，则该两条编码的多肽之间的序列同一性百分数为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
“变体”蛋白质旨在意指通过如下手段而衍生自天然蛋白质的蛋白质：在天然蛋白质的N末端和/或C末端缺失一个或多个氨基酸；在该天然蛋白质中的一个或多个内部位点缺失和/或添加一个或多个氨基酸；和/或在天然蛋白质中的一个或多个位点置换一个或多个氨基酸。变体蛋白质保留天然蛋白质的所需生物活性。例如，变体细胞增殖因子刺激增殖并且变体babyboom多肽能够刺激增殖、诱导胚发生、调整植物的再生能力、增加植物中的转化效率、在非生物胁迫下增加或保持植物中的产量、产生植物中无性来源的胚和/或提高靶向多核苷酸修饰率。这种变体可例如由遗传多态性或由人类操纵而得到。通过序列比对程序和参数测定，天然蛋白质的生物活性变体将与该天然蛋白质的氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。天然蛋白质的生物活性变体可与该蛋白质相差少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个如6-10个、少至5个、少至4个、3个、2个或甚至1个氨基酸残基。
如适当的话，可对编码多核苷酸进行优化以使其在转化的植物中的表达提高。也就是说，可使用植物偏好的密码子来合成编码多核苷酸，以提高表达。有关宿主偏好密码子用法的讨论，参见例如Campbell and Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11(Campbell和Gowri，1990年，《植物生理学》，第92卷，第1-11页)。本领域可获得用于合成植物偏好基因的方法。参见例如，美国专利No.5,380,831和No.5,436,391，以及Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)，所述专利和文献以引用方式并入本文。
已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及其他此类充分表征的可能有害于基因表达的序列。可将序列的G-C含量调整到给定的细胞宿主的平均水平，这通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。当可能时，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。
以下术语用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”以及(d)“序列同一性百分数”。
(a)如本文所用，“参考序列”是用作序列比较的基础的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，为全长cDNA或者基因序列的区段或者完整的cDNA或者基因序列。
(b)本文所用的“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该比较窗口中的该多核苷酸序列相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两个多核苷酸的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续核苷酸，任选可为30、40、50、100个或者更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中纳入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
将序列比对以作比较的方法是本领域公知的。因此，可使用数学算法来完成任何两个序列之间序列同一性百分数的确定。此类数学算法的非限制性例子是Myers and Miller(1988)CABIOS 4：11-17(Myers和Miller，1988年，《生物信息学》，第4卷，第11-17页)的算法；Smith et al.(1981)Adv.Appl.Math.2：482(Smith等人，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页)的局部比对算法；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的全局比对算法；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448(Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页)的局部搜索比对法；Karlin andAltschul(1990)Proc..Natl.Acad.Sci.USA 872264(Karlin和Altschul，1990年，《美国国家科学院院刊》，第872264页)的算法，其在Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877(Karlin和Altschul，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5877页)中作了修正。
这些数学算法的计算机实现方式可以用来比较序列以确定序列同一性。此类实现方式包括但不限于：PC/Gene程序(可获自加利福尼亚州山景城的Intelligenetics公司(Intelligenetics，Mountain View，California))中的CLUSTAL；GCG Wisconsin Genetics Software版本10(可得自加利福尼亚州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的Accelrys有限公司(Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，California，USA))中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可以使用默认参数进行。以下文献对CLUSTAL程序进行了详细描述：Higgins et al.(1988)Gene 73：237-244(1988)(Higgins等人，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页，1988年)；Higgins et al.(1989)CABIOS 5：151-153(Higgins等人，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)；Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90(Corpet等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第10881-10890页)；Huang et al.(1992)CABIOS 8：155-65(Huang等人，1992年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页)；以及Pearsonet al.(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331(Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24卷，第307-331页)。ALIGN程序是基于Myers和Miller(1988)(出处同上)的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可以使用PAM120加权残基表(weight residue table)、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul et al(1990)J.Mol.Biol.215：403(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403页)的BLAST程序是基于Karlin和Altschul(1990)(出处同上)的算法。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序、得分(score)＝100、字长(wordlength)＝12来进行，以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTX程序、得分＝50、字长＝3来进行，以获得与本发明蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得带空位的比对结果，可以如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389页)中所述采用Gapped BLAST(在BLAST2.0中)。作为另一种选择，PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)可以用来执行检测分子之间远源关系的迭代搜索。参见Altschul等人，(1997)，出处同上。当采用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可使用各个程序的默认参数(例如，BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质)。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。还可以以手动方式通过检查来进行比对。
除非另外指明，否则本文提供的序列同一性/相似性值指使用采用如下参数的GAP版本10或其任何等同程序获得的值：核苷酸序列的同一性％和相似性％采用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的同一性％和相似性％采用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵。所谓“等同程序”意指任何这样的序列比较程序，其对于任何两个所考虑的序列，相比于GAP版本10所产生的相应比对，能产生出具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分数的比对。
GAP使用Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的算法，以找到两个完全序列的比对，该比对能使匹配数最大和使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。对于蛋白质序列，GCG Wisconsin Genetics Software Package的版本10中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生罚分和空位延伸罚分可以表述为选自0-200的整数。因此，例如，空位产生罚分和空位延伸罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。
GAP给出具有最佳比对的家族中的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因子：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了比对序列而最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评定为相似性。GCG Wisconsin Genetics Software Package的版本10中使用的评分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页))。
(c)在两个多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，应认识到，不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被其他具有相似的化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可以上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差异在于这类保守置换的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的方法是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的打分是例如如在程序PC/GENE(加利福尼亚州山景城的Intelligenetics公司(Intelligenetics，Mountain View，California))中所执行那样进行计算。
(d)本文所用的“序列同一性百分比”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。通过以下方式计算这种百分数：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
在杂交技术中，将已知的多核苷酸的全部或部分用作探针，该探针选择性地杂交至来自选定生物体的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段的群体(即基因组文库或cDNA文库)中存在的其他相应多核苷酸。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可用可检测基团(如32P)或任何其他可检测标记进行标记。因此，例如，杂交用探针可通过对基于babyboom多核苷酸的合成寡核苷酸进行标记来制备。制备杂交用探针和构建cDNA和基因组文库的方法通常是本领域已知的，并且在Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤)中有所公开。
例如，整个编码多核苷酸或其一个或多个部分可用作能够与相应的编码多核苷酸和信使RNA特异性杂交的探针。为实现在多种条件下的特异性杂交，这类探针包括在编码多核苷酸序列的特定家族当中独特的序列，且优选长度为至少约10个核苷酸，最优选长度为至少约20个核苷酸。这类探针可用来通过PCR从选定的植物扩增相应的编码多核苷酸。该技术可用于从所需植物分离出另外的编码序列或用作诊断测定法以确定编码序列在植物中的存在。杂交技术包括对平板DNA文库(噬菌斑或菌落)的杂交筛选；参见例如，Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤)。
这类序列的杂交可以在严格条件下进行。所谓“严格条件”或“严格杂交条件”意指探针与其靶标序列杂交的程度将可检测地大于与其他序列杂交的程度(例如比背景大至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，并且将在不同环境下不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶标序列(同源探测)。作为另一种选择，可以调节严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度小于约1000个核苷酸，最佳地长度小于500个核苷酸。
通常，严格条件将为那些其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的条件。严格条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃下用30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交和在0.5×至1×SSC中在55℃至60℃下洗涤。示例性的高严格性条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交和在0.1X SSC中在60至65℃下洗涤。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％SDS。杂交的持续时间通常少于约24小时，一般约4至约12小时。洗涤的持续时间将为至少足以达到平衡的时间长度。
特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以从Meinkoth and Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284(Meinkoth和Wahl，1984年，《分析生物化学》，第138卷，第267-284页)的公式近似获得：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm为50％的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。每1％的错配，Tm降低约1℃；因此，可以调节Tm、杂交、和/或洗涤条件以与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极端严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤；利用该公式、杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需程度的错配导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选的是增加SSC浓度以便可使用较高的温度。有关核酸杂交的详尽指导见Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2(Elsevier，New York)(Tijssen，1993，《生物化学和分子生物学实验技术-核酸探针杂交》，第I部分，第2章，爱思唯尔出版社，纽约)；以及Ausubel et al.，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)(Ausubel等人编辑，1995年，《分子生物学实验手册》，第2章，Greene Publishing and Wiley-Interscience出版社，纽约)。参见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤)。
可将本发明所公开的多核苷酸构建体引入宿主细胞中。所谓“宿主细胞”意指包含异源核酸序列的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。在一些例子中，宿主细胞是单子叶或双子叶植物细胞。在特定实施例中，单子叶宿主细胞是甘蔗宿主细胞。
可使用中间宿主细胞，例如以增加克隆载体的拷贝数和/或介导不同宿主细胞的转化。随着拷贝数增加，可分离极大数量的含有目标核酸的载体来引入进所需的植物细胞中。在一个实施例中，采用不会引起所述多肽在细菌中表达的植物启动子。
