CN102159718A - 除草剂耐受性植物 - Google Patents

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Abstract

本发明特别涉及在包含农作物和杂草的地点选择性控制杂草的方法，其中该方法包括在所述地点施用包含尿黑酸法呢基转移酶(homogentisate solanesyltransferase)(HST)抑制型除草剂和/或羟基苯基丙酮酸双加氧酶(hydroxy phenyl pyruvate dioxygenase)(HPPD)抑制型除草剂的杂草控制量杀虫剂组合物，其中所述农作物包含至少一种含有编码HST之区域的重组多核苷酸；本发明还涉及在包含农作物和杂草的地点选择性控制杂草的方法，其中所述方法包括在所述地点施用包含尿黑酸法呢基转移酶(HST)抑制型除草剂的杂草控制量杀虫剂组合物，其中所述农作物包含至少一种含有编码HPPD酶之区域的重组多核苷酸，本发明还涉及用于此方法的重组多核苷酸和载体。本发明进一步涉及包含HPPD-抑制型除草剂和HST-抑制型除草剂的除草剂组合物。

Description

除草剂耐受性植物
本发明涉及用于在某一地点选择性控制杂草的方法。本发明进一步涉及重组DNA技术，尤其是产生较非转基因类似植物而言对除草剂展现出充分的抗性或充分的耐受性的转基因植物。对除草剂充分“耐受”的植物在被施用除草剂时呈现的剂量/应答曲线与同样接受施用的非耐受性类似植物所呈现的曲线相比较而言向右偏移。这样的剂量/应答曲线是将“剂量”标示在x轴上，而将“杀死百分率”、“除草效果”等标示在y轴上。耐受性植物通常需要非耐受性类似植物接受的至少两倍量的除草剂以得到特定的除草效果。充分抗除草剂的植物在接受农业界对田地除草通常使用之浓度和比率的除草剂时展现出即便有也是很少的坏死、细胞溶解、萎黄病或其它损伤。
更具体而言，本发明涉及产生对抑制羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)的除草剂和/或抑制到达质体醌途径内尿黑酸法呢基转移酶(HST)步骤的除草剂有抗性的植物。
通过抑制HPPD发挥作用的除草剂是本领域众所周知的。HPPD的抑制阻断了从酪氨酸到质体醌(PQ)的生物合成。PQ是光合中心之光损伤防护所必不可少的类胡萝卜色素生物合成中的必要辅助因子。HPPD-抑制型除草剂是韧皮易变性漂白剂，它促使暴露于光下的新分生组织和叶子显现出白色，在缺乏类胡萝卜素的情况下，其中的叶绿素被光破坏并且其自身经由单线态氧的光产生而变成光破坏性物质。用于产生展现出充分抵抗或充分耐受HPPD抑制型除草剂的转基因植物的方法已有报道，例如WO02/46387。
在质体醌生物合成途径中催化从HPPD之后步骤的酶是HST。HST酶是异戊烯转移酶，它将尿黑酸脱羧基并将来自法呢基二磷酸盐的法呢基转移至其上，由此形成2-甲基-6-法呢基-l，4-苯醌(MSBQ)，一种沿生物合成途径到达质体醌的中间产物。HST酶是膜结合的，并且其编码基因包括质体靶向序列。最近已披露了用于检测HST的方法。
已有报道在转基因植物中HST过表达-并且所说的植物据称展现出稍高浓度的α-生育酚。不过，迄今为止还未公认HST是某些种类除草剂化合物的靶位点-它们完全或部分通过抑制HST来发挥作用。此外，目前已发现转基因植物中HST的过表达提供了对HST-抑制型和/或HPPD抑制型除草剂的耐受性。
因此，本发明提供了在包含农作物和杂草的地点选择性控制杂草的方法，其中所述方法包括对所述地点施用包含尿黑酸法呢基转移酶(homogentisate solanesyltransferase，HST)抑制型除草剂和/或羟基苯基丙酮酸双加氧酶(hydroxy phenyl pyruvate dioxygenase，HPPD)抑制型除草剂的杂草控制量杀虫剂组合物，其中所述农作物包含至少一种含有编码HST之区域的异源多核苷酸。在所述方法的一个优选实施方案中，所述农作物进一步包含另外的含有编码羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)之区域的异源多核苷酸。
本发明还进一步提供了在包含农作物和杂草的地点选择性控制杂草的方法，其中所述方法包括对所述地点施用包含HST抑制型除草剂的杂草控制量杀虫剂组合物，其中所述农作物包含至少一种含有编码HPPD酶之区域的异源多核苷酸。
在一个优选的实施方案中，上述方法中提到的杀虫剂组合物包含HST抑制型除草剂和HPPD抑制型除草剂二者。
就本发明的目的而言-HST抑制型除草剂是这样的除草剂，其自身或作为除草剂前体(procide)产生以IC50小于150ppm、优选小于60ppm的水平抑制拟南芥HST的分子(利用如本文所提出的“总提取物”检验方法测定)。应当意识到，HST抑制型除草剂可能还作为HPPD抑制剂发挥作用(可能用例如HPPD酶检验和/或HPPD或HST过表达转基因植物系的不同应答来确认)，并且因此，如下文所示，自我协同它们抑制HST的效应。优选所述HST抑制型除草剂选自由以下各式化合物组成的组：
式(IIa)化合物
Figure BDA0000050194610000031
其中
R1，R2，R3和R4独立地是氢或卤素；条件是R1，R2，R3和R4中的至少3个是卤素；或它们的盐；
式(IIb)的化合物
其中
R1和R2独立地是氢，C1-C4烷基，C1-C4卤代烷基，卤素，氰基，羟基，C1-C4烷氧基，C1-C4烷硫基，芳基或被1至5个可能相同或不同的R6取代的芳基，或者杂芳基或被1至5个可能相同或不同的R6取代的杂芳基；
R3是氢，C1-C10烷基，C2-C10烯基，C2-C10炔基，C3-C10环烷基，C3-C10环烷基-C1-C6烷基-，C1-C10烷氧基-C1-C6烷基-，C1-C10氰烷基-，C1-C10烷氧羰基-C1-C6烷基-，N-C1-C3烷基-氨基羰基-C1-C6烷基-，N，N-二-(C1-C3烷基)-氨基羰基-C1-C6烷基-，芳基-C1-C6烷基-或者其中所述芳基部分被1至3个可能相同或不同的R7取代的芳基-C1-C6烷基-，或者杂环基-C1-Có烷基-或其中杂环基部分被1至3个可能相同或不同的R7取代的杂环基-C1-Có烷基-；
R4是芳基或被1至5个可能相同或不同的R8取代的芳基，或者杂芳基或被1至4个可能相同或不同的R8取代的杂芳基；
R5是羟基，R9-氧基-，R10-羰基氧基-，三-R11-甲硅烷氧基-或R12-磺酰氧基-，每个R6，R7和R8独立地是卤素，氰基，硝基，C1-C10烷基，C1-C4卤代烷基，C2-C10烯基，C2-C10炔基，羟基，C1-C10烷氧基，C1-C4卤代烷氧基，C1-C10烷氧基-C1-C4烷基-，C3-C7环烷基，C3-C7环烷氧基，C3-C7环烷基-C1-C4烷基-，C3-C7环烷基-C1-C4烷氧基-，C1-Có烷基羰基-，甲酰基，C1-C4烷氧基-羰基-，C1-C4烷基羰基氧基-，C1-C10烷硫基-，C1-C4卤代烷硫基-，C1-C10烷基亚硫酰基-，C1-C4卤代烷基亚硫酰基-，C1-C10烷基磺酰基-，C1-C4卤代烷基磺酰基-，氨基，C1-C10烷氨基-，二-C1-C10烷氨基-，C1-C10烷基羰基氨基-，芳基或被1至3个可能相同或不同的R13取代的芳基，杂芳基或被1至3个可能相同或不同的R13取代的杂芳基，芳基-C1-C4烷基-或其中芳基部分被1至3个可能相同或不同的R13取代的芳基-C1-C4烷基-，杂芳基-C1-C4烷基-或其中杂芳基部分被1至3个可能相同或不同的R13取代的杂芳基-C1-C4烷基-，芳氧基-或被1至3个可能相同或不同的R13取代的芳氧基-，杂芳氧基-或被1至3个可能相同或不同的R13取代的杂芳氧基-，芳硫基-或被1至3个可能相同或不同的R13取代的芳硫基，或者杂芳硫基-或被1至3个可能相同或不同的R13取代的杂芳硫基；
R9是C1-C10烷基，C2-C10烯基，C2-C10炔基或者芳基-C1-C4烷基-或者如下的芳基-C1-C4烷基-(其中芳基部分被1至5个独立选自卤素，氰基，硝基，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基或C1-C6烷氧基的取代基所取代)；
R10是C1-C10烷基，C3-C10环烷基，C3-C10环烷基-C1-C10烷基-，C1-C10卤代烷基，C2-C10烯基，C2-C10炔基，C1-C4烷氧基-C1-C10烷基-，C1-C4烷硫基-C1-C4烷基-，C1-C10烷氧基，C2-C10烯氧基，C2-C10炔氧基，C1-C10烷硫基-，N-C1-C4烷基-氨基-，N，N-二-(C1-C4烷基)-氨基-，芳基或被1至3个可能相同或不同的R14取代的芳基，杂芳基或被1至3个可能相同或不同的R14取代的杂芳基，芳基-C1-C4烷基-或其中芳基部分被1至3个可能相同或不同的R14取代的芳基-C1-C4烷基-，杂芳基-C1-C4烷基-或其中杂芳基部分被1至3个可能相同或不同的R14取代的杂芳基-C1-C4烷基-，芳氧基-或被1至3个R14取代的芳氧基，它们可能是相同的或不同的，杂芳氧基-或被1至3个可能相同或不同的R14取代的杂芳氧基-，芳硫基-或被1至3个可能相同或不同的R14取代的芳硫基-，或者杂芳硫基-或被1至3个可能相同或不同的R14取代的杂芳硫基-；
每个R11独立地是C1-C10烷基或者苯基或被1至5个独立地选自卤素，氰基，硝基，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基或C1-C6烷氧基的取代基所取代的苯基；R12是C1-C10烷基或者苯基或被1至5个独立选自卤素，氰基，硝基，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基或者C1-C6烷氧基的取代基所取代的苯基；
每个R13独立地是卤素，氰基，硝基，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基或C1-C6烷氧基；而
每个R14独立地是卤素，氰基，硝基，C1-C10烷基，C1-C4卤代烷基，C1-C10烷氧基，C1-C4烷氧羰基-，C1-C4卤烷氧基，C1-C10烷硫基-，C1-C4卤烷硫基-，C1-C10烷基亚硫酰基-，C1-C4卤代烷基亚硫酰基-，C1-C10烷磺酰基-，C1-C4卤烷磺酰基-，芳基或被1至5个独立选自卤素，氰基，硝基，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基或C1-C6烷氧基的取代基所取代的芳基，或者杂芳基或被1至4个独立选自卤素，氰基，硝基，C1-C6烷基，C1-Có卤代烷基或C1-C6烷氧基的取代基所取代的杂芳基；或者它们的盐或N-氧化物；
式(IIc)的化合物
Figure BDA0000050194610000051
其中R1和R2独立地是氢，C1-C4烷基，C1-C4卤代烷基，卤素，氰基，羟基，C1-C4烷氧基，C1-C4烷硫基，芳基或被1至5个可能相同或不同的R6取代的芳基，或者杂芳基或被1至5个可能相同或不同的R6取代的杂芳基；R3是C1-C4卤代烷基，C2-C4卤烯基或C2-C4卤炔基；R4是芳基或被1至5个可能相同或不同的R8取代的芳基，或者杂芳基或被1至4个可能相同或不同的R8取代的杂芳基；
R5是羟基或可以代谢成羟基的基团；每个R6和R8独立地是卤素，氰基，硝基，C1-C10烷基，C1-C4卤代烷基，C2-C10烯基，C2-C10炔基，羟基，C1-C10烷氧基，C1-C4卤烷氧基，C1-C10烷氧基-C1-C4烷基-，C3-C7环烷基，C3-C7环烷氧基，C3-C7环烷基-C1-C4烷基-，C3-C7环烷基-C1-C4烷氧基-，C1-Có烷基羰基-，甲酰基，C1-C4烷氧羰基-，C1-C4烷基羰基氧基-，C1-C10烷硫基-，C1-C4卤烷硫基-，C1-C10烷基亚硫酰基-，C1-C4卤代烷基亚硫酰基-，C1-C10烷基磺酰基-，C1-C4卤代烷基磺酰基，氨基，C1-C10烷氨基-，二-C1-C10烷氨基-，C1-C10烷基羰基氨基-，芳基或被1至3个可能相同或不同的R13取代的芳基，杂芳基或被1至3个可能相同或不同的R13取代的杂芳基，芳基-C1-C4烷基-或其中芳基部分被1至3个可能相同或不同的R13取代的芳基-C1-C4烷基-，杂芳基-C1-C4烷基-或其中杂芳基部分被1至3个可能相同或不同的R13取代的杂芳基-C1-C4烷基-，芳氧基-或被1至3个可能相同或不同的R13取代的芳氧基，杂芳氧基-或被1至3个可能相同或不同的R13取代的杂芳氧基，芳硫基-或被1至3个可能相同或不同的R13取代的芳硫基，或者杂芳硫基-或被1至3个可能相同或不同的R13取代的杂芳硫基；而每个R13独立地是卤素，氰基，硝基，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基或C1-C6烷氧基；或者它们的盐或N-氧化物；
式(IId)的化合物
Figure BDA0000050194610000061
其中
R1和R2独立地是氢，C1-C4烷基，C1-C4卤代烷基，卤素，氰基，羟基，C1-C4烷氧基，C1-C4烷硫基，芳基或被1至5个可能相同或不同的R6取代的芳基，或被1至5个可能相同或不同的R6取代的杂芳基；
R3是氢，C1-C10烷基，C1-C4卤代烷基，C2-C10烯基，C2-C4卤烯基，C2-C10炔基，C2-C4卤炔基，C3-C10环烷基，C3-C10环烷基-C1-C6烷基-，C1-C10烷氧基-C1-C6烷基-，C1-C10氰烷基-，C1-C10烷氧羰基-C1-C6烷基-，N-C1-C3烷基-氨基羰基-C1-C6烷基-，N，N-二-(C1-C3烷基)-氨基羰基-C1-C6烷基-，芳基-C1-C6烷基-或其中芳基部分被1至3个可能相同或不同的R7取代的芳基-C1-C6烷基-，或者杂环基-C1-Có烷基-或其中杂环基部分被1至3个可能是相同或不同的R7取代的杂环基-C1-C6烷基-；
R4是芳基或被1至5个可能相同或不同的R8取代的芳基，或者杂芳基或被1至4个可能相同或不同的R8取代的杂芳基；
R5是羟基或者可代谢成羟基的基团；每个R6，R7和R8独立地是卤素，氰基，硝基，C1-C10烷基，C1-C4卤代烷基，C2-C10烯基，C2-C10炔基，羟基，C1-C10烷氧基，C1-C4卤烷氧基，C1-C10烷氧基-C1-C4烷基-，C3-C7环烷基，C3-C7环烷氧基，C3-C7环烷基-C1-C4烷基-，C3-C7环烷基-C1-C4烷氧基-，C1-C6烷基羰基-，甲酰基，C1-C4烷氧基-羰基-，C1-C4烷基羰基氧基-，C1-C10烷硫基-，C1-C4卤烷硫基-，C1-C10烷基亚硫酰基-，C1-C4卤代烷基亚硫酰基-，C1-C10烷基磺酰基-，C1-C4卤代烷基磺酰基-，氨基，C1-C10烷氨基-，二-C1-C10烷氨基-，C1-C10烷基羰基氨基-，芳基或被1至3个可能相同或不同的R13取代的芳基，杂芳基或被1至3个可能相同或不同的R13取代的杂芳基，芳基-C1-C4烷基-或其中芳基部分被1至3个可能是相同或不同的R13取代的芳基-C1-C4烷基-，杂芳基-C1-C4烷基-或其中杂芳基部分被1至3个可能相同或不同的R13取代的杂芳基-C1-C4烷基-，芳氧基-或被1至3个可能是相同或不同的R13取代的芳氧基，杂芳氧基-或被1至3个可能相同或不同的R13取代的杂芳氧基，芳硫基-或被1至3个可能相同或不同的R13取代的芳硫基，或者杂芳硫基-或被1至3个可能相同或不同的R13取代的杂芳硫基；
其中每个R13独立地是卤素，氰基，硝基，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基或C1-C6烷氧基；或者它们的盐或N-氧化物；
式(IIe)的化合物
Figure BDA0000050194610000071
其中
A1，A2，A3和A4独立地是C-R1或N，条件是A1，A2，A3和A4中的至少一个是N，并且条件是如果A1和A4均为N，则A2和A3不都是C-R1；
每个R1独立地是氢，C1-C4烷基，C1-C4卤代烷基，卤素，氰基，羟基，C1-C4烷氧基，C1-C4烷硫基，芳基或被1至5个可能相同或不同的R6取代的芳基，或者杂芳基或被1至5个可能相同或不同的R6取代的杂芳基；
R3是氢，C1-C10烷基，C1-C4卤代烷基，C2-C10烯基，C2-C4卤烯基，C2-C10炔基，C2-C4卤炔基，C3-C10环烷基，C3-C10环烷基-C1-C6烷基-，C1-C10烷氧基-C1-C6烷基-，C1-C10氰烷基-，C1-C10烷氧羰基-C1-C6烷基-，N-C1-C3烷基-氨基羰基-C1-C6烷基-，N，N-二-(C1-C3烷基)-氨基羰基-C1-C6烷基-，芳基-C1-C6烷基-或其中芳基部分被1至3个可能相同或不同的R7取代的芳基-C1-C6烷基-，或者杂环基-C1-C6烷基-或其中杂环基部分被1至3个可能相同或不同的R7取代的杂环基-C1-C6烷基-；
R4是芳基或被1至5个可能相同或不同的R8取代的芳基，或者杂芳基或被1至4个可能相同或不同的R8取代的杂芳基；
R5是羟基或者可代谢成羟基的基团；
每个R6，R7和R8独立地是卤素，氰基，硝基，C1-C10烷基，C1-C4卤代烷基，C2-C10烯基，C2-C10炔基，羟基，C1-C10烷氧基，C1-C4卤烷氧基，C1-C10烷氧基-C1-C4烷基-，C3-C7环烷基，C3-C7环烷氧基，C3-C7环烷基-C1-C4烷基-，C3-C7环烷基-C1-C4烷氧基-，C1-C6烷基羰基-，甲酰基，C1-C4烷氧基-羰基-，C1-C4烷基羰基氧基-，C1-C10烷硫基-，C1-C4卤烷硫基-，C1-C10烷基亚硫酰基-，C1-C4卤代烷基亚硫酰基-，C1-C10烷基磺酰基-，C1-C4卤代烷基磺酰基-，氨基，C1-C10烷氨基-，二-C1-C10烷氨基-，C1-C10烷基羰基氨基-，芳基或被1至3个可能相同或不同的R13取代的芳基，杂芳基或被1至3个可能相同或不同的R13取代的杂芳基，芳基-C1-C4烷基-或其中芳基部分被1至3个可能相同或不同的R13取代的芳基-C1-C4烷基-，杂芳基-C1-C4烷基-或其中杂芳基部分-被1至3个可能相同或不同的R13取代的杂芳基-C1-C4烷基-，芳氧基-或被1至3个可能相同或不同的R13取代的芳氧基-，杂芳氧基-或被1至3个可能相同或不同的R13取代的杂芳氧基-，芳硫基-或被1至3个可能相同或不同的R13取代的芳硫基-，或者杂芳硫基-或被1至3个可能相同或不同的R13取代的杂芳硫基-；
每个R13独立地是卤素，氰基，硝基，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基或C1-C6烷氧基；或者它们的盐或N-氧化物；以及
式(IIf)的化合物
Figure BDA0000050194610000091
其中
R1是C1-C6烷基或C1-C6烷氧基-C1-C6烷基；
R2是氢或C1-C6烷基；
G是氢，-(C＝L)R3，-(SO2)R4，或-(P＝L)R5R6，其中L是氧或硫；
R3是C1-C6烷基，C3-C8环烷基，C2-C6烯基，C2-C6炔基，C6-C10芳基，C6-C10芳基-C1-C6烷基-，C1-C6烷氧基，C3-C8环烷氧基，C2-C6烯氧基，C2-C6炔氧基，C6-C10芳氧基，C6-C10芳基-C1-Có烷氧基-，氨基，C1-C6烷基氨基，C2-C6烯基氨基，C6-C10芳基氨基，二(C1-C6烷基)氨基，二(C2-C6烯基)氨基，(C1-Có烷基)(C6-C10芳基)氨基或三元至八元的含氮杂环。
R4是C1-C6烷基，C6-C10芳基，C1-C6烷基氨基或二(C1-C6烷基)氨基；
R5和R6可能是相同的或不同的，并且独立地是C1-C6烷基，C3-8环烷基，C2-C6烯基，C6-C10芳基，C1-C6烷氧基，C3-C8环烷氧基，C6-C10芳氧基，C6-C10芳基-C1-C6烷氧基，C1-C6烷硫基，C1-C6烷基氨基或二(C1-C6烷基)氨基，由此任一R3，R4，R5和R6可能被以下基团所取代：卤素，C3-C8环烷基，C6-C10芳基，C6-C10芳基-C1-C6烷基-，C3-C8环烷氧基，C6-C10芳氧基，C6-C10芳基-C1-C6烷氧基-，C6-C10芳基氨基，(C1-C6烷基)(C6-C10芳基)氨基以及可能被至少一个C1-C6烷基取代的三元至八元的含氮杂环；
Z1是C1-C6烷基；
Z2是C1-C6烷基；
n是0，1，2，3或4；
并且当n代表2或更大的整数时，Z2的每一个可能是相同的或不同的，并且Z1代表的基团中碳原子数目与Z2代表的基团中碳原子数目的总和等于2或更大。
式(IIa)的HST抑制物是已知的，例如氟啶草和氯草定。式(IIb)的HST抑制物是已知的，例如可见于文献WO 2008/009908中。式(IIc)的HST抑制物是已知的，例如可见于文献WO 2008/071918中。式(IId)的HST抑制物是已知的，例如可见于文献WO 2009/063180中。式(IIe)的HST抑制物是已知的，例如可见于文献WO2009/090401和WO2009/090402中。式(IIf)的HST抑制物是已知的，例如可见于文献WO 2007/119434中。
优选式(IIa)的化合物
Figure BDA0000050194610000101
其中
R1，R2，R3和R4独立地是氢，溴，氯或氟；条件是R1，R2，R3和R4中至少3个是溴，氯或氟，最优选这样的式(IIa)的化合物，其中R1和R4是氟而R2和R3是氯(氟啶草)，或者其中R1，R2和R3是氯而R4是氢(氯草定)。
术语″HPPD抑制型除草剂″指这样的除草剂，其或者直接或者作为除草剂前体(procide)发挥作用而抑制HPPD，并且在其活性形式下，当使用WO 02/46387中所述的结合/解离速率方法(on and off rate methods)进行检测时对拟南芥HPPD展示出Ki小于5nM，优选1nM。在本发明的上下文中术语羟基苯基丙酮酸盐(或丙酮酸)双加氧酶(HPPD)，4-羟基苯基丙酮酸盐(或丙酮酸)双加氧酶(4-HPPD)和对羟基苯基丙酮酸盐(或丙酮酸)双加氧酶(p-HPPD)是同义的。
优选的，HPPD抑制型除草剂选自下组中：
式(Ia)的化合物：
Figure BDA0000050194610000111
其中R1和R2是氢或者一起形成亚乙基桥；
R3是羟基或苯硫基-；R4是卤素，硝基，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基-C1-C4烷基-，C1-C4烷氧基-C1-C4烷氧基-C1-C4烷基-；
X是次甲基，氮，或C-R5，其中R5是氢，C1-C4卤烷氧基-C1-C4烷基-，或基团
Figure BDA0000050194610000112
而R6是C1-C4烷基磺酰基-或C1-C4卤代烷基；
式(Ib)的化合物
Figure BDA0000050194610000113
R1和R2独立地是C1-C4烷基；以及它们的游离酸；
