EA026277B1

EA026277B1 - Отвечающая на засуху экспрессия генов с промотора rab17 zea mays

Info

Publication number: EA026277B1
Application number: EA201171278A
Authority: EA
Inventors: Сергий Лопато; Сара Морран; Омид Эйни; Питер Лэнгридж
Original assignee: Острэйлиан Сентр Фор Плант Фанкшенл Дженомикс Пти Лтд.
Priority date: 2009-04-24
Filing date: 2010-04-23
Publication date: 2017-03-31
Also published as: EP2421979A1; AU2010239155A1; EP2421979A4; EA201171278A1; AU2010239155B2; WO2010121316A1; CA2759007A1; US8766037B2; US20120102592A1

Abstract

Изобретение главным образом относится к засухоспецифической экспрессии, представляющей интерес нуклеотидной последовательности в одной или нескольких клетках растения. В некоторых конкретных вариантах изобретение относится к засухоспецифической экспрессии, представляющей интерес нуклеотидной последовательности в пшенице под контролем последовательности регуляции транскрипции Rab17.

Description

По настоящей заявке на выдачу патента испрашивается приоритет на основании предварительной заявки на выдачу патента Австралии 2009901749, поданной 24 апреля 2009 г., содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение главным образом относится к засухоспецифической экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности в одной или нескольких клетках растения.

Уровень техники

Показано, что несколько семейств факторов транскрипции, таких как ΌΚΕΒ/СВР, ΕΚΕ, ΜΥΚ, ΜΥΒ, АКЕВ/АВР, ЫАС и ΗΌΖίρ класса I и II, вовлечены в регуляцию реакции растений на засуху. Такие факторы связывают специфичные цис-элементы в промоторах регулируемых засухой генов.

Белки, связывающие элементы ответа на дегидратацию (ΌΚΕΒ), или белки, связывающие С-повторы (СВР), относятся к первым открытым семействам факторов транскрипции, ответственных за регуляцию генов в условиях недостатка воды. Они представляют собой группу факторов транскрипции с одним доменом АР2, который регулирует экспрессию многих индуцируемых стрессом генов у растений. Многие факторы ΌΚΕΒ/СВР сами индуцируются такими условиями абиотического стресса, подобными засухе, холоду, солености и жаре.

Шесть факторов транскрипции, включая четыре фактора ΌΚΕΒ1/СВР и два фактора ΌΚΕΒ2, идентифицированы у АгаЫйор818. Было показано, что факторы ΌΚΕΒ 1/СВР индуцируются засухой, солью и холодом, тогда как факторы ΌΚΕΒ2 индуцируются только засухой и солью.

После открытия роли факторов ΌΚΕΒ/СВР в реакции на стресс было предпринято несколько попыток с тем, чтобы продемонстрировать их способность повышать устойчивость к стрессу у АгаЫйор818 и таких сельскохозяйственных культур, таких как Вгаккюа _щисеае, соя, рис, пшеница и другие злаковые травы.

В случае большинства попыток сверхэкспрессировать факторы ΌΚΕΒ у растений использовали конститутивные промоторы, такие как промотор 358 вируса мозаики цветной капусты, промотор актина 1 риса и промотор полиубиквитина кукурузы. Однако в большинстве случаев высокая конститутивная экспрессия приводила к разной степени задержки роста, которая затем приводила к карликовости трансгенных растений.

Были предприняты попытки преодолеть проблемы, связанные с сильной задержкой роста путем уменьшения продолжительности сверхэкспрессии с использованием индуцируемых стрессом промоторов. Например, предпринимались попытки экспрессии факторов ΌΚΕΒ под контролем промотора гб29А в ряде растений. Однако обнаружили, что такой промотор обычно имеет некоторый уровень основной экспрессии в отсутствие стресса, вызванного засухой. Как указано выше, экспрессия факторов ΌΚΕΒ в отсутствие вызванного засухой стресса ассоциирована с карликовостью и/или низкорослостью растений.

В свете указанного выше было бы желательно иметь возможность управлять экспрессией нуклеотидных последовательностей, включая последовательности, вовлеченные в засухоустойчивость (такие как факторы ΌΚΕΒ), отвечающим на засуху образом. Таким образом, нуклеотидные последовательности могут быть экспрессированы в нужные моменты, т.е. в ответ на засуху, но не экспрессируются в отсутствие засухи, когда могут появляться нежелательные фенотипы, такие как карликовость и/или низкорослость растений.

Ссылки на любые документы предшествующего уровня техники в настоящем описании не являются, и их не следует воспринимать как признание или любую форму указания того, что такой предшествующий уровень техники образует часть общеизвестного уровня техники в любой стране.

Сущность изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу осуществления отвечающей на засуху экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности в одной или нескольких клетках растения, включающему экспрессию в одной или нескольких клетках растения представляющей интерес нуклеотидной последовательности, функционально связанной с последовательностью регуляции транскрипции, которая индуцируется засухой в растении и, по существу, не обладает основной активностью в растении в отсутствие засухи.

В некоторых вариантах растение является растением пшеницы.

В некоторых вариантах последовательность регуляции транскрипции содержит последовательность регуляции транскрипции Κ;·ιΌ17. В некоторых вариантах последовательность регуляции транскрипции Κ;·ιΌ17, используемая согласно настоящему изобретению, может представлять собой последовательность регуляции транскрипции ИаЬ17 Ζеа шау8 или ее функционально активный фрагмент или вариант.

В некоторых вариантах представляющая интерес нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, которая при экспрессии одной или несколькими клетками растения повышает засухоустойчивость растения. В некоторых вариантах представляющая интерес нуклеотидная последовательность кодирует полипептид ΌΚΕΒ.

Во втором аспекте настоящее изобретение также относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей представляющую интерес нуклеотидную последовательность, функционально связанную с

- 1 026277 индуцируемой засухой последовательностью регуляции транскрипции, которая, по существу, не обладает основной активностью в растении в отсутствие засухи.

В некоторых вариантах последовательность регуляции транскрипции является индуцируемой засухой у пшеницы и, по существу, не обладает основной активностью у пшеницы в отсутствие засухи. В некоторых вариантах последовательность регуляции транскрипции содержит последовательность регуляции транскрипции КаЫ7. В некоторых вариантах последовательность регуляции транскрипции содержит последовательность регуляции транскрипции КаЫ7 Ζοα таук или ее функционально активный фрагмент или вариант.

В некоторых вариантах представляющая интерес нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, которая при экспрессии одной или несколькими клетками растения повышает засухоустойчивость растения. В некоторых вариантах представляющая интерес нуклеотидная последовательность кодирует полипептид ΌΡΕΒ.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к генетически модифицированной клетке, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты согласно второму аспекту изобретения или ее интегрированную в геном форму.

В некоторых вариантах клеткой является клетка пшеницы.

В четвертом аспекте настоящего изобретения предлагается многоклеточная структура, содержащая одну или несколько клеток согласно третьему аспекту изобретения.

В некоторых вариантах многоклеточная структура включает растение или его часть, орган или ткань. В некоторых вариантах растение или его часть, орган или ткань включает растение пшеницы или его часть, орган или ткань.

В некоторых вариантах настоящее изобретение также относится к растению или его части, органу или ткани, обладающим повышенной засухоустойчивостью, при этом растение содержит одну или несколько клеток согласно третьему аспекту изобретения.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности указаны в настоящем описании с использованием идентификационного номера последовательности (§ЕЦ ГО N0:). Суммарно идентификационные номера последовательностей представлены в табл. 1. Последовательность приведена в конце описания.

Таблица 1

Сводные данные об идентификационных номерах последовательностей

Идентификационный номер последовательности	Последовательность	Номер в списке последовательностей
5ЕС Ю N0: 1	Промотор НаЫ7 2еа шауз	400<1>

Описание иллюстративных вариантов

Следует понимать, что следующее описание предназначено только в целях описания конкретных вариантов и не предназначено для ограничения в отношении приведенного выше описания.

В настоящем описании упоминание растения может включать виды семенных растений, таких как однодольные покрытосеменные растения (однодольные), двудольные покрытосеменные растения (двудольные) и/или голосеменные растения.

В некоторых вариантах растение является зерновым культурным растением. В используемом в настоящем описании смысле термин зерновое культурное растение может быть представителем Роасеае (семейство злаковых), которые дают зерно. Примерами зерновых культурных растений Роасеае являются пшеница, рис, кукуруза, просо, сорго, рожь, тритикале, овес, ячмень, метличка, дикий рис, спельта и тому подобные. Также следует понимать, что термин зерновое культурное растение включает ряд не относящихся к Роасеае видов растений, которые также дают пищевое зерно, которые известны как псевдозлаковые, и включают, например, амарант, гречиху и кинву.

В некоторых вариантах растением является растение пшеницы. В используемом в настоящем описании смысле термин пшеница следует понимать как растение рода Тгйгсит. Таким образом, термин пшеница охватывает диплоидную пшеницу, тетраплоидную пшеницу и гексаплоидную пшеницу. В некоторых вариантах растение пшеницы может относиться к культивируемому виду пшеницы, включая, например, Т. аекШит, Т. бигит, Т. топососсит или Т. крейа. В некоторых вариантах термин пшеница относится к пшенице вида Тгйюит аекйуит.

Как указано выше способ охватывает осуществление отвечающей на засуху экспрессии представ- 2 026277 ляющей интерес нуклеотидной последовательности в одной или нескольких клетках растения.

В используемом в настоящем описании смысле следует понимать что термин отвечающая на засуху экспрессия относится к транскрипции нуклеотидной последовательности в одной или нескольких клеток растения, когда растение испытывает засуху, и, по существу, не выявляемой транскрипции представляющей интерес нуклеотидной последовательности в одной или нескольких клетках растения, когда растение не испытывает засуху.

Следует понимать, что термин засуха в используемом в настоящем описании смысле включает любую ситуацию, когда количество воды, доступной для растения при физиологически соответствующем уровне солености, меньше чем оптимальный уровень воды для такого растения. В некоторых вариантах засуха может включать низкое объемное содержание влаги (У^С) в почве. В некоторых вариантах засуха может включать У\УС почвы менее чем 10%, менее чем 7%, менее чем 5%, менее чем 4% или менее чем 3%. В некоторых вариантах засуха также может включать другие формы осмотического стресса, такие как ситуации, когда доступен относительно высокий объем воды, но уровень солености в воде является достаточно высоким, вызывающим осмотический стресс в растении. В некоторых вариантах использование в настоящем описании термина засуха включает достаточно суровые условия, вызывающие в растении видимые симптомы, такие как потеря тургора, увядание, скрученные листья, хлороз, задержка роста и/или гибель растения.

В способе согласно настоящему изобретению отвечающую на засуху экспрессию представляющей интерес нуклеотидной последовательности осуществляют, используя представляющую интерес нуклеотидную последовательность, функционально связанную с последовательностью регуляции транскрипции, которая индуцируется засухой в растении и, по существу, не обладает основной активностью в растении в отсутствие засухи.

В используемом в настоящем описании смысле термин последовательность регуляции транскрипции следует понимать как нуклеотидную последовательность, которая модулирует, по меньшей мере, транскрипцию функционально связанной нуклеотидной последовательности. В этой связи последовательности регуляции транскрипции согласно настоящему изобретению может содержать, например, любой один или несколько из следующих элементов: промотор, 5'- или З'-ИТК, энхансер или расположенную выше активирующую последовательность. В некоторых вариантах последовательность регуляции транскрипции может содержать промотор и/или 5'-ИТК.

В используемом в настоящем описании смысле термин функционально связанная относится к связи последовательности регуляции транскрипции, такой как промотор, и представляющей интерес нуклеотидной последовательности, таким образом, который приводит к тому, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность оказывается под транскрипционным контролем последовательности регуляции транскрипции. Например, промоторы обычно располагают с 5'-стороны (выше) нуклеотидной последовательности, которую необходимо функционально связать с промотором.

Как указано выше, последовательности регуляции транскрипции, предполагаемые для применения в настоящем изобретении, являются индуцируемыми засухой. Следует понимать, что индуцируемые засухой последовательности регуляции транскрипции включают последовательности регуляции транскрипции, которые порождают более высокую скорость и/или более высокий уровень транскрипции функционально связанной нуклеотидной последовательности в растении, когда растение подвергается воздействию засухи. В некоторых вариантах индуцируемая засухой последовательность регуляции транскрипции может быть активирована одним или несколькими факторами транскрипции или другими полипептидами, которые экспрессируются в растении, когда растение подвергается воздействию засухи.

Последовательности регуляции транскрипции, предполагаемые для применения в настоящем изобретении, также по существу, не обладают основной активностью в отсутствие засухи. В используемом в настоящем описании смысле следует понимать, что такое выражение означает, что последовательность регуляции транскрипции не вызывает регистрируемой экспрессии в представляющем интерес растении в отсутствие засухи. Следует понимать, что в некоторых вариантах отсутствие регистрируемой экспрессии означает, что транскрипция функционально связанной нуклеотидной последовательности не может быть выявлена при Нозерн-блоттинге и/или Ц-ПЦР. Как будет понятно, некоторый очень низкий уровень экспрессии, который не выявляется при Нозерн-блоттинге и/или О-ПЦР. все еще может иметь место в случае последовательностей регуляции транскрипции, который подпадает под значение по существу, не обладает основной активностью в используемом в настоящем описании смысле.