原核生物最常由各种大肠杆菌菌株代表。然而，也可以使用其他微生物菌株。在本文中定义为包括用于转录起始的启动子(任选具有操纵子)以及核糖体结合序列的常用原核控制序列，包括例如β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Chang et al.(1977)Nature 198：1056(Chang等人，1977年，《自然》，第198卷，第1056页))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel et al.(1980)Nucleic Acids Res.8：4057(Goeddel等人，1980年，《核酸研究》，第8卷，第4057页))和λ衍生P L启动子之类的常用启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake et al.(1981)Nature 292：128(Shimatake等人，1981年，《自然》，第292卷，第128页))。在转染进大肠杆菌中的DNA载体中包含选择标记也是有用的。这种标记的例子包括确定对氨苄青霉素、四环素或氯霉素的抗性的基因。
选择载体以使得能引入到适当的宿主细胞中。细菌载体通常是质粒或噬菌体起源的。将适当的细菌细胞用噬菌体载体颗粒转染或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，则将细菌细胞用质粒载体DNA转染。用于表达蛋白质的表达系统可用芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)和沙门氏菌(Salmonella)(Palva et al.(1983)Gene 22：229-235(Palva等人，1983年，《基因》，第22卷，第229-235页)；Mosbach et al.(1983)Nature302：543-545(Mosbach等人，1983年，《自然》，第302卷，第543-545页))进行。
提供了用于调控除草剂耐受性多核苷酸的表达的方法，其中提供了包含本发明所公开的多核苷酸构建体的宿主细胞，并且位点特异性重组酶的表达被诱导，从而切除所述切除盒并允许除草剂耐受性多核苷酸与其启动子的有效连接及除草剂耐受性多核苷酸的表达。
此类方法允许延迟除草剂耐受性多核苷酸的表达，直到除草剂选择更有效的发育时间点。
因此，还提供了用于选择除草剂耐受性植物细胞、诱导重组酶的表达以及使细胞群体与除草剂耐受性多肽赋予对其的耐受性的除草剂接触以便选择除草剂耐受性植物细胞的方法，其中提供了植物细胞群体，其中该群体内的至少一个植物细胞包含本发明所公开的多核苷酸构建体。
如本文所用，术语“植物细胞群体”可指下列任何一种：单独植物细胞的分组；单个组织、植物或植物部分内存在的植物细胞的分组；植物群体；来自相同植物或不同植物的植物组织的群体；来自相同植物或不同植物的种子的群体；或来自相同植物或不同植物的植物部分的群体。可使所提供的植物细胞、植物组织、植物或植物部分的群体与除草剂接触。作为另一种选择，可将所提供的植物细胞群体培养成植物组织群体或植物群体，然后使其暴露于除草剂。同样，可种植所提供的植物种子群体以产生植物群体，然后使其暴露于除草剂。
在一些实施例中，在诱导步骤之前、期间或之后将所提供的植物细胞群体培养成植物组织或植物的群体，然后使植物组织或植物的群体与除草剂接触。在这些实施例的一些中，在组织再生成植物期间使植物组织群体与除草剂接触，或使从植物组织群体再生的植物群体与除草剂接触。
在某些实施例中，所提供的植物细胞群体是未成熟或成熟种子群体。在这些实施例的一些中，在诱导步骤之前、期间或之后种植所提供的种子群体以产生植物群体，并且使植物群体与除草剂接触。在其中所提供的植物细胞群体是未成熟种子群体并且调控位点特异性重组酶的表达的诱导型启动子是干旱诱导型启动子的那些实施例中，干旱诱导型启动子响应于未成熟种子向成熟种子的成熟期间发生的自然干化而活化。
在其他实施例中，所提供的植物细胞群体是植物组织群体，并且在诱导步骤之前、期间或之后将这些植物组织培养成植物群体，然后使植物群体与除草剂接触。
在其他实施例中，所提供的植物细胞群体是植物群体。
在一些实施例中，包含本发明所公开的多核苷酸构建体的植物或植物部分的提供包括将多核苷酸构建体引入植物或植物部分中。
“引入”旨在意指以一定方式向生物体诸如植物或细胞呈递多核苷酸或多肽，使得序列可以进入生物体细胞内部或进入细胞自身。所述方法和组合物不取决于将序列引入生物体或细胞中的特定方法，只要多核苷酸或多肽可以进入生物体的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物或植物部分中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
“稳定转化”旨在意指引入植物中的核苷酸构建体整合到植物的基因组中，并能够由其后代继承。“瞬时转化”旨在意指多核苷酸被引入到植物中但没有整合到植物的基因组中，或者多肽被引入到植物中。
将多肽或多核苷酸序列引入到植物中的规程可根据要进行转化的植物或植物细胞的类型(单子叶植物或双子叶植物)而异。将多肽和多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway et al.(1986)Biotechniques 4：320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页))、电穿孔法(Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606(Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第5602-5606页)、农杆菌介导的转化(美国专利No.5,563,055和美国专利No.5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页))和弹道粒子加速(参见例如，美国专利No.4,945,050；美国专利No.5,879,918、美国专利No.5,886,244和No.5,932,782；Tomes et al.(1995)in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)(Tomes等人，1995年，载于《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg和Phillips编辑(施普林格，柏林))；McCabe et al.(1988)Biotechnology 6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页))以及Lec1转化(WO 00/28058)。还可参见Weissingeret al.(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年鉴》，第22卷，第421-477页)；Sanford et al.(1987)ParticulateScience and Technology 5：27-37(Sanford等人，1987年，《粒子科学和技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christou et al.(1988)Plant Physiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页)(大豆)；McCabe et al.(1988)Bio/Technology 6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物/技术》，第6卷，第923-926页)(大豆)；Finerand McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(Finer和McMullen，1991年，《体外细胞发育生物学》，第27P卷，第175-182页)(大豆)；Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(Singh等人，1998年，《理论和应用遗传学》，第96卷，第319-324页)(大豆)；Datta et al.(1990)Biotechnology 8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页)(水稻)；Klein et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉蜀黍)；Klein et al.(1988)Biotechnology 6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉蜀黍)；美国专利No.5,240,855、No.5,322,783和No.5,324,646；Klein et al.(1988)Plant Physiol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉蜀黍)；Fromm et al.(1990)Biotechnology 8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页)(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984)Nature 311：763-764(Hooykaas-Van Slogteren等人，1984年，《自然》，第311卷，第763-764页)；美国专利No.5,736,369(谷类)；Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(Bytebier等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；DeWet et al.(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman et al.(Longman，New York)，pp.197-209(De Wet等人，1985年，载于《胚珠组织的实验操作》，Chapman等人编辑(朗文出版社，纽约)，第197-209页)(花粉)；Kaeppler et al.(1990)Plant Cell Rep 9：415-418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)，以及Kaeppler et al.(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论和应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(晶须介导的转化)；D′Halluin et al.(1992)Plant Cell 4：1495-1505(D′Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔)；Li etal.(1993)Plant Cell Rep 12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页)，以及Christou and Ford(1995)Annals ofBotany 75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjoda et al.(1996)Nat Biotechnol 14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然-生物技术》，第14卷，第745-750页)(通过根瘤农杆菌转化玉蜀黍)；所有这些文献均以引用方式并入本文。
在具体实施例中，可使用多种瞬时转化方法将多核苷酸构建体提供给植物。此类瞬时转化方法包括但不限于直接将多核苷酸构建体引入植物中。这类方法包括例如微注射或粒子轰击。参见例如Crossway et al.(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185(Crossway等人，1986年，《分子遗传学和基因组学》，第202卷，第179-185页)；Nomura et al.(1986)Plant Sci.44：53-58(Nomura等人，1986年，《植物科学》，第44卷，第53-58页)；Hepler et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180(Hepler等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第2176-2180页)和Hush etal.(1994)J Cell Sci 107：775-784(Hush等人，1994年，《细胞科学杂志》，第107卷，第775-784页)，所有这些文献都以引用方式并入本文。作为另一种选择，可使用本领域已知的技术将多核苷酸构建体瞬时转化到植物中。这类技术包括病毒载体系统以及将多核苷酸以避免该DNA随后释放的方式进行的沉淀。因此，可能从粒子结合的DNA发生转录，但将它释放出来以整合到基因组中的频率大大降低。这种方法包括使用包被有聚乙基亚胺(PEI；Sigma#P3143)的粒子。
在其他实施例中，可通过使植物或植物部分与病毒或病毒核酸接触，而将多核苷酸构建体引入植物或植物部分中。一般来讲，这类方法涉及将核苷酸构建体整合到病毒DNA或RNA分子内部。已经认识到，由多核苷酸构建体的各种编码多核苷酸所编码的蛋白质可被初始合成为病毒多蛋白的一部分，该病毒多蛋白随后可通过体内或体外蛋白分解进行加工，从而产生所需的重组蛋白质。此外，已经认识到，启动子还涵盖用于通过病毒RNA聚合酶进行的转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如美国专利No.5,889,191、No.5,889,190、No.5,866,785、No.5,589,367、No.5,316,931，以及Porta et al.(1996)Molecular Biotechnology5：209-221(Porta等人，1996年，《分子生物技术》，第5卷，第209-221页)；这些专利和文献以引用方式并入本文。
可使用将多核苷酸引入植物或植物部分中的其他方法，包括质体转化方法以及用于将多核苷酸引入来自籽苗或成熟种子的组织中的方法。
用于在植物基因组中特定位置处定向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，使用位点特异性重组系统，实现在所需的基因组位置处插入多核苷酸。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，所有这些专利以引用方式并入本文。简而言之，可将多核苷酸包含在转移盒中，该转移盒旁侧带有两个不发生重组的重组位点。将转移盒引入到在其基因组中稳定掺入了这样的靶标位点的植物或植物部分中，该靶标位点旁侧带有两个对应于该转移盒的所述位点的不发生重组的重组位点。提供适当的重组酶并且将所述转移盒整合在靶标位点处。多核苷酸构建体因此整合在植物基因组中的特定染色体位置。
转化的细胞可以根据常规方式培育成植株。参见例如McCormick et al.(1986)Plant Cell Rep 5：81-84(McCormick等人，1986年，《植物细胞报道》，第5卷，第81-84页)。然后可以培育这些植株，用相同的转化株系或者不同的株系授粉，并鉴定出具有所需表型特征的组成型表达的所得杂交体。可以培育两代或更多代以确保稳定保持和遗传所需表型特征的表达，然后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。这样，提供了具有稳定整合到其基因组中的核苷酸构建体例如表达盒的转化种子(也称为“转基因种子”)。因此，本发明的组合物包括包含本发明所公开的多核苷酸构建体的植物细胞、植物组织、植物部分和植物。同样，本发明的方法可在植物细胞、植物组织、植物部分和植物中进行。
在某些实施例中，本发明所公开的多核苷酸构建体可与目标的多核苷酸序列的任何组合进行堆叠，以产生具有所需性状的植物。本文所用的性状是指衍自特定序列或序列群组的表型。具有各种堆叠的性状组合的植物可通过任何方法来产生，包括但不限于通过任何常规方法或顶交(TopCross)方法或遗传转化来对植物进行杂交育种。如果序列通过遗传转化植株来堆叠，则目标的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。例如，可将包含一种或多种期望性状的转基因植物用作靶标，通过后续的转化引入更多性状。可以用共转化规程将性状与目标多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。在某些情况下，可能有利的是引入会抑制目标多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中生成所需的性状组合。还认识到，可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，所有这些专利以引用方式并入本文。
可转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目标植物物种的例子包括但不限于：玉米(Zea mays)、芸苔属(Brassica)物种(例如，甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea)，特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种)、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟(例如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicum miliaceum)、小米(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamustinctorius)、小麦(Triticum spp.)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotianatabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Oleaeuropaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏树(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦(Avena)、大麦(Hordeum)、拟南芥、柳枝稷、蔬菜、观赏植物、草和针叶树。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和香甘瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、朱槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipaspp.)、水仙(Narcissus spp.)、矮牵牛(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。