式(Ic)的化合物
其中R1是羟基，苯基羰基-C1-C4烷氧基-或苯基羰基-C1-C4烷氧基-(其中苯基部分被卤素或C1-C4烷基在对位取代)，或者苯基磺酰氧基-或其中苯基部分被卤素或C1-C4烷基在对位取代的苯基磺酰氧基-；
R2是C1-C4烷基；
R3是氢或C1-C4烷基；R4和R6独立地是卤素，C1-C4烷基，C1-C4卤代烷基，或者C1-C4烷基磺酰基-；而
R5是氢，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基-C1-C4烷氧基-，或基团
Figure BDA0000050194610000121
式(Id)的化合物
其中R1是羟基；
R2是C1-C4烷基；
R3是氢；而R4，R5和R6独立地是C1-C4烷基；
式(Ie)的化合物
Figure BDA0000050194610000123
其中R1是环丙基；
R2和R4独立地是卤素，C1-C4卤代烷基，或C1-C4烷基磺酰基-；
而R3是氢；以及
式(If)的化合物
Figure BDA0000050194610000124
其中R1是环丙基；
R2和R4独立地是卤素，C1-C4卤代烷基，或C1-C4烷基磺酰基-；而
R3是氢。
HPPD-抑制物的例子也公开于WO2009/016841中。在一个优选的实施方案中，HPPD抑制物选自苯并双环酮，硝磺酮，磺草酮，双环磺草酮(tefuryltrione)，tembotrione，4-羟基-3-[[2-(2-甲氧基乙氧基)甲基]-6-(三氟甲基)-3-吡啶基]羰基]-双环[3.2.1]-辛-3-烯-2-酮(双环吡喃酮)，ketospiradox或其游离酸，联苯肼酯，磺酰草吡唑，吡唑特，苄草唑，吡草磺，[2-氯-3-(2-甲氧基乙氧基)-4-(甲磺酰基)苯基](l-乙基-5羟基-1H-吡唑-4-基)-甲酮，(2，3-二氢-3，3，4-三甲基-l，l-二氧化苯并[b]噻吩-5-基)(5-羟基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)-甲酮，异恶氯草酮，异恶唑草酮，α-(环丙基羰基)-2-(甲磺酰基)-β-氧-4-氯-苯丙腈(benzenepropanenitrile)，和α-(环丙基羰基)-2-(甲磺酰基)-β-氧-4-(三氟甲基)-苯丙腈(benzenepropanenitrile)。
这些HPPD抑制物是已知的，并且有以下化学文摘注册编号：苯并双环酮(CAS RN 156963-66-5)，硝磺酮(CAS RN 104206-82-8)，磺草酮(CAS RN 99105-77-8)，双环磺草酮(tefuryltrione)(CAS RN473278-76-1)，tembotrione(CAS RN 335104-84-2)，4-羟基-3-[[2-(2-甲氧基乙氧基)甲基]-6-(三氟甲基)-3-吡啶基]羰基]-双环[3.2.l]辛-3-烯-2-酮(CAS RN 352010-68-5)，ketospiradox(CAS RN 192708-91-1)或其游离酸(CAS RN 187270-87-7)，联苯肼酯(CAS RN 82692-44-2)，磺酰草吡唑(CAS RN 365400-11-9)，吡唑特(CAS RN 58011-68-0)，苄草唑(CAS RN 71561-11-0)，吡草磺(CAS RN 210631-68-8)，[2-氯-3-(2-甲氧基乙氧基)-4-(甲磺酰基)苯基](l-乙基-5羟基-1H-吡唑-4-基)-甲酮(CAS RN 128133-27-7)，(2，3-二氢-3，3，4-三甲基-1，1-二氧化苯并[b]噻吩-5-基)(5-羟基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)-甲酮(CAS RN345363-97-5)，异氯草酮(CAS RN 141112-06-3)，异
Figure BDA0000050194610000131
唑草酮(CASRN 141112-29-0)，α-(环丙基羰基)-2-(甲磺酰基)-β-氧-4-氯-苯丙腈(CAS RN 143701-66-0)和α-(环丙基羰基)-2-(甲磺酰基)-β-氧-4-(三氟甲基)-苯丙腈(CAS RN 143701-75-1)。
以下定义适用于关于式I和式II中所用的这些术语。
烷基部分(或者单独或者作为较大基团的一部分，诸如烷氧基，烷氧基-羰基，烷基羰基，烷基氨基羰基，二烷基氨基羰基)是直链或支链的，并且是例如甲基、乙基、正丙基、正丁基，正戊基，正己基，异丙基、正丁基，仲丁基，异丁基，叔丁基或新戊基。烷基优选是C1-C6烷基，更优选C1-C4，最优选甲基。
烯基和炔基部分(或者单独或者作为较大基团的一部分，诸如烯氧基或炔氧基)可以是直链或支链形式，且烯基部分，在适当的情况下，可以是(E)-或(Z)-构型。实例有乙烯基、烯丙基和炔丙基。烯基和炔基优选C2至C6烯基或炔基，更优选C2-C4烯基或炔基，最优选C2-C3烯基或炔基。
烷氧基烷基优选链长为2至8个碳或氧原子。烷氧基烷基的例子是2-甲氧基-乙基-。
卤素通常是氟，氯，溴或碘，优选氟或氯。与其它含义结合使用，(诸如卤代烷基)时，卤素的含义同上。
卤代烷基优选链长为1至4个碳原子。卤代烷基是例如氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、2，2，2-三氟乙基、2-氟乙基、2-氯乙基、五氟乙基、1，1-二氟-2，2，2-三氯乙基、2，2，3，3-四氟乙基或2，2，2-三氯乙基；优选三氯甲基、二氟氯甲基、二氟甲基、三氟甲基或二氯氟甲基。
卤烷氧基烷基优选链长2至8个碳或氧原子。烷氧基烷基的例子是2，2，2-三氟乙氧基甲基-。
烷氧基烷氧基优选链长2至8个碳或氧原子。烷氧基烷氧基的例子有：甲氧基甲氧基，2-甲氧基-乙氧基，甲氧基丙氧基，乙氧基甲氧基，乙氧基乙氧基，丙氧基甲氧基和丁氧基丁氧基。烷氧基烷基优选链长为1至6个碳原子。烷氧基烷基是例如甲氧基甲基、甲氧基乙基、乙氧基甲基、乙氧基乙基、正丙氧基甲基、正丙氧基乙基、异丙氧基甲基或异丙氧基乙基。
烷氧基烷氧基烷基优选链长为3至8个碳或氧原子。烷氧基-烷氧基-烷基的例子有：甲氧基甲氧基甲基、甲氧基乙氧基甲基、乙氧基甲氧基氧甲基和甲氧基乙氧基乙基。
氰烷基是被一个或多个氰基取代的烷基，例如，氰甲基或1，3-二氰丙基。
环烷基可以是单环或双环形式的，并且可能任选的被一个或多个甲基取代。环烷基优选包含3至8个碳原子，更优选3至6个碳原子。单环环烷基的实例有环丙基，1-甲基环丙基，2-甲基环丙基，环丁基，环戊基和环己基。
在本说明书的上下文中，术语“芳基”指可能是单环、二环或三环的环系。这样的环的例子包括苯基，萘基，蒽基，茚基或菲基。优选的芳基是苯基。
术语″杂芳基″指包含至少一个杂原子并且由单个环或者两个或更多个稠合环组成的芳香环系。优选的，单个环将包含多达三个杂原子，双环系将包含多达4个杂原子，所述杂原子优选选自氮、氧和硫。所述基团的例子包括吡啶基，吡嗪基，嘧啶基，吡嗪基，三嗪基，呋喃基，噻吩硫基，
Figure BDA0000050194610000151
唑基，异
Figure BDA0000050194610000152
唑基，
Figure BDA0000050194610000153
二唑基，噻唑基，异噻唑基，噻二唑基，吡咯基，吡唑基，咪唑基，三唑基和四唑基。优选的杂芳基是吡啶。双环基团的例子是苯并噻吩基，苯并咪唑基，苯并噻二唑基，喹啉基，噌嗪基，喹
Figure BDA0000050194610000154
啉基和吡唑并[1，5-a]嘧啶基。
术语″杂环基″定义为包括杂芳基以及它们的不饱和或部分不饱和类似物，诸如4，5，6，7-四氢-苯并噻吩基，chromen-4-onyl，9H-芴基，3，4-二氢-2H-苯并-l，4-dioxepinyl，2，3-二氢-苯并呋喃基，哌啶基，1，3-二氧杂环戊烷基(1，3-dioxolanyl)，1，3-二氧杂环己基(1，3-dioxanyl)，4，5-二氢-异
Figure BDA0000050194610000155
唑基，四氢呋喃基和吗啉基。
应当理解，在上述方法中，除草剂组合物可能施用于农作物出苗前的和/或农作物出苗后的地点。在一个优选的实施方案中，除草剂组合物在农作物出苗后施用-所谓的″顶部″施用。为了获得预期的杂草控制，可能根据需要采用单一的或实际上多次的施加。
术语″杂草″涉及任何不需要的植被，包括例如大豆作物田地内的遗留物或″劣种″或″自生的″农作物。
通常，所述异源多核苷酸会包含(i)植物可操作启动子，其可操作性连接(ii)编码HST酶的区域以及(iii)转录终止子。通常，该异源多核苷酸进一步包含编码能将HST酶靶向亚细胞器诸如叶绿体或线粒体-优选叶绿体的多肽的区域。异源多核苷酸可能进一步包含例如转录增强子。此外，取决于HST酶预期在其中表达的植物宿主，编码HST酶的区域可以进行“密码子最优化”。技术熟练人员十分清楚本发明上下文中有用的植物可操作启动子、转录终止子、叶绿体转运肽、增强子等等。
HST可能是“野生型”酶，或者它可能是被修饰以提供关于除草剂耐受性植物而言优选的动力学特性的酶。在优选的实施方案中，HST的特征在于它包含一个或多个以下的多肽基元：
-W-(R/K)-F-L-R-P-H-T-I-R-G-T；和/或
N-G-(Y/F)-I-V-G-I-N-Q-I-(Y/F)-D；和/或
I-A-I-T-K-D-L-P；和/或
Y-(R/Q)-(F/W)-(I/V)-W-N-L-F-Y。
合适的HST来自拟南芥、大豆(Glycine max)、稻(Oryza sativa)或莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。在一个更优选的实施方案中，HST选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO.10。应该指出，SEQ IDNOS：1至10中提供的氨基酸序列是包含编码叶绿体转运肽的区域的HST氨基酸序列的实例。
SEQ ID NOS 11-20相应于编码SEQ ID NO.1-10所述的HST的DNA序列，而SEQ ID NOS 21-24是编码无转运肽区之截短的成熟HST序列的DNA序列的实例。
SEQ ID NOS 25-28中所提供的氨基酸序列是HPPD氨基酸序列的实例，而SEQ ID NOS 29-32是编码它们的DNA序列的实例。适于提供对HPPD抑制型除草剂的耐受性的HPPD是技术熟练人员众所周知的-例如WO 02/46387。SEQ ID No 33提供了TMV翻译增强子的DNA序列，而SEQ ID No 34提供了TMV翻译增强子的DNA序列在5′与编码拟南芥HST的DNA序列融合。
此外还应理解，用于所说方法中的农作物可能进一步包含编码另外的除草剂耐受酶的更多异源多核苷酸。另外的除草剂耐受酶包括例如选自如下的除草剂耐受酶：5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，草甘膦乙酰基转移酶(GAT)，细胞色素P450，膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)，乙酰乳酸合酶(ALS)，原卟啉原氧化酶(PPGO)，八氢番茄红素去饱和酶(PD)，麦草畏降解酶(e.g WO 02/068607)和如WO2007/053482和WO2005/107437中所述芳氧基除草剂降解酶。
上述方法中所用的杀虫剂组合物可能进一步包含一种或更多种另外的杀虫剂-尤其是除草剂-农作物对它们天然耐受或者经由本文所提及的一种或更多种另外的转基因的表达而对其具有抗性。在一个优选的实施方案中，所述的一种或更多种另外的除草剂选自草甘膦(包括其农业化学上可接受的盐)；草铵膦(包括其农业化学上可接受的盐)；氯乙酰苯胺例如甲草胺，乙草胺，异丙甲草胺，S-异丙甲草胺；光系统II抑制剂例如三嗪类诸如莠灭净，阿特拉津，氰草津和特丁津，三嗪酮类诸如环嗪酮和嗪草酮，尿素诸如氯麦隆，敌草隆，异丙隆，利谷隆和terbuthiuron；ALS抑制剂例如磺酰脲诸如酰嘧磺隆，氯磺隆，氟啶嘧磺隆，氯吡嘧磺隆，nicosulfuron，氟嘧磺隆，氟磺隆，砜嘧磺隆，醚苯磺隆，三氟啶磺隆和三氟甲磺隆；二苯醚例如aciflurofen和氟磺胺草醚。
本发明进一步提供了包含可操作性连接于植物可操作性启动子的编码HST酶的区域的重组多核苷酸，其中所述编码HST酶的区域不包括SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15中所述的多核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，HST-酶选自SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10。
本发明还进一步提供了包含以下部分的重组多核苷酸(i)可操作性连接于植物可操作性启动子的编码HST酶的区域和(ii)至少一种另外的异源多核苷酸，它包含编码另外的除草剂耐受酶的区域，其可操作性的与植物可操作性启动子连接。所述的另外的除草剂耐受酶选自例如羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)，5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，草甘膦乙酰基转移酶(GAT)，细胞色素P450，膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)，乙酰乳酸合酶(ALS)，原卟啉原氧化酶(PPGO)，八氢番茄红素去饱和酶(PD)以及如WO 02/068607中所述的麦草畏降解酶。
优选所述重组多核苷酸包含(i)与植物可操作性启动子可操作性连接的编码HST的区域以及(ii)与植物可操作性启动子可操作性连接的编码HPPD的区域。此外对于重组多核苷酸而言还可能包含至少两个、三个或更多个各自编码例如如前所述除草剂耐受酶的附加区域。因此，在另一优选实施方案中，所述重组多核苷酸包含(i)编码HST酶的区域，(ii)编码HPPD酶的区域以及(iii)编码草甘膦耐受酶的区域。
本发明进一步提供了包含本发明之重组多核苷酸的载体。
本发明进一步涉及与非转基因类似植物相比对HST抑制型除草剂和/或HPPD抑制型除草剂呈现出充分抗性或充分耐受性的过表达HST酶的转化植物。此外应认识到本发明的转化植物通常展示出增强的压力耐受性，包括对热和干旱的耐受。
由此，本发明进一步提供了与非转基因类似植物细胞相比对HST抑制型除草剂和/或HPPD抑制型除草剂展示出充分抗性或充分耐受性的植物细胞-所说植物细胞包含本文所述之本发明的重组多核苷酸。应当意识到，编码HST的区域和编码一种或更多种附加除草剂耐受酶的任何区域可能在同一(“连接的”)或实际上分开的转化重组多核苷酸分子上提供。
所述植物细胞可能进一步包含另外的转基因特性，例如提供对昆虫、真菌和/或线虫的抗性的异源多核苷酸。
本发明进一步提供了形态学上正常的可育HST抑制剂耐受型植物、植物细胞、组织和包含本发明植物细胞的种子。
被转化的植物或植物细胞包括但不局限于大田作物、水果和蔬菜诸如菜籽油菜，向日葵，烟草，甜菜，棉花，玉米，小麦，大麦，稻(rice)，高粱，西红柿，芒果，梨、苹果、桃、草莓、香蕉、瓜，mangelworzel，马铃薯，胡萝卜，莴苣，甘蓝，洋葱等等。尤其优选的经遗传修饰的植物是大豆，甘蔗，豌豆(pea)，大田豆类，白杨，葡萄，柑桔，紫花苜蓿、黑麦、燕麦、草皮和饲草、亚麻和油籽芸苔，以及未特别提及的产坚果的植物。在所述方法一个特别优选的实施方案中，所说的植物是双子叶植物，优选自菜籽油菜，向日葵，烟草，甜菜，大豆，棉花，高粱，西红柿，芒果，梨，苹果，桃，草莓，香蕉，瓜，马铃薯，胡萝卜，莴苣，甘蓝，洋葱，并且尤其优选大豆。在进一步优选的实施方案中，所说的植物是玉米或稻。优选地，本发明植物是大豆、稻或玉米。本发明还包括前述植物的后代以及所述植物和后代的种子或其它繁殖材料。
在一个特别优选的方面，本发明的重组多核苷酸用于保护大豆作物免受选自式Ia或Ig之化合物中的HPPD化学分类HPPD抑制物除草剂的除草损伤。在一个进一步的实施方案中，HPPD抑制物除草剂选自磺草酮，硝磺酮，tembotrione和式Ia的化合物，其中X是氮而R4是CF3，CF2H或CFH2，并且/或者其中的R1和R2一起形成亚乙基桥。
本发明还进一步提供了得到对HST抑制型和/或HPPD抑制型除草剂耐受的转基因植物的方法，它包括用含有编码HST酶的区域的重组多核苷酸转化植物材料，用HST抑制型除草剂和/或HPPD抑制型除草剂选择经转化的植物材料，并且将该材料再生成形态学上正常的可育植物。在一个优选的实施方案中，被转化的植物材料是单独用HST-抑制型除草剂或者联合使用HPPD抑制型除草剂进行筛选的。
本发明进一步涉及利用含有编码HST酶的区域的多核苷酸作为植物转化中的选择性标记物以及在对完全或部分通过抑制HST发挥作用的除草剂耐受的植物产生中使用含编码HST酶的区域的多核苷酸。
本发明还进一步涉及使用HST抑制物作为植物转化中的选择剂以及在潜在除草剂的体外筛选中使用重组HST酶。
本发明还进一步提供了除草组合物，优选具有协同作用的除草剂组合物，其中包含HPPD抑制型除草剂(如本文所定义)和HST抑制型除草剂(如本文所定义)。组合物中HPPD抑制型除草剂对HST抑制型除草剂的比例是任何合适的比例-通常从100∶1至1∶100，优选从1∶10至1∶100，还更优选从1∶1至1∶20。技术熟练人员将意识到最佳比例将取决于两种除草剂的相对潜力和图谱这可根据常规实验优化而确定。
所述除草组合物可能进一步包含一种或更多种另外的杀虫成分。所述的另外的杀虫剂可能包括例如除草剂、杀真菌剂或杀虫剂(诸如thiomethoxam)-不过优选除草剂。因而，所述的另外的除草剂优选自草甘膦(包括其农业化学上可接受的盐)；草铵膦(包括其农业化学上可接受的盐)；氯乙酰苯胺例如甲草胺，乙草胺，异丙甲草胺，S-异丙甲草胺；光系统II(PS-II)抑制剂例如三嗪类诸如莠灭净，阿特拉津，氰草津和特丁津，三嗪酮类诸如环嗪酮和嗪草酮，以及脲类诸如氯麦隆，敌草隆，异丙隆，利谷隆和terbuthiuron；ALS-抑制剂例如磺酰脲诸如酰嘧磺隆，氯磺隆，氟啶嘧磺隆，氯吡嘧磺隆，烟嘧磺隆，氟嘧磺隆，氟磺隆，砜嘧磺隆，醚苯磺隆，trifloxysulfuron和三氟甲磺隆；二苯醚例如aciflurofen和氟磺胺草醚。PS-II除草剂是特别优选的，因为这样的混合物展示了特别好的效力。
因此，本发明还进一步提供了在包含农作物和杂草的地点选择性控制杂草的方法，包括对所述地点施用杂草控制量的如前所定义的协同作用除草组合物。在本发明进一步的实施方案中，将HPPD和HST抑制型除草剂顺序喷洒而非在同一时间作为混合物喷洒。因此例如，在本发明杂草控制的程序中，HST除草剂可有利地施用于先前已施用过HPPD除草剂的农作物地点。通常应在同一季节进行，但在更持久的HPPD除草剂的情形下，在随后的季节使用HST除草剂也是有利。此外，HST抑制型除草剂作为杂草控制程序中的一部分使用也是有利的，其中HPPD抑制型除草剂在同一季节的较早时候或者甚至在前一个季节被施用。
HPPD抑制型除草剂可能以任何适当的比率施用于所述地点-例如从1至1000g/ha，更优选从2至200g/ha。同样地，HST抑制型除草剂可能以任何适当的比率施用-例如从10至2000g/ha，更优选从50至400g/ha。
在另一实施方案中，HPPD抑制型除草剂以在没有其它除草剂情况下施用该HPPD抑制型除草剂时对杂草为亚致死的比率施用于所述地点。实际的亚致死比率将取决于存在的杂草种类和实际的杂草HPPD抑制物-但通常小于50g/ha-更优选小于10g/ha。由此，本发明进一步提供了利用HPPD抑制型除草剂的亚致死性施用来增加HST抑制型除草剂对杂草的控制效力的用途。
本发明将进一步通过以下非限制性实施例和序列表加以阐明。
序列表
SEQ ID NO.1拟南芥HST氨基酸序列
melsisqsprvrfsslaprflaashhhrpsvhlagkfislprdvrftslstsrmrskfvstnyrkisiracsqvgaaesddpvldriarfqnacwrflrphtirgtalgstalvtralienthlikwslvlkalsgllalicgngyivginqiydigidkvnkpylpiaagdlsvqsawllviffaiagllvvgfnfgpfitslyslglflgtiysvpplrmkrfpvaafliiatvrgfllnfgvyhatraalglpfqwsapvafitsfvtlfalviaitkdlpdvegdrkfqistlatklgvrniaflgsglllvnyvsaislafympqvfrgslmipahvilasglifqtwvlekanytkeaisgyyrfiwnlfyaeyllfpfl
SEQ ID NO.2稻(rice)HST氨基酸序列
maslaspplpcraaatasrsgrpaprllgpppppaspllssasarfprapcnaarwsrrdavrvcsqagaagpaplsktlsdlkdscwrflrphtirgtalgsmslvaralienpqlinwwlvfkafyglvalicgngyivginqiydiridkvnkpylpiaagdlsvqtawllvvlfaaagfsivvtnfgpfitslyclglflgtiysvppfrlkrypvaafliiatvrgfllnfgvyyatraalgltfqwsspvafitcfvtlfalviaitkdlpdvegdrkyqistlatklgvrniaflgsgllianyvaaiavaflmpqafrrtvmvpvhaalavgiifqtwvleqakyt kdaisqyyrfiwnlfyaeyiffpli
SEQ ID NO.3稻HST变体氨基酸序列
maslaspplpcraaatasrsgrpaprllgpppppaspllssasarfprapcnaarwsrrdavrvcsqagaagpaplsktlsdlkdscwrflrphtirgtalgsialvaralienpqlinwwlvfkafyglvalicgngyivginqiydiridkvnkpylpiaagdlsvqtawllvvlfaaagfsivvtnfgpfitslyclglflgtiysvppfrlkrypvaafliiatvrgfllnfgvyyatraalgltfqwsspvafitcfvtlfalviaitkdlpdvegdrkyqistlatklgvrniaflgsgllianyvaaiavaflmpqafrrtvmvpvhaalavgiifqtwvleqakytkdaisqyyrfiwnlfyaeyiffpli
SEQ ID NO.4大豆HST氨基酸序列