Кроме того, термины индуцируемая засухой и по существу, не имеет основной активности в отсутствие засухи предполагают необходимость в оценке в контексте представляющего интерес растения. Например, конкретная последовательность регуляции транскрипции может проявлять способность к индуцированию засухой и, по существу, не обладать основной активностью в отсутствие засухи в представляющем интерес растении, но не обязательно должна проявлять оба или любое из указанных свойств во всех видах растений, чтобы подпадать под определение указанных выше терминов в целях настоящего изобретения. В некоторых вариантах термины индуцируемая засухой и по существу, не обладает основной активностью в отсутствие засухи также предполагают оценку в контексте конкретного типа ткани. Например, конкретная последовательность регуляции транскрипции может проявлять способ- 3 026277 ность к индуцированию засухой и, по существу, не обладать основной активностью в отсутствие засухи в конкретной представляющей интерес ткани растения, например в листьях, но не обязательно должна проявлять оба или любое одно из указанных свойств во всех тканях растения, чтобы подпадать под определение указанных выше терминов в целях настоящего изобретения.

В некоторых вариантах последовательность регуляции транскрипции содержит последовательность регуляции транскрипции КаЬ17.

В используемом в настоящем описании смысле термин последовательность регуляции транскрипции КаЬ17 относится к любой последовательности регуляции транскрипции, которая получена из гена КаЬ17 растения.

Ген КаЬ17 также может быть известен под другими названиями, включая, например, беНубгшЕ ύΐιηΐ или 1еа2. Примером гена КаЬ17 является ген КаЬ17 2еа тауз, описанный под номером Еп1гс/ Оеие ОеиеГО: 542373.

Ген КаЬ17 из 2еа тауз индуцируется АВА и недостатком воды. Он имеет сходство по последовательности с основной группой белков, присутствующих в большом количестве на поздних стадиях развития зародыша. Представители данного надсемейства белков конститутивно экспрессируются в зрелых зародышах и в некоторых случаях в эндосперме и могут быть активированы в остальных тканях растения несколькими формами осмотического стресса, такого как водный, солевой и холодовый стресс. Гены, сходные с КаЬ17 кукурузы были выделены из некоторых других растений, и проведено тестирование активности промоторов некоторых из таких генов. Продукт гена КаЬ17 кукурузы может связывать последовательность сигнала ядерной локализации (ΝΓδ), и такое связывание зависит от фосфорилирования протеинкиназой СК2.

Гомологи КаЬ17 также были идентифицированы в ряде других видов растений, и следует понимать, что термин ген КаЬ17 в используемом в настоящем описании смысле охватывает все такие гомологи.

В некоторых вариантах ссылка в настоящем описании на ген КаЬ17 может включать гены, которые кодируют полипептид, имеющий по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичность последовательности с последовательностью полипептида КаЬ17 2еа тауз, которая указана в базе данных по белкам Еп1ге/ с номером доступа ΝΡ_001105419.

При сравнении аминокислотных последовательностей с целью вычисления идентичности в процентах сравниваемые последовательности необходимо сравнивать на протяжении окна сравнения по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 аминокислотных остатков, по меньшей мере 150 аминокислотных остатков или на протяжении полной длины ΝΡ 001105419. Окно сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пробелы), на долю которых приходится около 20% или меньше от эталонной последовательности (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания в окне сравнения можно осуществлять с использованием компьютеризированных алгоритмов, таких как семейство программ ВЬА8Т, которые описаны, например, АПзс1ш1 с соавт. (Νιιαί. Асίάδ Кез. 25: 3389-3402, 1997). Подробное обсуждение анализа последовательностей можно найти в главе 19.3 в публикации Аи8иЬе1 с соавт. (Сиггеи! Рго1осо1з ίη Мо1еси1аг В|о1оду 1ойи \УПеу аиб §оиз 1пс, 19941998, СЬар1ег 15, 1998).

В некоторых вариантах указание в настоящем описании гена КаЬ17 может включать гены, которые кодируют мРНК, имеющую по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичность последовательности с последовательностью мРНК КаЬ17 2еа тауз, которая указана в базе данных по нуклеотидным последовательностям ЕЩге/ с номером доступа ΝΜ_001111949.

При сравнении нуклеотидных последовательностей с целью вычисления идентичности в процентах сравниваемые последовательности необходимо сравнивать на протяжении окна сравнения, включающего в себя по меньшей мере 100 нуклеотидных остатков, по меньшей мере 200 нуклеотидных остатков, по меньшей мере 400 нуклеотидных остатков, по меньшей мере 600 нуклеотидных остатков или полную длину ΝΜ 001111949. В некоторых вариантах окно сравнения может содержать по меньшей мере 100 нуклеотидных остатков, по меньшей мере 200 нуклеотидных остатков, по меньшей мере 400 нуклеотидных остатков или полную длину кодирующей СГО8 последовательности в ΝΜ 001111949. Окно сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пробелы), составляющие около 20% или меньше от эталонной последовательности (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания в окне сравнения можно осуществлять с использованием компьютеризированных алгоритмов, таких как

- 4 026277 семейство программ ВЬА§Т, которые, например, описаны АЙкс1ш1 с соавт. (Ыис1. Ашбк Кек. 25: 33893402, 1997). Подробное обсуждение анализа последовательностей можно найти в главе 19.3 в публикации АикиЬе1 с соавт. (Ситгеп! Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду 1ойп \УПсу апб §опк 1пс, 1994-1998, Сйар1ет 15, 1998).

Ген КаЬ17 также может включать нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, указанную в базе данных по нуклеотидным последовательностям с номером доступа ΝΜ 001111949, в жестких условиях.

В используемом в настоящем описании смысле условия жесткости гибридизации будут представлять собой условия, при которых концентрация соли составляет менее чем примерно 1,5 М ионов Να, обычно концентрация ионов Να составляет примерно от 0,01 до 1,0 М (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3 и температуре по меньшей мере 30°С. Условия жесткости также могут быть достигнуты с использованием добавления дестабилизирующих средств, таких как формамид. В некоторых вариантах условия жесткости гибридизации могут представлять собой условия низкой жесткости, условия умеренной жесткости или условия высокой жесткости. Примеры условий низкой жесткости включают гибридизацию с использованием буферного раствора, содержащего от 30 до 35% формамида, 1 М №С1, 1% §Ό§ (додецилсульфат натрия), при 37°С и промывку с 1-кратном - 2-кратном §§С (20х§§С=3,0 М №С1/0,3 М цитрат тринатрия) при 50-55°С. Примеры условий умеренной жесткости включают гибридизацию в 40-45% формамиде, 1,0 М №С1, 1% §Ό§ при 37°С и промывку в 0,5-кратном - 1-кратном §§С при 55-60°С. Примеры условий высокой жесткости включают гибридизацию в 50% формамиде, 1 М №С1, 1% §Ό§ при 37°С и промывку в 0,1х§§С при 60-65°С. Необязательно буферы для промывки могут содержать примерно от 0,1% до, примерно 1% §Ό§. Продолжительность гибридизации обычно составляет менее чем примерно 24 ч, обычно примерно от 4 до примерно 12 ч.

Специфичность гибридизации также является функцией промывок после гибридизации, при этом решающими факторами являются ионная сила и температура раствора для конечной промывки. В случае ДНК-ДНК-гибридов температуры точка плавления (Т_т) может быть аппроксимирована из уравнения Ме1пко1й и \\аН1 (Апа1. Вюсйет. 138: 267-284, 1984), т.е. Тт=81,5°С+16, 6 (1од М)+0,41 (% ОС-0,61 (% формамида)-500/л; где М означает молярность одновалентных катионов, % ОС означает процентное содержание гуанозиновых и цитозиновых нуклеотидов в ДНК, % формамида означает процентное содержание формамида в растворе для гибридизации, и Ь означает длину гибрида в парах оснований. Т_т означает температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% комплементарной последовательности-мишени гибридизуется с точно совпадающим зондом. Т_т снижается примерно на 1°С для каждого 1% ошибочного спаривания; таким образом, Т_т, условия гибридизации и/или промывки можно корректировать для гибридизации с последовательностями разной степени комплементарности. Например, последовательности, идентичные >90%, могут быть гибридизованы при снижении Т_т примерно на 10°С. Обычно условия жесткости выбирают так, чтобы они были примерно на 5°С ниже, чем Т_т для конкретной последовательности и ее комплемента при определенной ионной силе и рН. Однако в случае условий высокой жесткости можно использовать гибридизацию и/или промывку, например, при температуре на 1-3 или 4°С ниже, чем Тт; в случае условий умеренной жесткости можно использовать гибридизацию и/или промывку, например, при температуре на 6-9 или 10°С ниже, чем Тт; в случае условий низкой жесткости можно использовать гибридизацию и/или промывку, например, при температуре на 11-15 или 20°С ниже, чем Тт. При использовании описанного уравнения, составов растворов для гибридизации и промывки и требуемого Т_т специалистам будет понятно, что, по существу, описаны вариации условий жесткости гибридизации и/или растворов для промывки. Если требуемая степень ошибочного спаривания приводит к Т_т менее, чем 45°С (водный раствор) или 32°С (раствор с формамидом), то предпочтительно увеличение концентрации §§С для того, чтобы использовать более высокую температуру. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот приведено в публикациях Туккеп (ЬаЬота1оту Тесйпцщек ш ВюсйепйкКу апб Мо1еси1аг Вюкду-НуЬпШкаОоп \\йй №с1ею Лаб РгоЬек, Ρΐ I, Сйар1ет 2, Е1кеу1ет, №ν Уотк, 1993), АикиЬе1 с соавт. (Ситгеп! Рто1осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, Сйар1ет 2, Отеепе РиЬйкЫпд апб ^беу-1п1егкс1епсе, №ν Уотк, 1995) и §атЬгоок с соавт. (Мо1еси1аг С1ошп§: А ЬаЬота1огу Мапиа1, 2'¹ еб., Со1б §рппд НагЬог ЬаЬота1огу Ргекк, Р1ату1е№, ΝΥ, 1989).

В некоторых вариантах примеры генов КаЬ17 включают гены, кодирующие мРНК КаЬ17, приведенные в таблице ниже.

- 5 026277

Таблица 2

Примеры генов КаЪ17

Номер доступа в базе данных Еп(егег ΝιιοΙβοΐάβ(ΜΡΗΚ)	Организм-источник
ΑΙ606474	Ра§из зуЬаИса
Х63061	Р[$ит заИгтт
ΕΙ)791889	Слскогшт т1уЬи$
ΝΜ 001111949	Ζβα тауз
Х15288	Ногйеит ик1§аге
Х15290	Ζΰα тауз
АМ180925	Ае%Иор$ итЪе11и1<йа
А1844000	Р1<т1а$о туаг
00487106	Ралах §1л$еп§
АМ161646	М&Нса$о $αΗνα
ΑΥ130998	Вгаззгса ]ипсеа
ΑΥ786415	Οη/ζα заНиа
ΑΥ607705	(2иегсиз гоЬиг
ΑΥ303803	Вгазз&а париз
ΑΙ300524	Рори1и$ еигатепсапа
ΑΙ289610	Ρίίΐιΐί зу/гегЩ'з
АБ109916	Р1сеа$1аиса
АР159804	νίχηα ип§шси1а1а
АР181451	НогАеит ии1§аге
Υ15813	5о1апит соттегзопи
1Л1696	5ог§кит Ысо1ог
Х74067	Сга&юзИ&па ρΐαηίαξίη&ιτη

Как указано выше, в некоторых вариантах настоящее изобретение охватывает последовательности регуляции транскрипции, полученные из гена КаЫ7.

Термин полученные из в используемом в настоящем описании смысле относится к источнику последовательности регуляции транскрипции. Например, последовательность регуляции транскрипции полученная из гена КаЪ17 относится к последовательности регуляции транскрипции, которая в своем нативном состоянии функционально связана с геном КаЪ17.

Последовательности регуляции транскрипции КаЪ17, описанные в настоящей публикации, могут быть получены из любого источника, включая последовательности, выделенные из любого подходящего организма, или они могут представлять собой синтетические молекулы нуклеиновых кислот.

В некоторых вариантах последовательности регуляции транскрипции КаЪ17, описанные в настоящей публикации, получены из растения. В некоторых вариантах последовательности регуляции транскрипции, согласно настоящему изобретению, получены из вида однодольного растения и в некоторых вариантах последовательности регуляции транскрипции, согласно настоящему изобретению, получены из вида растения, относящегося к зерновым культурам. В некоторых вариантах последовательность регуляции транскрипции получена из Ζοη таук.