可用于实施本发明的针叶树包括(例如)松树如火炬松(Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、西黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西铁杉(Tsugacanadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；枞树(truefirs)如银枞(Abies amabilis)和胶枞(Abies balsamea)；以及雪松如西方红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。在具体实施例中，本发明的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、稷、烟草等等)。
甘蔗(Saccharum spp.)。在其他实施例中，植物是玉蜀黍、水稻、高粱、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草或柳枝稷。在具体实施例中，植物是甘蔗。
其他目标植物包括提供目标种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。目标种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、裸麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。荚果类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。
在某些实施例中，植物或植物部分是冬小麦植物或植物部分。如本文所用，“冬小麦”是指需要长时间低温才能开花的小麦植物或植物部分。冬小麦的非限制性例子包括普通小麦(Triticum aestivum)和一粒小麦。
如本文所用，术语“植物部分”是指植物细胞、植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块、在植物或植物部分中完好的植物细胞如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、籽粒、穗、穗轴、壳、秆、根、根尖、花粉囊等以及所述部分自身。谷粒旨在意指由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含所引入的多核苷酸。
还提供了用于增加转化效率的方法，其中提供了包含本发明所公开的多核苷酸构建体的宿主细胞，该多核苷酸构建体包含将编码除草剂耐受性多肽的多核苷酸与其启动子分隔开的切除盒，其中切除盒包含编码位点特异性重组酶的多核苷酸，所述位点特异性重组酶在被表达时可切除所述切除盒。在不存在除草剂耐受性多肽赋予对其的除草剂抗性的除草剂的情况下，将包含多核苷酸构建体的植物细胞群体培养足以使植物细胞群体增殖的一段时间，然后诱导位点特异性重组酶的表达，从而切除所述切除盒并允许除草剂耐受性多核苷酸与其启动子的有效连接，并且除草剂耐受性多核苷酸的表达允许直接除草剂选择，从而与不包含切除盒并且直接通过除草剂选择而选择的对比植物细胞相比，转化频率得到增加。在一些实施例中，除草剂是草甘膦。在一些实施例中，诱导包括干化所述植物细胞群体。在一些实施例中，诱导包括冷处理。
所谓“足以使细胞群体增殖的一段时间”旨在意指细胞群体已增殖到能产生最佳水平的转基因事件的尺寸和质量。足以使细胞增殖的时间段可根据植物物种、品种、外植体和增殖培养基而变化。在一些实施例中，在不存在除草剂耐受性多肽赋予对其的除草剂抗性的除草剂的情况下，将植物细胞群体培养约1小时至约12周、约1天至约12周、约1周至约12周、或约1周至6周，包括但不限于约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周和12周。在其他实施例中，在不存在除草剂耐受性多肽赋予对其的除草剂抗性的除草剂的情况下，在切除前，将植物细胞群体培养约1天至约6周、约1天至约2周、约1天至约4周、约2天至约6周、约4天至约6周、约1周至约6周、约2周至约6周、约2周至约4周、或约2周至约3周。
“转化频率”是指在对细胞执行转化规程以引入核酸之后被异源核酸成功转化的植物细胞的百分比。在一些实施例中，转化还包括选择规程以选择那些正表达被目标异源核酸所编码的一种或多种蛋白质的细胞。在一些实施例中，转化利用“载体”，该载体是被设计用于转化到宿主细胞中的核酸分子。
如本文所用，增加的“转化频率”是指任何改善，诸如转化频率的增加、增加的质量事件频率、节省劳力和/或通过减少所需的资源量使影响转化过程总体效率的人类工程学影响降低。
一般来讲，在使用本文教导的方法之后，与对照相关的转化频率相比，转化频率增加至少约3％、5％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更大，或甚至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更大。“对照”提供了用于测量受试植物或植物细胞的表型(例如转化频率/效率、愈伤组织质量或转化过程时间)的变化的参考点。对照可包括例如用不含切除盒的对应核酸转化的植物细胞。
在某些实施例中，可用于本发明所公开的方法和组合物中的植物或植物部分是顽拗型。如本文所用，“顽拗型植物”或“顽拗型植物部分”是使用典型转化方法的平均转化频率相对较低且通常小于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％或30％的植物或植物部分。相对于一种或多种转化方法(例如，农杆菌介导的转化)而言，与非顽拗型变种的转化相比，难于转化的物种、变种或品种的转化是耗时、费力且低效的。难于进行农杆菌介导的转化的物种的非限制性例子包括但不限于黑麦草属(Lolium)的物种(黑麦草)、玉蜀黍的优良变种、甘蔗的品种、水稻的物种(尤其是籼稻)以及各种草坪草物种。在一些实施例中，顽拗型植物或植物部分无法在不存在细胞增殖因子的情况下进行转化。在某些实施例中，顽拗型植物或植物部分是优良玉蜀黍自交系或其细胞或组织。在其他实施例中，顽拗型植物或植物部分是甘蔗品种CP96-1252、CP01-1372、CPCL97-2730、HoCP85-845或CP89-2143或其细胞或组织。
在本发明方法的一些实施例中，顽拗型植物部分是来自模式或顽拗型自交系或品种的外植体。在本发明方法和组合物的一些实施例中，外植体来自具有I型愈伤组织基因型的顽拗型自交系。在本发明方法和组合物的一些实施例中，外植体来自具有I型愈伤组织基因型的顽拗型玉蜀黍自交系。可基于颜色、质地、再生系统和愈伤组织起始所需的时间量，将草类愈伤组织分类为I型或II型。愈伤组织的形态已在农艺上重要的单子叶植物作物中报道并描述，诸如玉蜀黍(Armstrong et al.(1985)Planta 164：207-214(Armstrong等人，1985年，《植物学》，第164卷，第207-214页)；Assam(2001)Arab J Biotechnol 4：247 256(Assam，2001年，《阿拉伯生物技术杂志》，第4卷，第247-256页)；Frame et al.(2000)In Vitro Cell DevBiol-Plant 36：21-29(Frame等人，2000年，《体外细胞与发育生物学-植物》，第36卷，第21-29页)；Lu et al.(1982)L.Theor Appl Genet 62：109-112(Lu等人，1982年，《理论和应用遗传学》，第62卷，第109-112页)；McCain et al.(1988)Bot Gazette 149：16-20(McCain等人，1988年，《植物学杂志》，第149卷，第16-20页)；Songstad et al.(1992)Am J Bat79：761-764(Songstad等人，1992年，《美国植物学杂志》，第79卷，第761-764页)；Welter et al.(1995)Plant Cell Rep 14：725-729(Welter等人，1995年，《植物细胞报道》，第14卷，第725-729页)；所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文)、水稻(Chen et al.(1985)Plant Cell TissueOrgan Cult 4：51-51(Chen等人，1985年，《植物细胞、组织和器官培养》，第4卷，第51-51页)；Nakamura et al.(1989)Japan J Crop Sci58：395-403(Nakamura等人，1989年，《日本作物科学杂志》，第58卷，第395-403页)；Rueb et al.(1994)Plant Cell Tissue Organ Cult 36：259-264(Rueb等人，1994年，《植物细胞、组织和器官培养》，第36卷，第259-264页)；所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文)、高粱(Jeoung et al.(2002)Hereditas 137：20-28(Jeoung等人，2002年，《遗传》，第137卷，第20-28页)；该文献全文以引用方式并入本文)、甘蔗(Guiderdoni et al.(1988)Plant Cell Tissue Organ Cult 14：71-88(Guiderdoni等人，1988年，《植物细胞、组织和器官培养》，第14卷，第71-88页)；该文献全文以引用方式并入本文)、小麦(Redway et al.(1990)Theor Appl Genet 79：609-617(Redway等人，1990年，《理论与应用遗传学》，第79卷，第609-617页)；该文献全文以引用方式并入本文)以及各种非食品草。I型愈伤组织是单子叶植物物种中形成的典型且最普遍的愈伤组织。其特征在于形态紧凑、生长缓慢、颜色呈白色至浅黄色、以及高度组织化。该愈伤组织几乎完全由不含大液泡的胞质分生细胞组成。在玉蜀黍中，I型愈伤组织仅可维持数月并且不能用于悬浮培养；而II型愈伤组织可在培养物中长时间维持并且能够形成细胞悬浮液。来源于玉蜀黍的II型愈伤组织已被描述为柔软、松散、生长快速和极强再生性，但通常以比I型愈伤组织更低的频率形成。胚发生悬浮细胞可从II型愈伤组织起始，很少玉蜀黍品系可形成II型愈伤组织。虽然形成II型愈伤组织的能力可回交到农艺上重要的玉蜀黍品系中，但实际上这是耗时且困难的。此外，即使对于可形成II型愈伤组织的那些品系而言，所述方法也需要大量时间和劳力，因此不切实际。通常，产生I型愈伤组织的顽拗型自交系或品种基因型具有较低转化频率。通常对于玉蜀黍I型自交系而言，必须筛选大量胚或其他外植体以鉴定足够数量的事件，这是昂贵且耗费劳力的。
应当注意，术语“一个”或“一种”实体是指该实体的一者或多者；例如，“多核苷酸”应理解为表示一个或多个多核苷酸。同样地，术语“一个”(或“一种”)、“一(个)种或多(个)种”和“至少一(个)种”在本文中可互换使用。
在本说明书和权利要求书全文中，措辞“包含”、“含有”和“包括”以非排他的意义使用，除非其中语境中有别的要求。
本文所用的术语“约”当指值时，意在涵盖偏离指定的量达，在一些实施例中，±50％的偏差，在一些实施例中，±20％的偏差，在一些实施例中，±10％的偏差，在一些实施例中，±5％的偏差，在一些实施例中，±1％的偏差，在一些实施例中，±0.5％的偏差，在一些实施例中，±0.1％的偏差，只要这种偏差适于执行所公开的方法或采用所公开的组合物。
另外，在量、浓度或其他值或参数以范围(优选范围)或上限优选值和下限优选值列表给出时，这应该理解为具体地公开了由任何范围上限或上限优选值和任何范围下限或下限优选值的任何配对形成的所有范围，而无论是否单独公开了这些范围。如果本文中叙述了数值的范围，除非另外指明，否则该范围旨在包括它们的端点，以及该范围内的所有整数和分数。当限定范围时，无意于使本发明所公开的主题的范围受限于所叙述的具体值。
以下实例以示例性方式而不是以限制性方式提供。
实验
实例1转化的玉蜀黍自交系PHR03的草甘膦选择
在授粉后9-13天收获来自玉蜀黍自交系PHR03的未成熟胚，其中胚尺寸在0.8-2.5mm长的范围内，并将这些未成熟胚与包含载体PHP29204的农杆菌菌株LBA4404或包含载体PHP32269的农杆菌菌株LBA4404在PHI-T培养基上于黑暗条件共培养2-4天。PHP29204：Ubi：DsRed+Ubi：GAT4602。PHP32269：Ubi：PMI+Ubi：MOPAT：：YFP。Ubi是指玉蜀黍泛素启动子(UBI1ZM PRO；SEQ ID NO：111)、泛素5′UTR(UBI1ZM5UTR；SEQ ID NO：112)和泛素内含子1(UBIZM INTRON1；SEQ IDNO：113)。然后将组织转移到不含选择剂的DBC3培养基中培养一周，接着转移到含0.25mM或0.5mM草甘膦的DBC3培养基中培养3周，然后转移到含0.5mM草甘膦的DBC3培养基再培养3-4周。然后将胚转移到含0.1mM草甘膦的PHI-RF成熟培养基中培养2-3周，直到形成苗，此时，将苗转移到植物托盘(Phytatray)中含100mg/L头孢噻肟的MSB培养基中以便生根。将根部良好的植株转移到土壤以供进一步生长和草甘膦喷雾测试。对于使用PHP32269进行的PMI选择，使用含12.5g/L甘露糖和5g/L麦芽糖的DBC3培养基进行选择。使用不含任何选择剂或糖改良的PHI-RF成熟培养基进行再生。
PHI-T培养基包含MS盐4.3mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、肌醇100mg/L、2，4-D 2mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、L-脯氨酸700mg/L、MES 0.5g/L、乙酰丁香酮100μM、抗坏血酸10mg/L和琼脂8.0g/L中的0.1μM铜。
PHI-RF是4.3g/L MS盐(GIBCO BRL 11117-074)、0.5mg/L烟酸、0.1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆醇、2.0mg/L甘氨酸、0.1g/L肌醇、0.49μM硫酸铜、0.5mg/L玉米素(Sigma Z-0164)、1mg/L IAA、26.4μg/LABA、噻苯隆0.1mg/L、60g/L蔗糖、100mg/L头孢噻肟、8g/L琼脂，pH5.6。
表4.用PHP29204或PHP32269转化玉蜀黍自交系PHR03的转化频率
载体 胚数量 T0事件数量 转化％ 单拷贝事件数量 单拷贝事件％
PHP29204 300 21 7 13 61.9
PHP32269 90 36 40 16 44.4
使用PHP29204和草甘膦选择的转化频率在玉蜀黍自交系PHR03中仅为7％。总之，草甘膦选择未实现洁净的选择，大量未转化的组织生长，并且转化和未转化的组织的形态均不规则。
实例2.使用不含发育基因的标准测试载体进行的农杆菌介导的甘蔗转 化
用于植物转化的培养基：
液体DBC3(M5G)包含MS盐(4.3g/L)加麦芽糖(30g/L)；葡萄糖(5g/L)；盐酸硫胺素(1mg/mL)；肌醇(0.25g/L)；N-Z-胺-A(酪蛋白水解产物)(1g/L)；脯氨酸(0.69g/L)；CuSO4(4.9μM)；2，4-D(1.0mg/L)；BAP(0.5mg/L)；用双蒸水将体积调至1L；pH 5.8-用1M KOH调节pH；高压灭菌。
DBC3包含MS盐(4.3g/L)加麦芽糖(30g/L)；盐酸硫胺素(1mg/mL)；肌醇(0.25g/L)；N-Z-胺-A(酪蛋白水解产物)(1g/L)；脯氨酸(0.69g/L)；CuSO4(4.9μM)；2，4-D(1.0mg/L)；BAP(0.5mg/L)；用双蒸水将体积调至1L；pH5.8-用1M KOH调节pH；植物凝胶(3.5g/L)；高压灭菌。
DBC6包含MS盐(4.3g/L)加麦芽糖(30g/L)；盐酸硫胺素(1mg/mL)；肌醇(0.25g/L)；N-Z-胺-A(酪蛋白水解产物)(1g/L)；脯氨酸(0.69g/L)；CuSO4(4.9μM)；2，4-D(0.5mg/L)；BAP(2.0mg/L)；用双蒸水将体积调至1L；pH 5.8-用1M KOH调节pH；植物凝胶(3.5g/L)；高压灭菌。
MSB包含MS盐和维生素(4.43g/L)加蔗糖(20g/L)；肌醇(1.0g/L)；吲哚-3-丁酸(IBA，0.5mg/L)；用双蒸水将体积调至1L；pH 5.8-用1MKOH调节pH；植物凝胶(3.5g/L)；高压灭菌。
农杆菌悬浮液的制备：
将来自-80°冻存等分试样的携带双元载体的根瘤农杆菌划线到包含适当抗生素的固体PHI-L或LB培养基上，并在28℃下于黑暗中培养2-3天。从母板挑取单一菌落或多个菌落，并划线到包含PHI-M培养基的平板上，并在28℃下于黑暗中温育1-2天。从使用5mL 10mM MgSO4培养基(农杆菌侵染培养基)加100μM乙酰丁香酮的固体培养基收集农杆菌细胞。将1mL悬浮液转移到分光光度计管并且使用相同培养基将悬浮液的OD500nm调节至550nm下的0.35-0.40。
农杆菌侵染和共培养：
将从体外培养的小植株诱导的良好质量愈伤组织收集在空培养皿中并暴露于层流罩中的空气约30分钟。短于2月龄的组织被认为对于转化是理想的。将1mL农杆菌悬浮液加入培养皿中，将组织破碎或切成小片，然后加入另外1-3mL农杆菌(AGL1)悬浮液以覆盖所有组织。将培养皿放置在透明的聚碳酸酯干燥器容器中，将容器盖上并连接到内部真空系统20分钟。侵染之后，从培养皿倒掉农杆菌悬浮液，并且将组织转移到新培养皿的2层VWR 415滤纸(7.5cm直径)上，并根据收集的组织的量加入0.7-2.0mL液体DBC3(M5G)培养基加100μM乙酰丁香酮以便共培养。将包含侵染组织的滤纸的顶层转移到另一个新培养皿中新的一层滤纸上。将侵染组织在21℃下于黑暗中温育3天。
选择和植物再生：
将愈伤组织转移到包含抗生素(特美汀和头孢噻肟)和3mg/L双丙氨膦(日本东京的明治制果株式会社(Meiii Seika，Tokyo，Japan))的第一轮选择DBC3中。将组织转移到包含抗生素和3-5mg/L双丙氨膦的第2轮选择DBC6中并在26-28℃于黑暗或弱光条件下继代培养3周。在包含抗生素和双丙氨膦的DBC6培养基上进行第3轮选择时，将组织破碎成小片并暴露于强光条件(30-150μmol m-2s-1)2-3周。将苗伸长的组织破碎成小片并转移到包含抗生素和3mg/L双丙氨膦的MSB再生/生根培养基中。分离单棵小植株并转移到土壤。
表5示出了使用7种美国甘蔗品种的转化实验的结果。使用包含DsRED和PAT(或moPAT)的标准载体时，CP89-2376和CP88-1762在T0植株水平具有＞100％转化频率，而其余5种品种CP96-1252、CP01-1372、CPCL97-2730、HoCP85-845和CP89-2143是难于转化的。
表5.使用标准测试载体时7种美国甘蔗品种中的T 0 植株水平的转化频 率。
CP96-1252 CP01-1372 CP89-2376 CPCL97-2730 HoCP85-845 CP89-2143 CP88-1762
n.t.* n.t. 75.0％(6/8) n.t. n.t. n.t. n.t.