melslsptshrvpstiptlnsaklsstkat ksqqplflgfskhfnsiglhhhsyrccsnavperpqrpssiractgvgasgsdrplaerlldlkdacwrflrphtirgtalgsfalvaralientnlikwslffkafcglfalicgngyivginqiydisidkvnkpylpiaagdlsvqsawflviffaaaglsiaglnfgpfifslytlglflgtiysvpplrmkrfpvaafliiatvrgfllnfgvyyatraslglafewsspvvfittfvtffalviaitkdlpdvegdrkyqistfatklgvrniaflgsgilivnyivsvlaaiympqafrrwllipahtifaisliyqarileqanytkdaisgfyrfiwnlfyaeyaifpfi
SEQ ID NO.5衣藻HST氨基酸序列
mdlcsstgrgaclspastsrpcpapvhlrgrrlafspaqpagrrhlpvlssaavpaplpnggndesfaqklanfpnafwkflrphtirgtilgttavtakvlmenpgcidwallpkallglvallcgngyivginqiydvdidvvnkpflpvasgelspalawglclslaaagagivaanfgnlitslytfglflgtvysvpplrlkqyavpafmiiatvrgfllnfgvysatraalglpfewspavsfitvfvtlfatviaitkdlpdvegdqannistfatrmgvrnvallaigllmanylgaialaltystafnvplmagahailaatlalrtlklhaasysreavasfyrwiwnlfyaeyallpfl
SEQ ID NO.6烟草HST氨基酸序列
melacsscsslrfssvlthqdtaasryrklpptspsckaanfvlkssknlsssaglhigytnfsktvsyrkyrhisiracsqvgtagsepvldklsqfkdafwrflrphtirgtalgslslvtralienpnlirwslamkafsglialicgngyivginqiydigidkvnkpylpiaagdlsvqsawflvllfamagllivginfgpfitslyclglflgtiysvppfrmkrfavvafliiatvrgfllnygvyyattaalglsfqwsspvafittfvtlfalviaitkdlpdvegdrkfqistlatklgvrniaflgsglllanyigavvaaiympqafrsslmipvhailalclvfqawllekanytkeaisayyqfiwnffyaeylifpfi
SEQ ID NO.7耧斗菜HST氨基酸序列
lcfsspsisipphcsttthyrkipinstfkstnflskasnnlttfgfsrnkkysrsilsrksrhfsiwassqvgaagsddpllkkipdfkdavwrflrphtirgtalgsialvsralienthlikwsllfkaicgvfalmcgngyivginqiydigidkvnkpylpiaagdlsvqsawslvtffavagvcivafnfgpfitslyclglflgtiysvpplrmkrypvaafliiatvrgfllnfgvyhatraalgltfewsypvafittfvtmfalviaitkdlpdvegdrkfqistlatklgvrniallgtglllanyigaivaaiylpqafrrnlmipahtilalglvfqawalegakyskeaildfyrfvwnlfyseyflfpfi
SEQ ID NO.8甘蓝型油菜HST氨基酸序列
melsishspclrfssssprflaasshhyrpsvhlagkllsrskdadltslssscmrskfvstnyrkisirassqvgaagsdpvldrlarfqnacwrflrphtirgtalgstalvtralienthlikwslvlkalsgllalicgngyivginqiydigidkvnkpylpiaagdlsvqsawllviffaiagltvvgfnfgpfitclyslglflgtiysvppfrmkrfpvaafliiatvrgfllnfgvyhatraalglsfqwsapvafitsfvtlfalviaitkdlpdvegdrkfqistlatklgvrniaflgsglllvnyisaislafympqvfrgslmipahmilasclvfqtwvlekanytkeaiagyyrfiwnlfyaeyllfpff
SEQ ID NO.9葡萄HST氨基酸序列
mkvdavgastqvgaagsdpplnkfsvfkdacwrflrphtirgtalgstalvaralienpnlikwsllfkafsgllalicgngyivginqiydisidkvnkpylpiaagdlsvqsawflvlffavagvlivgsnfgsfitslyclglvlgtiysvppfrmkrfpvaafliiatvrgfllnfgvyyatraalglpfmwsapvvfittfvtlfalviaitkdlpdvegdrkyqistlatklgvrniaflgsglllvnyigsilaaiympqafrlslmipahailaaglifqarvleqanytkeaisdfyrfiwnlfyveyiifpfi
SEQ ID NO.10小立碗藓HST序列
mgltaivvdvaqassssvalsqgrgatrrlpgglalgdafkglrkreyaqglqcrvrreggcasearvwkvrcssdsagslggdlpasqpqqsevsgirdpaaasaasfaplpqrialfydafwrflrphtirgtflgtsalvtrallenptlinwallpkalrgllallcgngfivginqifdsgidkvnkpflpiaagdlsvpaawalvgglaalgvglvatnfgplittlytfglflgtiysvpplrlkqypvpafmiiatvrgfllnfgvyyatraalglsyewspsvmfitifvtlfatviaitkdlpdiegdkkfnistfatnlgvrkisflgaglllvnyigaivaafylpqafktkimvtghavlglsliyqtwlldtakyskeaisnfyrfiwnlfyseyalfpfi
SEQ ID NO.11拟南芥HST(DNA)
atggagctctcgatctcacaatcaccgcgtgttcggttctcgtctctggcgcctcgtttcttagcagcttctcatcatcatcgtccttctgtgcatttagctgggaagtttataagcctccctcgagatgttcgcttcacgagcttatcaacttcaagaatgcggtccaaatttgtttcaaccaattatagaaaaatctcaatccgggcatgttctcaggttggtgctgctgagtctgatgatccagtgctggatagaattgcccggttccaaaatgcttgctggagatttcttagaccccatacaatccgcggaacagctttaggatccactgccttggtgacaagagctttgatagagaacactcatttgatcaaatggagtcttgtactaaaggcactttcaggtcttcttgctcttatttgtgggaatggttatatagtcggcatcaatcagatctacgacattggaatcgacaaagtgaacaaaccatacttgccaatagcagcaggagatctatcagtgcagtctgcttggttgttagtgatattttttgcgatagcagggcttttagttgtcggatttaactttggtccattcattacaagcctatactctcttggcctttttctgggaaccatctattctgttccacccctcagaatgaaaagattcccagttgcagcatttcttattattgccacggtacgaggtttccttcttaactttggtgtgtaccatgctacaagagctgctcttggacttccatttcagtggagtgcacctgtggcgttcatcacatcttttgtgacactgtttgcactggtcattgctattacaaaggaccttcctgatgttgaaggagatcgaaagttccaaatatcaaccctggcaacaaaacttggagtgagaaacattgcattcctcggttctggacttctgctagtaaattatgtttcagccatatcactagctttctacatgcctcaggtttttagaggtagcttgatgattcctgcacatgtgatcttggcttcaggcttaattttccagacatgggtactagaaaaagcaaactacaccaaggaagctatctcaggatattatcggtttatatggaatctcttctacgcagagtatctgttattccccttcctctag
SEQ ID NO.12稻HST(DNA)
atggcttccctcgcctcccctcctctcccctgccgcgccgccgccaccgccagccgcagcgggcgtcctgctccgcgcctcctcggccctccgccgccgcccgcttcccctctcctctcctccgcttcggcgcgcttcccgcgtgccccctgcaacgccgcacgctggagccggcgcgacgccgtgcgggtttgctctcaagctggtgcagctggaccagccccattatcgaagacattgtcagacctcaaggattcctgctggagatttttacggccacatacaattcgaggaactgccttgggatccatgtcattagttgctagagctttgatagagaacccccaactgataaattggtggttggtattcaaagcgttctatgggctcgtggcgttaatctgtggcaatggttacatcgttgggatcaatcagatctatgacattagaatcgataaggtaaacaagccatatttaccaattgctgccggtgatctctcagttcagacagcatggttattggtggtattatttgcagctgcgggattttcaattgttgtgacaaactttggacctttcattacctctctatattgccttggtctatttcttggcaccatatactctgttcctccattcagacttaagagatatcctgttgctgcttttcttatcattgcaacggtccgtggttttcttctcaactttggtgtgtactatgctactagagcagcactgggtcttacattccaatggagctcgcctgttgctttcattacatgcttcgtgactttatttgctttggtcattgctataaccaaagatctcccagatgttgaaggggatcggaagtatcaaatatcaactttggcgacaaagctcggtgtcagaaacattgcatttcttggctctggtttattgatagcaaattatgttgctgctattgctgtagcttttctcatgcctcaggctttcaggcgcactgtaatggtgcctgtgcatgctgcccttgccgttggtataattttccagacatgggttctggagcaagcaaaatatactaaggatgctatttcacagtactaccggttcatttggaatctcttctatgctgaatacatcttcttcccgttgata
SEQ ID NO.13稻变体HST(DNA)
atggcttccctcgcctcccctcctctcccctgccgcgccgccgccaccgccagccgcagcgggcgtcctgctccgcgcctcctcggccctccgccgccgcccgcttcccctctcctctcctccgcttcggcgcgcttcccgcgtgccccctgcaacgccgcacgctggagccggcgcgacgccgtgcgggtttgctctcaagctggtgcagctggaccagccccattatcgaagacattgtcagacctcaaggattcctgctggagatttttacggccacatacaattcgaggaactgccttgggatccatagcattagttgctagagctttgatagagaacccccaactgataaattggtggttggtattcaaagcgttctatgggctcgtggcgttaatctgtggcaatggttacatcgttgggatcaatcagatctatgacattagaatcgataaggtaaacaagccatatttaccaattgctgccggtgatctctcagttcagacagcatggttattggtggtattatttgcagctgcgggattttcaattgttgtgacaaactttggacctttcattacctctctatattgccttggtctatttcttggcaccatatactctgttcctccattcagacttaagagatatcctgttgctgcttttcttatcattgcaacggtccgtggttttcttctcaactttggtgtgtactatgctactagagcagcactgggtcttacattccaatggagctcgcctgttgctttcattacatgcttcgtgactttatttgctttggtcattgctataaccaaagatctcccagatgttgaaggggatcggaagtatcaaatatcaactttggcgacaaagctcggtgtcagaaacattgcatttcttggctctggtttattgatagcaaattatgttgctgctattgctgtagcttttctcatgcctcaggctttcaggcgcactgtaatggtgcctgtgcatgctgcccttgccgttggtataattttccagacatgggttctggagcaagcaaaatatactaaggatgctatttcacagtactaccggttcatttggaatctcttctatgctgaatacatcttcttcccgttgatatag
SEQ ID NO.14大豆HST(DNA)
tctgctaaattatcttctactaaagctactaaatctcaacaacctttatttttaggattttctaaacattttaattctattggattacatcatcattcttatagatgttgttctaatgctgtacctgaaagacctcaaagaccttcttctattagagcttgtactggagtaggagcttctggatctgatagacctttagctgaaagattattagatttaaaagatgcttgttggagatttttaagacctcatactattagaggaactgctttaggatcttttgctttagtagctagagctttaattgaaaatactaatttaattaaatggtctttattttttaaagctttttgtggattatttgctttaatttgtggaaatggatatattgtaggaattaatcaaatttatgatatttctattgataaagtaaataaaccttatttacctattgctgctggagatttatctgtacaatctgcttggtttttagtaattttttttgctgctgctggattatctattgctggattaaattttggaccttttattttttctttatatactttaggattatttttaggaactatttattctgtacctcctttaagaatgaaaagatttcctgtagctgcttttttaattattgctactgtaagaggatttttattaaattttggagtatattatgctactagagcttctttaggattagcttttgaatggtcttctcctgtagtatttattactacttttgtaactttttttgctttagtaattgctattactaaagatttacctgatgtagaaggagatagaaaatatcaaatttctacttttgctactaaattaggagtaagaaatattgcttttttaggatctggaattttattagtaaattatattgtatctgtattagctgctatttatatgcctcaagcttttagaagatggttattaattcctgctcatactatttttgctatttctttaatttatcaagctagaattttagaacaagctaattatactaaagatgctatttctggattttatagatttatttggaatttattttatgctgaatatgctatttttccttttatt
SEQ ID NO.15衣藻HST(DNA)
atggacctttgcagctcaactggaagaggagcatgcctttcgccggcatccacgtcgcggccgtgcccagcaccagtgcatttgcgcggccgacgcctggctttctctccggctcagcctgctggacggcgccacttgccggtgctctcatctgcagcggtccccgctcccctcccaaatggtggaaacgacgagagcttcgcacaaaaactggctaactttccaaacgccttctggaagttcctgcggccacacaccatccgggggactatcctgggcaccacagctgtgaccgccaaggtccttatggagaaccccggctgcatagactgggcactgctgccgaaggcgctgctcggcctggtggcgctgctgtgcggcaacggctacattgtgggcatcaaccaaatctacgacgtcgacattgacgtggtcaacaagccattcctccccgtggcgtcgggcgagctgtcgccggcgctggcgtggggcctgtgtctgtcgctggcggctgcgggcgcgggcatcgtagccgccaacttcggcaacctcatcaccagcctctacacctttggcctcttcctgggcaccgtgtacagtgtgcctcccctgcgcctgaagcagtacgcggtgccggccttcatgatcatcgccacggtgcgcggcttcctgctcaacttcggcgtgtacagcgccacgcgggcggcactgggactgcccttcgagtggagcccggccgtcagcttcatcacggtgtttgtgacgctgtttgccactgtgatcgccatcaccaaggacctgccggacgtggagggcgaccaggccaacaacatctccaccttcgccacgcgcatgggcgtgcgcaacgtggcactgctggccatcggccttctcatggccaactacctgggtgccatcgcgctggcactcacctactccaccgccttcaacgtgccgctcatggcgggcgcgcacgccatcctggccgccacgctggcgctgcgcacgctcaagctgcacgccgccagctacagccgggaggcggtggcgtccttctaccgctggatctggaacctgttctacgccgagtacgcgctgctgccgttcctgtag
SEQ ID NO.16烟草HST DNA
atggaattagcttgttcttcttgttcttctttaagattttcttctgtattaactcatcaagatactgctgcttctagatatagaaaattacctcctacttctccttcttgtaaagctgctaattttgtattaaaatcttctaaaaatttatcttcttctgctggattacatattggatatactaatttttctaaaactgtatcttatagaaaatatagacatatttctattagagcttgttctcaagtaggaactgctggatctgaacctgtattagataaattatctcaatttaaagatgctttttggagatttttaagacctcatactattagaggaactgctttaggatctttatctttagtaactagagctttaattgaaaatcctaatttaattagatggtctttagctatgaaagctttttctggattaattgctttaatttgtggaaatggatatattgtaggaattaatcaaatttatgatattggaattgataaagtaaataaaccttatttacctattgctgctggagatttatctgtacaatctgcttggtttttagtattattatttgctatggctggattattaattgtaggaattaattttggaccttttattacttctttatattgtttaggattatttttaggaactatttattctgtacctccttttagaatgaaaagatttgctgtagtagcttttttaattattgctactgtaagaggatttttattaaattatggagtatattatgctactactgctgctttaggattatcttttcaatggtcttctcctgtagcttttattactacttttgtaactttatttgctttagtaattgctattactaaagatttacctgatgtagaaggagatagaaaatttcaaatttctactttagctactaaattaggagtaagaaatattgcttttttaggatctggattattattagctaattatattggagctgtagtagctgctatttatatgcctcaagcttttagatcttctttaatgattcctgtacatgctattttagctttatgtttagtatttcaagcttggttattagaaaaagctaattatactaaagaagctatttctgcttattatcaatttatttggaattttttttatgctgaatatttaatttttccttttatt
SEQ ID NO.17耧斗菜HST DNA