Последовательности регуляции транскрипции могут быть выделены из генов КаЪ17 с использованием способов, известных в данной области. Такие способы могут быть основаны на использовании гомологии последовательности кодирующей области КаЪ17. Например, вся или часть последовательности кодирующей области КаЪ17 может быть использована в качестве зонда для гибридизации с гомологичными последовательностями в библиотеке геномной ДНК выбранного организма. Способы легкодоступны в области гибридизации последовательностей нуклеиновых кислот. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот приведено в публикациях Туккси, ЬаЪога1огу ТссНшсщск ίη ВюсНспикЦу аиб Мо1сси1аг ВЫоду-НуЪпД/аПоп \νί11ι Ыискю Ашб РгоЪск, Рай I, СНар1сг 2 Оусгуюту о£ ргшщркк о£ НуЪпД/аЦоп аиб !йс к!га1с§у о£ иис1сю ааб ргоЪс аккаук, Е1ксуюг, Ысте Уогк (1993); аиб Сиггси! Рго1осо1к ίη Мо1сси1аг Вю1о§у, 25 Сйар1сг 2, АикиЪс1, с! а1., Ебк., Сгссис РиЪйкЫид аиб АйсуЛйсгксюисс, Ысте Уогк (1995). Дополнительные примеры способов выделения промоторов или других последовательностей регуляции транскрипции из гена растения описаны в АО 2007/092992, АО 2008/052285, А02009/033229, АО 2007/137361 и 2007/048207. Как будет понятно, ряд других способов ш уйго и ш кШсо для идентификации промоторов, ассоциированных с конкретным геном растения, таким как КаЪ17, может быть определен специалистом в данной области.

- 6 026277

Примеры последовательностей регуляции транскрипции КаЫ7 включают последовательности, описанные ВисНаиаи с соавт. (Оеиейск 168(3): 1639-1654, 2004).

В некоторых вариантах последовательность регуляции транскрипции КаЫ7, используемая согласно настоящему изобретению, может представлять собой последовательность регуляции транскрипции КаЫ7 2еа таук или ее функционально активный фрагмент или вариант.

Промотор КаЫ7 2еа таук тестировали в нескольких гетерологичных системах. Во-первых, промотор тестировали в стабильно трансформированном табаке и в случае временной экспрессии в протопластах риса, и в обоих случаях показана индукция промотора стрессом, вызванным недостатком воды, и/или обработкой АВА. Активность фрагмента промотора КаЫ7 длиной 1,3 т.п.н., слитого с геном ОИ8, анализировали в трансгенных растениях АгаЬИоркн дикого типа, а также мутантах АтаЫборк1к с недостаточностью АВА и нечувствительных к АВА. Хотя промотор КаЫ7 был активным в зародыше и эндосперме на поздних стадиях развития семени, во время прорастания семян активность промотора снижалась, и активность ОИ8 не усиливалась под влиянием АВА и недостатка воды в трансгенных растениях дикого типа и мутантных растениях. Полученные данные свидетельствуют, что специфичную для семян экспрессию и индукцию промотора КаЫ7, вызванную АВА и стрессом в результате недостатка воды, опосредуют разные молекулярные механизмы, и показывают, что механизмы индукции стрессом различны у кукурузы и АтаЫборык. Филогенетический анализ 5'-некодирующих областей из семейства генов КаЫ6/17 сорго, кукурузы и риса выявил отсутствие некоторых важных цис-элементов в промоторах и некоторые различия в экспрессии В.аЫ7-подобных генов у таких растений.

В некоторых вариантах последовательность регуляции транскрипции КаЫ7 2еа таук или ее функционально активный фрагмент или вариант содержит нуклеотидную последовательность, указанную в 8ЕО ГО N0:1, или ее функционально активный фрагмент или вариант.

Несмотря на указанное выше, было показано, что последовательность регуляции транскрипции КаЫ7 2еа таук обычно имеет относительно высокий уровень основной экспрессии, т.е. экспрессии в отсутствие засухи, при экспрессии в гетерологичном виде растения.

Однако согласно настоящему изобретению неожиданно было обнаружено, что последовательность регуляции транскрипции КаЫ7 2еа таук индуцируется засухой в растении пшеницы, при этом также, по существу, отсутствует основная активность у пшеницы в отсутствие засухи.

Кроме того, как описано далее, трансгенные растения пшеницы, которые экспрессировали ЭВЕВкодирующие нуклеотидные последовательности, функционально связанные с промотором КаЫ7 2еа таук, также не проявляли нежелательных признаков в развитии, подобных замедленному росту, карликовости, запоздалому цветению и более мелким колосьям, которые наблюдали у растений с конститутивной сверхэкспрессией факторов ЭВЕВ.

Таким образом, в некоторых вариантах первого аспекта изобретения последовательность регуляции транскрипции содержит последовательность регуляции транскрипции В.аЫ7 2еа таук или ее функционально активный фрагмент или вариант, и растение представляет собой растение пшеницы, которое описано выше.

Функционально активные фрагменты или функционально активные варианты последовательности регуляции транскрипции В.аЫ7 2еа таук могут включать фрагменты или варианты последовательности регуляции транскрипции, которые сохраняют функциональную активность последовательности регуляции транскрипции В.аЫ7 2еа таук, которая описана выше. В некоторых вариантах функционально активный фрагмент или вариант, по меньшей мере, проявляет способность к индуцированию засухой у пшеницы, при этом также, по существу, не обладает основной активностью у пшеницы в отсутствие засухи.

В некоторых вариантах изобретения функционально активный фрагмент имеет длину по меньшей мере 200 нуклеотидов (н.), по меньшей мере 300 н., по меньшей мере 400 н., по меньшей мере 500 н. или по меньшей мере 600 н. В следующих вариантах фрагмент содержит по меньшей мере 200, по меньшей мере 300, по меньшей мере 400, по меньшей мере 500 или по меньшей мере 600 следующих друг за другом нуклеотидных оснований из нуклеотидной последовательности, указанной в 8ЕО ГО N0: 1.

Функциональное активные варианты могут включать ортологические последовательности регуляции транскрипции из других организмов; мутанты последовательности регуляции транскрипции; варианты последовательности регуляции транскрипции, в которых один или несколько нуклеотидов в последовательности были заменены, добавлены или делетированы; и аналоги, которые содержат одно или несколько модифицированных оснований или ДНК- или РНК-остовы, модифицированные для стабильности или по другим причинам.

Как будет понятно, функционально активные фрагменты или варианты последовательности регуляции транскрипции В.аЫ7 2еа таук могут включать последовательности регуляции транскрипции, выделенные из других растений, и/или синтетические нуклеотидные последовательности.

В некоторых вариантах функционально активный фрагмент или вариант имеет по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%,

- 7 026277 по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичность нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, указанной в §ЕЦ ГО N0:1. При сравнении последовательностей нуклеиновых кислот для вычисления идентичности в процентах сравниваемые нуклеотидные последовательности следует сравнивать на протяжении окна сравнения, содержащего по меньшей мере 200 н., по меньшей мере 300 н., по меньшей мере 400 н., по меньшей мере 500 н., по меньшей мере 600 н., или полную длину последовательности §ЕЦ ГО N0:1. Окно сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пробелы), составляющие примерно 20% или меньше от эталонной последовательности (которая не содержит добавлений или делеций), для оптимального выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания в окне сравнения можно осуществлять, как описано выше.

В некоторых вариантах функционально активный фрагмент или вариант содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, определяющей последовательность регуляции транскрипции согласно настоящему изобретению, в жестких условиях. В некоторых вариантах функционально активный фрагмент или вариант содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, указанную в §ЕЦ ГО N0:1, в жестких условиях.

В некоторых вариантах жесткие условия могут представлять собой условия, описанные выше.

Настоящее изобретение можно применять для того, чтобы оказать влияние на специфичную для засухи экспрессию любой представляющей интерес нуклеотидной последовательности в одной или нескольких клетках растения.

В некоторых вариантах представляющая интерес нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, которая при экспрессии одной или несколькими клетками растения повышает засухоустойчивость растения.

Засухоустойчивость в используемом в настоящем описании смысле относится к любому свойству растения, которое позволяет растению выживать, восстанавливаться и/или размножаться во время или после воздействия засухи. Меры засухоустойчивости могут включать, например, способность растения продолжать расти, размножаться или давать урожай во время или после эпизода засухи; скорость или частоту восстановления растений после эпизода засухи; степень любой потери урожая, даваемого растением после перенесенного эпизода засухи; эффективность использования воды растением; и тому подобные. Повышение засухоустойчивости растения следует рассматривать, как любое увеличение способности растения выживать, восстанавливаться или размножаться во время или после перенесенной засухи. Например, повышенная засухоустойчивость растения может включать повышенную способность растения продолжать расти, размножаться или давать урожай во время или после эпизода засухи и/или при более низкой влажности почвы; повышенную скорость или частоту восстановления растений после эпизода засухи; уменьшение или ослабление любой потери урожая, ассоциированной с эпизодом засухи; повышенную эффективность использования воды растением; и тому подобное.

Примерами нуклеотидной последовательности, которая при экспрессии одной или несколькими клетками растения, повышает засухоустойчивость растения являются, например, гены, кодирующие факторы транскрипции, такие как факторы ОКЕВ, факторы МУС, факторы ΜΥΒ, факторы ΗΌΖίρ, факторы ΟΖίρ. факторы ΗδΕ, факторы ЕКР, факторы ^ΚΚΥ и т.д.; гены, кодирующие протеинкиназы, которые активируются или подвергаются повышающей регуляции транскрипции вод влиянием стресса, вызванного засухой, такие как 8ΑΡΚ, рецепторные киназы, МАР-киназы и тому подобные; гены, кодирующие фосфатазы, связанные с реакциями на стресс, такие как ΖтΡΡ2С, инозитол-5-фосфатаза типа 1 и тому подобные; индуцируемые стрессом гены, которые защищают целостность клеток (например, стабильность мембран, стабильность хлоропластов/хлорофилла, правильный фолдинг белка и стабильность белка и тому подобное), такие как ЬЕА, ΌΗΝ, СОК, КО и тому подобные; гены, кодирующие водные каналы, такие как аквапорины, ΡΙΡ, ΤΙΡ и ΝΙΡ; гены, кодирующие регуляторы открывания устьиц, такие как ΑΙΜΚΡ4, АВС-переносчик АВСС-типа плазматической мембраны замыкающих клеток, ΝΡΎΑ5 ΤΡ, NΑС и ΜΥΒ ΤΡ и тому подобные; гены, ответственные за метаболизм сахаров, такие как гены трегалоза6-фосфатсинтазы (ΤΡδ) и трегалоза-6-фосфатфосфатазы (ТРР), АВА2 (или нечувствительный к глюкозе 1 [ΟΙΝ1]), кодирующий короткоцепочечную дегидрогеназу/редуктазу; гены, замедляющие индуцированное засухой увядание листьев, такие как ген ассоциированной с увяданием рецепторной протеинкиназы (§АКК), ген, кодирующий зависимую от созревания/увядания рецепторную протеинкиназу.

В некоторых вариантах представляющая интерес нуклеотидная последовательность кодирует полипептид ОКЕВ.

Белки, связывающие элементы ответа на дегидратацию (ОКЕВ), или белки, связывающие Сповторы (СВР), относятся к первым открытым семействам факторов транскрипции, ответственных за регуляцию генов в условиях недостатка воды.

В некоторых вариантах полипептид ОКЕВ в используемом в настоящем описании смысле может содержать домен АР2. В некоторых вариантах полипептид ОКЕВ может содержать один домен АР2. Домен белка АР2 подробно описан под номером доступа рГат ΡΡ00847. В используемом в настоящем описании смысле термин белки, связывающие элементы ответа на дегидратацию или ОКЕВ также может

- 8 026277 охватывать белок, связывающий С-повтор, или СВР.