0％(0/8) 0％(0/8) 100.0％(8/8) 0％(0/8) n.t. n.t. n.t.
n.t. n.t. 87.5％(7/8) n.t. n.t. n.t. n.t.
n.t. n.t. 150.0％(12/8) n.t. 0％(0/8) n.t. n.t.
n.t. n.t. n.t. n.t. n.t. 0％(0/8) 62.5％(5/8)
n.t. n.t. 100.0％(8/8) n.t. n.t. 0％(0/8) 137.5％(11/8)
n.t. n.t. 187.5％(15/8) n.t. n.t. n.t. 137.5％(11/8)
转化频率＝(转基因事件数/用农杆菌侵染的外植体数)×100％
*n.t.：未测试
转基因事件的确认：
根据可见RFP标记基因表达来鉴定推定的稳定愈伤组织/绿色组织/再生植物。将所有这些推定的转基因愈伤组织转移到用于在标准再生条件下再生植物的培养基中。根据分子分析诸如PCR和DNA印迹杂交来确定稳定转化频率的最终确认。
实例3.使用发直基因(DevGene)载体PHP35648的甘蔗转化和切除测试
最初将具有BBM/WUS基因盒的DevGene双元载体(PHP35648，图1)与包含PAT或moPAT加DsRED而不含BBM/WUS基因盒的标准载体对于使用两种农杆菌菌株AGL1和LBA4404在品种CP89-2376和顽拗型品种CP01-1372中的转化频率进行比较(表6)。DevGene双元载体包含Ubi：：LoxP：：CFP+Rab17Pro-attb1：：Cre+Nos：：ZmWUS2+Ubi：：ZmBBM-LoxP：：YFP+Ubi：：MOPAT(图1)；每个基因盒具有3′终止子。可通过受Rab17启动子控制的Cre重组酶切除包含CFP：：Cre：：WUS：：BBM的Lox盒。PHP35648载体被设计成使用可视化标记来显示切除盒的切除效率。PHP35648切除盒包含青色荧光蛋白(CFP)，其受控于泛素启动子(包含玉蜀黍泛素启动子(UBI1ZM PRO；SEQ ID NO：111)、泛素5′UTR(UBI1ZM 5UTR；SEQ ID NO：112)和泛素内含子1(UBIZMINTRON1；SEQ ID NO：113))，该启动子处在位于切除盒旁侧的loxP位点外部(参见图1)。可通过青色荧光蛋白(CFP)的存在来目测鉴定包含切除盒的转化子。当切除盒被切除时，黄色荧光蛋白(YFP)在泛素启动子的调控下表达。可通过黄色荧光蛋白(YFP)的存在来目测鉴定不含切除盒的转化子。青色荧光蛋白(CFP)与黄色荧光蛋白(YFP)的比率可用于表示切除效率。在PHP35648中，控制moPAT基因产物的表达的泛素启动子包括在切除盒的外部作为阳性选择，以减少逸出种的数量。
将所有5种甘蔗品种的愈伤组织在DBC3培养基上诱导和维持。用包含DevGene双元载体PHP35648的农杆菌在液体10mM MgSO4加100μM乙酰丁香酮中侵染组织，然后用液体DBC3(M5G)培养基加100μM乙酰丁香酮在培养皿中的滤纸上于21℃在黑暗中共培养。共培养后三天，将组织转移到含100mg/L头孢噻肟和150mg/L特美汀的DBC3(对于AGL1而言)中以及含100mg/L羧苄青霉素的DBC3(对于LBA4404而言)中，并且在26℃(±1℃)下于黑暗或弱光中温育3-7天。然后，将组织转移到与之前步骤相同的培养基中并加入3或5mg/L双丙氨膦。在2至3周后，将组织转移到含抗生素和3-5mg/L双丙氨膦的第2轮选择DBC6中。从实验开始起两个月后，通过将显示出CFP表达部分的组织的数量除以被农杆菌侵染的外植体的数量来计算转化频率。在CP89-2376和CP01-1372两者中AGL1的转化效率大于LBA4404(表6，第1和2行)。在转化频率方面也存在基因型差异；使用这两种农杆菌菌株中的任一种时，CP89-2376品种具有比顽拗型品种CP01-1372高得多的转化频率。
还使用包含DevGene双元载体PHP35648的AGL1在另一组四个实验(表6，第3-6行)中利用5种不同品种(CP96-1252、CP01-1372、CP89-2376、CPCL97-2730和HoCP85-845)测试甘蔗种质筛选。将测试的所有5种品种的愈伤组织在DBC3培养基上诱导和维持，并且用包含发育基因双元载体PHP35648的AGL1侵染组织。发育基因的使用显著增加了测试的所有5种品种中的转化频率。使用标准双元载体时最顺应品种CP89-2376中的转化频率平均为116.7％(56/48)(表6)。相比之下，使用DevGene双元载体PHP35648时，来自5个实验的CP89-2376中的平均转化频率为＞2,512.5％(＞1,005个事件/40个侵染组织)(参见表6，第2-6行)。在顽拗型品种CP96-1252、CP01-1372、CPCL97-2730和HoCP85-845中也观察到转化频率的增加；其中使用AGL1时转化频率在62.5％至1250.0％的范围内，而使用不含BBM/WUS基因盒的标准载体时未从这些品种获得转基因事件(表6，第7行)。
表6.使用BBM/WUS发育基因载体PHP35648时甘蔗中的转化频率
每个转化处理具有8片0.4-0.5cm大小的愈伤组织。
DGa：含BBM/WUS基因盒的发育基因载体
Stdb：不含BBM/WUS基因盒的标准载体
n.t.c：未测试
通过可视化标记监测干化引起的LoxP盒的切除
将转基因愈伤组织在干燥滤纸上干化一天以诱导由Rab17启动子驱动的Cre重组酶切除包含CFP：：Cre：：WUS：：BBM的Lox盒(图1)。通过因存在作为切除的结果而形成的UBI：loxP：YFP连接，观察到干化转基因愈伤组织事件上的YFP表达，以此来监测切除(图1)。87个转基因事件中有83个(95.4％)发生了Cre切除(表7)。将来自切除后的一些转基因事件的植株在MSB加1-3mg/L双丙氨膦和抗生素上再生。
表7.干化引起的转基因甘蔗事件中的BBM/WUS基因盒的切除效率。
DGa：含BBM/WUS基因盒的发育基因(DevGene)载体PHP35648
实例4.使用发直基因(DevGene)载体PHP54561生成的转化愈伤组织/绿 色组织事件的甘蔗切除诱导和植物再生
转基因事件的生成：
如图2所述设计含BBM/WUS基因盒的新DevGene双元载体PHP54561。DevGene双元载体PHP54561包含Ubi：：LoxP-moPAT+Ubi：YFP+Rab17Pro-attb1：Cre+Nos：ZmWUS2+Ubi：ZmBBM-LoxP：：GLYAT(图2)；每个基因盒具有3′终止子。可通过受Rab17启动子控制的Cre重组酶切除包含moPAT+Ubi：YFP+Rab17Pro-attb1：Cre+Nos：ZmWUS2+Ubi：ZmBBM的Lox盒。PHP54561切除盒被设计成直接通过草甘膦耐受性来测试切除效率(参见图2)。黄色荧光蛋白(YFP)包括在PHP54561切除盒中作为可视化标记并且moPAT作为切除之前的选择标记(参见图2)。Ubi是指玉蜀黍泛素启动子(UBI1ZM PRO；SEQ ID NO：111)、泛素5′UTR(UBI1ZM 5UTR；SEQ ID NO：112)和泛素内含子1(UBIZM INTRON1；SEQ ID NO：113)。
将两种美国甘蔗品种CP88-1762、CP01-1372和1种澳大利亚品种KQ228的愈伤组织在DBC3或DBC6培养基上诱导和维持。用包含DevGene双元载体PHP54561的农杆菌在液体10mM MgSO4加100μM乙酰丁香酮中侵染组织，然后用液体DBC3(M5G)培养基加100μM乙酰丁香酮在培养皿中的滤纸上于21℃在黑暗中共培养。共培养后三天，将CP88-1762/CP01-1372和KQ228的组织转移到分别包含100mg/L头孢噻肟和150mg/L特美汀的DBC3和DBC6中，并且在26℃(±1℃)下于黑暗或弱光中温育3-7天。然后，将组织转移到与之前步骤相同的培养基中并加入3或5mg/L双丙氨膦。在2至3周后，将组织转移到含抗生素和3-5mg/L双丙氨膦的第2轮选择DBC6中。将YFP表达部分转移到相同培养基中以进行增殖。从实验开始起两个月后，通过将显示出YFP表达部分的组织的数量除以被农杆菌侵染的外植体的数量来计算转化频率。表8展示了3种甘蔗品种中在T0组织水平的转化频率。顺应品种CP88-1762具有405％的转化率。两种顽拗型品种CP01-1372和KQ228也具有高转化频率，分别为885％和130％。
表8.在切除前进行双丙氨膦选择的甘蔗中T 0 组织水平的转化频率。
品种 Txn频率(％)
CP01-1372* 270％(27/10)
CP01-1372* 1500％(150/10)
Total 885％(177/20)
CP88-1762 400％(40/10)
CP88-1762 410％(41/10)
Total 405％(81/20)
KQ228* 10％(1/10)
KQ228* 250％(25/10)
Total 130％(26/20)
*CP01-1372和KQ228是顽拗型商业品种。
干化引起的LoxP盒的切除以及在草甘膦选择下的植物再生：
将转基因组织(直径为0.3-0.5mm)转移到空的60mm×25mm培养皿中，该培养皿装有一张灭菌玻璃滤纸(VWR玻璃微纤维滤纸，691)。用盖子盖上培养皿并放置在带有紧密密封盖的容器中。将盖子打开的含约20mL灭菌水的培养皿(或烧杯)放置在容器中。将容器保持在28℃的黑暗培养室中1-2.5天；干化时间段取决于组织的程度或尺寸。在干化处理1-2.5天后，将干化组织转移到含抗生素和100μM草甘膦的DBC6增殖培养基中。将平板保持在26-28℃下弱光(10-50μmol m-2s-1)至中等强光中2-3周(图3)。如有必要，将组织在相同培养基上再进行另一轮继代培养2-3周以获得绿色小苗；将平板保持在26-28℃下较高强度的光中。挑取带有苗的组织，并放置在作为胶凝剂的A175琼脂(植物技术实验室(PhytoTechnology Lab))中包含抗生素和20-30μM草甘膦的MSB再生/生根培养基上。将组织在26-28℃下在强光条件(50-200μmol m-2s-1)下培养3-4周。当苗足够壮时，分离单棵小植株并转移到土壤。一般来讲，切除完全的植株表现出正常表型且更绿、生长更快速，而来自未切除发育基因或切除不完全的组织的小植株通常显示出矮化表型或白化苗，表明易受草甘膦影响(图4和图5)。将具有正常表型的植株转移到土壤以供进一步生长、草甘膦喷雾测试和分子测定。
表9示出了3种甘蔗品种CP88-1762、CP01-1372和KQ228的转基因事件中基于这些事件的草甘膦抗性的LoxP盒切除效率。在这3种品种中切除效率在32％至68％的范围内。
表9.在转基因甘蔗事件的草甘膦选择下干化引起的切除效率。
*切除前的双丙氨膦选择
通过草甘膦喷雾测试进行的草甘膦抗性确认：
然后将T0小植株移到土壤中，并且用4×草甘膦进行喷雾测试以确认切除/草甘膦抗性。来自3种甘蔗品种的所有72个独立的T0事件(表9)显示出强效草甘膦抗性，而3种非转基因品种的植株被草甘膦喷雾完全杀死。根据分子分析诸如PCR和DNA印迹杂交来确定稳定转化频率的最终确认。
实例5.干化T 1 未成熟胚的玉米切除诱导和植物再生
玉米转化：
用包含切除载体PHP54353的农杆菌菌株AGL1转化玉米优良自交系PHR03。PHP54353载体包含Ubi：：LoxP-Ds RED+Rab17-attB：：CRE-LoxP：：GLYAT(图6)。可通过受Rab17启动子控制的Cre重组酶切除包含Ds RED+Rab17-attB：：CRE的Lox盒。PHP54353切除盒被设计成证实直接草甘膦选择。Ubi是指玉蜀黍泛素启动子(UBI1ZM PRO；SEQ ID NO：111)、泛素5′UTR(UBI1ZM 5UTR；SEQ ID NO：112)和泛素内含子1(UBIZM INTRON1；SEQ ID NO：113)。
在授粉后9-13天收获来自玉蜀黍自交系PHR03的未成熟胚，其中胚尺寸在0.8-2.5mm长的范围内，并将这些未成熟胚与包含切除载体PHP54353的农杆菌菌株AGL1在PHI-T培养基上于黑暗条件共培养3天。然后在弱光条件下将这些胚转移到包含100mg/L头孢噻肟的DBC3培养基中。挑取RFP表达部分并且在相同培养基上增殖。当每个转基因事件的组织增殖时间足够时，将组织移到PHI-RF成熟培养基中。将再生苗转移到植物托盘中包含100mg/L头孢噻肟的MSB培养基中以便生根。将具有良好根部的植株转移到土壤以供进一步生长、草甘膦喷雾测试和分子测定。
PHI-T培养基包含MS盐4.3mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、肌醇100mg/L、2，4-D 2mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、L-脯氨酸700mg/L、MES 0.5g/L、乙酰丁香酮100μM、抗坏血酸10mg/L和琼脂8.0g/L中的0.1μM铜。