atgttatgtttttcttctccttctatttctattcctcctcattgttctactactactcattatagaaaaattcctattaattctacttttaaatctactaattttttatctaaagcttctaataatttaactacttttggattttctagaaataaaaaatattctagatctattttatctagaaaatctagacatttttctatttgggcttcttctcaagtaggagctgctggatctgatgatcctttattaaaaaaaattcctgattttaaagatgctgtatggagatttttaagacctcatactattagaggaactgctttaggatctattgctttagtatctagagctttaattgaaaatactcatttaattaaatggtctttattatttaaagctatttgtggagtatttgctttaatgtgtggaaatggatatattgtaggaattaatcaaatttatgatattggaattgataaagtaaataaaccttatttacctattgctgctggagatttatctgtacaatctgcttggtctttagtaactttttttgctgtagctggagtatgtattgtagcttttaattttggaccttttattacttctttatattgtttaggattatttttaggaactatttattctgtacctcctttaagaatgaaaagatatcctgtagctgcttttttaattattgctactgtaagaggatttttattaaattttggagtatatcatgctactagagctgctttaggattaacttttgaatggtcttatcctgtagcttttattactacttttgtaactatgtttgctttagtaattgctattactaaagatttacctgatgtagaaggagatagaaaatttcaaatttctactttagctactaaattaggagtaagaaatattgctttattaggaactggattattattagctaattatattggagctattgtagctgctatttatttacctcaagcttttagaagaaatttaatgattcctgctcatactattttagctttaggattagtatttcaagcttgggctttagaacaagctaaatattctaaagaagctattttagatttttatagatttgtatggaatttattttattctgaatattttttatttccttttatt
SEQ ID NO.18甘蓝型油菜HST DNA
ttagctgcttcttctcatcattatagaccttctgtacatttagctggaaaattattatctagatctaaagatgctgatttaacttctttatcttcttcttgtatgagatctaaatttgtatctactaattatagaaaaatttctattagagcttcttctcaagtaggagctgctggatctgatcctgtattagatagattagctagatttcaaaatgcttgttggagatttttaagacctcatactattagaggaactgctttaggatctactgctttagtaactagagctttaattgaaaatactcatttaattaaatggtctttagtattaaaagctttatctggattattagctttaatttgtggaaatggatatattgtaggaattaatcaaatttatgatattggaattgataaagtaaataaaccttatttacctattgctgctggagatttatctgtacaatctgcttggttattagtaattttttttgctattgctggattaactgtagtaggatttaattttggaccttttattacttgtttatattctttaggattatttttaggaactatttattctgtacctccttttagaatgaaaagatttcctgtagctgcttttttaattattgctactgtaagaggatttttattaaattttggagtatatcatgctactagagctgctttaggattatcttttcaatggtctgctcctgtagcttttattacttcttttgtaactttatttgctttagtaattgctattactaaagatttacctgatgtagaaggagatagaaaatttcaaatttctactttagctactaaattaggagtaagaaatattgcttttttaggatctggattattattagtaaattatatttctgctatttctttagctttttatatgcctcaagtatttagaggatctttaatgattcctgctcatatgattttagcttcttgtttagtatttcaaacttgggtattagaaaaagctaattatactaaagaagctattgctggatattatagatttatttggaatttattttatgctgaatatttattatttccttttttt
SEQ ID NO.19葡萄HST DNA
atgaaagtagatgctgtacaagcttctactcaagtaggagctgctggatctgatcctcctttaaataaattttctgtatttaaagatgcttgttggagatttttaagacctcatactattagaggaactgctttaggatctactgctttagtagctagagctttaattgaaaatcctaatttaattaaatggtctttattatttaaagctttttctggattattagctttaatttgtggaaatggatatattgtaggaattaatcaaatttatgatatttctattgataaagtaaataaaccttatttacctattgctgctggagatttatctgtacaatctgcttggtttttagtattattttttgctgtagctggagtattaattgtaggatctaattttggatcttttattacttctttatattgtttaggattagtattaggaactatttattctgtacctccttttagaatgaaaagatttcctgtagctgcttttttaattattgctactgtaagaggatttttattaaattttggagtatattatgctactagagctgctttaggattaccttttatgtggtctgctcctgtagtatttattactacttttgtaactttatttgctttagtaattgctattactaaagatttacctgatgtagaaggagatagaaaatatcaaatttctactttagctactaaattaggagtaagaaatattgcttttttaggatctggattattattagtaaattatattggatctattttagctgctatttatatgcctcaagcttttagattatctttaatgattcctgctcatgctattttagctgctggattaatttttcaagctagagtattagaacaagctaattatactaaagaagctatttctgatttttatagatttatttggaatttattttatgtagaatatattatttttccttttatt
SEQ ID NO.20小立碗藓HST DNA
atgggattaactgctattgtagtagatgtagctcaagcttcttcttcttctgtagctttatctcaaggaagaggagctactagaagattacctggaggattagctttaggagatgcttttaaaggattaagaaaaagagaatatgctcaaggattacaatgtagagtaagaagagaaggaggatgtgcttctgaagctagagtatggaaagtaagatgttcttctgattctgctggatctttaggaggagatttacctgcttctcaacctcaacaatctgaagtatctggaattagagatcctgctgctgcttctgctgcttcttttgctcctttacctcaaagaattgctttattttatgatgctttttggagatttttaagacctcatactattagaggaacttttttaggaacttctgctttagtaactagagctttattagaaaatcctactttaattaattgggctttattacctaaagctttaagaggattattagctttattatgtggaaatggatttattgtaggaattaatcaaatttttgattctggaattgataaagtaaataaaccttttttacctattgctgctggagatttatctgtacctgctgcttgggctttagtaggaggattagctgctttaggagtaggattagtagctactaattttggacctttaattactactttatatacttttggattatttttaggaactatttattctgtacctcctttaagattaaaacaatatcctgtacctgcttttatgattattgctactgtaagaggatttttattaaattttggagtatattatgctactagagctgctttaggattatcttatgaatggtctccttctgtaatgtttattactatttttgtaactttatttgctactgtaattgctattactaaagatttacctgatattgaaggagataaaaaatttaatatttctacttttgctactaatttaggagtaagaaaaatttcttttttaggagctggattattattagtaaattatattggagctattgtagctgctttttatttacctcaagcttttaaaactaaaattatggtaactggacatgctgtattaggattatctttaatttatcaaacttggttattagatactgctaaatattctaaagaagctatttctaatttttatagatttatttggaatttattttattctgaatatgctttatttccttttatt
SEQ ID NO.21编码成熟拟南芥HST的DNA
agaaaaatctcaatccgggcatgttctcaggttggtgctgctgagtctgatgatccagtgctggatagaattgcccggttccaaaatgcttgctggagatttcttagaccccatacaatccgcggaacagctttaggatccactgccttggtgacaagagctttgatagagaacactcatttgatcaaatggagtcttgtactaaaggcactttcaggtcttcttgctcttatttgtgggaatggttatatagtcggcatcaatcagatctacgacattggaatcgacaaagtgaacaaaccatacttgccaatagcagcaggagatctatcagtgcagtctgcttggttgttagtgatattttttgcgatagcagggcttttagttgtcggatttaactttggtccattcattacaagcctatactctcttggcctttttctgggaaccatctattctgttccacccctcagaatgaaaagattcccagttgcagcatttcttattattgccacggtacgaggtttccttcttaactttggtgtgtaccatgctacaagagctgctcttggacttccatttcagtggagtgcacctgtggcgttcatcacatcttttgtgacactgtttgcactggtcattgctattacaaaggaccttcctgatgttgaaggagatcgaaagttccaaatatcaaccctggcaacaaaacttggagtgagaaacattgcattcctcggttctggacttctgctagtaaattatgtttcagccatatcactagctttctacatgcctcaggtttttagaggtagcttgatgattcctgcacatgtgatcttggcttcaggcttaattttccagacatgggtactagaaaaagcaaactacaccaaggaagctatctcaggatattatcggtttatatggaatctcttctacgcagagtatctgttattccccttcctcta
SEQ ID NO.22编码成熟稻HST的DNA
cggcgcgacgccgtgcgggtttgctctcaagctggtgcagctggaccagccccattatcgaagacattgtcagacctcaaggattcctgctggagatttttacggccacatacaattcgaggaactgccttgggatccatgtcattagttgctagagctttgatagagaacccccaactgataaattggtggttggtattcaaagcgttctatgggctcgtggcgttaatctgtggcaatggttacatcgttgggatcaatcagatctatgacattagaatcgataaggtaaacaagccatatttaccaattgctgccggtgatctctcagttcagacagcatggttattggtggtattatttgcagctgcgggattttcaattgttgtgacaaactttggacctttcattacctctctatattgccttggtctatttcttggcaccatatactctgttcctccattcagacttaagagatatcctgttgctgcttttcttatcattgcaacggtccgtggttttcttctcaactttggtgtgtactatgctactagagcagcactgggtcttacattccaatggagctcgcctgttgctttcattacatgcttcgtgactttatttgctttggtcattgctataaccaaagatctcccagatgttgaaggggatcggaagtatcaaatatcaactttggcgacaaagctcggtgtcagaaacattgcatttcttggctctggtttattgatagcaaattatgttgctgctattgctgtagcttttctcatgcctcaggctttcaggcgcactgtaatggtgcctgtgcatgctgcccttgccgttggtataattttccagacatgggttctggagcaagcaaaatatactaaggatgctatttcacagtactaccggttcatttggaatctcttctatgctgaatacatcttcttcccgttgatatag
SEQ ID NO.23编码成熟稻变体HST的DNA
cggcgcgacgccgtgcgggtttgctctcaagctggtgcagctggaccagccccattatcgaagacattgtcagacctcaaggattcctgctggagatttttacggccacatacaattcgaggaactgccttgggatccatagcattagttgctagagctttgatagagaacccccaactgataaattggtggttggtattcaaagcgttctatgggctcgtggcgttaatctgtggcaatggttacatcgttgggatcaatcagatctatgacattagaatcgataaggtaaacaagccatatttaccaattgctgccggtgatctctcagttcagacagcatggttattggtggtattatttgcagctgcgggattttcaattgttgtgacaaactttggacctttcattacctctctatattgccttggtctatttcttggcaccatatactctgttcctccattcagacttaagagatatcctgttgctgcttttcttatcattgcaacggtccgtggttttcttctcaactttggtgtgtactatgctactagagcagcactgggtcttacattccaatggagctcgcctgttgctttcattacatgcttcgtgactttatttgctttggtcattgctataaccaaagatctcccagatgttgaaggggatcggaagtatcaaatatcaactttggcgacaaagctcggtgtcagaaacattgcatttcttggctctggtttattgatagcaaattatgttgctgctattgctgtagcttttctcatgcctcaggctttcaggcgcactgtaatggtgcctgtgcatgctgcccttgccgttggtataattttccagacatgggttctggagcaagcaaaatatactaaggatgctatttcacagtactaccggttcatttggaatctcttctatgctgaatacatcttcttcccgttgatatag
SEQ ID NO.24编码昆虫细胞密码子最优化的成熟拟南芥HST的DNA
gggatccctcgtgcttgctcccaggtcggcgctgctgagtccgacgaccccgtgctggaccgtatcgctcgtttccagaacgcttgctggcgtttcctgcgtccccacaccatccgtggcaccgctctgggttccaccgccctggtgacccgtgctctgatcgagaacacccacctgatcaagtggtccctggtgctgaaggctctgtccggtctgctggctctgatctgcggtaacggttacatcgtgggtatcaaccagatctacgacatcggtatcgacaaggtgaacaagccctacctgcccatcgctgctggtgacctgtccgtgcagtccgcttggctgctggtcatcttcttcgctatcgctggtctgctggtcgtgggtttcaacttcggtcccttcatcacttccctgtactccctgggcctgttcctgggcaccatctactccgtgccccccctgcgtatgaagcgtttccccgtggctgctttcctgatcatcgctaccgtgcgtggtttcctgctgaacttcggtgtctaccacgctacccgtgctgctctgggtctgcccttccagtggtccgctcccgtggctttcatcaccagcttcgtgaccctgttcgctctggtgatcgctatcaccaaggacctgcccgacgtggagggtgaccgtaagttccagatctccaccctggctaccaagctgggtgtgcgtaacatcgctttcctcggttccggcctgctgctcgtgaactacgtgtccgctatctccctggctttctacatgccccaggtgttccgtggttccctgatgatccccgctcacgtgatcctggcttccggtctgatcttccagacctgggtgctcgagaaggctaactacaccaaggaagctatctccggttactaccgcttcatctggaacctgttctacgctgagtacctgctgttccccttcctgtaa
SEQ ID No.25来自荧光假单胞杆菌菌株87-79的HPPD a/a序列
madqyenpmglmgfefiefasptpgtlepifeimgftkvathrsknvhlyrqgeinlilnnqpdslasyfaaehgpsvcgmafrvkdsqqaynralelgaqpihietgpmelnlpaikgiggaplylidrfgegssiydidfvylegvdrnpvgagl kvidhlthnvyrgrmaywanfyeklfnfrearyfdikgeytgltskamsapdgmiriplneesskgagqieeflmqfngegiqhvafltedlvktwdalkkigmrfmtappdtyyemlegrlpnhgepvdqlqargilldgssiegdkrlllqifsetlmgpvffefiqrkgddgfgegnfkalfesierdqvrrgvlttd
SEQ ID NO.26来自燕麦的HPPD a/a序列
mpptpatatgaaaaavtpehaarsfprvvrvnprsdrfpvlsfhhvelwcadaasaagrfsfalgaplaarsdlstgnsahaslllrsgalaflftapyapppqeaataaatasipsfsadaartfaaahglavrsvgvrvadaaeafrvsvaggarpafapadlghgfglaevelygdvvlrfvsypdetdlpflpgfervsspgavdygltrfdhvvgnvpemapvidymkgflgfhefaeftaedvgttesglnsvvlannseavllplnepvhgtkrrsqiqtyleyhggpgvqhialasndvlrtlremrartpmggfefmappqakyyegvrriagdvlseeqikecqelgvlvdrddqgvllqiftkpvgdrptfflemiqrigcmekdevgqeyqkggcggfgkgnfselfksiedyekslevkqsvvaqks
SEQ ID NO.27来自小麦的HPPD a/a序列
mpptpttpaatgaaavtpeharprrmvrfnprsdrfhtlafhhvefwcadaasaagrfafalgaplaarsdlstgn5vhasqllrsgnlaflftapyangcdaataslpsfsadaarqfsadhglavrsialrvadaaeafrasvdggarpafspvdlgrgfgfaevelygdvvlrfvshpdgrdvpflpgfegvsnpdavdygltrfdhvvgnvpelapaaayvagftgfhefaefttedvgtaesglnsmvlannsegvllplnepvhgtkrrsqiqtflehhggsgvqhiavassdvlrtlremrarsamggfdflppplpkyyegvrriagdvlseaqikecqelgvlvdrddqgvllqiftkpvgdrptlflemiqrigcmekdergeeyqkggcggfgkgnfselfksiedyeksleakqsaavqgs