Примеры полипептидов ЭКЕВ/СВР включают полипептиды, имеющие следующие номера доступа в базе данных о белках Νί’ΒΙ:

из ТггНсюп певИрит - АВС86563; АВС86564; АВК55389; АВК55388;

АВК55387; АВК55386; АВК55385; АВК55384; АВК55383; АВК55382; АВК55381;

АВК55380; АВК55379; АВК55378; АВК55377; АВК55376; АВК55375; АВК55374;

АВК55373; АВК55372; АВ1У87011; АВК55390; АВК55389; АВК55388; АВК55387;

АВК55386; АВК55385; АВК55384; АВК55383; АВК55382; АВК55381; АВК55380;

АВК55379; АВК55377; АВК55376; АВК55375; АВК55374; АВК55373; АВК55372;

АВК55371; АВК55370; АВК55369; АВК55368; АВК55367; АВК55366; АВК55365;

АВК55364; АВК55363; АВК55362; АВК55361; АВК55360; АВК55359; АВК55358;

АВК55357; АВК55356; АВК55355; АВК55354; ΑΑΥ32564; ΑΑΥ32563; ΑΑΥ32562;

ΑΑΥ32561; ΑΑΥ32560; ΑΑΥ32558; ΑΑΥ32557; ΑΑΥ32556; ΑΑΥ32555; ΑΑΥ32554;

ΑΑΥ32553; ΑΑΥ32552; ΑΑΥ32551; ААХ28966; ААХ28965; ААХ28963; ААХ28962;

ААХ28961; АСК99532; АСВ69508; АСВ69507; АСВ69506; АСВ69505; АСВ69504;

АСВ69503; ΒΑΏ66926; ВАП66925; АВВ90544; АВА08426; АВА08425; АВА08424;

ААХ13287; ААХ13285; ААХ13287; ААХ13285; ААХ13289; ААХ13289; ААХ13289;

ААХ13287; ААХ13286; ААХ13285; ААХ13284; ААХ13283; ААХ13282; ААХ13279;

ААХ13278; ААХ13277; ААЕ05861; АВВ84399; ААХ28964; АВТО7014; ААХ13274 из ТгШсит топоаксыт - АВИГ87013; ЛБР.’87О12; АВТО7011; АВК55390; ΑΑΥ32550; ААХ28967;

из АецИарз греКоМег ьиЬьр. 5ре11ои1е$ - АСО35591; АСО35590; АСО35589; АСО35588; АСО35587; АСО35586; АСО35585; АСО35584; АСО35583; ΑΑΥ25517;

из НогЯеит гги1£аге вчЬвр. Уи1£аге - ААС59618; АВА25897; АВА25896; ΑΑΖ99830; ΑΑΖ99829; АСС63523; АВА25904; АВА01494; АВА01493; АВА01492; АВА01491; ААХ28957; ААХ28956; ААХ28955; ААХ28954; ААХ28953; ААХ28952; ААХ28950; ААХ28949; ААХ28948; ААХ23718; ААХ23714; ААХ23707; ААХ23704; ААХ23701; ААХ23698; ААХ23696; ААХ23692; ААХ23688; ААХ23684; ААХ23683; АВР18984; АВР18983; АВР18982; ААХ28951; ААХ23720; ААХ23719; ААХ23717;

ААХ23716; ААХ23715; ААХ23713; ААХ23712; ААХ23710; ААХ23709; ААХ23708; ААХ23706; ААХ23705; ААХ23703; ААХ23702; ААХ23700; ААХ23699; ААХ23697; ААХ23695; ААХ23694; ААХ23693; ААХ23691; ААХ23690; ААХ23689; ААХ23687; ААХ23686; ААХ23685; ААХ19267; ААХ19266 из АгОпОорыв НгаНапа - ΝΡ_849340; ΝΡ_564496; ΝΡ.181551; ΝΡ_177844;

ΝΡ_001031837; ΝΡ_567719; ΝΡ_563624; ΝΡ_196160; ΝΡ_201318; ΝΡ_191319;

ΝΡ_181186; ΝΡ_181368; ΝΡ_172721; ΝΡ_176620; ΝΡ_565609; ΝΡ_172723;

ΝΡ_001077764; ΝΡ_181566; ΝΡ.177681; ΝΡ_173355; ΝΡ.680184; ΝΡ.567867;

ΝΡ.567721; ΝΡ_567720; ΝΡ_565929; ΝΡ_564468; ΝΡ_200015; ΝΡ_200012; ΝΡ_201520;

ΝΡ.197953; ΝΡ.196720; ΝΡ.197346; ΝΡ.193098; ΝΡ.195688; ΝΡ.193408; ΝΡ.195408;

ΝΡ.194543; ΝΡ_195006; ΝΡ.191608; ΝΡ.190595; ΝΡ.187713; ΝΡ.179915; ΝΡ.181113;

ΝΡ.179810; ΝΡ_182021; ΝΡ_177887; ΝΡ.177631; ΝΡ_176491; ΝΡ_173695; ΝΡ_175104;

ΝΡ.173609; ΝΡ.177931; ΝΡ.174636; ΝΡ.177307; ΝΡ.177301; ΑΑΡ13384; ΑΑ500621;

ΑΑΟ39764; ΑΑΡ92125; ΑΑ1.40870; ААС59619; ΑΑΝ85707; ΝΡ_181186; ΑΑΧ57275;

(23Τ5Ν4; Ο0ΙΟΡ7; ГмИЗ'УЗ; (ΜΙ Α5; Ο64ΜΑ1; ΑΑΡ83325; ΑΑΡ83323; ΑΑΡ83324;

ΑΑΡ83322; ΑΑΡ83321; ΑΑΝ02487; ΑΑΝ02488; ΑΑΝ02486

В некоторых вариантах полипептид ΌΚΕΒ является ТаЭКЕВЗ-подобным полипептидом.

Термин ТаЭКЕВЗ-подобный полипептид в используемом в настоящем описании смысле следует понимать как любой полипептид ЭКЕВ. который имеет по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или 100% идентичность последовательности с последовательностью с номером доступа в базе данных по белкам

- 9 026277

Νί’ΒΙ АВС86564 и/или последовательностью СВТ/ОВЕ-связывающего фактора 5 (ΑΑΥ32551; МШет с1 а1., Мо1. Сепе1. Оеиотек 275(2), 193-203, 2006). При сравнении аминокислотных последовательностей для вычисления идентичности, в процентах сравниваемые последовательности следует сравнивать на протяжении окна сравнения, содержащего по меньшей мере 50 аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 аминокислотных остатков, по меньшей мере 150 аминокислотных остатков или полную длину АВС86564 и/или ΑΑΥ32551. Окно сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пробелы), составляющие примерно 20% или меньше по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций), для оптимального выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения в окне сравнения можно осуществлять с использованием компьютеризированных алгоритмов, таких как семейство программ ВЬА§Т, которые описаны выше.

В некоторых вариантах ТаЭВЕВ3-подобный полипептид содержит полипептид, кодируемый мРНК, содержащей нуклеотидную последовательность, указанную в NСВI с номером доступа ЭО353853.

В некоторых вариантах полипептид ЭВЕВ является ТаЭВЕВ2-подобным полипептидом.

ТаЭВЕВ2-подобный полипептид в используемом в настоящем описании смысле следует понимать как любой полипептид ЭВЕВ, который имеет, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичность последовательности с последовательностью в базе данных по белкам NСΒI с номером доступа АВС86563 и/или ТNΥ (ΊΊΝΥ) из А. ШаПаиа, (ΝΡ_197953; \\ΊΕοιι е! а1., Р1аШ Се11 8(4): 659-671, 1996). При сравнении аминокислотных последовательностей для вычисления идентичности, в процентах сравниваемые последовательности следует сравнивать на протяжении окна сравнения, содержащего по меньшей мере 50 аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 аминокислотных остатков, по меньшей мере 150 аминокислотных остатков или полную длину АВС86563 и/или ΝΡ_197953. Окно сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пробелы), составляющие примерно 20% или меньше по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций), для оптимального выравнивания двух последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения в окне сравнения можно осуществлять с использованием компьютеризированных алгоритмов, таких как семейство программ ВЬА§Т, которые описаны выше.

В некоторых вариантах ТаЭВЕВ2-подобный полипептид содержит полипептид, кодируемый мРНК, содержащей нуклеотидную последовательность, указанную в NСΒI с номером доступа ЭО353852.

В некоторых вариантах полипептид ЭВЕВ получают из растения пшеницы, которое описано выше.

Устойчивость трансгенных растений с повышенными уровнями некоторых факторов транскрипции ЭВЕВ/СВЕ, по меньшей мере, отчасти является результатом активации генов, кодирующих белки, в большом количестве присутствующие на поздних стадиях развития зародыша (ЬЕА), известные также как дегидрины (ΌΗΝ), и генов, отвечающих на холод (СОВ). Гены ЬЕА являются активными во время созревания зародыша и при потере влаги семенами, как в зародыше, так и в эндосперме. Гены также индуцируются условиями стресса, вызываемыми засухой, холодом и солью, в вегетативных тканях. Продукты таких генов часто являются довольно гидрофобными, и могут быть вовлечены в непосредственную защиту клетки от стресса за счет повышения стабильности мембраны и предотвращения неправильной укладки белков. Акклиматизация растений к холоду приводит к накоплению ЬЕА и повышает морозоустойчивость. Сверхэкспрессия конкретных белков ЬЕА в некоторых случаях приводит к повышению устойчивости к стрессу.

Таким образом, в некоторых вариантах экспрессия полипептида ЭВЕВ в растении дополнительно может обеспечивать повышающую регуляцию экспрессии одного или нескольких белков ЬЕА, ΌΗΝ или СОВ.

В свете указанного выше, в некоторых вариантах настоящее изобретение относится к способу повышения засухоустойчивости растения, включающему экспрессию представляющей интерес нуклеотидной последовательности, которая при экспрессии одной или несколькими клетками растения повышает засухоустойчивость растения функционально связанной с индуцируемой засухой последовательностью регуляции транскрипции, которая, по существу, не обладает основной активностью в растении в отсутствие засухи, как описано выше.

Как указано выше, настоящее изобретение предусматривает экспрессию представляющей интерес нуклеотидной последовательности под контролем индуцируемой засухой последовательности регуляции транскрипции, которая, по существу, не обладает основной активностью в растении в отсутствие засухи.

В некоторых вариантах такую экспрессию осуществляют посредством введения в растение нуклеиновой кислоты, которая содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, функционально связанную с индуцируемой засухой последовательностью регуляции транскрипции, которая, по существу, не обладает основной активностью в растении в отсутствие засухи.

Молекула нуклеиновой кислоты может быть введена в растение любым способом, известным в данной области. Например, эксплантат или культивируемая ткань растения могут быть трансформирова- 10 026277 ны молекулой нуклеиновой кислоты, при этом после этого эксплантат или культивируемую ткань растения регенерируют в зрелое растение, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты; нуклеиновой кислотой можно непосредственно трансформировать семя растения, либо стабильно, либо временно; нуклеиновая кислота может быть введена в семя в результате селекции растений с использованием исходного растения, которое несет молекулу нуклеиновой кислоты; и тому подобное.

В некоторых вариантах молекулу нуклеиновой кислоты вводят в растительную клетку в результате трансформации. Растения могут быть трансформированы любым способом, известным в данной области, который подходит для конкретного вида растения. Обычные способы включают опосредованную АдгоЬасЮгшт трансформацию, основанные на бомбардировке микрочастицами способы трансформации и способы, основанные на прямом поглощении ДНК. В обзоре Роа-Ройпдие/ с соавт. (АдгоЬас1егшттей1а!ей 1гаи8£огтайои о£ р1аи18, 3^гй Ей. САМВ1А 1п1с11сс1иа1 Ргорейу Рсюнгсс. СаиЬегга, АикйаНа, 2003) описано широкое множество подходящих способов опосредованной АдгоЬас1егшт трансформации для широкого диапазона видов растений. Также могут быть использованы другие способы опосредуемой бактериями трансформации растений, смотри, например, публикацию Вгоо1Ьаей8 с соавт. (2005, выше). Бомбардировка микрочастицами также может быть использована для трансформации растительной ткани, и обзор способов трансформации растений, в частности зерновых растений, приведен в публикации Са§а8 с соавт. (Р1ап1 Вгеейтд Кеу. 13: 235-264, 1995). Примеры протоколов трансформации на основе прямого поглощения ДНК, такие как трансформация протопластов и электропорация, подробно описаны Оа1ЬгаИЬ с соавт. (Ме1йой8 ίη Се11 Вю1оду Уо1. 50, Асайепис Рге88, 8аи П1едо, 1995). Кроме указанных выше способов также можно применять ряд других протоколов трансформации. Такие способы включают инфильтрацию, электропорацию клеток и тканей, электропорацию зародышей, микроинъекцию, трансформацию с использованием пути проникновения пыльцевой трубки, опосредованную карбидом кремния и липосомами трансформацию. Обзор способов, таких как способы, указанные выше, приведен в публикации Ракос/у-Тго)апо\У5ка (Се11. Мо1. Вю1. Ье11. 7: 849-858, 2002). Ряд других способов трансформации растения также могут быть известны специалистам в данной области, и соответственно настоящее изобретение следует считать никоим образом не ограниченным конкретными способами трансформации растений, примеры которых приведены выше.

Как будет понятно специалисту в данной области, встраивание нуклеиновой кислоты в геном клетки-мишени может представлять собой либо неспецифичную для сайта инсерцию с использованием стандартных векторов и протоколов трансформации, либо сайт-специфичную инсерцию, например, как описано Тегайа с соавт. (Ыа1. Вю1есЬио1 20: 1030-1034, 2002).

Во втором аспекте настоящее изобретение также относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей представляющую интерес нуклеотидную последовательность, функционально связанную с индуцируемой засухой последовательностью регуляции транскрипции, которая, по существу, не обладает основной активностью в растении в отсутствие засухи.

Конструкция нуклеиновой кислоты согласно второму аспекту настоящего изобретения может содержать любой полирибонуклеотид или полидезоксирибонуклеотид, который может представлять собой немодифицированную РНК или ДНК или модифицированную РНК или ДНК. Например, конструкция нуклеиновой кислоты может содержать одно- и/или двухнитевую ДНК, ДНК, которая является смесью одно- и двухнитевых областей, одно- и двухнитевую РНК и РНК, которая является смесью одно- и двухнитевых областей, гибридные молекулы, содержащие ДНК и РНК, которые могут быть однонитевыми, или более обычно двунитевыми или смесью одно- и двухнитевых областей. Кроме того, конструкция нуклеиновой кислоты может содержать трехнитевые области, содержащие РНК или ДНК или одновременно РНК и ДНК. Конструкция нуклеиновой кислоты также может содержать одно или несколько модифицированных оснований или остовов ДНК или РНК, модифицированных для стабильности или по другим причинам. В ДНК или РНК может быть осуществлено множество модификаций; таким образом, термин конструкция нуклеиновой кислоты охватывает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы.