PHI-RF是4.3g/L MS盐(GIBCO BRL 11117-074)、0.5mg/L烟酸、0.1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆醇、2.0mg/L甘氨酸、0.1g/L肌醇、0.49μM硫酸铜、0.5mg/L玉米素(Sigma Z-0164)、1mg/L IAA、26.4μg/LABA、噻苯隆0.1mg/L、60g/L蔗糖、100mg/L头孢噻肟、8g/L琼脂，pH5.6。
未成熟胚分离、干化、选择和再生：
将2.0-3.5mm的灭菌未成熟胚以盾片侧朝下的方式放置在培养皿中的无菌玻璃纤维滤纸上。将300μL含100mg/L头孢噻肟的DBC6液体培养基加入到滤纸上以防止过度干燥。用封口膜缠绕平板，并在干化之前检查DsRed的表达以便比较干化后的表达。将平板移到无菌层流罩中，拆开并使之静置2-4天直到胚显得更暗且收缩为止，并进行干化。然后将胚以盾片侧朝下的方式放置在包含100mg/L头孢噻肟及用于选择的10-50μM草甘膦的MSA再生培养基上。5至10天后，在发出的苗中检查DsRed表达。
实例6.转基因成熟玉米种子中的自然干化和切除
用切除载体AGL1/PHP54353转化玉蜀黍自交系PHR03的未成熟胚，目测确认DsRed的表达，并且如实例5所述那样使T0小植株再生。在将T0小植株移到土壤之前，再次目测确认DsRed的表达。
草甘膦抗性确认
为了确认在种子成熟期间发生的自然干化过程实际上会允许DsRed的切除和对草甘膦的抗性，使从与野生型PHR03花粉杂交的T0植株收集的种子在土壤中萌发。通过将种子直接播种到土壤中而不进行任何处理，切除将是自然过程的结果。
选择三个随机事件以通过该方法进行测试。将各来自下列事件PHP54353 T0事件编号6、7和10的五个成熟T1种子置于装有Metro Mix土壤(加利福尼亚州麦克法兰的阳光园艺公司(Sun Gro Horticulture，McFarland，CA))且施有肥料的小盆中，并且放置于温室中。在植株萌发并生长到约12-18cm(种植后10-12天)后，然后用草甘膦+表面活性剂以2×或4×浓度(1×等于田间所用浓度)对植株喷雾。在喷雾前，使所有盆均匀地间隔和定位以确保它们接收到均匀分布的草甘膦。喷雾器喷嘴与植株顶端分生组织之间的距离为大约18英寸。在10-12天内，可明显看出哪些植株不受除草剂影响以及哪些植株严重受损。
喷雾测试的结果在表10中给出。根据可见喷雾测试结果，正如预测，所有野生型PHR03植株都严重受损。还明显的是，来自事件编号6的4个植株中的2个没有损伤迹象，并且继续以正常速率生长，任何叶组织均未损失。然而，来自事件编号7的所有5个植株确实显示出等同于野生型PHR03植株的损伤，这是始料未及的。来自事件编号10的所有4个植株也显示出等同于野生型PHR03植株的损伤。当分析T0植株的DsRED和GLYAT基因的存在时，发现事件编号10不具有DsRED基因，并且虽然T0植株具有GLYAT基因，但据推测，GLYAT未被表达，因为其未有效连接到启动子(参见表10)。在事件编号13中，5个植株中有3个显示出损伤，并且5个植株中有2个具有耐受性。
表10.对由T 1 成熟玉米种子所萌发的植株的草甘膦喷雾测试
实例7.转化组织事件的烟草切除诱导和植物再生
烟草转化
从体外培养的烟草植株收获幼叶，并切成0.5-1cm尺寸作为农杆菌侵染靶标。AGL1/PHP55062(标准切除载体，图8)用于转化。转基因烟草(Petite havana品种)植株按照Horsch et al.(1985)Science 227：1229-1231(Horsch等人，1985年，《科学》，第227卷，第1229-1231页)所述的叶盘法生成，该文献全文以引用方式并入本文，并且50mg/L潮霉素B用于选择。
干化引起的LoxP盒的切除以及在草甘膦选择下的植物再生
进行烟草干化实验以从转化组织事件诱导切除，并且使转化的植物再生。一旦来自具有可视化标记表达的每个事件的组织在含潮霉素的选择培养基上生长时达到足够尺寸，即可进行干化实验。将组织(直径为0.3-0.5mm)切片并转移到空的60mm×25mm培养皿中，该培养皿装有一张灭菌玻璃滤纸(VWR玻璃微纤维滤纸，691)。盖上培养皿并放置在带有紧密密封盖的容器中。将含15mL灭菌水的打开培养皿放置在容器中。将容器放置在28℃的黑暗培养室中。在干化处理2-3天后，将组织直接转移到含抗生素和20-50μM草甘膦且植物凝胶用作胶凝剂的再生培养基或选择培养基中在平板密封的情况下培养2-3周，以进行增殖和再生。将组织转移到含抗生素和20-50μM草甘膦的再生培养基中再培养2-4周以生成苗。将平板放置在26-28℃下较高强度的光中。当苗足够壮时，分离单棵小植株并转移到土壤。收集叶样品进行qPCR分析。
实例8.干化T 1 未成熟种子的烟草切除诱导和植物再生
分离来自转基因烟草植株的T1未成熟种子，用15％Clorox+2滴吐温20灭菌，并用高压灭菌水漂洗3次。将灭菌未成熟种子放置在培养皿中的无菌玻璃纤维滤纸上。盖上培养皿并移到无菌层流罩中，拆开并温育1-2天直到种子干化。然后将干化的未成熟种子放置在包含100mg/L头孢噻肟以及用于选择的20-50μM草甘膦的再生培养基上。1至2周后，在发出的苗中检查DsRed表达。已适当干化的未成熟种子具有很弱或没有DsRed表达，因为该基因已经由LoxP位点切除。未进行干化处理的转基因和非转基因种子均将在不含草甘膦的培养基上良好萌发，而它们两者在20-50μM草甘膦上时萌发将被完全抑制。在干化下成功经历了基因切除的未成熟种子将具有草甘膦抗性并且将在包含20-50μM草甘膦的培养基上再生。
将健康小植株转移到植物托盘中包含100mg/L头孢噻肟和20-50μM草甘膦的再生培养基中以供进一步选择和生长。
实例9.转基因成熟烟草种子的自然干化和切除
成熟种子灭菌、选择/再生：
将用AGL1/PHP55062转化的T1成熟烟草种子使用20％Clorox+2滴吐温20灭菌，并用高压灭菌水漂洗3次。然后将灭菌种子转移到包含100mg/L头孢噻肟以及用于选择的20-50μM草甘膦的再生培养基上。5-10天后，在发出的苗中检查DsRed表达。已被切除的种子不再具有DsRed表达，因为该基因已经由Lox P位点切割。成功切除了DsRed的那些种子将具有草甘膦抗性并且将在包含草甘膦的培养基上再生。一旦种子具有健康的苗和根形成，就将小植株移到土壤或植物托盘中包含100mg/L头孢噻肟的另一再生培养基且加有20或50μM草甘膦以供进一步选择和生长。
将干燥烟草T 1 种子直接播种到土壤中以及草甘膦抗性确认：
为了确认在种子成熟期间发生的自然干化过程实际上会允许DsRed的切除和对草甘膦的抗性，使从T0烟草植株收集的种子在土壤中萌发。通过将种子直接播种到土壤中而不进行任何处理，切除将为真实自然过程的结果。在植株萌发并生长到约10-15cm后，用草甘膦+表面活性剂以2×或4×浓度(1×等于田间所用浓度)对植株喷雾。在10-12天内，可明显看出哪些植株不受除草剂影响以及哪些植株严重受损。
实例10.转化组织事件的大豆切除诱导和植物再生
大豆转化：
将大豆(Jack品种)成熟种子灭菌并纵向地切半，并且将半粒种子用作农杆菌侵染靶标。包含PHP55062载体(标准切除载体，图8)的农杆菌菌株AGL1用于转化。作为另一种选择，经由如本文所述的农杆菌介导的转化或通过粒子枪轰击的方法(Klein et al.(1987)Nature，327：70(Klein等人，1987年，《自然》，第327卷，第70页)，该文献全文以引用方式并入本文)，用PHP55062载体转化大豆胚发生悬浮培养物。
按照美国专利No.7,473,822所述的方法生成转基因大豆植株，该专利全文以引用方式并入本文，并且5至30mg/L潮霉素B用于选择。
干化引起的LoxP盒的切除以及在草甘膦选择下的植物再生：
进行大豆干化实验以从转化组织事件诱导切除，并且使转化的植物再生。一旦来自具有可视化标记表达的每个事件的组织在含潮霉素的选择培养基上生长时达到足够尺寸，即可进行干化实验。将组织(直径为0.3-0.5mm)切片并转移到空的60mm×25mm培养皿中，该培养皿装有一张灭菌玻璃滤纸(VWR玻璃微纤维滤纸，691)。盖上培养皿并放置在带有紧密密封盖的容器中。将含15mL灭菌水的打开培养皿放置在容器中。将容器放置在28℃的黑暗培养室中。在干化处理2-3天后，将组织直接转移到含抗生素和20-50μM草甘膦且植物凝胶用作胶凝剂的再生培养基中在平板密封的情况下培养2-3周，以进行增殖和再生。将组织转移到含抗生素和20-50μM草甘膦的再生培养基中再培养2-4周以生成苗。将平板放置在26-28℃下较高强度的光中。当苗足够壮时，分离单棵小植株并转移到土壤。收集叶样品进行qPCR分析。
实例11.干化T 1 未成熟种子的大豆切除诱导和植物再生
收获来自转基因大豆植株的T1未成熟豆荚，用15％Clorox+2滴吐温20灭菌，并用高压灭菌水漂洗3次。将未成熟种子从灭菌豆荚中分离并放置在培养皿中的无菌玻璃纤维滤纸上。盖上培养皿并移到无菌层流罩中，拆开并温育1-2天直到种子干化。然后将干化的未成熟种子放置在包含100mg/L头孢噻肟以及用于选择的20-50μM草甘膦的再生培养基上。1至2周后，在发出的苗中检查DsRed表达。已适当干化的未成熟种子将具有很弱或没有DsRed表达，因为该基因已经由LoxP位点切除。未进行干化处理的转基因和非转基因种子均将在不含草甘膦的培养基上良好萌发，而它们两者在20-50μM草甘膦上时萌发将被完全抑制。在干化下成功经历了基因切除的未成熟种子将具有草甘膦抗性并且将在包含20-50μM草甘膦的培养基上再生。
将健康小植株转移到植物托盘中包含100mg/L头孢噻肟和20-50μM草甘膦的再生培养基中以供进一步选择和生长。
实例12.转基因成熟大豆种子的自然干化和切除
成熟种子灭菌、选择/再生：
将用AGL1/PHP55062转化的T1成熟大豆种子使用20％Clorox+2滴吐温20灭菌，并用高压灭菌水漂洗3次。然后将灭菌种子转移到包含100mg/L头孢噻肟以及用于选择的20-50μM草甘膦的再生培养基上。5-10天后，在发出的苗中检查DsRed表达。已被切除的种子不再具有DsRed表达，因为该基因已经由Lox P位点切割。成功切除了DsRed的那些种子将具有草甘膦抗性并且将在包含草甘膦的培养基上再生。一旦种子具有健康的苗和根形成，就将小植株移到土壤或植物托盘中包含100mg/L头孢噻肟的另一再生培养基且加有20或50μM草甘膦以供进一步选择和生长。
将干燥大豆T 1 种子直接播种到土壤中以及草甘膦抗性确认：
为了确认在种子成熟期间发生的自然干化过程实际上会允许DsRed的切除和对草甘膦的抗性，使从T0大豆植株收集的种子在土壤中萌发。通过将种子直接播种到土壤中而不进行任何处理，切除将为真实自然过程的结果。在植株萌发并生长到约10-15cm后，用草甘膦+表面活性剂以2×或4×浓度(1×等于田间所用浓度)对植株喷雾。在10天内，可明显看出哪些植株不受除草剂影响以及哪些植株严重受损。
实例13.在标准处理和砂石处理的情况下使用未成熟胚(IE)进行的农杆 菌介导的小麦转化
农杆菌悬浮液的制备：
将携带目标载体的根瘤农杆菌从-80℃冻存等分试样划线到包含选择剂(卡那霉素或壮观霉素)的固体LB培养基上。将农杆菌在21℃下在LB平板上于黑暗中培养2-3天。从母板上选择单个菌落，并划线到包含选择剂的810D培养基平板上，并将其在28℃下于黑暗中温育过夜。使用无菌刮刀从固体培养基收集农杆菌细胞，并将细胞悬浮于约5mL含400μM乙酰丁香酮(As)的小麦侵染培养基(WI4)中(表1)。使用相同培养基将悬浮液的OD调节至600nm下的0.1。
小麦未成熟胚转化：
材料制备、灭菌和砂石处理
收集4-5个穗，其包含具有1.5-2.5mm胚的未成熟种子。然后通过在麦芒上朝下拉并移除两组苞片(外稃和内稃)，而从穗分离未成熟种子/小麦粒。将小麦粒在20％(v/v)漂白剂(5.25％次氯酸钠)加1滴吐温20中表面灭菌15分钟，然后将其在无菌水中洗涤2-3次。将未成熟胚(IE)从小麦粒分离，并放入2mL微量离心管中的1.5mL WI4培养基中。将未成熟胚分离并放入含0.25mL高压灭菌砂石的1mL WI4培养基中。将装有未成熟胚的2mL微量离心管以6k离心30秒，以4.5、5或6涡旋10秒，然后以6k离心30秒。使胚静置20分钟。
用砂石进行的胚处理和侵染
倒掉WI4培养基，并且将1.0mL农杆菌悬浮液加入装有未成熟胚的2mL微量离心管中。使胚静置20分钟。将农杆菌和未成熟胚的悬浮液倒在小麦共培养基WC21上(表2)。使用无菌刮刀将留在管中的任何胚转移到平板。将未成熟胚以胚轴侧朝下的方式放置在培养基上，并且确保胚浸入溶液中。将平板用封口膜胶带密封，并于25℃下在黑暗中温育以共培养3天。
培养基方案和选择
在共培养3天后，将未成熟胚以胚轴侧朝下的方式转移到包含100mg/L头孢噻肟的DBC4绿色组织(GT)诱导培养基(堪萨斯州肖尼米申的植物技术实验室(PhytoTechnology Lab.，Shawnee Mission，KS))中(表3)。然后将所有胚于26-28℃下在弱光中温育两周，接着转移到包含100mg/L头孢噻肟的DBC6组织(GT)诱导培养基中再培养两周(表4)。可再生部分在转化后3-4周出现，且准备好在分离后进行再生。将可再生部分从未转化组织切下，并放置在含100mg/L头孢噻肟的再生培养基MSA上(表5)。应将MSA培养基上的这些部分放置在强光中1.5-2周或直到根和伸长苗已形成。在这些部分发育成小植株后，将它们转移到植物托盘直到小植株准备好转移到土壤。在每次转移期间，检查小植株的标记基因表达并且移除任何未表达或嵌合组织。