SEQ ID NO.28来自Shewanella collwelliana的HPPD a/a序列
Maseqnplgllgieftefatpdldfmhkvfidfgfsklkkhkqkdivyykqndinfllnnekqgfsaqfakthgpaissmgwrvedanfafegavargakpaadevkdlpypaiygigdsliyfidtfgddnniytsdfealdepiitqekgfievdhltnnvhkgtmeywsnfykdifgftevryfdikgsqtalisyalrspdgsfcipinegkgddrnqideylkeydgpgvqhlafrsrdivasldamegssiqtldiipeyydtifeklpqvtedrdrikhhqilvdgdedgyllqiftknlfgpifieiiqrknnlgfgegnfkalfesierdqvrrgvl
SEQ ID NO.29来自荧光假单胞菌菌株87-79的HPPD DNA序列
atggccgaccaatacgaaaacccaatgggcctgatgggctttgaatttattgaattcgcatcgccgactccgggcaccctggagccgatcttcgagatcatgggcttcaccaaagtcgcgacccaccgctccaagaatgtgcacctgtaccgccagggcgagatcaacctgatcctcaacaaccagcccgacagcctggcctcgtacttcgccgccgaacacggcccttcggtgtgcggcatggcgttccgggtcaaagactcgcagcaggcttacaaccgcgcgttggaactgggcgcccagccgattcatatcgaaaccggcccgatggaactcaacctgccggccatcaagggcatcggcggtgcgccgctgtacctgatcgaccgcttcggtgaaggcagctcgatatatgacatcgacttcgtgtacctcgaaggtgtcgaccgcaacccggtaggcgcgggcctcaaggtcatcgaccacctgacccacaacgtgtatcgcggccgcatggcctactgggccaacttctacgagaaactgttcaacttccgtgaagcacgctacttcgatatcaagggcgaatacaccggccttacgtccaaggccatgagtgccccggacggcatgatccgcatcccgctgaacgaggaatcgtccaagggcgccggccagatcgaagagttcctgatgcagttcaacggcgagggcatccagcacgtggcgttcctcaccgaagacctggtcaagacctgggatgcgttgaagaagatcggcatgcgcttcatgaccgcgccgccggacacctactacgaaatgctcgaaggccgcctgccaaaccacggcgagccggtggaccaactgcaggcgcgcggtattttgctggacggctcctcgatcgagggcgacaagcgcctgctgctgcagatcttctcggaaaccctgatgggcccggtgttcttcgaattcatccagcgcaaaggcgacgatgggtttggcgagggcaacttcaaggcgctgttcgagtcgatcgagcgcgaccaggtacgtcgcggtgtactgaccaccgac
SEQ ID NO.30来自燕麦的HPPD DNA序列
atgccgcccacccccgccaccgccaccggcgccgccgcggccgccgtgactccagagcacgcggcccggagctttccccgagtggtccgcgtcaacccgcgcagcgaccgcttccccgtgctctccttccaccacgtcgagctctggtgcgccgacgccgcctcagcggccggacgcttctccttcgcgctcggcgcgccgctcgccgcccggtccgacctctccacggggaactccgcgcacgcctccctcctgctccgctcgggcgccctcgccttcctcttcacggcgccctacgcgccgccgccgcaggaggccgccacggccgcagccaccgcctccatcccctccttctccgccgacgccgcgcggacgttcgccgccgcccacggcctcgcggtgcgctccgtcggggtccgcgtcgctgacgccgccgaggccttccgcgtcagcgtagccggcggcgctcgcccggccttcgccccagccgacctcggccatggcttcggcctcgccgaggtcgagctctacggcgacgtcgtgctacgcttcgtcagctacccggacgagacagacctgccattcctgccagggttcgagcgcgtgagcagccccggcgccgtggactacggcctcacgcggttcgaccacgtcgtgggcaacgtcccggagatggccccggtcatagactacatgaaaggcttcttggggttccacgagttcgccgagttcaccgccgaggacgtgggcacgaccgagagcgggctcaactcggtggtgctcgccaacaactccgaggccgtgctgctgccgctcaacgagcccgtgcacggcacaaagcgacggagccagatacagacgtacctggagtatcacggcgggcccggcgtgcagcacatcgcgctcgccagcaacgacgtgctcaggacgctcagggagatgcgggcgcgcacgcccatgggcggcttcgagttcatggcgccaccgcaggcgaaatactatgaaggcgtgcggcgcatcgcaggtgacgtgctctcggaagagcagatcaaggaatgccaggagctgggggtgctagtcgacagggatgatcaaggggtgttgctccaaatcttcaccaagccagtaggggacaggccaacgtttttcctggagatgatccaaagaatcgggtgcatggagaaggacgaggtcgggcaagagtaccagaagggtggctgcggcgggtttggcaagggcaatttctccgagctgttcaagtccattgaggactatgagaaatcccttgaggtcaagcaatctgttgtagctcagaaatcctag
SEQ ID No.31来自小麦的HPPD cDNA序列
atgccgcccacccccaccacccccgcagccaccggcgccgccgcggtgacgccggagcacgcgcggccgcgccgaatggtccgcttcaacccgcgcagcgaccgcttccacacgctcgccttccaccacgtcgagttctggtgcgcggacgccgcctccgccgccggccgcttcgccttcgcgctcggcgcgccgctcgccgccaggtccgacctctccacggggaactccgtgcacgcctcccagctgctccgctcgggcaacctcgccttcctcttcacggccccctacgccaacggctgcgacgccgccaccgcctccctgccctccttctccgccgacgccgcgcgccagttctccgcggaccacggcctcgcggtgcgctccatagcgctgcgcgtcgcggacgctgccgaggccttccgcgccagcgtcgacgggggcgcgcgcccggccttcagccctgtggacctcggccgcggcttcggcttcgcggaggtcgagctctacggcgacgtcgtgctccgcttcgtcagccacccggacggcagggacgtgcccttcttgccggggttcgagggcgtgagcaacccagacgccgtggactacggcctgacgcggttcgaccacgtcgtcggcaacgtcccggagcttgcccccgccgcggcctacgtcgccgggttcacggggttccacgagttcgccgagttcacgacggaggacgtgggcacggccgagagcgggctcaactcgatggtgctcgccaacaactcggagggcgtgctgctgccgctcaacgagccggtgcacggcaccaagcgccggagccagatacagacgttcctggaacaccacggcggctcgggcgtgcagcacatcgcggtggccagcagcgacgtgctcaggacgctcagggagatgcgtgcgcgctccgccatgggcggcttcgacttcctgccacccccgctgccgaagtactacgaaggcgtgcggcgcatcgccggggatgtgctctcggaggcgcagatcaaggaatgccaggagctgggggtgctcgtcgacagggacgaccaaggggtgttgctacaaatcttcaccaagccagtaggggacaggccgacgttgttcctggagatgatccagaggatcgggtgcatggagaaggacgagagaggggaagagtaccagaagggtggctgcggcgggttcggcaaaggcaacttctccgagctgttcaagtccattgaagattacgagaagtcccttgaagccaagcaatctgctgcagttcagggatcatag
SEQ ID NO.32来自Shewanella collwelliana的HPPD DNA序列
gactttatgagtcgcacaggtatcgaagcgggctacatgaccttacatcaaaaaggcgtgccgcatggaccacaacctggtcgtactgaagcctcagtgggcaaaactgaaacctatgagtatgcagtaatggtggacacctttgcaccactgcaactgacccagcatgtcaatgcgtgcatgagcaaagattacaaccgttcctggctagaagagtaaaagcgttcagccagtgctgaacatctaataaatataacaccagaggtgacaccgaagagtgcccttggttgcaataagttgaaagaggataattacatggcaagcgaacaaaacccactgggtctacttggtatcgaattcactgaatttgctacaccagatctagattttatgcataaagtttttatcgactttggtttctcaaaacttaaaaaacacaagcagaaagatattgtttactataaacaaaatgatattaactttttactcaacaatgaaaaacagggcttttcagcccagtttgccaaaacgcatggcccagccattagttctatgggctggcgtgtagaagatgccaactttgcctttgaaggtgctgtagcccgtggggctaaacccgcagcagatgaggtgaaagatcttccctatcccgctatctatggcattggtgacagccttatctactttatcgatacgtttggcgatgacaacaatatctacacttctgattttgaagcgttagatgagcctatcatcacccaagagaaaggcttcattgaggtcgaccatctcaccaataatgtccataagggcaccatggaatattggtcaaacttctacaaagacatttttggctttacagaagtgcgttacttcgacattaagggctcacaaacagctcttatctcttacgccctgcgctcgccagatggtagtttctgcattccaattaacgaaggcaaaggcgatgatcgtaaccaaattgatgagtacttaaaagagtacgatggcccaggtgtccaacacttagcgttccgtagccgcgacatagttgcctcactggatgccatggaaggaagctccattcaaaccttggacataattccagagtattacgacactatctttgaaaagctgcctcaagtcactgaagacagagatcgcatcaagcatcatcaaatcctggtagatggcgatgaagatggctacttactgcaaattttcaccaaaaatctatttggtccaatttttatcgaaatcatccagcgtaaaaacaatctcggttttggcgaaggtaattttaaagccctatttgaatcgattgagcgtgatcaggtgcgtcgcggcgtactctaacaatcacccagtgatccaacctcaaaaaaccagcatcgcgctggtttttttattgcagcacaacaataaacctctacactagca
SEQ ID NO.33TMV翻译增强子核苷酸序列
tatttttacaacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattactatttacaattacac
SEQ ID NO.34TMV和拟南芥HST编码序列的融合
tatttttacaacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattactatttacaattacacatatggagctctcgatctcacaatcaccgcgtgttcggttctcgtctctggcgcctcgtttcttagcagcttctcatcatcatcgtccttctgtgcatttagctgggaagtttataagcctcccacgagatgttcgcttcacgagcttatcaacttcaagaatgcggtccaaatttgtttcaaccaattatagaaaaatctcaatccgggcatgttctcaggttggtgctgctgagtctgatgatccagtgctggatagaattgcccggttccaaaatgcttgctggagatttcttagaccccatacaatccgcggaacagctttaggatccactgccttggtgacaagagctttgatagagaacactcatttgatcaaatggagtcttgtactaaaggcactttcaggtcttcttgctcttatttgtgggaatggttatatagtcggcatcaatcagatctacgacattggaatcgacaaagtgaacaaaccatacttgccaatagcagcaggagatctatcagtgcagtctgcttggttgttagtgatattttttgcgatagcagggcttttagttgtcggatttaactttggtccattcattacaagcctatactctcttggcctttttctgggaaccatctattctgttccacccctcagaatgaaaagattcccagttgcagcatttcttattattgccacggtacgaggtttccttcttaactttggtgtgtaccatgctacaagagctgctcttggacttccatttcagtggagtgcacctgtggcgttcatcacatcttttgtgacactgtttgcactggtcattgctattacaaaggaccttcctgatgttgaaggagatcgaaagttccaaatatcaaccctggcaacaaaacttggagtgagaaacattgcattcctcggttctggacttctgctagtaaattatgtttcagccatatcactagctttctacatgcctcaggtttttagaggtagcttgatgattcctgcacatgtgatcttggcttcaggcttaattttccagacatgggtactagaaaaagcaaactacaccaaggaagctatctcaggatattatcggtttatatggaatctcttctacgcagagtatctgttattccccttcctctag
SEQ ID NO.35HST多肽基元1.
W(R/K)FLRPHTIRGT
SEQ ID NO.36HST多肽基元2.
NG(Y/F)IVGINQI(Y/F)D
SEQ ID NO.37HST多肽基元3.
IAITKD LP
SEQ ID NO.38HST多肽基元4.
Y(R/Q)(F/W)(I/V)WNLFY
实施例
以正规的方式基于植物损伤、分生组织的褪色症状等评估在除草剂的一品系不同浓度下原代植物转化事件的除草剂耐受或抗性水平的平均值和分布。这些数据可表示为例如，从“剂量”绘制于x-轴而“百分比杀死”、“除草效果”、“新出现绿色植物数目”等绘制于y-轴上的剂量/应答曲线推出的GR50值，其中GR50值的增大可能例如相应于内在的抑制剂耐受水平的增加(例如Ki x kcat./KmHPP值增大)和/或表达的HPPD和/或HST的表达水平的增高。
以下实验是利用表A-F中所述的多种抑制型除草剂进行的。
Figure BDA0000050194610000341
  化合物   R1   R2   R3   R4
  1.1   F   Cl   Cl   F
  1.2   Cl   Cl   Cl   Cl
  1.3   F   F   Br   F
  1.4   F   Br   Br   F
表A.化合物1.1-1.4.
Figure BDA0000050194610000342
  化合物   A1   R1   R2   R3   R4   R5   R6   R7
  2.1   N   F   H   H   Br   Cl   H   OH
  2.2   N   -CH3   H   -CH3   H   -CH3   -CH3   OH
  2.3   N   F   H   H   F   Cl   -CH2CF2H   OH
  2.4   N   F   H   H   F   Cl   CH3   OH
  2.5   N   F   H   H   Br   Cl   CH3   OH
  2.6   N   H   H   H   H   -OCF3   H   OH
  2.7   N   F   H   H   F   Cl   H   OH
  2.8   N   F   H   H   Br   Cl   -CH2CF2H   OH
  2.9   N   H   CF3   H   H   Cl   -CH2CF2H   OH
  2.10   N   -CH2CH3   H   -CH2CH3   H   -CH2CH3   H   OH
  2.11   N   -CH3   H   -CH3   H   -CH3   -CH2CF2H   OH
  2.12   N   H   H   H   H   -OCF3   H   OH
  2.13   CH   F   H   H   F   Cl   -CH2CF2H   OH
  2.14   N   Cl   Cl   H   H   Cl   -CH2CF2H   OH
  2.15   CH   F   H   H   Br   Cl   -CH2CF2H   OH
  2.16   N   Cl   H   H   H   -CF3   -CH3   OH
  2.17   N   F   H   H   F   Cl   -CH2CF3   OH
  2.18   N   F   H   H   F   Cl   -C≡CH   OH
  2.19   N   H   Cl   H   H   CF3   -CH2CF2H   OH
  2.20   N   Cl   H   H   H   CF3   -CH2CF2H   OH
  2.21   N   F   H   H   Cl   Cl   -CH2CF2H   OH
  2.22   CH   Cl   H   H   Br   Cl   -CH2CF2H   OH
  2.23   N   F   H   H   Br   Cl   H   -O(C＝O)-Et
  2.24   N   -CH3   H   -CH3   H   -CH3   -CH3   -O(C＝O)-iPr
  2.25   N   F   H   H   Cl   Cl   -CH2CF2H   -O(C＝O)-tBu
  2.26   CH   F   H   H   F   Cl   CH3   -O(C＝O)-tBu
  2.27   N   F   H   H   Br   Cl   CH3   -O(C＝O)-iPr
  2.28   N   Cl   H   H   H   -CF3   -CH2CF2H   -O(C＝O)-iPr
  2.29   N   F   H   H   F   Cl   H   -O(C＝O)-tBu
  2.30   N   F   H   H   Br   Cl   -CH2CF2H   -O(C＝O)-iPr
  2.31   N   Cl   H   H   H   CF3   -CH2CF2H   -O(C＝O)-iPr
  2.32   N   -CH2CH3   H   -CH2CH3   H   -CH2CH3   H   O(C＝O)-iPr
  2.33   N   -CH3   H   -CH3   H   -CH3   -CH2CF2H   -O(C＝O)-Et
  2.34   N   H   H   H   H   -OCF3   H   -O(C＝O)-iPr
表B.化合物2.1-2.34.
Figure BDA0000050194610000361
  化合物   A1   R1   R2   R3   R4   R5   R6   R7
  3.1   N   CF3   H   H   H   Cl   -CH2CH3   OH
  3.2   N   H   H   Cl   H   Cl   -CH3   OH
  3.3   N   Cl   H   H   H   CF3   -CH2CF2H   OH
  3.4   N   Cl   H   H   Cl   Cl   -CH2CF2H   OH
  3.5   N   H   H   Br   H   CF3   -CH2CF2H   OH
  3.6   N   CF3   H   H   Cl   H   -CH2CF2H   -O(C＝O)-iPr
表C.化合物3.1-3.6.