В некоторых вариантах конструкция нуклеиновой кислоты содержит ДНК. Соответственно конструкция нуклеиновой кислоты может содержать, например, линейную молекулу ДНК, плазмиду, транспозон, космиду, искусственную хромосому и тому подобное. Кроме того, конструкция нуклеиновой кислоты может представлять собой отдельную молекулу нуклеиновой кислоты или может быть частью более крупной молекулы нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах индуцируемая засухой последовательность регуляции транскрипции, которая, по существу, не обладает основной активностью в растении в отсутствие засухи, может представлять собой последовательность, которая описана выше.

В некоторых вариантах последовательность регуляции транскрипции индуцируется засухой у пшеницы и, по существу, не обладает основной активностью у пшеницы в отсутствие засухи.

В некоторых вариантах последовательность регуляции транскрипции содержит последовательность регуляции транскрипции КаЬ17, которая описана выше.

В некоторых вариантах последовательность регуляции транскрипции содержит последовательность регуляции транскрипции КаЬ17 2еа тау8 или ее функционально активный фрагмент или вариант, кото- 11 026277 рые описаны выше.

В некоторых вариантах представляющая интерес нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, которая при экспрессии одной или несколькими клетками растения повышает засухоустойчивость растения, которая описана выше.

В некоторых вариантах представляющая интерес нуклеотидная последовательность кодирует полипептид ΌΚΕΒ, который описан выше. В некоторых вариантах полипептид ΌΡΕΒ представляет собой ТаЭКЕВ3-подобный полипептид или ТаЭКЕВ2-подобный полипептид, который описан выше.

В некоторых вариантах конструкция нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать нуклеотидную последовательность, определяющую терминатор транскрипции. Термин терминатор транскрипции или терминатор относится к последовательности ДНК на конце транскрипционной единицы, которая подает сигналы окончания транскрипции. Терминаторы обычно представляют собой 3'нетранслируемые последовательности ДНК и могут содержать сигнал полиаденилирования, который облегчает добавление полиаденилатных последовательностей к 3'-концу первичного транскрипта. Как и в случае промоторных последовательностей, терминатор может представлять собой любую последовательность терминатора, которая является функциональной в клетках, тканях или органах, в которых предполагается ее использование. Примеры подходящих последовательностей терминатора, которые можно использовать в растительных клетках, включают: терминатор нопалинсинтазы (поз), терминатор СаМУ 358. терминатор октопинсинтазы (осз), терминаторы гена ингибитора протеиназы (ρίη), такие как терминаторы ρίηΙΙ и ρίηΙΙΙ, и тому подобные.

Конструкции нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению дополнительно могут содержать другие необходимые нуклеотидные последовательности. Например, конструкция нуклеиновой кислоты может включать начало репликации одного или нескольких хозяев; ген селектируемого маркера, который активен в одном или нескольких хозяевах, или тому подобные.

В используемом в настоящем описании смысле термин ген селектируемого маркера включает любой ген, который придает определенный фенотип клетке, в которой он экспрессируется, для облегчения идентификации и/или селекции клеток, которые трансфицированы или трансформированы конструкцией нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Ряд нуклеотидных последовательностей, кодирующих подходящие селектируемые маркеры, известны в данной области. Примеры нуклеотидных последовательностей, которые кодируют селектируемые маркеры, включают: гены резистентности к антибиотикам, такие как гены резистентности к ампициллину, гены резистентности к тетрациклину, гены резистентности к канамицину, ген ΑυΚΙ-С, который придает резистентность к антибиотику ауреобазидину А, гены неомицинфосфотрансфераз (например, ηρΐΙ и ηρΐΙΙ) и гены гигромицинфосфотрансфераз (например, Ηρΐ); гены резистентности к гербицидам, включая гены резистентности к глюфосинату, фосфинотрицину или биалафосу, такие как гены, кодирующие фосфинотрицинацетилтрансферазу (например, Ьат), гены резистентности к глифосату, включая гены, кодирующие З-еноилпирувилшикимат-5фосфатсинтазу (например, агоА), гены резистентности к бромикснилу, включая гены, кодирующие бромикснилнитрилазу, гены резистентности к сульфонамидам, включая гены, кодирующие дигидроптератсинтазу (например, 8и1), и гены резистентности к сульфонилмочевинам, включая гены, кодирующие ацетолактатсинтазу; репортерные гены, кодирующие ферменты, такие как гены, кодирующие Ουδ и хлорамфениколацетилтрансферазу (САТ); гены флуоресцирующих репортеров, такие как ген, кодирующий зеленый флуоресцирующий белок, и гены основанных на люминесценции репортеров, такие как, наряду с прочими, ген люциферазы.

Генетические конструкции, описанные в настоящей публикации, дополнительно могут включать нуклеотидные последовательности, предназначенные для поддержания и/или репликации генетической конструкции у прокариот или эукариот, и/или для интеграции генетической конструкции или ее части в геном эукариотической или прокариотической клетки.

В некоторых вариантах конструкция согласно изобретению приспособлена, по меньшей мере, для частичного переноса в клетку растения посредством опосредованной А§тоЬас1етшт трансформации. Соответственно в некоторых вариантах конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательности левой и/или правой границ Т-ДНК. Подходящие последовательности границ Т-ДНК могут быть легко определены специалистом в данной области. Однако следует понимать, что термин последовательности границ Т-ДНК включает, например, любую из имеющих значительную гомологию и представляющих собой прямые повторы нуклеотидных последовательностей, которые определяют границы молекулы нуклеиновой кислоты, которую переносят из клетки АдгоЬас1епшп §ρ. в растительную клетку, чувствительную к трансформации, опосредованной АдгоЬас1епшп. В качестве примера может быть приведена ссылка на публикацию РетаДа и Кеат (Ргос. №11. Асай. δα. υδΑ, 82(15): 5112-5116, 1985) и обзор Ое1уш (МютоЬю1о§у апй Мо1еси1аг Вю1о§у Кеу1е№8, 67 (1): 16-37, 2003).

В некоторых вариантах настоящее изобретение также охватывает любые подходящие модификации генетической конструкции, которые облегчают опосредованное бактериями встраивание в растительную клетку посредством других бактерий, отличных от АдгоЬасЮгшт §ρ., например, как описано в публикации Втоойаейк с соавт. (Ыа1иге 433: 629-633, 2005).

Специалистам в данной области будет известно, как получить конструкции, описанные в настоящей

- 12 026277 публикации, и каковы требования для получения их экспрессии, когда это необходимо, в конкретной клетке или типе клеток в требуемых условиях. В частности, специалистам в данной области будет известно, что генетические манипуляции, необходимые для осуществления настоящего изобретения, могут требовать размножения генетической конструкции, описанной в настоящей публикации, или ее производного в прокариотической клетке, такой как клетка Е. сой, или в растительной клетке или клетке животного. Примеры способов клонирования молекул нуклеиновой кислоты описаны БатЪтоок с соавт. (Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЪота1огу Мапиа1, СоИ §ртшд Нагйот йаЪогаЮгу Рте88, №ν Уотк, 2000).

В используемом в настоящем описании смысле генетически модифицированная клетка включает любую клетку, содержащую не встречающуюся в природе и/или введенную нуклеиновую кислоту. Обычно в случае клеток согласно третьему аспекту настоящего изобретения введенная и/или не встречающаяся в природе нуклеиновая кислота содержит конструкцию согласно второму аспекту изобретения.

Клетки согласно третьему аспекту изобретения могут представлять собой трансформированные клетки, которые содержат конструкцию согласно второму аспекту изобретения или ее интегрированную в геном форму, или потомство таких трансформированных клеток, которые сохраняют конструкцию или ее интегрированную в геном форму.

Как указано выше, конструкция нуклеиновой кислоты может поддерживаться в клетке в виде молекулы нуклеиновой кислоты, в виде автономно реплицирующегося генетического элемента (например, плазмиды, космиды, искусственной хромосомы или тому подобного) или может быть интегрирована в геномную ДНК клетки.

В используемом в настоящем описании смысле следует понимать, термин геномная ДНК в его наиболее широком контексте включает любую или все эндогенные ДНК, которые образуют генетический набор клетки. В связи с этим следует понимать, что геномная ДНК клетки включает хромосомы, митохондриальную ДНК, ДНК пластид, ДНК хлоропластов, эндогенную плазмидную ДНК и тому подобные. Как таковой термин интегрированная в геном охватывает хромосомную интеграцию, интеграцию в митохондриальную ДНК, интеграцию в ДНК пластид, интеграцию в ДНК хлоропластов, интеграцию в эндогенную плазмиду и тому подобные. Интегрированная в геном форма конструкции может представлять собой всю или часть конструкции. Однако в некоторых вариантах интегрированная в геном форма конструкции, по меньшей мере, включает в себя молекулу нуклеиновой кислоты согласно первому аспекту изобретения.

Клетки, предусмотренные в третьем аспекте изобретения, включают любую прокариотическую или эукариотическую клетку. В некоторых вариантах клетка является растительной клеткой. В некоторых вариантах клетка является клеткой однодольного растения. В некоторых вариантах клетка является клеткой культурного зернового растения.

В некоторых вариантах клетка является клеткой пшеницы, которая описана выше.

В некоторых вариантах клетка также может включать прокариотическую клетку. Например, прокариотическая клетка может включать клетку АдгоЪасЮгйип §р. (или другую бактериальную клетку), которая несет конструкцию нуклеиновой кислоты и которая может быть использована, например, для трансформации растения. В некоторых вариантах прокариотической клеткой может быть клетка, используемая для конструирования или клонирования конструкции нуклеиновой кислоты (например, клетка Е. сой).

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к многоклеточной структуре, содержащей одну или несколько клеток согласно третьему аспекту изобретения.

В некоторых вариантах многоклеточная структура включает растение или его часть, орган или ткань. В используемом в настоящем описании смысле следует понимать, что термин растение или его часть, орган или ткань специально включает целое растение; растительную ткань; орган растения; часть растения; зародыш растения; и культивируемую растительную ткань, такую как каллюс или суспензионная культура.

В некоторых вариантах растение или его часть, орган или ткань включает однодольное растение или его часть, орган или ткань. В некоторых вариантах растение или его часть, орган или ткань включает зерновое культурное растение или его часть, орган или ткань. В некоторых вариантах растение или его часть, орган или ткань включает растение пшеницы или его часть, орган или ткань.

В некоторых вариантах представляющая интерес нуклеотидная последовательность экспрессируется в одной или нескольких клетках растения или его части, органа или ткани в ответ на засуху.

В некоторых вариантах представляющая интерес нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, которая при экспрессии одной или несколькими клетками растения повышает засухоустойчивость растения, которое описано выше.

В некоторых вариантах представляющая интерес нуклеотидная последовательность кодирует полипептид ΌΚΕΒ, который описан выше. В некоторых вариантах полипептид ΌΚΕΒ представляет собой

- 13 026277

ТаЭКЕВЗ-подобный полипептид или ТаЭКЕВ2-подобный полипептид, который описан выше.

В некоторых вариантах растение или его часть, орган или ткань обладает повышенной засухоустойчивостью по сравнению с растением или его частью, органом или тканью, которые не содержат одну или несколько клеток согласно третьему аспекту изобретения.

Растение или его часть, орган или ткань согласно четвертому аспекту изобретения могут быть регенерированы из трансформированного растительного материала, такого как трансформированный каллюс, культивируемые зародыши, эксплантаты или тому подобное, с использованием стандартных в данной области способов. Такие растения обычно называют растениями Т₀. Также следует понимать, что растения согласно третьему аспекту изобретения включают потомство растений Т₀. Такие растения-потомки могут быть получены в результате самооплодотворения растений Т0 или скрещивания растений Т0 с одним или несколькими другими растениями того же вида или других видов с образованием гибридов. Как будет понятно, конструкция согласно второму аспекту изобретения может подвергаться расщеплению в растениях-потомках, и таким образом, растения согласно четвертому аспекту изобретения распространяются только на те растения-потомки, которые содержат конструкцию.

Наконец, приведена ссылка на стандартные руководства по молекулярной биологии, которые содержат описания способов осуществления основных способов, используемых в настоящем изобретении, включая рестрикцию и лигирование ДНК для создания различных генетических конструкций, описанных в настоящей публикации; см., например, 8атЬгоок апб Ки88е11, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаФгу Мапиа1 (Згб ебйюп). Со1б §ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу Рге88, 2001.

Настоящее изобретение далее описано со ссылкой на следующие неограничивающие примеры. Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показано филогенетическое древо взаимосвязи ТаЭКЕВ2 и ТаЭКЕВЗ с факторами ΌΚΕΒ из других растений. Древо основано на выравнивании полных последовательностей белков.

Фиг. 2 иллюстрирует экспрессию о£ ТаЭКЕВ2 и ТаЭКЕВЗ в разных тканях пшеницы, показанную с помощью количественной ПЦР.

На фиг. 3 показана конститутивная экспрессия ТаЭКЕВ2 и ТаЭКЕВЗ в растениях ячменя. А - Подтверждение экспрессии трансгена в трансгенных линиях Т₀ с использованием Нозерн-блотгибридизации. В - Фенотипы трансгенных растений Т₁ в фазе цветения в отсутствие стресса. Для каждого из трансгенных растений показаны три независимых линии.