表15.再生MSA培养基
在标准处理和砂石处理的情况下使用未成熟胚进行农杆菌介导的小麦转化，以比较T0植株水平的转化频率。
表16示出了使用先锋(Pioneer)优良春小麦变种SBC0456D的标准载体在标准处理和砂石处理的情况下进行转化实验时在T0植株水平(T0)的转化频率；双元载体是难以转化的构建体，因为可视标记被weal启动子驱动以便选择。所有实验均在对标准处理和砂石处理采用4.5-6涡旋速度的情况下进行。数据显示，对于标准处理，T0频率在0％至1.2％的范围内。对于砂石处理，T0频率在5.9％至6.8％的范围内。结果表明，与标准处理相比，在砂石处理的情况下进行的实验具有更高的转化频率。
表16.在标准处理和砂石处理的情况下使用标准载体进行的农杆菌介导 的未成熟胚转化。
本说明书中提及的所有公布和专利申请指示了本发明所属领域的技术人员的水平。所有公布和专利申请在相同程度上全文以引用方式并入本文，如同每个单独的公布或专利申请被具体地和独立地指出全文以引用方式并入本文一样。
借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，本发明所属领域的技术人员将会想到本发明的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，本发明不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在所附权利要求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但所述术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。

Claims (46)

1.一种多核苷酸构建体，包含：
a)包含表达盒A(ECA)的切除盒，所述表达盒包含：
i)编码位点特异性重组酶的编码多核苷酸A(CPA)；以及
ii)有效连接到所述CPA的诱导型启动子A(PA)；
b)位于所述切除盒的旁侧的第一重组位点和第二重组位点；
c)编码除草剂耐受性多肽的编码多核苷酸B(CPB)；以及
d)启动子B(PB)，其中在切除所述切除盒之后，所述PB有效连接到所述CPB。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中所述诱导型启动子PA选自胁迫诱导型启动子和化学诱导型启动子。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸构建体，其中所述化学诱导型启动子包括包含tet操纵子的启动子。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体还包含编码磺酰脲响应性转录阻遏蛋白的编码多核苷酸F(CPF)，其中所述CPF有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。
5.根据权利要求2所述的多核苷酸构建体，其中所述胁迫诱导型启动子可响应于寒冷、干旱、高盐度、干化或它们的组合而被诱导。
6.根据权利要求2所述的多核苷酸构建体，其中所述胁迫诱导型启动子包含选自如下的核苷酸序列：
a)具有SEQ ID NO：18所示的序列的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：18所示的序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)包含SEQ ID NO：18所示的序列的至少50个连续核苷酸的核苷酸序列；
d)SEQ ID NO：18的第291-430位核苷酸所示的核苷酸序列；以及
e)与SEQ ID NO：18的第291-430位核苷酸所示的序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中所述PB是组成型启动子。
8.根据权利要求7所述的多核苷酸构建体，其中所述PB选自泛素启动子、油质蛋白启动子、肌动蛋白启动子和紫茉莉(Mirabilis)花叶病毒(MMV)启动子。
9.根据权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中所述切除盒还包含编码选择性标记的编码多核苷酸C(CPC)，其中所述CPC有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。
10.根据权利要求9所述的多核苷酸构建体，其中在切除所述切除盒之前，所述CPC有效连接到PB。
11.根据权利要求9所述的多核苷酸构建体，其中所述切除盒还包含有效连接到所述CPC的启动子C(PC)。
12.根据权利要求11所述的多核苷酸构建体，其中所述PC是组成型启动子。
13.根据权利要求9所述的多核苷酸构建体，其中所述选择性标记选自荧光蛋白、抗生素抗性多肽、除草剂耐受性多肽和代谢酶。
14.根据权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中由CPB编码的所述除草剂耐受性多肽包括草甘膦-N-乙酰转移酶(GLYAT)多肽或ALS抑制剂耐受性多肽。
15.根据权利要求14所述的多核苷酸构建体，其中所述ALS抑制剂耐受性多肽包括乙酰乳酸合成酶的高度耐受性ALS(HRA)突变。
16.根据权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中所述切除盒还包含编码细胞增殖因子的编码多核苷酸D(CPD)，所述编码多核苷酸D有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。
17.根据权利要求16所述的多核苷酸构建体，其中所述细胞增殖因子选自WUSCHEL多肽和babyboom多肽。
18.根据权利要求17所述的多核苷酸构建体，其中所述babyboom多肽包含至少两个AP2结构域和下列氨基酸序列中的至少一者：
a)SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列相差一个氨基酸的氨基酸序列；以及
b)SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列相差一个氨基酸的氨基酸序列。
19.根据权利要求17所述的多核苷酸构建体，其中所述CPD具有选自如下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：55、57、58、60、74、76、78、80、82、84、86、87、88、90、92、94、96、98、99或101所示的核苷酸序列；
b)与SEQ ID NO：55、57、58、60、74、76、78、80、82、84、86、87、88、90、92、94、96、98、99或101具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)编码具有SEQ ID NO：56、59、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、100或102所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及
d)编码具有与SEQ ID NO：56、59、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、100或102所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
20.根据权利要求17所述的多核苷酸构建体，其中编码WUSCHEL多肽的所述多核苷酸具有选自如下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：103、105、107或109所示的核苷酸序列；以及
b)与SEQ ID NO：103、105、107或109具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；
c)编码具有SEQ ID NO：104、106、108或110所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及
d)编码具有与SEQ ID NO：104、106、108或110具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
21.根据权利要求20所述的多核苷酸构建体，其中编码WUSCHEL多肽的所述多核苷酸有效连接到玉蜀黍In2-2启动子或胭脂碱合成酶启动子。
22.根据权利要求16所述的多核苷酸构建体，其中所述切除盒还包含有效连接到所述CPD的启动子D(PD)。
23.根据权利要求22所述的多核苷酸构建体，其中所述PD是组成型启动子。
24.根据权利要求23所述的多核苷酸构建体，其中所述PD是泛素启动子或油质蛋白启动子。
25.根据权利要求16所述的多核苷酸构建体，其中所述切除盒包含至少编码babyboom多肽的第一编码多核苷酸D(CPD1)以及编码WUSCHEL多肽的第二编码多核苷酸D(CPD2)。
26.根据权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体还包含编码目标多肽的编码多核苷酸E(CPE)，其中所述CPE有效连接到在植物细胞中有活性的启动子。
27.根据权利要求26所述的多核苷酸构建体，其中所述CPE在位于所述切除盒旁侧的所述第一重组位点和第二重组位点的外部。
28.一种宿主细胞，包含根据权利要求1所述的多核苷酸构建体。
29.一种植物细胞，包含根据权利要求1所述的多核苷酸构建体。
30.一种植物或植物部分，包含根据权利要求29所述的植物细胞。
31.根据权利要求30所述的植物或植物部分，其中所述植物或植物部分是双子叶植物。
32.根据权利要求30所述的植物或植物部分，其中所述植物或植物部分是单子叶植物。
33.根据权利要求32所述的植物或植物部分，其中所述单子叶植物选自玉蜀黍、水稻、高粱、大麦、粟、燕麦、裸麦、黑小麦、甘蔗、柳枝稷以及草坪草/饲草。
34.根据权利要求30所述的植物或植物部分，其中所述植物或植物部分难于转化。
35.根据权利要求30所述的植物或植物部分，其中所述植物部分是种子。
36.一种用于产生转基因植物或植物部分的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的多核苷酸构建体引入植物或植物部分中。
37.一种用于调控除草剂耐受性多核苷酸的表达的方法，其中所述方法包括：
a)提供根据权利要求28所述的宿主细胞；以及
b)诱导所述位点特异性重组酶的表达，从而从所述多核苷酸构建体切除所述切除盒并且表达所述除草剂耐受性多核苷酸。
38.一种用于选择除草剂耐受性植物细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
A)提供植物细胞群体，其中所述群体中的至少一个植物细胞包含根据权利要求1所述的多核苷酸构建体；
B)诱导所述位点特异性重组酶的表达；以及
C)使所述植物细胞群体与所述除草剂耐受性多肽赋予对其的耐受性的除草剂接触，从而选择具有对所述除草剂的耐受性的植物细胞。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述方法还包括在步骤A)之前将所述多核苷酸构建体引入所述至少一个植物细胞中。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述诱导型启动子A(PA)响应于寒冷、干旱、干化、高盐度或它们的组合而诱导。
41.根据权利要求38所述的方法，其中所述诱导包括干化所述植物细胞群体。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述干化在未成熟种子的成熟期间发生。
43.根据权利要求38所述的方法，其中所述切除盒还包含编码多核苷酸C(CPC)，其中所述CPC编码选择性标记且有效连接到启动子，并且其中所述方法还包括在步骤B)之前的选择步骤，其中鉴定包含所述选择性标记的所述植物细胞群体内的那些植物细胞，并且其中这些选择的植物细胞构成步骤B)中诱导的所述植物细胞群体。
44.一种用于增加植物组织的转化效率的方法，所述方法包括如下步骤：
a)提供植物细胞群体，其中所述群体中的至少一个植物细胞包含根据权利要求1所述的多核苷酸构建体；
b)在不存在所述除草剂耐受性多肽赋予对其的除草剂抗性的除草剂的情况下，将所述植物细胞群体培养足以使所述植物细胞群体增殖的一段时间；
c)诱导所述位点特异性重组酶的表达，从而切除所述切除盒；
d)使来自c)的所述植物细胞群体与所述除草剂耐受性多肽赋予对其的耐受性的所述除草剂接触；以及