Figure BDA0000050194610000362
  化合物   R1   R2   R3   R4   R5   R6
  4.1   F   H   H   F   Cl   CH3
表D.化合物4.1
Figure BDA0000050194610000363
  化合物   A1   R1   R2   R4   R5 R6
  5.1   N   Cl   H   H   Cl -CH2CF2H
表E.化合物5.1
Figure BDA0000050194610000371
  化合物   R1   R2   R3   R4   R5
  6.1   -CH3   -CH3   -CH3   -CH3   -CH3
表F.化合物6.1
实施例1.在昆虫细胞和大肠杆菌中克隆和表达植物HST酶
从cDNA文库中扩增或合成制备来自拟南芥(SEQ ID 11)和稻(SEQ ID 12或SEQ ID 13)的全长HST编码序列(减去ATG起始密码子)，其具有侧接的EcoRI位点。将这些全长的以及截短的编码序列(编码起始于ARG 64的成熟序列拟南芥SEQ ID 21，稻SEQ ID 22和稻SEQ ID 23)均克隆入pAcG3X载体(BD Biosciences Cat.No.21415P)的EcoRI位点，转化入并随后表达于Sf9(Spodoptera fugiperda)昆虫细胞(如下文所述)中成为具有因子Xa切割位点的N-末端GST融合蛋白。同样的，将编码另一截短的成熟(ARG 69)拟南芥HST的昆虫细胞密码子最优化DNA序列SEQ ID 24克隆入pAcG3X的EcoRI位点并以N-末端GST融合蛋白形式表达于SfP细胞中。拟南芥HST SWISSPROT登录号(蛋白质)是Ql ACB3，而拟南芥HST EMBL登录号(DNA)是DQ231060。
或者，将拟南芥和衣藻的成熟HST编码序列以GST N-末端融合酶的形式克隆并表达于大肠杆菌中。
实施例2.细胞生长及HST酶提取物的制备。
对以GST N-末端融合蛋白形式表达成熟拟南芥或衣藻HST的大肠杆菌BL21A1细胞进行培养、收获、破碎和产生表达HST的膜部分。
例如，用1ng重组DNA转化BL21DE3细胞以获取满盘单独的菌落。挑取这些菌落中的一个接种于补充了终浓度50ug/ml卡那霉素的100ml路尼亚肉汤培养基(LB)中在37℃以220rpm振荡培养过夜。第二天早上用10ml的过夜培养物接种补充了终浓度50ug/ml卡那霉素的1L新鲜无菌LB培养基，在37℃以220rpm振荡培养至600nm的OD达到0.6，用0.1mM IPTG诱导并在15℃诱导过夜。在4℃以4600rpm离心10分钟收获细胞并将沉淀贮存于-80℃。
例如，已发现1升细胞产生大约5g的湿细胞沉淀。然后将大肠杆菌细胞沉淀重悬于补充了Roche无EDTA-蛋白酶抑制剂片剂(200ml缓冲液中放一片)的25ml 50mM Tris，pH 7.5中。将10ml细胞在冰上进行超声破碎。将产生的裂解细胞在3000g离心10分钟沉淀细胞核/碎片等。将10ml上清吸出并以150,000g于4℃离心60分钟。将含有膜的沉淀重悬于2ml的上述缓冲液中。在加入甘油至50％v/v进行稀释后，将这些样品以100μl的等分贮存于-80℃。
将表达HST的pAcG3X-来源转移载体(上述)用FlashBac(Oxford Expression Technologies)亲代杆状病毒载体独立共转化入Sf9悬浮细胞中。依照制造商的说明书进行杆状病毒扩增和HST蛋白质表达。
将Sf9悬浮细胞培养物以1.0EXP 6个细胞/ml的密度次培养于500ml锥形摇瓶的140ml Sf900II培养基(Invitrogen Cat No.10902)中。在27℃以120rpm振荡培养24小时后，测量细胞密度并调整至140ml中的2.0EXP 6个细胞/ml。将已知滴度的大量扩增病毒贮液加入已制备好的悬浮液摇瓶中以达到感染复数10。将摇瓶密封并在27℃以125rpm振荡培养72小时以便得到无细胞碎片的蛋白质表达。通过将细胞均分于三个50ml Falcon管中然后以900rpm离心4分钟来收获细胞。弃培养基，余3ml细胞沉淀速冻于液氮中并保存于-80℃。
将来自25ml Sf9细胞的沉淀(诱导表达4天后)重悬于补充了Roche-无EDTA蛋白酶抑制剂片剂(200ml缓冲液中放1片)的10ml50mM Tris，pH 7.5中并用手持式匀浆器进行匀浆。产生的裂解细胞以3000g离心10分钟沉淀细胞核/碎片等。吸出10ml上清并以150,000g在4℃离心60分钟。将含有膜的沉淀重悬于1ml以上缓冲液中并在首次通过加入甘油至50％v/v进行稀释后将样品以100μl的等份贮存于-80℃。
通过与抗GST HRP缀合抗体(GE Healthcare，1∶5000工作液)一起保温并随后加入ECL(GE Healthcare)进行Western印迹监测表达。
用于检测的HST酶制备物还可直接制备自新鲜的植物材料。例如HST酶制备物来自菠菜。在第一步中从两份500g的新鲜稚嫩菠菜叶子(例如来自当地超级市场的沙拉区)中制备完整的菠菜叶绿体。预先包装的菠菜通常是已洗净的，但如果购买松散的叶子则在处理之前必须在水中洗净。去除茎、大叶子和中脉。将每500g份的叶子加入装在2L塑料烧杯中的1.5L“′研磨剂”中。研磨剂是冷的(4℃)50mMTricine/NaOH缓冲液，pH 7.1，其中含有330mM葡萄糖，2mM异抗坏血酸钠，5mM MgC12和0.1％牛血清白蛋白。将保存在4℃的烧杯放置于安装了1.5″切割探头的Polytron 6000搅拌器下并将混合物以5-8秒的短脉冲高达8-10k rpm的转速下进行混合直至全部叶子均软化分离。将匀浆物通过4层纱布和两层50μ网眼的尼龙布过滤至5L烧杯(埋于冰桶中)中。将过滤液转移至Beckman GS-6离心机的250ml桶中并在4℃以200x g(3020rpm)旋转2分钟。排干并弃上清以便留下叶绿体沉积物。通过温和旋转并温和使用浸泡于重悬液中的毛刷将叶绿体重悬于几毫升冰冷重悬剂中。重悬剂是处于4℃并包含330mM山梨糖醇，2mM EDTA，5mM KH2PO4，2mM MgC12和0.1％牛血清白蛋白的50mM Hepes/KOH pH 7.8。将叶绿体重悬于5-10ml的重悬缓冲液中，重复离心沉淀并再次悬浮以清洗它们。然后再一次将叶绿体离心下来并通过重悬于大约5ml的50mM Tricine-NaOHpH 7.8中至蛋白浓度约40mg/ml进行破碎。将溶液以等份试样贮存于-80℃。将此重悬液解冻并直接用于HST活性检测中。或者，制备叶绿体并重悬于含330mM山梨糖醇并处于pH 7.8的50mM Tris/HCl缓冲液(另一悬浮缓冲液)中并层置于percol梯度(包含含有45％percol的相同缓冲液)的顶部，离心下来，取出完整的叶绿体部分并在另一重悬缓冲液中洗2次或3次，然后再次将其离心下来，重悬于破碎缓冲液(无山梨糖醇)中，速冻并以等份试样贮存于-80℃。
实施例3.HST酶检验
用法尼基二磷酸盐(FDP)作为异戊二烯基供体，通过测定[U 14C]尿黑酸的异戊二烯化速率来测量异戊烯转移酶(HST)的活性。14C尿黑酸是利用L氨基酸氧化酶和HPPD制备自14C酪氨酸的。对于抑制剂测试而言，将化合物溶解于二甲亚砜(DMSO)中。添加高达2％的DMSO对试验无影响。对照试验包含与抑制剂试验中相同浓度的DMSO。
利用菠菜叶绿体提取物(100μl终体积)进行的试验包含多达2mg的叶绿体蛋白质，50mM Tricine-NaOH pH 8.5，50mM MgCl2，200μM法尼基二磷酸盐(FDP)和26μM14C-尿黑酸(167dpm/pmol)。试验在28℃进行大约1小时。对于抑制剂研究而言，已发现终浓度500ppm的氟啶草完全抑制了所述反应。或者，停止反应并在起始瞬间进行溶剂抽提也提供了100％抑制的基线标准。提取亲脂的反应产物并基本上如文献所述进行分析。
用配制于50mM Tricine-NaOH pH 8.5，20mM MgCl2中的200μM FDP和100μM 14C-尿黑酸(40dpm/pmol)以标准反应混合物形式检验表达于大肠杆菌膜中的重组衣藻HST。加入酶开始试验并在28℃进行约20分钟。
重组拟南芥和稻(rice)HST表达于昆虫细胞中。检验如同对衣藻HST一样进行，除了检测温度是27℃之外。用300μl的溶剂混合物(1∶2的氯仿∶甲醇)和100μl的0.5％NaCl终止检测，搅动/混合并在台式eppendorf离心机中以13,000rpm旋转离心5分钟。将80μl的下层相提取物加到TLC平板上(硅胶60，20cm x 20cm)FLA3000系统上并在二氯甲烷中泳动35分钟。用富士磷光影像分析仪对放射性进行定量，并对条带亮度进行积分作为产物量的定量测量。鉴定相应于氧化和还原的2-甲基-6-法尼基-l，4-苯醌(MFBQ)的条带，并计算这两种(氧化和还原的)条带亮度的总和以便估计MFBQ产物形成的总量。例如对于表达于来自转染4天和5天的昆虫细胞的膜中的GST融合截短拟南芥HST基因(SEQ ID#3)而言估计分别是8pmol MFBQ min-1mg-1蛋白质(23pmol)和7pmol MFBQ min-1mg-1蛋白质(14pmol)的比活性。从过往有关大肠杆菌表达拟南芥HST的文献中提到了相似的结果。来自昆虫细胞所表达之GST融合的已截短的稻(rice)HST(SEQ ID#4)的活性是相似的。将非截短型HST编码序列作为GST融合体表达也提供了HST活性。例如，昆虫细胞优化型GST融合之已截短拟南芥HST(SEQ ID#23)的表达具有比非优化基因增加大约3-10倍的比活性。
利用以上检测法，已报道了在抑制剂的一品系剂量下形成的MFBQ量相对于无抑制剂存在时获得的对照量的百分比抑制(表1)。较好的抑制剂在较低的剂量下给出了较高的百分比抑制。
已发现，对于在指定反应条件下检测的所有HST酶制品而言，MFBQ的形成并不是由HST从14C尿黑酸(HGA)所催化的唯一反应。事实上，来自14C HGA的主要(-90％)的放射性标记产物不是MFBQ。这些未知的其它产物也被抽提入氯仿/甲醇中，但在二氯甲烷TLC中则被发现停留在或者层析在基线附近。利用12∶3∶5∶0.5的二氯甲烷∶己烷∶乙腈∶甲酸在TLC的第二相中部分拆分出4条明显的14C-标记条带(据推测相应于两个醌/醌醇对)。在缺乏FPP(或者实际上当FPP被焦磷酸盐取代时)的情况下没有观察到这样的条带，据推测，所述条带相应于由于法尼基化和脱羧作用没有紧密偶联所形成的产物，即在缺少脱羧作用的情形下进行的法尼基化(产生羧化的MFBQ)以及在缺少法尼基化情形下进行脱羧作用(产生甲基醌醇/醌)。无论它们的身份如何，相当清楚的是这些比MFBQ更极性的产物均是bonefide酶反应产物，因为在缺乏FDP或使用类似的非转基因(非HST表达)膜的情况下，没有形成它们。此外，已发现抑制剂诸如氟啶草抑制了这些其它产物的形成，当剂量改变时，它以与MFBQ的形成抑制明显共线性的方式发挥上述作用。由此500ppm氟啶草大约完全抑制HST酶反应并且不形成MFBQ和任何其它产物。
因此，在改良的、更灵敏且方便形式的以上检测中，摒弃了TLC步骤，用500ppm氟啶草(或合适浓度的其它抑制剂)进行处理作为100％抑制“对照”，并将氯仿/甲醇提取物的一部分直接放入闪烁瓶中并计数。
常规是在100μM14C HGA，25℃持续小于20分钟(即对照检验速率保持线性的期间)并且在一品系测试抑制剂浓度下进行这些检验，以便可以通过对希尔方程(能使率值n变化)的曲线拟合推断出IC50。
结果
Figure BDA0000050194610000421
Figure BDA0000050194610000431
表1.用各种来源的HST(如标记的)观察在各种化合物的各个浓度下HST反应(相对于对照)的百分率抑制。检测是基于TLC并估计所形成的MFBQ的量。
  化合物   估计的IC50(pm)   95％置信限
  2.3   19*
  2.4   211*
  2.5   48*
  2.8   12   10.5-14
  2.9   6   4.5-8
  2.11   31*
  2.13   54*
  2.14   9   8-9.5
  2.15   12   9.6-14
  2.16   78   51-118
  2.17   38   21-68
  2.18   6   4.3-7.5
  2.19   6   4.5-8
  2.20   16   11-25
  2.21   64   52-78
  3.5   42   28-62
  6.1   63   39-102
表2.基于总提取物(非TLC)检验的拟南芥HST抑制的估计IC50值。＊这些估计值来自只在50μM HPP进行的3点剂量曲线。
实施例4.表达异源HST酶的稳定转基因植物品系的制备
例如，将拟南芥HST SEQ ID#11克隆在双重的35s CMV启动子序列和TMV翻译增强子序列之后并在来自一氧化氮合酶(nos)基因的3，终止子之前。将此表达盒连接入pMJBl(WO98/20144中所述)中并随后连入pBIN19中，然后转化入根癌农杆菌菌株LBA4404再进行植物转化。
例如，通过重叠PCR将全长拟南芥HST seq ID#11融合入TMV翻译增强子序列(SEQ ID#33)，并同时通过PCR加入5′Xhol位点和3′KpnI位点。进行定位诱变去除内在的Xhol位点。经由Xhol/Kpnl消化将TMV/HPPD融合体从pBIN19上切下并用TMV/HST融合体(SEQ ID#34)置换。此刻将TMV/HST融合体克隆在双重35s启动子之后并在nos基因的3’终止子之前。然后再次将经过修饰的pBIN19载体(ζpBinAT HST′)转化入根癌农杆菌菌株LBA4404。
同样地，将用于植物转化的载体构建成包含任一HST的DNA序列，例如序列编号12-20的序列。
备选地，载体包含编码来自光合原生动物、较高等和较低等植物的HST的DNA，其序列可用技术熟练人员已知的方法从cDNA文库获得。例如用Tri-Zol提取(Life Technologies)方法从5-20天龄的植物秧苗中制备总RNA。用Oligotex mRNA纯化系统(Qiagen)从例如燕麦中获取mRNA。用5′RACE鉴定例如A.sativa HST基因的5’末端，该实验利用内在的HST基因特异性引物(基于HST共有区域，例如SEQ No.35，36，37和38)通过Gene Racer kit(Invitrogen)进行。用3′RACE鉴定基因的3’末端，该实验利用适当的低聚的dT引物和适当的内在HST引物经由Themoscript RT(Life Technologies)并随后的PCR来完成。所有方法均依照各个已提及制造商所提供的流程进行。将从5′和3′RACE反应获取的产物克隆入pCR 2.1TOPO(invitrogen)中并用通用的M 13正向和反向引物经由自动的ABI377DNA序列仪对克隆产物进行测序。然后分别针对HST基因的翻译起始和终止密码子设计引物。将两个引物与One-step RTPCR试剂盒(Qiagen或Invitrogen)联合使用以获得全长编码序列。将获取的产物克隆入pCR 2.1TOPO中，测序，并通过与本领域已知的序列(以及例如本文的HST序列)进行比较而鉴定为HST。
用包含二元载体pBinAT HST(上文有描述)或含有不同HST之类似二元载体的根癌农杆菌母板单菌落接种含100mg/L利福平加50mg/L卡那霉素的10ml LB。将其在28℃以200rpm振荡温育过夜。用此全部过夜培养物接种50ml体积的LA(加抗生素)。再次将其在28℃以200rpm培养过夜。以3000rpm离心15分钟沉淀农杆菌细胞并然后重悬于带30g/L蔗糖且pH 5.9的MS培养基中至OD(600nM)＝0.6。将此悬浮液以25ml的等份分入皮氏培养皿中。
用无性系的微繁殖烟草发芽培养物来切下年幼的(还未完全展开的)叶子。取下中脉和外部叶缘并丢弃，将剩余叶片切成1cm的正方形。将这些转移至农杆菌悬浮液中20分钟。然后取下外植体，轻拍在无菌滤纸上以去除过量的悬浮液，然后转移至NBM培养基(MS培养基，30g/L蔗糖，1mg/L BAP，0.1mg/L NAA，pH 5.9，用8g/L的Plantagar固化)，使每个外植体的背轴面均接触培养基。每个平板上转移大约7个外植体，然后密封并于25℃，16小时光周期的条件在光培养箱中培养3天。
然后将外植体转移至含100mg/L卡那霉素加防止农杆菌进一步生长之抗生素(200mg/L替漫汀(timentin)和250mg/L羧苄青霉素)的NBM培养基中。然后每两周在此相同的培养基上进行进一步的次培养。
当芽开始从正在愈合的叶子外植体上再生，取下这些芽并放置于芽延伸培养基(MS培养基，30g/1蔗糖，8g/1Plantagar，100mg/L卡那霉素，200mg/L替漫汀(timentin)，250mg/L羧苄青霉素，pH5.9)中。稳定的转基因植物很容易在两周内生根。为了在每个事件中提供多个植物以便最终可以对每个转基因植物进行一种以上的除草剂测试，将所有的生根的芽进行微繁殖以产生3个或更多个生根的克隆。
用扩增拟南芥HST转基因内之500bp片段的引物通过PCR分析在掺入了卡那霉素的培养基中正在生根并显示出强劲的发芽生长的推定转基因植物。在未转化烟草上评估此相同引物对，结论显示这些引物不会扩增来自天然烟草HST基因的序列。
为了粗略的评估异位HST表达的比较性水平，对阳性烟草芽进行独立PCR，取下幼嫩的叶子，切成1cm的正方形并铺在掺入了1mg/L氟啶草的NBM培养基上。这些叶子外植体产生愈合组织并最终再生出芽。那些过表达HST的外植体再生出绿色的愈合组织和芽。未转化的外植体或来自具有有限HST表达之转化子的那些外植体产生褪色的愈合组织和发育迟缓的并最终死亡的褪色的芽。
已发现PCR 阳性事件对应于在氟啶草存在情形下产生绿色芽增殖(计分＞＝3)的愈合组织并且更多的展示出大于未转化对照材料的一定水平耐受性。
将已生根的转基因T0植物幼苗从琼脂上转移并盆栽入50％腐殖土，50％John Innes土壤no 3或例如
Figure BDA0000050194610000481