На фиг. 4 показаны результаты эксперимента по засухоустойчивости, осуществляемого с использованием проростков трансгенных растений ячменя Т₁, трансформированных конструкциями (А) 2ХЗ5§:ТаЭКЕВ2 и (В) 2ХЗ58:ТаОКЕВЗ.

Устойчивость к стрессу трансгенных растений хорошо коррелировала с экспрессией трансгенов. Результаты Нозерн-блот-гибридизации показаны на верхних панелях каждого чертежа.

На фиг. 5 показана эффективность использования воды (^ИЕ) трансгенными растениями ячменя Т₂с конститутивной экспрессией ТаЭКЕВ2 или ТаЭКЕВЗ. А - Трансгенные растения могли расти дополнительно в течение 7-10 дней при использовании такого же количества воды, как и в случае контрольных растений. В - ^ИЕ для двух независимых линий трансгенных растений ячменя, в которых происходит повышающая регуляция уровней экспрессии ТаЭКЕВ2 или ТаЭКЕВЗ.

На фиг. 6 показан анализ экспрессии ниже расположенных генов в трансгенном ячмене, трансформированном конструкцией 2ХЗ58:ТаОКЕВЗ. Повышающая регуляция генов ЬЕА в трансгенных растениях ячменя Т0 - Т2 представлена в виде кратного увеличения по сравнению с экспрессией у контрольных растений. Обнаружено, что экспрессия трансгена (ТхТаЭКЕВЗ) коррелирует с экспрессией расположенных ниже генов.

На фиг. 7 показан анализ расположенных ниже генов в трансгенном ячмене, трансформированном конструкцией 2ХЗ58:ТаОКЕВ2. Повышающая регуляция нескольких генов ЬЕА в трансгенных растениях ячменя Т₀-Т₂ представлена в виде количества копий на микрограмм РНК.

На фиг. 8 показаны результаты эксперимента по засухоустойчивости, полученные с использованием трансгенных растений ячменя Т₁ с индуцируемой засухой экспрессией ТаЭКЕВ2. 0 день - день перед прекращением подачи воды; -2 недели - 2 недели без полива; +8 дней - 8 дней после возобновления полива; +З недели - З недели после возобновления полива.

На фиг. 9 показаны результаты эксперимента по засухоустойчивости, полученные с использованием трансгенных растений ячменя Т₁ с индуцируемой засухой экспрессией ТаЭКЕВЗ. О день - день перед прекращением подачи воды; -2 недели - 2 недели без полива; +8 дней - 8 дней после возобновления полива; +З недели - З недели после возобновления полива.

На фиг. 10 показаны результаты эксперимента по засухоустойчивости, полученные с использованием трансгенных растений пшеницы Т₁ с индуцируемой засухой экспрессией ТаЭКЕВЗ. Растения показаны после 18 дней засухи и через 7 и 14 дней после возобновления полива.

На фиг. 11 показаны результаты эксперимента по засухоустойчивости, полученные с использовани- 14 026277 ем трансгенных растений пшеницы Т₂ с индуцируемой засухой экспрессией ТаЭКЕВ3. 0 день - день перед прекращением подачи воды; -2 недели - 2 недели без полива; +8 дней - 8 дней после возобновления полива; +3 недели - 3 недели после возобновления полива.

На фиг. 12 показаны результаты эксперимента по засухоустойчивости, полученные с использованием трансгенных растений пшеницы Т₁ с индуцируемой засухой экспрессией ТаЭКЕВ2. 0 день - день перед прекращением подачи воды; -2 недели - 2 недели без полива; +8 дней - 8 дней после возобновления полива; +3 недели - 3 недели после возобновления полива.

На фиг. 13 показана экспрессия трансгена в трансгенных растениях ячменя Т₁, трансформированных конструкциями рКаЫ7:ТаЭКЕВ2 и рКаЫ7:ТаЭКЕВ3, перед засухой (номер линии) и в условиях засухи (номер линии и Ό). В разных линиях можно наблюдать разные основные уровни экспрессии трансгена. Не было строгой корреляции между скоростью восстановления и экспрессией трансгена.

На фиг. 14 показана экспрессия трансгена в трансгенных растениях пшеницы Т_1? трансформированных конструкциями рКаЫ7:ТаЭКЕВ3, в контрольных условиях (номер линии) и в условиях засухи (номер линии и Ό). Не обнаружено основного уровня активности промотора и различий у растений перед стрессом. Имела место хорошая корреляция между восстановлением и экспрессией трансгена.

На фиг. 15 показана экспрессия трансгена в трансгенных растениях пшеницы Т₂, трансформированных конструкциями рКаЫ7:ТаОКЕВ3 в контрольных условиях (номер линии) и условиях засухи (номер линии и Ό). Не выявлено основного уровня активности промотора и различий среди растений перед стрессом.

На фиг. 16 показана экспрессия трансгена в трансгенных растениях пшеницы Т₂, трансформированных конструкциями рКаЫ7:ТаОКЕВ3, перед засухой (номер линии), в условиях засухи (номер линии и И) и через 3 недели после восстановления (номер линии и К). Не выявлено основного уровня активности промотора и различий среди растений перед и после стресса.

На фиг. 17 изображена активность промотора КаЫ7 кукурузы в трансгенных растениях ячменя, трансформированных конструкциями рКаЫ7:ТаЭКЕВ2 (0193) или рКаЫ7:ТаЭКЕВ3 (0194), показанная в виде данных Ц-ПЦР экспрессии трансгена. Высокие уровни экспрессии трансгена можно наблюдать в растениях перед применением стресса, вызываемого засухой (без буквы). Некоторую индукцию промотора можно наблюдать после применения стресса, вызываемого засухой (буква 8) (1-2% У\УС в почве, растения проявляли явные признаки стресса).

На фиг. 18 изображена активность промотора КаЫ7 кукурузы в трансгенных растениях пшеницы, трансформированных конструкциями рКаЫ7:ТаЭКЕВ2 (В^7) и рКаЫ7:ТаЭКЕВ3 (В^8), показанная в виде данных Ц-ПЦР экспрессии трансгена. Не было выявлено экспрессии трансгена в растениях перед применением стресса, вызываемого засухой (без буквы). Можно было наблюдать сильную индукцию промотора после применения стресса, вызываемого засухой (буква 8). Очень низкие уровни активности промотора можно было выявить через 3 недели после возобновления полива (буква К), когда растения полностью восстанавливались и начинали цвести.

На фиг. 19 показаны уровни экспрессии эндогенного ТаЭКЕВ2 (верхняя панель) и ТаЭКЕВ3 (нижняя панель) в тех же линиях трансгенных и контрольных растений, которые показаны на фиг. 19.

На фиг. 20 показано поведение растений пшеницы с индуцируемой засухой экспрессией ТаЭКЕВ2 и ТаЭКЕВ3 во время испытания на засухоустойчивость по жизнеспособности, при умеренном недостатке воды. График показывает устьичную проводимость и водный потенциал листа в полдень для зрелых листьев двух ТаЭКЕВ2-трансформированных линий (Ь2-4-3, синий треугольник и Ь5-4, синий квадрат), двух ТаОКЕВ3-трансформированных линий (Ь7-7-1, красный треугольник и Ы0-2-2, красный квадрат) и контрольных растений (черные точки и линии), измеряемый для трех водных режимов (хорошее увлажнение, предрассветный водный потенциал листа -0,3 и -0,6 мПа).

На фиг. 21 показано поведение растений пшеницы с индуцируемой засухой экспрессией ТаЭКЕВ2 и ТаЭКЕВ3 во время испытании на засухоустойчивость по жизнеспособности. На графике показан процент растений, которые выживали, для нескольких независимых линий растений, трансформированных либо рКаЫ7-ТаЭКЕВ2, либо рКаЫ7-ТаЭКЕВ3, по сравнению с контрольными растениями.

На фиг. 22 показана экспрессия трансгена и индуцируемых стрессом генов ЬЕА/СОК/ΌΗΝ в трансгенных растениях пшеницы с индуцируемой сверхэкспрессией ТаЭКЕВ2 и ТаЭКЕВ3. На панели А показана экспрессия трансгенов в условиях хорошего увлажнения (XV) и в условиях засухи (И); на панели В показана повышающая регуляция отвечающих на стресс генов в трансгенных растениях, выраженная в виде кратной повышающей регуляции засухой по сравнению с условиями хорошего увлажнения, и нормализованная против контролей.

Пример 1. Структура генов, гомологи и ДНК-связывающие свойства.

Полноразмерные кДНК ТаЭКЕВ2 и ТаЭКЕВ3 выделяли из библиотеки, полученной из зерна пшеницы, с использованием ИКЕ из АгаЫборк1К в качестве приманки (Ьора1о е1 а1., Р1аШ Мебюбк 2: 3, 2006).

Выравнивание последовательности белка с последовательностями других факторов ИКЕВ из АгаЫборк1к, риса и ячменя показало, что ТаЭКЕВ3 относится к подсемейству ИКЕВ1 факторов транскрипции и может быть вовлечен в ответные на реакцию стрессы, вызванные холодом, солью и засухой.

В условиях вызванного засухой стресса активация ТаЭКЕВ2 происходит сильнее, чем активация

- 15 026277

ТаЭКЕВ3. Белок ТаЭКЕВ2 имеет более высокую гомологию последовательности с последовательностью ΤΙΝΥ из А. (НаПапа и относится к небольшому подсемейству белков с последовательностями, отличными от последовательностей подсемейств ΌΚΕΒ1 и ΌΚΕΒ2 (фиг. 1).

Анализ пространственной экспрессии показал, что оба фактора экспрессируются в отсутствие стресса в тканях цветка и зерна. Относительно высокий уровень экспрессии ТаЭКЕВ2 также был выявлен в корнях (фиг. 2). В отсутствие стресса, по существу, не выявлено экспрессии ни одного из факторов транскрипции в листе. Кроме того, в тканях листа не наблюдали индукции солевым стрессом и наблюдали очень слабую индукцию под действием АВА.

Пример 2. Конститутивная экспрессия ТаЭКЕВ2 или ТаЭКЕВЗ приводила к нежелательным фенотипам.

Чтобы исследовать возможность повышения засухоустойчивости в результате активации ТаЭКЕВ2 и ТаЭКЕВЗ, их кодирующие области клонировали в векторе рМОС32 под контролем промотора 2x358 (СитИк апб Ого88П1к1аи8, Р1ап! Рйу8ю1о§у 133: 462-469, 2003).

Согласно предыдущему опыту авторов изобретения промотор 2x358 обладает сильной активностью в трансгенном ячмене и обладает активностью, сравнимой с активностью промотора полиубиквитина кукурузы. Однако авторы изобретения обнаружили, что 2x358 обеспечивает только относительно слабую конститутивную экспрессию у пшеницы.

Одиннадцать и тринадцать независимых трансгенных линий ячменя были получены для ТаЭКЕВ2 и ТаЭКЕВ3 соответственно с использованием способа опосредованной АдгоЬас1сг1ит трансформации (смотри МаиНс\У5 е( а1., Мо1еси1аг Втеебшд 7: 195-202, 2001 и Тшдау е( а1., Р1ап( 1оигпа1 11: 1369-1376, 1997).

Согласно данным, полученным при Саузерн-блот-гибридизации, большинство трансгенных линий Т₀ имели от 2 до 6 копий трансгена. В некоторых растениях все или несколько копий трансгена были встроены в тандеме или очень близко друг к другу, что приводило к отсутствию расщепления в 4 поколениях.

Уровни экспрессии трансгенов исследовали в РНК-блот-анализе, используя суммарную РНК из тканей листа. Большинство линий Т₀ имело высокие уровни сверхэкспрессии трансгена (фиг. 3А). Анализ трансгенных растений осуществляли, используя четыре поколения растений. Однако, поскольку эксперименты начинали, используя растения Т_1? которые не были гомозиготными и содержали несколько копий трансгена, использовали Нозерн-блот-гибридизацию для подтверждения экспрессии трансгена в каждом растении и поддерживали фенотипы растений с определенными уровнями экспрессии в большинстве экспериментов. Растения дикого типа и растения, в которых не было экспрессии трансгена (предположительно сегреганты), использовали в качестве контроля. Не наблюдали различий в развитии и устойчивости к стрессу в двух группах контрольных растений.

Конститутивная активация ТаЭКЕВ2 и ТаЭКЕВ3 вызывала более медленный рост и развитие растений по сравнению с контрольными растениями, и была показана задержка времени цветения от нескольких недель до одного месяца. Однако трансгенные растения ячменя с конститутивной активацией ТаЭКЕВ2 достигали размера контрольных растений при цветении (фиг. 3В), и у них развивались нормальные колосья. Они также имели более широкие и более темные листья по сравнению с контрольными растениями.

В отличие от ТаЭКЕВ2-трансгенных растений, растения с конститутивной активацией ТаЭКЕВ3 достигали только примерно 2/3 размера контрольных растений при цветении, и растения с наиболее выраженным фенотипом имели более короткие колосья (фиг. 3В). Не наблюдали различий по фертильности или размеру зерна между трансгенными и контрольными растениями.

В случае трансгенных растений, подвергнутых сильной засухе (18 дней без полива, последние 14 дней объемное содержание влаги (У^С) в почве составляло 2-3%), после восстановления растения развивались медленнее и начинали цвести позже, чем трансгенные растения, которые не были подвергнуты стрессу, вызванному засухой.