e)选择具有对所述除草剂的耐受性的植物细胞，其中与不包含所述切除盒并且直接通过除草剂选择而选择的可比植物细胞相比，转化频率得到增加。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述诱导包括干化所述植物细胞群体。
46.根据权利要求44所述的方法，其中在切除之前，在不存在所述除草剂耐受性多肽赋予对其的除草剂耐受性的所述除草剂的情况下，将所述植物细胞群体培养约1小时至约6周。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110709519A (zh) * 2017-03-31 2020-01-17 先锋国际良种公司 表达调控元件及其用途
CN110950943A (zh) * 2019-12-30 2020-04-03 上海交通大学 紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34及其编码基因
CN111868247A (zh) * 2018-03-12 2020-10-30 先锋国际良种公司 用于植物转化的方法
CN114096672A (zh) * 2019-08-12 2022-02-25 先正达农作物保护股份公司 Wox基因

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150065908A (ko) * 2012-06-26 2015-06-15 유오피 엘엘씨 포스포늄계 이온성 액체 및 이를 포함하는 알킬화 촉매
US11330776B2 (en) 2015-10-30 2022-05-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for rapid plant transformation
CA3042939A1 (en) * 2016-12-08 2018-06-14 Syngenta Participations Ag Methods for improving transformation frequency
BR112019018175A2 (pt) 2017-03-07 2020-04-07 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula, célula, planta, sementes, polipeptídeos recombinantes, método para produzir um polipeptídeo, planta, método para controlar ervas, uso do ácido nucleico e produto de utilidade
BR112019018059A2 (pt) 2017-03-07 2020-08-04 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula de ácido nucleico recombinante, célula hospedeira, plantas, sementes transgênicas, polipeptídeo recombinante, método para produzir um polipeptídeo, método de controle de ervas daninhas, uso do ácido nucleico e produto de utilidade
CA3056319A1 (en) * 2017-03-23 2018-09-27 Basf Se Anther-specific promoter and uses thereof
US20210254091A1 (en) * 2018-06-29 2021-08-19 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Herbicide tolerant plants expressing a cyanobacterial plastoquinone biosynthetic pathway
CN109212053B (zh) * 2018-07-07 2021-05-14 丁立平 一种测定饮用水中痕量草铵膦、草甘膦及氨甲基膦酸的气相色谱法
CN109666757B (zh) * 2019-01-31 2022-04-19 宁夏农林科学院农作物研究所（宁夏回族自治区农作物育种中心） 用于鉴定小麦春化基因vrn-d4的试剂盒及其专用成套引物对
WO2020198408A1 (en) * 2019-03-27 2020-10-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant explant transformation
CN110106200B (zh) * 2019-05-17 2021-02-02 中国农业科学院作物科学研究所 玉米bbm1基因在提高植物遗传转化效率中的应用
WO2023081731A1 (en) * 2021-11-02 2023-05-11 University Of Florida Researchfoundation, Incorporated Improved genetic transformation by improving de-novo shoot regeneration in adult plants and during in-vitro tissue culture

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110167516A1 (en) * 2009-12-30 2011-07-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for the introduction and regulated expression of genes in plants
CN102159718A (zh) * 2008-09-15 2011-08-17 辛根塔有限公司 除草剂耐受性植物

Family Cites Families (130)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US762264A (en) 1903-11-06 1904-06-07 Pierre C Waring Process of making felt cloth.
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US5304732A (en) 1984-03-06 1994-04-19 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
US5331107A (en) 1984-03-06 1994-07-19 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
ES2018274T5 (es) 1986-03-11 1996-12-16 Plant Genetic Systems Nv Celulas vegetales resistentes a los inhibidores de glutamina sintetasa, preparadas por ingenieria genetica.
US5273894A (en) 1986-08-23 1993-12-28 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5378824A (en) 1986-08-26 1995-01-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5605011A (en) 1986-08-26 1997-02-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5013659A (en) 1987-07-27 1991-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
US4764440A (en) 1987-05-05 1988-08-16 Eveready Battery Company Low temperature molten compositions
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
JPH01258408A (ja) * 1988-04-08 1989-10-16 Asahi Glass Co Ltd 非水電解液エネルギー貯蔵装置
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US5023179A (en) 1988-11-14 1991-06-11 Eric Lam Promoter enhancer element for gene expression in plant roots
US5110732A (en) 1989-03-14 1992-05-05 The Rockefeller University Selective gene expression in plants
US5240855A (en) 1989-05-12 1993-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Particle gun
US5879918A (en) 1989-05-12 1999-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pretreatment of microprojectiles prior to using in a particle gun
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
ES2150900T3 (es) 1989-10-31 2000-12-16 Monsanto Co Promotor para plantas transgenicas.
FR2659871B1 (fr) 1990-03-20 1992-06-05 Inst Francais Du Petrole Composition liquide non aqueuse a caractere ionique et son utilisation comme solvant. invention de mm. yves chauvin, dominique commereuc, isabelle guibard, andre hirschauer, helene olivier, lucien saussine.
DE69133128T2 (de) 1990-04-12 2003-06-18 Syngenta Participations Ag Gewebe-spezifische Promotoren
US5466597A (en) 1990-04-26 1995-11-14 Plant Genetic Systems, N.V. Bacillus thuringiensis strains and their genes encoding insecticidal toxins
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
JP3173784B2 (ja) 1990-06-25 2001-06-04 モンサント カンパニー グリホセート耐性植物
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
US5277905A (en) 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
US5459252A (en) 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
GB9114259D0 (en) 1991-07-02 1991-08-21 Ici Plc Plant derived enzyme and dna sequences
US5731180A (en) 1991-07-31 1998-03-24 American Cyanamid Company Imidazolinone resistant AHAS mutants
EP0602064B1 (en) 1991-08-02 1998-12-16 Mycogen Corporation Novel microorganism and insecticide
ES2140416T3 (es) 1991-08-27 2000-03-01 Novartis Ag Proteinas con propiedades insecticidas contra insectos homopteros y su uso en la proteccion de plantas.