380土壤(Sun Gro Horticulture，Bellevue，WA)并带慢释放肥料的3英寸圆形或4英寸正方形罐中，并保持有规律的喷水以便在温室内安放8-12天。温室条件是大约白天24-27℃；夜间18-21℃以及大约14小时(或者在英国的夏季为更长的时间)光周期。湿度是约65％，并且在实验台水平上光照水平高达2000μmol/m2。一旦新的组织出现并且植物达到2-4叶期，用溶于含0.2-0.25％X-77表面活性剂之水中的测试化学制品喷洒来自每一事件的一些克隆，喷洒是从以2mph移动的在DeVries喷雾室内的合适的轨道喷雾器上的喷杆实施的，喷嘴高度距植物顶部约2英寸。喷洒体积合适地是每英亩25加仑或者例如2001/ha。
测试的化学制品是例如500g/ha的化合物2.3。在如此喷洒转基因植物的同时，还喷洒从种子生长起来的野生型Samsun烟草(tobacco)植株以及再生自组织培养物的非转基因植物和非转基因组织培养物野生种。与类似大小和发育阶段的未喷洒对照植物相比来评估损害。
Figure BDA0000050194610000491
表3.用化合物2.3(表中指定为化合物3)评估拟南芥HST转基因烟草(tobacco)植物的11个DAT。与未处理的对照相比，所有植物均受到500g/公顷处理的影响并且较小且生长延缓。不过，与显示白色分生组织并且基本上死亡的对照不同，许多HST转基因显示出绿色的分生组织并且正在恢复且有一些显示出基本上没有褪色。以0至10的尺度对植物进行评分，0意味着植物充分褪色/烧伤且分生组织死亡/变白，而10则意味着整个植物看起来是绿色且未损坏的。
除了以上实验之外，用250g/ha氟啶草处理两个品系的表达拟南芥HST的转基因植物E9和F6，处理方式与上述方法相似，除了处理时间是在稍晚的生长阶段(4-5叶期)之外。在评估8DAT后，野生型植物有55和65％受损坏，品系F6植物是50和75％受损，而品系E9植物只有20和40％受损。
在25DAT，野生型和F6植物保持发育迟缓的、褪色且小(50-70％受损)而E9植物此刻显现出为健康的且与未处理对照植物相似的大小。由此拟南芥HST的表达赋予了对氟啶草的抗性。
在处理多达28DAT后于不同的时间对植物进行评估。将那些显示出最小的来自HST除草剂之损害的事件(例如C8，G9，E9)培养至开花、松弛下垂并使其可自花授粉。收集来自选定植物的种子再次播种于罐中并在对除草剂抗性的喷洒试验中再次测试其除草剂抗性。通过它们3∶1的分离比率(如，取决于构建体，经由卡那霉素选择和wrt除草剂抗性表型二者)并通过定量RT-PCR鉴定T1植物品系中的单拷贝事件。
实施例5.经转化表达拟南芥HST，Avena HPPD或假单胞杆菌HPPD的T1和T2转基因植物的产生和进一步测试
对前述实施例中所述的T0转基因烟草植物品系B8和G9进行自花授粉。将来自每个品系每次自花授粉所产生的约50个种子移植入装在3英寸罐中的土壤/腐殖土混合物中，在温室中生长7-10天并喷洒500g/ha的化合物2.3(均如前述实施例中所述)。对于每个品系，大约四分之三的植物展示出对除草剂的明显抗性，并且其中少许植物(可能在单一插入事件中是纯合体)显现出最大的抗性。对这些更高耐受性的T1植物中的少数再次进行自花授粉以产生成批的T2种子。
将来自野生型w/t Samsun烟草(tobacco)的6粒种子和来自事件B8和G9的8粒T1种子也移植3英寸罐中，培养7至12天，然后如前述实施例所述，对植物幼苗进行喷洒测试其对各种化学制品的抗性并在14DAT进行评估。化学制品配制成0.2％X77并以2001/lha的喷洒体积喷洒。结果如下表4中所述。结果清楚证实了除草剂抗性表型的遗传性能。此外结果还显示了，除了明显的非转基因的分离种之外，当利用例如化合物2.15和2.30时转基因拟南芥HST烟草Tl植物展示出对HST除草剂的抗性，除此之外其表型是特异的且植物不显著耐受其它两种被测的除草剂达草灭(norflurazon)和阿特拉津。
Figure BDA0000050194610000511
表4.用各种除草剂评估除草剂对14DAT的拟南芥HST品系B8和G9的T1后代植物的百分比损伤。
如WO0246387的实施例4中所详述的提供了在双重增强的35SCMV启动子区、Nos3′终止子和TMV翻译增强子的可操作控制下表达荧光假单胞杆菌菌株87-79之野生型HPPD基因的烟草植物。对展示出耐受硝磺酮的T0事件进行自花授粉以产生单一的插T1品系(展示3∶1分离的除草剂耐受和卡那霉素选择表型)，将其再次进行进一步的自花授粉以提供命名为C2的T2品系。
将野生型烟草植物、C2烟草植物以及进一步的表达拟南芥-HST之烟草品系D2之T1后代的种子移植至户外的3英寸罐中，培养，以表5所示的比率喷洒化合物1.1，2.30和3.6。评估处于7DAT时的百分比损伤得分。除了假定的非-转基因分离种之外，包含拟南芥HST表达构建体的D2品系提供了针对两种HST除草剂的最高耐受水平，而在此试验的条件下利用假单胞菌HPPD，C2品系只提供了最低限度的耐受性。
Figure BDA0000050194610000521
表5.野生型(WT)Samsun，C2和D2烟草品系与各种HST抑制剂的测试。结果描述了在7DAT时的％损伤。
Figure BDA0000050194610000522
表6用硝磺酮处理的拟南芥HST烟草T0系的测试。
用拟南芥HST转化的5个烟草品系受10g/ha硝磺酮的损伤在10DAT时小于类似处理的野生型品系。拟南芥HST的表达赋予了一定程度的对除草剂硝磺酮的耐受性。
实施例6.表达Avena HPPD的植物对HST除草剂的抗性。
如WO0246387中所述提供了在双重增强的35S CMV启动子区、Nos3’终止子和TMV翻译增强子的可操作控制下表达燕麦野生型HPPD基因的分离T1品系烟草的种子。将来自自花授粉的、硝磺酮-耐受型T0事件的约30-40粒T1种子培养至7-10天龄的植物幼苗，如上所述进行喷洒和评估，结果(在6DAT)如下表7中所述。在实验条件下，Avena HPPD显现出提供了对HST抑制剂2.30和3.6二者的一定程度的耐受性。
Figure BDA0000050194610000531
表7.野生型(WT)Samsun烟草和表达Avena HPPD的烟草品系对硝磺酮、化合物2.30和化合物3.6的测试。结果描述了在6DAT的百分比损伤。
实施例7.表达HST的烟草转化子的转化和针对HST除草剂选择。
用包含二元载体pBinAT HST(实施例6有描述)的根癌农杆菌单菌落母板接种含100mg/L利福平加50mg/L卡那霉素的10ml LB。将其在28℃以200rpm振荡温育过夜。用此全部过夜培养物接种50ml体积的LA(加抗生素)。再次将其在28℃以200rpm培养过夜。以3000rpm离心15分钟沉淀农杆菌细胞并然后重悬于带30g/L蔗糖且pH 5.9的MS培养基中至OD(600nM)＝0.6。将此悬浮液以25ml的等份分入皮氏培养皿中。
用无性系的微繁殖烟草(tobacco)发芽培养物来切下年幼的(还未完全展开的)叶子。取下中脉和外部叶缘并丢弃，将剩余叶片切成1cm的正方形。将这些转移至农杆菌悬浮液中20分钟。然后取下外植体，轻拍在无菌滤纸上以去除过量的悬浮液，然后转移至NBM培养基(MS培养基，30g/L蔗糖，1mg/L BAP，0.1mg/L NAA，pH 5.9，用8g/L的Plantagar固化)中，使每个外植体的背轴面均接触培养基。每个平板上转移大约7个外植体，然后密封并于25℃，16小时光周期的条件在光培养箱中培养3天。
然后将外植体转移至含0.5mg/L氟啶草加防止农杆菌进一步生长之抗生素(200mg/L替漫汀(timentin)和250mg/L羧苄青霉素)的NBM培养基中。然后每两周在此相同的培养基上进行进一步的次培养。
当芽开始从正在愈合的叶子外植体再生时，取下这些芽并放置于芽延伸培养基(MS培养基，30g/1蔗糖，8g/1Plantagar，lmg/L氟啶草(或相似的或在适当有差别浓度的任何其它浓度的HST除草剂)，200mg/L替漫汀(timentin)，250mg/L羧苄青霉素，pH 5.9)中。通过PCR对生根并继续增殖的芽分析HST转基因的稳定整合。最终将这些已生根的芽转移至土壤中并在温室条件下进一步发育。自选定的T0品系产生T1种子。由此发现利用HST基因联合HST抑制型除草剂提供了一种选择转基因植物组织的方式。
实施例8.制备和测试表达异源HPPD酶的稳定的转基因植物品系
可将烟草、大豆和玉米等的转基因品系加工成表达来自例如Avena(SEQ ID#26)，小麦(SEQ ID#27)，荧光假单胞杆菌(SEQ ID#25)和Shewanella colwelliana(SEQ ID#28)的各种异源HPPD，如例如WO 02/46387中所述。
收集来自选定事件的种子再次播种于罐中并在针对HPPD除草剂(例如硝磺酮)抗性的喷洒试验中再次测试其除草剂抗性。通过它们3∶1的分离比率(wrt卡那霉素以及/或除草剂)并通过定量RT-PCR鉴定T1植物品系内的单拷贝事件。将来自由此选定的Tl烟草(tobacco)(var Samsun)品系的种子播种于包含50％腐殖土，50％John Innes土壤no 3的直径3英寸的罐中。在生长至3叶期之后，如上所述对植物进行喷洒，以测试其相对于类似处理之非转基因烟草植物而言的除草剂耐受性。
以37，111，333和1000g/公顷的比率对对照烟草植物和表达假单胞菌或小麦HPPD基因的T1植物喷洒HST抑制剂例如化合物2.3。在16DAT对植物进行评估并计算其％损伤。
Figure BDA0000050194610000551
表8.比较在16DAT的野生型烟草植物中与在表达假单胞菌或小麦HPPD之转基因植物中观察到的％损伤。
由此观察到两者中任一种HPPD基因的表达都为烟草提供了对HST抑制剂2.3以及硝磺酮处理的高水平抗性。经处理的野生型烟草植物显示出白色的已褪色分生组织，而表达转基因HPPD的植物则具有绿色的健康分生组织和新叶子并且看上去几乎未损坏。在此测试中，植物在喷洒时相对较大，因此对照未完全受控制。
实施例9.表达不同异源HST和HPPD酶及其它们堆叠组合的转基因植物品系的制备。对除草剂耐受性的温室测试。
如前所述将全长拟南芥(加起始密码子)HST seq ID 11克隆入双重的35s CMV启动子序列和TMV翻译增强子序列之后及nos基因的3’终止子之前。如上所述将此表达构建体克隆入二元载体(pBIN 35S拟南芥HST)中转化入烟草内以产生30-50个转基因事件的群体，在愈伤组织期再将它们细分，从而每个转基因事件得到2-4个无性系植物，然后使它们再生并转移入土壤中，再移入温室进行测试。以正好相同的方式，将衣藻HST基因序列(AM285678)进行针对烟草的密码子优化并在双重的花椰菜花叶病毒35S启动子和烟草花叶病毒增强子序列之后及nos基因终止子之前克隆入二元载体并转化烟草以产生T0植物群体。
完全如WO 02/46387的实施例5所述将小麦HPPD基因序列(Embl DD064495)克隆在拟南芥Rubisco小亚基(SSU)启动子之后及nos基因终止子之前，以产生′SSU小麦HPPD nos表达盒′，将其克隆入二元载体并转化烟草以产生30-50个转基因事件的群体。
此外还建立了″pBin拟南芥HST/小麦HPPD″载体以提供共表达HST和HPPD酶的植物群。将SSU小麦HPPD nos盒(上文所述)克隆入pBin 35S拟南芥HST载体(上文所述)的EcoRI位点之后以产生HST/HPPD表达构建体和二元载体。再次将它转化入烟草中以产生原代转化子群。
或者，首先通过转化表达异源HST或HPPD随后用已设计为表达另一种酶的构建体转化后代组织，从而产生表达HPPD和HST二者的转基因植物。例如，如WO 02/46387中所述，对烟草植物进行转化以便在拟南芥小亚基rubisco启动子、TMV翻译增强子和nos基因3’终止子的表达调控下表达小麦，Avena或假单胞杆菌HPPD。将高度耐受硝磺酮的T0事件的实例自花授粉以制备T1种子。将来自单一事件的约100粒种子用1％卫康(Virkon)消毒剂进行表面消毒15分钟，然后用无菌水漂洗并铺在含20g/L蔗糖，100mg/L卡那霉素，pH 5.8，以8g/1plantagar固化的MS培养基上。从发芽的半合子和纯合子植物混合群中挑选单个植物，将它们体外并经微繁殖以提供无性系重组芽培养物。用前述构建体和选择方法对来自这些芽培养物的叶子进行转化。为了初始评估HPPD和HST的共表达是否导致了植物对硝磺酮的抗性相较于单独表达HPPD而言有所提高，将来源于仅HPPD转化子和HPPD加HST转化子的叶外植体的芽培养物铺在含硝磺酮浓度范围为0.1至5mg/L之间的NBM培养基上。来自组合有HPPD和HST的转基因植物的外植体可能展示绿色愈伤组织并且再生的芽在较高的硝磺酮浓度下展示出比来自无性系单个植物即HPPD事件来源材料之仅HPPD转化子的“背景”外植体更有限的褪色。
“对照”植物幼苗是从来源于单一事件单一植物的未转化(用HST)HPPD-表达克隆背景材料再生的。如前实施例中针对氟啶草所述在此背景下选择另外用HST转化的T0HST转基因植物幼苗，并进行再生。如前实施例所述将植物幼苗微繁殖成更多的克隆、生根并培养于温室内的罐中。
Figure BDA0000050194610000571
表9.包含上文所述表达盒的烟草事件T0群体，所述表达盒具有1)35S拟南芥HST基因，2)SSU小麦HPPD基因或3)35S衣藻HST基因。在喷洒100g化合物2.30后的不同时间对除草损伤进行评估。参数″ht″指相对于对照植物而言的高度降低百分数，而参数″blch″指相对于对照植物而言观察到的分生组织处的褪色百分率。明显可见用全部三个构建体转化均赋予了对化合物2.30的耐受性。在经两种HST基因中任一种转化的植物群中均观察到了最大数目的最小受损植物(约50％的事件＜30％发育迟缓)。
Figure BDA0000050194610000581
表10.包含上文所述表达盒的烟草事件T0群体，所述表达盒具有1)拟南芥HST基因，2)小麦HPPD基因或3)衣藻HST基因。在喷洒40g化合物1.1后的不同时间对除草损伤进行评估。参数″ht″指相对于对照植物而言的高度降低百分数，而参数″blch″指相对于对照植物而言观察到的分生组织处的褪色百分率。全部三个构建体均提供了对化合物1.1的耐受性。在经两种HST基因中的任一种转化的植物中均观察到了最大数目的最小受损植物(超过的50％事件＜35％发育迟缓)。
Figure BDA0000050194610000591
表11.包含上文所述表达盒的烟草事件T0群体，所述表达盒具有1)拟南芥HST基因，2)小麦HPPD堆叠拟南芥HST基因或3)衣藻HST基因。在喷洒500g化合物2.30后的不同时间对除草损伤进行评估。参数″ht″指相对于对照植物而言的高度降低百分数，而参数″blch″指相对于对照植物而言观察到的分生组织处的褪色百分率。全部三个构建体均提供了对化合物2.30的耐受性。在经HPPD和HST基因堆叠组合转化的植物中观察到了最大数目的最小受损植物(超过的50％事件＜30％发育迟缓)。
Figure BDA0000050194610000601
表12.含有上述表达盒的烟草事件的TO群体，其中所述表达盒具有1)拟南芥HST基因或2)衣藻HST基因。在喷洒15g/公顷硝磺酮后在各个时间点评估除草剂损伤。一些含有衣藻HST基因的植物品系表现出对硝磺酮的一些耐受性，其中特别有3个品系比类似处理的对照植物显著更大程度地变绿和恢复。
实施例10：大豆转化载体的构建。
将用于双子叶植物(大豆)转化的二元载体(17107)构建成带有例如驱动衣藻HST编码序列(SEQ ID#15)表达的拟南芥UBQ3启动子，随后是Nos基因3’终止子。基于HST基因编码区的预测氨基酸序列将所述基因针对大豆表达进行密码子优化。SEQ ID#5中提供了衣藻HST基因所编码蛋白的氨基酸序列。任选地，转化载体还包含两个PAT基因盒(一个带35S启动子，一个带CMP启动子，两个PAT基因均跟随有nos终止子)用于转化过程中基于草铵膦的选择。
同样地构建相似的二元载体(17108)，但它除此之外还包含表达大豆密码子优化之Avena HPPD基因的表达盒。在此情形下没有PAT基因，利用HPPD除草剂或如本文所述用HST除草剂进行选择。
实施例11：大豆T0代植物的建立和选择。
用本领域众所周知的方法完成大豆的转化。从组织培养物中取出T0代植物放入温室中，在那它们被移植入混合了1％granular
Figure BDA0000050194610000611
(Olympic Horticultural Products，Co.，Mainland，PA)的饱和土壤(
Figure BDA0000050194610000612
Plug and Seedling Mix，Sun Gro Horticulture，Bellevue，WA)中，放入有5-10g/gal
Figure BDA0000050194610000613
Mix的2″正方形罐内。将所述植物用潮湿的圆盖覆盖并放置于Conviron室(Pembina，ND)内，环境条件如下：白天24℃；夜间18℃；光周期23小时；80％相对湿度。
在植物在土壤中安置好并出现新的生长后(约1-2周)，对植物采样并用针对HST和/或HPPD基因或启动子(例如prCMP和prUBq3)的合适探针经由TaqmanTM分析检验预期转基因的存在。将所有的阳性植物和若干阴性植物移植入含
Figure BDA0000050194610000614
380土壤(Sun Gro Horticulture，Bellevue，WA)的4″正方形罐中。将Sierra 17-6-12缓释肥料以推荐比率掺入土壤中。阴性植物用作喷洒实验的对照。然后将植物重新移入标准温室内以适应新环境(约1周)。环境条件是：白天27℃；夜间21℃；光周期12小时(带环境光)；环境湿度。适应新环境(约1周)后，预备用预期除草剂喷洒所述植物。
实施例12HPPD/HST除草剂混合物。加入少量HPPD抑制物对HST除草剂之除草活性的影响。
使烟草(tobacco)(var Samsun)植物幼苗在无菌条件下于由1/3强度Murashige和Skoog盐培养基伴随各种剂量除草剂组成的琼脂中发芽。于7DAT对新出现植物幼苗评估褪色损伤。将植物幼苗保持覆盖于清晰的透明玻璃下并在16小时白天(约500-900umol/m2)，8小时黑暗的状况下培养于18℃(夜间)和24℃(白天)。受除草剂影响的植物幼苗褪色成白色并且生长较少。用Colby公式计算协同/拮抗应答(Colby，S.R.(Colby，S.R.(Calculating synergistic and antagonistic responses of herbicide Combinations″，Weeds，15，p.20-22，1967)。