Пример 3. Устойчивость к вызванному засухой стрессу растений ячменя, которые конститутивно экспрессировали ТаЭКЕВ2 или ТаЭКЕВ3.

Чтобы выяснить, повышает ли экспрессия ТаЭКЕВ2 и ТаЭКЕВ3 засухоустойчивость трансгенных растений, контрольные (С) и либо Т_1? либо Т₂, Т₃ и Т₄ трансгенные проростки четырехнедельного возраста подвергали вызванному засухой стрессу в течение 18-21 дня. Контрольные растения начинали проявлять признаки стресса, такие как потеря тургора, скручивание листьев и потеря хлорофилла, намного раньше, чем трансгенные растения.

Трансгенные линии оставались без изменений на 2-3 дня дольше, чем контрольные растения, некоторые из них сохраняли тургор и не проявляли признаков увядания или других признаков стресса еще дольше (фиг. 4).

Возобновление полива растений через две с половиной недели засухи обычно приводило к 95-100% потере контрольных растений. Однако большинство трансгенных растений с подтвержденной экспрессией генов выживали и полностью восстанавливались в течение 1-2 недель после возобновления полива.

- 16 026277

Наблюдали хорошую корреляцию между уровнем экспрессии трансгена и скоростью восстановления.

В ходе тестирования влияния засухи контролировали влагосодержание в почве, размер растения, фенотип растения, время перехода к цветению после стресса и уровни экспрессии трансгена для каждого растения. Все горшочки содержали одинаковое количество почвы, и их поливали до насыщения в последний день перед прекращением полива.

Анализ данных показал, что различие в размере растений (длина растений и количество листьев) коррелировало с уровнями экспрессии трансгена. У\УС в почве с меньшими по размеру растениями изменялось более медленно, чем в горшочках с более крупными растениями и составляло примерно 5% на четвертый день по сравнению с 2-3% У\УС в горшочках с контрольными растениями. Также наблюдали, что самые маленькие растения проявляли наилучшее поведение при стрессе и самое быстрое восстановление. Полученные результаты свидетельствуют, что наблюдаемая засухоустойчивость трансгенных растений в данном случае вероятно главным образом отражает меньшее потребление воды в результате более медленного роста и меньшего размера.

Чтобы подтвердить приведенную выше гипотезу, осуществляли сходное испытание влияния засухи, используя два других трансгенных объекта, которые сверэкспрессируют гены, которые не связаны с засухоустойчивостью но, тем не менее, подавляют рост растений подобно факторам ΌΚΕΒ. В данном эксперименте наблюдали засухоустойчивость, которая сходна с засухоустойчивостью, наблюдаемой у трансгенных растений с конститутивной сверхэкспрессией ΤηΌΚΕΒ2 и ΤηΌΚΕΒ3.

Хотя жизнеспособность таких плацебо-трансгенных растений в условиях засухи была лучше, чем жизнеспособность контрольных растений, она не была такой высокой, как у трансгенного ячменя с конститутивно подвергаемыми повышающей регуляции ΤηΌΚΕΒ2 и ΤηΌΚΕΒ3. что свидетельствует о наличии второго существенного компонента засухоустойчивости у трансгенного ячменя с подвергаемой повышающей регуляции экспрессией факторов ΌΚΕΒ. Наблюдаемую устойчивость в случае плацеборастений не обнаруживали, если в эксперименте использовали более крупные горшочки, содержащие несколько трансгенных и контрольных растений. В данном случае контрольные растения имели доступ к воде, остающейся в горшочке в результате более низкого потребления медленно растущими трансгенными растениями.

Чтобы выявить компонент, связанный с реальной засухоустойчивостью, осуществляли анализ эффективности использования воды (^ΌΕ). Такой анализ основан на предположении, что ^ΌΕ не должна зависеть от скорости роста и размера растения. Контрольные и трансгенные растения Т₂ выращивали в закрытых пластиковых емкостях с одним небольшим отверстием для роста растения. Емкости заполняли одинаковым количеством почвы и воды, и искажающая результаты потеря влаги была в значительной степени предотвращена. Через три с половиной недели, незадолго перед тем, как контрольные растения проявляли признаки стресса, вызванного засухой, вычисляли использованием воды растениями, растения нарезали, сушили, измеряли сухую массу и определяли ^ΌΕ.

Неожиданно трансгенные растения, которые конститутивно сверхэкспрессируют ΤηΌΚΕΒ3, показали примерно на 20% более высокое значение ^ΌΕ, чем контрольные растения. Значения ^ΌΕ для трансгенного ячменя, который конститутивно сверхэкспрессирует ΤηΌΚΕΒ2, были только незначительно выше, чем ^ΌΕ для контрольных растений (фиг. 5).

Половине трансгенных растений, используемых в эксперименте по определению ^ΌΕ, давали возможность использовать всю поданную воду вплоть до их гибели. В случае таких растений оба типа трансгенных растений были способны расти дополнительно в течение 7-10 дней, используя такое же количество воды, как и контрольные растения (фиг. 5).

Пример 4. Активация расположенных ниже генов в результате конститутивной сверхэкспрессии ΤηΌΚΕΒ2 или ΤηΌΚΕΒ3 у ячменя.

Одна из наибольших групп генов, подвергаемых повышающей регуляции стрессом, вызванным засухой, солью и холодом, включает гены белков, присутствующих в большом количестве на поздних стадиях развития зародыша (ΕΕΛ). Исследовали уровни экспрессии 6 разных генов ΕΕΛ ячменя в трансгенных и контрольных растениях.

Значительная повышающая регуляция 5 из 6 тестируемых генов ^ΕΛ обнаружена в растениях, которые конститутивно сверхэкспрессируют ΤηΌΚΕΒ3. Наиболее высокая повышающая регуляция показана для ΗνΌΗΝ14, ΗνΌΗΝ5 и НуА22. Однако экспрессия ΗνΚΌ22 не была эффективной. Наблюдали сильную корреляцию между экспрессией генов ΤηΌΚΕΒ3 и ^ΕΛ (фиг. 6).

Только очень умеренную (примерно двукратную и меньше) повышающую регуляцию двух из шести тестированных генов ^ΕΛ наблюдали в трансгенном ячмене, который конститутивно сверхэкспрессирует ΤηΌΚΕΒ2 (фиг. 7). Выявленное отсутствие сильной корреляции между экспрессией трансгена ΤηΌΚΕΒ2 и экспрессией генов ^ΕΛ. в общем, может свидетельствовать о непрямой повышающей регуляции ΗνΌΗΝδ и ΗνΚΌ17 (фиг. 7). Способность ΤηΌΚΕΒ3 и неспособность ΤηΌΚΕΒ2 активировать промотор ΗνΌΗΝδ-подобного гена из пшеницы в кратковременном анализе дополнительно подтверждает такую идею (данные не показаны).

- 17 026277

Пример 5. Трансгенные растения ячменя и пшеницы с индуцируемой засухой экспрессией факторов ΌΚΕΒ.

Чтобы исключить нежелательные фенотипы, создаваемые в результате конститутивной экспрессии факторов транскрипции ТаЭКЕВ2 и ТаЭКЕВЗ (и, следовательно, уменьшить засухоустойчивость, связанную только со скоростью роста и размером растения) растения ячменя и пшеницы трансформировали конструкциями, в которых промотор 2x358 заменяли фрагментом длиной 600 п.н. промотора КаЫ7 кукурузы, индуцируемого засухой и солью (УПагйс11 с1 а1., Р1ап1 Мо1еси1аг Вю1оду 14: 423-432, 1990).

Трансгенные растения пшеницы и ячменя получали, используя протоколы баллистической бомбардировки и опосредованной АдгоЪас1егшт трансформации соответственно. Получали по 20 независимых линий ячменя для каждой конструкции. Было создано 45 и 18 независимых линий пшеницы, трансформированных рКаЫ7:ТаОКЕВ2 и рКаЫ7:ТаОКЕВ3 соответственно.

Присутствие каждого трансгена подтверждали в ПЦР, используя праймеры, специфичные для промотора КаЫ7 и терминатора ио8.

Эксперименты по засухоустойчивости осуществляли, используя такие же условия, которые применяли во время тестирования трансгенного ячменя с конститутивной экспрессией ТаЭКЕВ2 и ТаЭКЕВ3 (которые описаны выше), за исключением того, что продолжительность засухи составляла 14 дней (в последние 10 дней У\УС было меньше 3%).

В случае ячменя трансгенные растения были немного меньше, чем контрольные растения. Однако различие по размеру наблюдали только в случае некоторых растений (обычно растений с более высоким основным уровнем активности промотора), и оно было намного менее выраженным, чем задержка роста, наблюдаемая в случае трансгенных растений с конститутивной сверхэкспрессией таких же факторов транскрипции.

Через 14 дней после прекращения поступления воды большинство трансгенных растений ячменя вели себя сходно с контрольными растениями: они теряли тургор примерно на 2-3 день засухи, у них скручивались листья и они становились хлорозными. Однако несколько более мелких по размеру растений обычно выглядели более здоровыми, чем контрольные растения через одну неделю после окончания полива.

В отличие от контрольных растений, которые все погибали, большинство трансгенных растений с подтвержденной сверхэкспрессией трансгена быстро восстанавливались после возобновления полива (фиг. 8 и 9). Трансгенные растения, по-видимому, восстанавливались в течение одной недели после возобновления полива и начинали цвести через 4-5 недель. Не наблюдали изменений в размере или количестве колосьев. Однако трансгенные растения ячменя, которые были подвержены стрессу, вызванному засухой, начинали цветение раньше при меньшем размере, чем растения, которые не были подвергнуты засухе.

В отличие от трансгенных растений ячменя, трансгенные линии пшеницы, трансформированные конструкциями рКаЫ7-ТаОКЕВ2 и рКаЫ7-ТаОКЕВ3, не имели задержки или замедления развития. В начале периода использования условий засухи трансгенные растения пшеницы обычно не отличались по своему виду от контрольных растений.

Например, в условиях хорошего увлажнения и при умеренном недостатке воды (вплоть до 5% У\УС, -0,6 МПа) устьичная проводимость трансформированных растений была сходной с устьичной проводимостью контрольных растений, снижаясь с 238±29 до 32±3 ммоль-м^-2-с^-1 по мере высыхания почвы. В результате не было различий в водном статусе листьев, независимо от водного статуса почвы, при этом водный потенциал листьев лишь незначительно снижался по мере высыхания почвы с -0,87 мПа в условиях хорошего увлажнения до -1,16 мПа в условиях засухи (смотри фиг. 20).

Во время периода засухи поведение контрольных и трансгенных растений также обычно было сходным: все растения засыхали с одной и той же скоростью и выглядели, по существу, сухими и мертвыми в последний день перед возобновлением полива.

Однако через одну неделю после возобновления полива ~90% контрольных растений все еще выглядели мертвыми, тогда как намного более высокий процент трансгенных растений начинал восстанавливаться (смотри фиг. 21).

Растения, трансформированные рКаЫ7:ТаЭКЕВ3, обычно восстанавливались намного быстрее, чем растения, трансформированные рКаЫ7:ТаОКЕВ2, и начинали цвести примерно через три недели после возобновления полива (фиг. 10 и 11). Растения пшеницы, трансформированные рКаЫ7:ТаЭКЕВ2, начинали цвести на 3-4 дня позже (фиг. 12).

Через несколько недель после восстановления оба типа трансгенных растений выглядели в общем нормальными, у них развивалось много колосьев обычного размера, и количество пустоцветов и недоразвитого зерна не превышало эквивалентные количества у контрольных растений.

Два из двадцати контрольных растений переживали вызванной засухой стресс, но восстанавливались намного медленнее, чем трансгенные растения. Они оставались очень маленькими (1/3 от нормального размера) при цветении и давали только 2 и 1 небольшой колос соответственно.

- 18 026277

Пример 6. Активность промотора КаЫ7 кукурузы у пшеницы и ячменя.

Нозерн-блот-анализ экспрессии факторов ОКЕВ под контролем промотора КаЫ7 осуществляли, используя образцы листьев, которые собирали за день до прекращения полива, через 3 дня после прекращения полива и через 3 недели после возобновления полива.

Относительно высокий основной уровень активности промотора КаЫ7 в отсутствие стресса наблюдали в растениях ячменя (фиг. 13). Уровни основной активности отличались в разных независимых линиях. Фенотипы, наблюдаемые в развитии некоторых растений, коррелировали с более высокими уровнями основной активности промотора.

Неожиданно не выявлено основной активности промотора КаЫ7 кукурузы у пшеницы при Нозернблот-гибридизации. Однако в условиях стресса, вызванного засухой, промотор быстро и в высокой степени активировался (фиг. 14-16). Это ограничивает активность экспрессии ОКЕВ периодом стресса и несколькими днями восстановления и, таким образом, приводит к отсутствию каких-либо нежелательных изменений в развитии растений до и после стресса.

И у ячменя и у пшеницы возобновление полива вызывало инактивацию промотора. Однако низкие уровни транскриптов трансгена наблюдали вплоть до трех недель после возобновления полива (фиг. 16). Наличие такого низкого уровня мРНК трансгена можно объяснить высокой стабильностью данных мРНК (например, терминатор иок вектора рМОС32 обеспечивает очень стабильную мРНК), а не остаточной активностью промотора. Не наблюдали негативного влияния остающихся транскриптов трансгена на время перехода к цветению, размер, количество и форму колосьев, и размер зерна.