DE69233410D1 (de) 1991-10-04 2004-10-21 Univ North Carolina State Pathogenresistente transgene pflanzen
TW261517B (zh) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US5324646A (en) 1992-01-06 1994-06-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of regeneration of Medicago sativa and expressing foreign DNA in same
US5428148A (en) 1992-04-24 1995-06-27 Beckman Instruments, Inc. N4 - acylated cytidinyl compounds useful in oligonucleotide synthesis
US5401836A (en) 1992-07-16 1995-03-28 Pioneer Hi-Bre International, Inc. Brassica regulatory sequence for root-specific or root-abundant gene expression
EP0652965A1 (en) 1992-07-27 1995-05-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of agrobacterium-mediated transformation of cultured soybean cells
IL108241A (en) 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus
AU6162294A (en) 1993-01-13 1994-08-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. High lysine derivatives of alpha-hordothionin
US5583210A (en) 1993-03-18 1996-12-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for controlling plant development
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
US5789156A (en) 1993-06-14 1998-08-04 Basf Ag Tetracycline-regulated transcriptional inhibitors
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US5633363A (en) 1994-06-03 1997-05-27 Iowa State University, Research Foundation In Root preferential promoter
US5767373A (en) 1994-06-16 1998-06-16 Novartis Finance Corporation Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US5792931A (en) 1994-08-12 1998-08-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fumonisin detoxification compositions and methods
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US5853973A (en) 1995-04-20 1998-12-29 American Cyanamid Company Structure based designed herbicide resistant products
DE69636637T2 (de) 1995-04-20 2007-08-23 Basf Ag Auf basis ihrer struktur entworfene herbizid-resistente produkte
WO1996038563A1 (en) 1995-06-02 1996-12-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. HIGH METHIONINE DERIVATIVES OF α-HORDOTHIONIN
BR9609200A (pt) 1995-06-02 1999-05-11 Pioneer Hi Bred Int Derivados de alta treonina de alpha-hordotionina
FR2734842B1 (fr) 1995-06-02 1998-02-27 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
WO1996040724A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Life Technologies, Inc. Recombinational cloning using engineered recombination sites
US5837876A (en) 1995-07-28 1998-11-17 North Carolina State University Root cortex specific gene promoter
US5737514A (en) 1995-11-29 1998-04-07 Texas Micro, Inc. Remote checkpoint memory system and protocol for fault-tolerant computer system
US5703049A (en) 1996-02-29 1997-12-30 Pioneer Hi-Bred Int'l, Inc. High methionine derivatives of α-hordothionin for pathogen-control
AUPN903196A0 (en) * 1996-03-29 1996-04-26 Australian National University, The Single-step excision means
US6175056B1 (en) 1996-04-29 2001-01-16 The Procter & Gamble Company Disposable absorbent article having an expanding topsheet and being capable of self-shaping in use
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
US5824832A (en) 1996-07-22 1998-10-20 Akzo Nobel Nv Linear alxylbenzene formation using low temperature ionic liquid
JP3441899B2 (ja) 1996-11-01 2003-09-02 理化学研究所 完全長ｃＤＮＡライブラリーの作成方法
DE19652284A1 (de) 1996-12-16 1998-06-18 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Neue Gene codierend für Aminosäure-Deacetylasen mit Spezifität für N-Acetyl-L-Phosphinothricin, ihre Isolierung und Verwendung
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
AU7968098A (en) 1997-06-11 1998-12-30 United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture, The Transformation of wheat with the cyanamide hydratase gene
EP1009843A1 (en) * 1997-09-05 2000-06-21 Purdue Research Foundation Selective expression of genes in plants
US6245968B1 (en) 1997-11-07 2001-06-12 Aventis Cropscience S.A. Mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, DNA sequence and isolation of plants which contain such a gene and which are tolerant to herbicides
US6069115A (en) 1997-11-12 2000-05-30 Rhone-Poulenc Agrochimie Method of controlling weeds in transgenic crops
JP4206154B2 (ja) 1997-11-13 2009-01-07 大日本住友製薬株式会社 変異型ｌｏｘＰ配列とその応用
ATE401410T1 (de) 1997-11-18 2008-08-15 Pioneer Hi Bred Int Zusammensetzungen und verfahren für die genetische modifizierung von pflanzen
US5929301A (en) 1997-11-18 1999-07-27 Pioneer Hi-Bred International Nucleic acid sequence encoding FLP recombinase
AU745960C (en) 1997-11-18 2003-09-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. A novel method for the integration of foreign DNA into eukaryoticgenomes
CA2306053C (en) 1997-11-18 2003-01-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Mobilization of viral genomes from t-dna using site-specific recombination systems
WO1999025853A1 (en) 1997-11-18 1999-05-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Targeted manipulation of herbicide-resistance genes in plants
ATE278782T1 (de) 1998-02-26 2004-10-15 Pioneer Hi Bred Int Konstitutive maispromotoren
EP1056862A1 (en) 1998-02-26 2000-12-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Family of maize pr-1 genes and promoters
US6070283A (en) 1998-07-10 2000-06-06 Rite-Hite Holding Corporation Dock leveler with integral bumpers
ES2252964T3 (es) 1998-08-20 2006-05-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Promotores preferidos de semillas.
WO2000012733A1 (en) 1998-08-28 2000-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoters from end genes
WO2000028058A2 (en) 1998-11-09 2000-05-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transcriptional activator lec1 nucleic acids, polypeptides and their uses
US6890726B1 (en) 1999-04-06 2005-05-10 Oklahoma Medical Research Foundation Method for selecting recombinase variants with altered specificity
ATE463569T1 (de) 1999-07-23 2010-04-15 Univ California Dna-rekombination in eukaryotischen zellen mittels des rekombinationszentrums vom bakteriophag phic31
WO2001011058A1 (en) 1999-08-09 2001-02-15 Monsanto Technology Llc Novel cloning methods and vectors
CA2381927A1 (en) 1999-08-13 2001-02-22 Syngenta Participations Ag Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase
AU7447000A (en) 1999-09-30 2001-04-30 Izumu Saito Dna containing variant frt sequences
DE60034929T2 (de) 1999-10-01 2008-01-24 E.I. Du Pont De Nemours And Co., Wilmington Wuschel (WUS)-Proteine
US7256322B2 (en) 1999-10-01 2007-08-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Wuschel (WUS) Gene Homologs
WO2002000900A2 (de) 2000-06-28 2002-01-03 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Binärvektoren zur verbesserten transformation von pflanzlichen systemen
US6512165B1 (en) 2000-07-10 2003-01-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for enhancing plant transformation frequencies
US7462481B2 (en) 2000-10-30 2008-12-09 Verdia, Inc. Glyphosate N-acetyltransferase (GAT) genes
WO2002036782A2 (en) 2000-10-30 2002-05-10 Maxygen, Inc. Novel glyphosate n-acetyltransferase (gat) genes
US7294759B2 (en) 2001-06-29 2007-11-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alteration of oil traits in plants
AT5356U1 (de) 2001-07-16 2002-06-25 Uv & P Umweltman Verfahrenstec Verfahren zur immobilisierung von verbrennungsrückständen
WO2003054189A2 (de) 2001-12-20 2003-07-03 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Verfahren zur transformation von pflanzlichen plastiden
CA2422480A1 (en) 2002-03-15 2003-09-15 National Research Council Of Canada Promoters for molecular farming and/or early detection of transgenic plants
US7238854B2 (en) 2002-04-11 2007-07-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method of controlling site-specific recombination
AU2003234328A1 (en) 2002-04-30 2003-11-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel glyphosate-n-acetyltransferase (gat) genes
US20040203141A1 (en) 2003-04-11 2004-10-14 Jorge Dubcovsky Use of the AP1 gene promoter to control the vernalization response and flowering time in grasses
CN1863914B (zh) 2003-04-29 2011-03-09 先锋高级育种国际公司 新的草甘膦-n-乙酰转移酶(gat)基因
US8329603B2 (en) * 2003-09-16 2012-12-11 Uop Llc Isoparaffin-olefin alkylation
DE602005012233D1 (de) 2004-02-02 2009-02-26 Pioneer Hi Bred Int Ap2-domäne-transkriptionsfaktor odp2 (ovule development protein 2) und verwendungsverfahren
AR048710A1 (es) 2004-04-26 2006-05-17 Pioneer Hi Bred Int Activadores de la transcripcion que participan en la tolerancia al estres abiotico
US7405074B2 (en) 2004-04-29 2008-07-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Glyphosate-N-acetyltransferase (GAT) genes
US7473822B1 (en) 2005-06-27 2009-01-06 Iowa State University Research Foundation, Inc. Soybean transformation and regeneration using half-seed explant
EP1907553B1 (en) 2005-07-18 2012-08-22 Pioneer Hi-Bred International Inc. Modified frt recombination sites and methods of use
ATE544861T1 (de) 2005-08-24 2012-02-15 Pioneer Hi Bred Int Verfahren und zusammensetzungen für den ausdruck eines polynukleotid von interesse
US7491813B2 (en) 2005-12-07 2009-02-17 Monsanto Technology Llc Promoter polynucleotides identified from Zea mays for use in plants
US7390928B2 (en) * 2005-12-14 2008-06-24 Chemtura Corporation Alkylation of N′-phenyl-N-alkylphenylenediamines in ionic liquid, N′-phenyl-N-alkyl (alkylphenylene) diamines produced thereby, and lubricant compositions containing same
US7569740B2 (en) * 2005-12-20 2009-08-04 Chevron U.S.A. Inc. Alkylation of olefins with isoparaffins in ionic liquid to make lubricant or fuel blendstock
US7928296B2 (en) 2006-10-30 2011-04-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize event DP-098140-6 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
GB2447416B (en) * 2006-12-15 2010-08-25 Uni I Stavanger Methods and vectors for transformation of plastids and marker excision using site-specific recombination
US8710206B2 (en) 2007-06-15 2014-04-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Soybean EF1A promoter and its use in constitutive expression of transgenic genes in plants
CN101284822A (zh) * 2008-06-06 2008-10-15 福建师范大学 一种制备环氧脂肪酸二元醇酯的方法
EP2364322A1 (en) 2008-10-28 2011-09-14 Pioneer Hi-Bred International Inc. Sulfonylurea-responsive repressor proteins
EA026277B1 (ru) * 2009-04-24 2017-03-31 Острэйлиан Сентр Фор Плант Фанкшенл Дженомикс Пти Лтд. Отвечающая на засуху экспрессия генов с промотора rab17 zea mays
US8581046B2 (en) 2010-11-24 2013-11-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Brassica gat event DP-073496-4 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
US20120136189A1 (en) * 2010-03-09 2012-05-31 Conocophillips Company - Ip Services Group Buffered ionic liquids for olefin dimerization
MX2012012211A (es) * 2010-04-23 2012-12-17 Du Pont Composiciones de interruptores genicos y metodos de uso de las mismas.
CN101979143B (zh) * 2010-09-15 2012-07-04 湖南科茂林化有限公司 一种松香或其衍生物的酯化催化剂及其应用
CA2835225A1 (en) * 2011-06-17 2012-12-20 Fluidic, Inc. Synthesis of hetero ionic compounds using dialkylcarbonate quaternization
AU2012301912A1 (en) * 2011-08-31 2014-03-06 E. I. Dupont De Nemours & Company Methods for tissue culture and transformation of sugarcane
KR20150065908A (ko) * 2012-06-26 2015-06-15 유오피 엘엘씨 포스포늄계 이온성 액체 및 이를 포함하는 알킬화 촉매

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102159718A (zh) * 2008-09-15 2011-08-17 辛根塔有限公司 除草剂耐受性植物
US20110167516A1 (en) * 2009-12-30 2011-07-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for the introduction and regulated expression of genes in plants

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HEE-JONG WOO ET AL.: "Auto-excision of selectable marker genes from transgenic tobacco via a stress inducible FLP/FRT site-specific recombination system", 《TRANSGENIC RESEARCH》 *
杨朝国等: "抗除草剂草丁膦转基因玉米后代筛选方法的研究", 《作物杂志》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110709519A (zh) * 2017-03-31 2020-01-17 先锋国际良种公司 表达调控元件及其用途
CN110709519B (zh) * 2017-03-31 2023-09-15 先锋国际良种公司 表达调控元件及其用途
US11814637B2 (en) 2017-03-31 2023-11-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc Expression modulating elements and use thereof
CN111868247A (zh) * 2018-03-12 2020-10-30 先锋国际良种公司 用于植物转化的方法
CN114096672A (zh) * 2019-08-12 2022-02-25 先正达农作物保护股份公司 Wox基因
CN110950943A (zh) * 2019-12-30 2020-04-03 上海交通大学 紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34及其编码基因
CN110950943B (zh) * 2019-12-30 2021-09-17 上海交通大学 紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA-D34及其编码基因

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