表13.HST+HPPD除草剂对琼脂中烟草秧苗的作用。在存在和缺少0.004ppm硝磺酮的条件下用各种剂量的氟啶草和0.75％v/vDMSO评估琼脂中观察到的7DAT的发芽烟草种子的％褪色。在此剂量下硝磺酮自身一致性地引起35％的褪色损伤，因此如Colby(1967)所述计算在不同剂量氟啶草的混合物中的预期损伤值。
在另一备选除草剂测试方法中，使烟草(tobacco)(var Samsun)植物幼苗在无菌条件下于由1/3强度Murashige和Skoog盐培养基组成的琼脂中发芽，并在4天后转移至12孔板的孔中使其漂浮在2.9ml无菌液体培养基(含30mM蔗糖的一半强度的Murashige和Skoog培养基)的顶部。将测试的化合物以不同剂量加入并在14-20DAT后评估褪色损伤。将植物幼苗保持覆盖于清晰的透明玻璃下并在16小时白天(约500-900umol/m2)，8小时黑暗的状况下培养于18℃(夜间)和24℃(白天)。在整个14-20DAT期间植物幼苗继续生长并产生新组织，但在控制量的除草剂存在情形下则褪色且生长较少。
Figure BDA0000050194610000622
表14.HST+HPPD除草剂对液体培养的烟草秧苗的影响。在存在和缺少0.001或0.0005ppm硝磺酮的条件下相对于含0.75％v/vDMSO的不同浓度HST除草剂化合物2.13来评估液体培养基中观察到的20DAT的烟草秧苗的％褪色。在这些剂量下硝磺酮自身或者产生最小的(20％)的褪色损伤或产生零褪色损伤。
从所提供的数据明显可见加入低剂量的硝磺酮对于HST抑制剂氟啶草对琼脂培养之烟草植物幼苗的除草剂作用具有协同效果。
  氟啶草ppm   仅氟啶草   +硝磺酮0.001ppm
  47   100   100
  16   100   100
  5.2   100   100
  1.7   100   100
  0.58   90   100
  0.19   50   100
  0.75％DMSO   0   5
表15a
  化合物2.15ppm   仅化合物2.15   +硝磺酮0.001ppm
  47   100   100
  16   100   100
  5.2   40   70
  1.7   5   80
  0.58   0   5
  0.19   5   0
  0.75％DMSO   0   5
表15b
表15a和15b.HST+HPPD除草剂对液体培养基上培养的烟草秧苗的损伤。在存在和缺少0.001ppm硝磺酮的条件下相对于含0.75％v/v DMSO的不同浓度HST除草剂氟啶草(表15a)和化合物2.15(表15b)来评估液体培养基中观察到的14DAT的烟草秧苗的％褪色。在此剂量下硝磺酮产生了最小的(0-5％v)损伤。
在液体培养中，硝磺酮对HST抑制剂2.13活性的协同效果比对氟啶草的协同效果更明显。即使加入一剂自身不产生明显可见损伤的硝磺酮，在对照预期水平仅为0、0和50％的化合物2.13剂量下(依照Colby)，均导致了40、90和100％的褪色损伤。同样地，在存在较高剂量硝磺酮的情况下，在其中预期仅20％褪色的一品系化合物2.13的比例下观察到80或90％褪色。同样地，在相似条件下的重复实验中，少量硝磺酮对由氟啶草和化合物2.15剂量应答所观察到的损伤具有明显的协同作用。
实施例13.通过HST和HPPD除草剂的混合物控制温室杂草。
将杂草种子移植至到装有合适的土壤(例如50％腐殖土，50％John Innes土壤no 3)的盘中并在白天24-27℃；夜间18-21℃及约14小时(或在英国的夏季则更长)光周期的温室条件下培养。湿度是约65％，而在苗床水平上光照水平高达2000μmol/m2。用溶于含0.2-0.25％X-77表面活性剂的水中的测试化学制品喷洒装于盆中的植物，喷洒来自以2mph移动的合适的轨道喷雾器上的喷杆(例如带距植物顶部约2英寸的喷嘴的DeVries喷雾室)。喷洒体积合适地是500-10001/ha。在出苗前和整个幼小植物在约7-12天出苗后至成熟前均进行喷洒。评估14DAT的植物并以0至100％的标度对除草损伤进行记分。以0和500g/ha之间的比率喷洒HST抑制剂化合物2.30(在表16和17中指定为化合物A)，氟啶草(化合物1.1)和化合物2.13(在表16和17指定为化合物AE)。以非常低的比率1g/ha施加硝磺酮，在此比率它基本上不引起损伤(＜10％损伤)。
Figure BDA0000050194610000651
表16.用HST/HPPD除草剂混合物进行出苗后的杂草控制。所报告的数字相应于观察到的％损伤。
Figure BDA0000050194610000652
表17.用HST/HPPD除草剂混合物进行出苗前的杂草控制。
实施例14.显示HPPD和HST除草剂之间协同效果的进一步研究
在进一步的试验中，其结果描述于表18和19中，将杂草种子移植至装有含50％腐殖土，50％John Innes no 3土壤的盘中并在白天24-27℃；夜间18-21℃及约15小时光周期的温室中培养。湿度是约65％，而在苗床水平上光照水平高达2mmol/m2。再次将所有喷洒化学制品溶于含0.2X-77表面活性剂的水中，并且自以2mph移动的轨道喷雾器上的喷杆中喷洒，其中具有设置在距植物顶部以上约2英寸处的喷嘴。喷洒体积是500l/ha。在出苗前和整个幼小植物在出苗后约7-12天均进行喷洒。评估14DAT的植物并以0至100％的标度对除草剂损伤进行记分。HPPD抑制型除草剂是化合物A22(4-羟基-3-[[2-(2-甲氧基乙氧基)甲基]-6-(三氟甲基)-3-吡啶基]羰基]-双环[3.2.1]辛-3-烯-2-酮)，它以2g/ha的比率单独地和与各种HST除草剂混合两种形式喷洒。结果和喷洒比率描述于表18和19中。再次用Colby公式基于单独以单一组分获得的结果计算用混合物处理后的观察到的协同得分。在多种杂草的出苗前和出苗后两个时间施用均观察到HPPD除草剂和多种HST抑制型除草剂之间的正协同作用。
Figure BDA0000050194610000671
表18.一系列杂草的出苗后杂草控制。用各种HST抑制剂单独或与A22混合喷洒后的％控制得分(仅单一重复试验)。
表18(继续).一系列杂草的出苗后杂草控制。用各种HST抑制剂单独或与A22混合喷洒后的％控制得分(仅单一重复试验)。
Figure BDA0000050194610000691
表19.一系列杂草的出苗前杂草控制。用多种HST抑制剂单独或与A22混合喷洒后14DAT的％控制得分。
Figure BDA0000050194610000701
表19.(继续)一系列杂草的出苗前杂草控制。用多种HST抑制剂单独或与A22混合喷洒后14DAT的％控制得分。
上表提供的数据显示，在许多情形下，在出苗前和出苗后加入相当低(亚致死)水平的硝磺酮均提高了HST抑制型除草剂对杂草的控制。

Claims (48)

1.一种在包含农作物和杂草的地点选择性控制杂草的方法，其中该方法包括在所述地点施用杂草控制量的杀虫剂组合物，该杀虫剂组合物包含尿黑酸法呢基转移酶(HST)抑制型除草剂和/或羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制型除草剂，其中所述农作物包含至少一种重组多核苷酸，该重组多核苷酸包含编码HST的区域。
2.依照权利要求1的方法，其中所述农作物包含另外的重组多核苷酸，该重组多核苷酸包含编码羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)的区域。
3.一种在包含农作物和杂草的地点选择性控制杂草的方法，其中该方法包括在所述地点施用杂草控制量的杀虫剂组合物，该杀虫剂组合物包含尿黑酸法呢基转移酶(HST)抑制型除草剂，其中所述农作物包含至少一种重组多核苷酸，该重组多核苷酸包含编码HPPD酶的区域。
4.依照前述权利要求任一项的方法，其中所述杀虫剂组合物包含HST抑制型除草剂和羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制型除草剂。
5.依照前述权利要求任一项的方法，其中所述HST抑制型除草剂选自下组：式(IIa)，(IIb)，(IIc)，(IId)，(IIe)和(IIf)。
6.依照权利要求1，2，4和5任一项的方法，其中所述HPPD抑制型除草剂选自下组：硝磺酮，磺草酮，异
Figure FDA0000050194600000011
唑草酮，环磺酮(tembotrione)，吡草磺，吡草酮，吡唑特(pyrazolate)，苄草唑，磺酰草吡唑，ketospiradox或其游离酸，4-羟基-3-[[2-(2-甲氧基乙氧基)甲基]-6-(三氟甲基)-3-吡啶基]羰基]-二环[3.2.1]辛-3-烯-2-酮，[2-氯-3-(2-甲氧基乙氧基)-4-(甲磺酰基)苯基](l-乙基-5羟基-1H-吡唑-4-基)-甲酮，α-(环丙基羰基)-2-(甲磺酰基)-β-氧-4-(三氟甲基)-苯丙腈(benzenepropanenitrile)，和(2，3-二氢-3，3，4-三甲基-1，1-二氧化苯并[b]噻吩-5-基)(5-羟基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)-甲酮。
7.依照前述权利要求任一项的方法，其中所述HST酶衍生自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆(Glycine max)、水稻(Oryza sativa)或莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。
8.依照前述权利要求任一项的方法，其中所述HST酶选自下组：
(a)SEQ ID NO.1至10所示的HST酶；和
(b)包含一种或多种下述多肽基序的HST：
W-(R/K)-F-L-R-P-H-T-I-R-G-T；和/或
N-G-(Y/F)-I-V-G-I-N-Q-I-(Y/F)-D；和/或
I-A-I-T-K-D-L-P；和/或
Y-(R/Q)-(F/W)-(I/V)-W-N-L-F-Y。
9.依照前述权利要求任一项的方法，其中所述农作物包含另一种重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码另一种除草剂耐受酶。
10.依照权利要求9的方法，其中所述另一种除草剂耐受酶选自下组：5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，草甘膦乙酰基转移酶(GAT)，细胞色素P450，膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)，乙酰乳酸合酶(ALS)，原卟啉原氧化酶(PPGO)，八氢番茄红素去饱和酶(PD)，麦草畏降解酶和芳氧基除草剂降解酶。
11.依照前述权利要求任一项的方法，其中所述杀虫剂组合物包含一种或多种额外的除草剂。
12.依照权利要求11的方法，其中所述一种或多种额外的除草剂选自下组：草甘膦(包括其农业化学上可接受的盐)；草铵膦(包括其农业化学上可接受的盐)；氯乙酰苯胺例如甲草胺，乙草胺，异丙甲草胺，S-异丙甲草胺(S-metholachlor)；光系统II抑制剂例如三嗪类诸如莠灭净，阿特拉津，氰草津和特丁津，三嗪酮类诸如环嗪酮和嗪草酮，以及脲类诸如绿麦隆，敌草隆，异丙隆，利谷隆和terbuthiuron；ALS-抑制剂例如磺酰脲诸如酰嘧磺隆，氯磺隆，氟啶嘧磺隆，氯吡嘧磺隆，烟嘧磺隆，氟嘧磺隆，氟磺隆，砜嘧磺隆，醚苯磺隆，三氟啶磺隆和三氟甲磺隆；二苯醚例如aciflurofen和氟磺胺草醚.
13.依照权利要求12的方法，其中所述一种或多种额外的除草剂是草甘膦和/或PS-II抑制型除草剂。
14.依照前述权利要求任一项的方法，其进一步包括在所述地点施用杀虫剂和/或杀真菌剂。
15.一种重组多核苷酸，其包含与植物可操作启动子可操作连接的编码HST酶的区域，其中所述编码HST酶的区域不包括SEQ IDNO.11，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15所示多核苷酸序列。
16.依照权利要求15的重组多核苷酸，其中所述HST选自下组：SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10。
17.一种重组多核苷酸，其包含(i)与植物可操作启动子可操作连接的编码HST酶的区域和(ii)至少一个额外的与植物可操作启动子可操作连接的编码选自下组的除草剂耐受酶的区域：羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)，5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，草甘膦乙酰基转移酶(GAT)，细胞色素P450，膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)，乙酰乳酸合酶(ALS)，原卟啉原氧化酶(PPGO)，八氢番茄红素去饱和酶(PD)，麦草畏降解酶，和芳氧基除草剂降解酶。
18.依照权利要求17的重组多核苷酸，其包含(i)编码HST酶的区域和(ii)至少一个额外的编码HPPD的区域。
19.依照权利要求17的重组多核苷酸，其包含至少两个额外的编码除草剂耐受酶的区域。
20.依照权利要求19的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(i)编码HST酶的区域，(ii)编码HPPD酶的区域和(iii)编码草甘膦耐受酶的区域。
21.一种载体，其包含依照权利要求15至20任一项的重组多核苷酸。
22.一种耐受HST抑制型除草剂和/或HPPD抑制型除草剂的植物细胞，所述植物细胞包含依照权利要求15至20任一项的重组多核苷酸。
23.依照权利要求22的植物细胞，其中所述植物选自玉米、大豆、小麦、大麦、甜菜、稻和甘蔗。
24.一种HST抑制物和/或HPPD抑制物耐受型植物，其包含依照权利要求22或权利要求23的植物细胞。
25.种子或其衍生材料，其包含依照权利要求22的植物细胞。
26.一种生产耐受HST抑制型和/或HPPD抑制型除草剂的转基因植物的方法，其包括用如下的重组多核苷酸转化植物材料，该重组多核苷酸包含编码HST的区域和任选地编码HPPD的区域，使用HST抑制物和/或HPPD抑制物来选择经转化的植物材料，并将该材料再生成形态学正常的可育植株。
27.依照权利要求26的方法，其中所述重组多核苷酸进一步包含编码非HST抑制型除草剂之靶物的区域和/或编码能够赋予经该区域转化的植物材料以对昆虫、真菌和/或线虫的抗性的蛋白质的区域。
28.一种形态学上正常的可育的完整植株，其是通过权利要求26或27的方法获得的。
29.包含编码HST酶的区域的重组多核苷酸在植物转化中作为选择标记的用途。
30.包含编码HST酶的区域的重组多核苷酸在生成耐受除草剂的植株中的用途，该除草剂完全或部分通过抑制HST来起作用。
31.HST抑制物在植物转化中作为选择剂的用途。
32.重组HST酶在潜在除草剂的体外筛选中的用途。
33.一种包含HPPD抑制型除草剂和HST抑制型除草剂的除草组合物。
34.依照权利要求33的除草组合物，其中所述HPPD抑制型除草剂如权利要求6中定义的。
35.依照权利要求33或权利要求34的除草组合物，其中所述HST抑制型除草剂如权利要求5中定义的。
36.依照权利要求33至35任一项的除草剂组合物，其中组合物中HPPD抑制型除草剂与HST抑制型除草剂的摩尔比为100∶1至1∶100。
37.依照权利要求36任一项的除草剂组合物，其中组合物中HPPD抑制型除草剂与HST抑制型除草剂的摩尔比为1∶1至1∶20。
38.依照权利要求33至37任一项的除草组合物，其进一步包含一种或多种额外的杀虫组分。
39.依照权利要求38的除草组合物，其中所述一种或多种额外的杀虫组分包含除草剂。
40.依照权利要求39的除草组合物，其中所述额外的除草剂选自下组：草甘膦(包括其农业化学上可接受的盐)；草铵膦(包括其农业化学上可接受的盐)；氯乙酰苯胺例如甲草胺，乙草胺，异丙甲草胺，S-异丙甲草胺；光系统II抑制剂例如三嗪类诸如莠灭净，阿特拉津，氰草津和特丁津，三嗪酮类诸如环嗪酮和嗪草酮，和脲类诸如绿麦隆，敌草隆，异丙隆，利谷隆和terbuthiuron；ALS-抑制剂例如磺酰脲诸如酰嘧磺隆，氟磺隆，氟啶嘧磺隆，氯吡嘧磺隆，烟嘧磺隆，氟嘧磺隆，氟磺隆，砜嘧磺隆，醚苯磺隆，三氟啶磺隆和三氟甲磺隆；二苯醚例如aciflurofen和氟磺胺草醚.
41.依照权利要求40的除草组合物，其中所述额外的除草剂选自下组：草甘膦，草铵膦，阿特拉津和S-异丙甲草胺。
42.一种在包含农作物和杂草的地点选择性控制杂草的方法，包括在所述地点施用杂草控制量的依照权利要求33至41任一项的除草组合物。
43.依照权利要求42的方法，其中以当单独施用HPPD抑制型除草剂时对杂草通常是亚致死性的比率在所述地点施用组合物中存在的HPPD抑制型除草剂。
44.依照权利要求43的方法，其中所述HST抑制型除草剂施用10至2000g/ha且所述HPPD抑制型除草剂施用5至1000g ai/ha。
45.依照权利要求42至44任一项的方法，其中所述农作物包含至少一种重组多核苷酸，该重组多核苷酸包含编码一种或多种除草剂耐受酶的区域，该除草剂耐受酶提供升高的对该除草组合物内包含的除草剂的耐受性。
46.依照权利要求45的方法，其中所述除草剂耐受酶选自下组：HST，HPPD，EPSPS，GAT，细胞色素P450，PAT，ALS，PPGO，八氢番茄红素去饱和酶(PD)和麦草畏降解酶。
47.依照权利要求42至46任一项的方法，其中所述农作物选自下组：玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、大豆、甜菜和甘蔗。
48.HPPD抑制型除草剂的亚致死施用来提高HST抑制型除草剂的杂草控制功效的用途。
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