На фиг. 17-19 показана активность промотора КаЫ7 кукурузы у пшеницы и ячменя, которую измеряли, используя Ц-ПЦР. Как показано на фиг. 17, у ячменя экспрессию трансгена можно наблюдать в растениях до воздействия стресса, вызванного засухой, хотя некоторую индукцию промотора можно видеть после воздействия стресса, вызванного засухой.

Напротив, на фиг. 18 показана активность промотора КаЫ7 кукурузы в трансгенных растениях пшеницы, при этом не выявлена экспрессия трансгена в растениях до воздействия стресса, вызванного засухой. Кроме того, сильную индукцию промотора можно было наблюдать после воздействия стресса, вызванного засухой.

На фиг. 19 показаны уровни экспрессии эндогенных Τа^КΕΒ2 и Τа^КΕΒ3 в тех же линиях трансгенных и контрольных растений, которые показаны на фиг. 18. Как можно видеть, исходя из шкалы на оси Ύ, уровень эндогенных Τа^КΕΒ2 и Τа^КΕΒ3 был значимо ниже, чем уровень экспрессии, управляемой промотором КаЫ7.

Пример 7. Активация индуцируемых стрессом генов посредством индуцируемой сверхэкспрессии факторов ОКЕВ у пшеницы.

Экспрессию девяти генов ЬЕА/СОК/ΟΗΝ пшеницы, которые, как известно, индуцируются засухой и холодом, исследовали в трансгенных растениях. Результаты экспрессии сначала использовали для определения соотношения уровней экспрессии в условиях стресса, вызываемого засухой (время отбора образцов: через 4 дня после того, как У\УС почвы достигало 2%), по сравнению с условиями хорошего увлажнения. Затем полученные данные использовали для расчета увеличения индукции экспрессии у трансгенных растений по сравнению с индукцией в контрольных растениях (смотри фиг. 22). Данные отражают дополнительную индукцию таких генов трансгенами ОКЕВ по сравнению с индукцией только засухой и потенциально связаны с влиянием эндогенных генов ОКЕВ.

Как показано на фиг. 22, индукция трансгеном достигала 50-кратной индукции в случае некоторых генов ЬЕА/СОК/ΟΗΝ, хотя в случае большинства генов наблюдали более низкую индукцию. Активация некоторых генов ЬЕА/СОК/ΟΗΝ также, по-видимому, является специфичной только для одного из трансгенов. Например, индукция экспрессии ΤаКΑΒ17 была намного более сильной в Τа^КΕΒ3трансгенных линиях, тогда как индукция экспрессии Πι\νΖΥ2 была более сильной в Τа^КΕΒ2трансгенных растениях.

Пример 8. Материалы и способы. Конструирование плазмид и трансформация пшеницы и ячменя.

Полноразмерные кодирующие области Τа^КΕΒ2 и Τа^КΕΒ3 амплифицировали в ПЦР, используя ДНК-полимеразу ΡΓχ ΑссиΡ^^те™ Диуйгодеи). Полноразмерные кДНК Τа^КΕΒ2 (Асе. ОЦ353852) и Τа^КΕΒ3 (Асе. ОЦ353853), выделенные при ^^скрининге из библиотеки кДНК зерен пшеницы (Ьора1о е! а1., ΡΗηΙ МеШойк 2: 3, 2006), использовали в качестве матриц. Кодирующие области кДНК П1ОКЕВ2 и Τа^КΕΒ3 клонировали: (ί) в векторе рМОС32 (Сигйк апй Ого88тк1аи8, ΡΗηΙ ΡЬу8^о1оду 133: 462-469, 2003) ниже дуплицированного промотора 358 вектора; и (ίί) в векторе рМОС32, в котором промотор 2X358 был вырезан с использованием сайтов рестрикции ΗίηάΙΙΙ - ΚρηΙΙ и заменен фрагментом промотора ΖтКаЫ7 длиной 634 п.н. (Викк е! а1., Ρ1πηΐ 1оита1 11: 1285-1295, 1997).

Все четыре конструкции использовали для трансфекции ячменя (Иогйеит уи1даге Ь. су. Со1йеи ΡΐΌΐηί^), применяя опосредованную АдгоЪас1егшт трансформацию способом, разработанным Пидау с соавт. (Пап! 1оигиа1 11: 1369-1376, 1997) и модифицированным Маййете с соавт. (Мо1еси1аг Вгеейшд 7: 195-202, 2001).

Пшеницу (ΤπΙίαιιη аеЧуит Ь. су. ВоЪ\\йПе) трансформировали, используя баллистическую бомбардировку. ρКаЪ17:Τа^КΕΒ2:ηо8 и ρКаЪ17:Τа^КΕΒ3:ηо8 вырезали из соответствующих конструкций, ис- 19 026277 пользуя Рте1 и ВзаХ1, очищали из геля и котрансфицировали вместе с кассетой иЬгйркиоз (фрагмент длиной 3676 п.н. векторной плазмиды, разрезанной Рте1 - 8та1) в пшеницу, используя бомбардировку микрочастицами. Присутствие трансгена и экспрессию в трансгенных растениях Т₀ и/или растениях поколения Т₁ анализировали, используя Саузерн-и Нозерн-блот-гибридизацию, как описано ЗатЬгоок и

Киззе11 (Мо1еси1аг С1отид: А ЬаЬогаЮгу Маииа1, 3^гб ебШои, Со1б Зргтд НагЬог ЬаЬога1огу Ргезз, 2001).

Рост растения и условия стресса.

Для анализа фенотипов растения выращивали в условиях теплицы со средней температурой днем/ночью 25/16°С и продолжительностью дневного периода 15 ч. Растения поколений Т₁ и Т₂ исследовали в отношении изменений фенотипа, таких как скорость роста, высота растения, время выбрасывания колоса, количество побегов, фенотип колоса, фенотип зерна и урожайность.

Проростки для тестирования в отношении засухоустойчивости выращивали в теплицах, используя 16-часоую продолжительность дневного периода при температуре днем/ночью 24/16°С. Растения поколений Т₁-Т₄ выращивали в горшочках диаметром 4 дюйма (10 см) в течение четырех недель и исследовали объемное содержание влаги (У^С) в горшочках. Во временной точке 4 недели прекращали полив водой. Примерно за 4 дня У\УС в горшочках достигало 1-2%, и наблюдали явное увядание контрольных растений. Растения оставляли еще на 10-17 дней без полива и затем полив возобновляли.

Растения оценивали в отношении восстановления после одной и трех недель возобновления полива, и устойчивые к стрессу растения переносили в теплицу для наблюдения развития и образования семян. Эффективность использования воды (^ИЕ) трансгенных растений определяли, используя анализ проростков, в котором семена сходного размера высевали в горшочки объемом 450 мл (15 см высотой х 7 см в диаметре). Каждый горшочек содержал 400 г почвы и такое же количество воды. Горшочки покрывали пленкой, чтобы предотвратить испарение воды. Растения выращивали до тех пор, пока не оставалось экстрагируемой воды. Общее использование воды растениями вычисляли, вычитая конечную массу горшочков из начальной массы, учитывая потерю воды в результате испарения. Затем вычисляли ^ИЕ в граммах на сухую биомассу побегов на миллилитр использованной воды.

Нозерн-блот и О-ПЦР-анализ.

Все растения, которые авторы использовали в своих экспериментах, контролировали в отношении экспрессии трансгена, используя Нозерн-блот-гибридизацию, которую осуществляли, как описано в ряде публикаций (ЗатЬгоок аиб Киззе11, Мо1еси1аг С1отид: А ЬаЬогаЮгу Маииа1, 3^гб ебйюи, Со1б Зргтд НагЬог ЬаЬога1огу Ргезз, 2001). О-ПЦР-анализ использовали для характеристики экспрессии ТаЭКЕВ2 и ТаЭКЕВ3 в разных тканях пшеницы и для анализа экспрессии расположенных ниже генов. Такой анализ осуществляли, используя праймеры, полученные из 3'-нетранслируемых областей соответствующих кДНК. Способ и нормализация описаны Вийои с соавт. (Р1аи! Рйузю1 134: 224-236, 2004).

Специалистам в данной области будет понятно, что изобретение, описанное в настоящей публикации, подвержено другим изменениям и модификациям, отличным от тех, которые описаны специально. Следует понимать, что изобретение включает все такие изменения и модификации. Изобретение также включает все стадии, признаки, композиции и соединения, названные или указанные в настоящем описании, отдельно или вместе, и любое и все сочетания любых двух или более стадий или признаков.

Следует понимать, что на протяжении описания, если контекст не требует иное, слова содержат или его вариации, такие как содержит или содержащий подразумевают включение указанного элемента или целого числа или группы элементов или целых чисел, но не исключение любого другого элемента или целого числа или группы элементов или целых чисел.

Также необходимо отметить, что в используемом в настоящем описании смысле формы единственного числа включают множественные аспекты, если контекст уже не диктует иное.

- 20 026277 <110> АизЕсаЫап СепЕге ίοτ Р1апЕ ГипсЕ1опа1 СепотАсз РЕу. ЬеС1 <120> окоиент кезроизхуе εχρκε55χον <130> окоиснт κεδΡΟΝδίνε εχρκε53ιον <160> 1 <170> ΡβΕβηεΐη уегзхоп 3.3 <210> 1 <211> 628 <212> ΟΝΑ <213> аеа тауз <400> 1

сЕЕдасддсс	сдддссддса	ЕЕЕсаааасс	асадсасссс	ааааЕЕдсаЕ	Еаасааасас	60
дсссЕааЕЕд	дЕасЕссЕда	даЕасЕаЕас	ссЕссЕдЕЕЕ	сааааЕадсЕ	ддсассассд	120
ааЕЕаЕсаЕЕ	ссасссссса	асдЕЕЕЕссс	ЕЕсЕЕЕЕааЕ	аЕаЕЕЕЕаЕд	аассЕЕааЕд	180
ЕаЕЕЕЕаааа	сдссасдсад	ЕЕсдсЕсЕдд	асЕСЕЕсЕдс	сдсдссЕаса	сЕЕдддЕдЕа	240
ссдддсссаа	асссадсссд	ассдассдсс	сдсассдаас	аасддасдад	сассддсааа	300
асссдсдсас	ссаасЕЕЕсд	адаадаассд	адасдсддсд	ддссдддсса	ссдасдсасд	360
дсассадсда	сЕдсасасдЕ	сссдссддсд	ЕасдЕдЕасд	Едссдссссс	Ссассддссд.	420
сссааЕссас	ЕсаЕдсаЕдс	ссасдЕасас	сссЕдссдЕд	дсдсдсссад	аЕссЕааЕсс	480
ЕЕЕсдссдЕЕ	сЕдсасЕЕсЕ	дсЕдссЕаЕа	ааЕддсддса	ЕсдассдЕса	ссЕдсЕЕсас	540
сассддсдад	ссасаЕсдад	аасасдассд	адсасасаад	сасдаадасЕ	сдЕЕЕаддад	600
ааассасааа	ссассаадсс	дЕдсаадс				628

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ обеспечения экспрессии, отвечающей на засуху представляющей интерес нуклеотидной последовательности в растении пшеницы, заключающийся в том, что данную экспрессию осуществляют при использовании функционально связанной с указанной представляющей интерес последовательностью последовательности регуляции транскрипции /еа таук, которая индуцируется под воздействием засухи и не обладает активностью в растении в отсутствие засухи, где указанная последовательность регуляции транскрипции /еа таук содержит нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕЭ ГО N0:1.
2. Способ по п.1, в котором представляющая интерес нуклеотидная последовательность кодирует фактор транскрипции ЭВЕВ.
3. Способ по п.2, в котором фактором транскрипции ЭВЕВ является ТаПВЕВ3-подобный полипептид или ТаПВЕВ2-подобный полипептид.
4. Конструкция нуклеиновой кислоты для экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности в растении пшеницы исключительно в ответ на засуху, где конструкция нуклеиновой кислоты содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, функционально связанную с последовательностью регуляции транскрипции /еа таук, которая индуцируется в растении пшеницы засухой и экспрессия которой не обнаруживается в растении в отсутствие засухи, где последовательность регуляции транскрипции /еа таук содержит нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ГО N0:1.
5. Конструкция по п.4, в которой представляющая интерес нуклеотидная последовательность кодирует фактор транскрипции ЭВЕВ.
6. Конструкция по п.5, где фактором транскрипции ЭВЕВ является ТаЭВЕВ3-подобный полипеп- 21 026277 тид или ТаПКЕВ2-подобный полипептид.
7. Способ повышения засухоустойчивости растения пшеницы, включающий экспрессию отвечающей на засуху представляющей интерес нуклеотидной последовательности в одной или нескольких клетках растения согласно способу по любому из пп.2, 3.
8. Генетически модифицированная клетка, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп.4-6 или ее интегрированную в геном форму.
9. Растение пшеницы или его часть, имеющее повышенную устойчивость к засухе, содержащее конструкцию по п.4.
10. Часть растения пшеницы по п.9, представляющая собой орган или ткань растения.