CN104962494B - 一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌 - Google Patents

一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌 Download PDF

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Abstract

一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌，属于生物防治技术领域，其特征在于：利用富集培养法，从黑龙江省伊春市南岔区长期施用阿特拉津的玉米地中筛选出阿特拉津降解菌株YJY4，其特征在于：菌株YJY4可以在32小时内将100mg/L的阿特拉津降解为无毒的氰尿酸；通过无机盐平板直接分离法，分离菌株YJY4；通过生理生化和16S rDNA鉴定，菌株YJY4被鉴定为Shewanella sp，该菌株YJY4可以以阿特拉津为唯一氮源生长，降解实验表明，该菌株YJY4具有良好的阿特拉津降解效果。

Description

一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌
技术领域
本发明涉及一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌，属于生物防治技术领域。
背景技术
阿特拉津(2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1，3，5-三嗪，Atrazine)是一种农田中广泛使用的三嗪类除草剂，主要用于玉米、高粱、甘蔗田阔叶杂草和禾草的防除(Johnson TA,Ellsworth TR,HudsonRJM,et al.2013.)。阿特拉津在全球范围内的使用已经超过50多年，截止到目前阿特拉津仍是应用最广泛的农业除草剂之一(AckermanF.2007.)。由于其半衰期长、迁移率高，已造成多个国家的土壤、地表水和地下水污染(李红梅,张新建,李纪顺,等.2014.)，从而对生态环境和人类饮用水源造成威胁(陈建军,何月秋,祖艳群,等.2010.；Freitas L G,Singer H,Müller S R,et al.2008.)。研究表明，长期接触低剂量的阿特拉津具有干扰人体内分泌激素的活性，目前已被作为环境科尔蒙可疑物质受到各国政府的监控(Safe S.2005.；Bianchi C L,Pirola C,Ragaini V,et al.2006.)。针对于阿特拉津污染问题，生物降解的方法具有成本低、效率高、不产生二次污染等物理法和化学法无法比拟的优势(H,Asakura,Matsuto T.2009.；董春香,姜桂兰.2001.；Cheyns K,Martin-LaurentF,Bru D,et al.2012.)。阿特拉津的生物降解途径包括三个过程：水解、脱烷基。开环，目前研究最深入的两株阿特拉津降解菌分别为Pseudomonas sp.ADP(Souza M L D,Sadowsky MJ,Wackett L P,et al.1999.)和Arthrobacter aurescens TC1(K S,N S,LP W,etal.2004.)。本研究从黑龙江省伊春市南岔区长期施用阿特拉津的玉米田土壤中分离驯化出对除草剂阿特拉津高效降解的希瓦氏菌，对希瓦氏菌对阿特拉津降解效果进行测定，以期对以后阿特拉津的生物治理工作提供理论基础。
目前，已有多种阿特拉津降解菌株被国内外研究人员从不同土壤中筛选出，如：Pseudomonas sp.ADP(Behki R M,Khan S U.1986.)、Arthrobacter sp.AD26(Q L,Y L,XZ,et al.2008.)、Bacillus sp.HB-6(Jinhua Wang,Lusheng Zhu,Qi Wang,et al.2014.)、Pseudaminobacter sp.(E T,H Z,SM N,et al.2000.)、Rhodococcus sp.(BehkiR.1993.)、Klebsiell sp.A1和Comamonas sp.A2(C Y.2010.)等，且其中大多数菌株能够利用阿特拉津为唯一氮源生长。但是，这些降解菌都受到氮抑制(王志刚,张颖,郭火生等.2014.)作用，在含有其他氮源的情况下，对阿特拉津的降解效果影响巨大。
如何寻找到一株在含有其他氮源的情况下对阿特拉津具有明显降解效果的阿特拉津降解菌成为急需解决的一大难题？所以，发明一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌，寻找到一种对除草剂阿特拉津高效降解的希瓦氏菌是必要的。
发明内容
为了克服目前发现的降解菌利用阿特拉津为唯一氮源生长则降解菌都受到氮抑制作用，在含有其他氮源的情况下，特别是对阿特拉津的降解效果影响巨大的难题，本发明提供了一个一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌(保藏编号：CGMCCNo.10859)。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌(保藏编号：CGMCCNo.10859)，具体构建及验证过程如下：
本实验所用的土样采集自黑龙江省伊春市南岔区长期施用阿特拉津的玉米田表层土(0-15厘米)。将土壤样品过20目筛以去除石块和植物碎屑，然后装入封口袋中4℃保存。
试剂：阿特拉津原药(2-氯-4-二乙胺基-6-异丙胺基-1，3，5-三嗪)(纯度≥98％)和氰尿酸(2，4，6-三羟基-1，3，5-三嗪)购自国药集团化学试剂有限公司(纯度≥98％)。其他常规试剂均为分析纯或更高纯度，用于液相色谱的试剂均为色谱级。
培养基：LB培养基：胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母粉5g，用蒸馏水定容到1L，pH7.0。无机盐培养基(MSM)：KH2PO40.9g，Na2HPO4·12H2O 6.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl0.4g，葡萄糖3g作为唯一碳源，微量元素溶液1ml(微量元素溶液(g/L)：Na2B4O7·10H2O0.4，Na2MoO4·2H2O 0.5，CuSO4·5H2O 0.8，FeSO4·7H2O 2g，MnSO4·H2O 2g，ZnSO4·7H2O10g，EDTA 5g)，按照实验需要加入适量的阿特拉津或氰尿酸。配置固体培养基时加入2％的琼脂粉。灭菌条件：120℃高压灭菌20分钟。
降解菌的富集、驯化与分离：称取5g土样加入到100mL以阿特拉津为唯一氮源的MSM液体培养基中，阿特拉津初始浓度为50mg/L，置于摇床中，30℃，150r/min振荡培养7天。7天之后将培养液以10％接种到新的以阿特拉津为唯一氮源的MSM液体培养基中，同时将阿特拉津浓度提升至100mg/mL，以此类推不断升高阿特拉津浓度。8次富集培养之后，将菌液分半稀释10-3、10-4、10-5，划线培养于含有阿特拉津的MSM固体培养基中，5天之后挑取颜色、形态不相同的菌落进行纯化。经过2个多月的驯化，观察到500mg/L阿特拉津的锥形瓶中白色沉淀大部分已经消失，且培养液趋于澄清。将阿特拉津浓度为500mg/L的培养液采用稀释平板涂布法将培养液涂布在阿特拉津MSM固体平板上，挑取颜色、形态各不相同的菌落进行纯化，并结合常规镜检方法进行分析，最终得到YJY4菌株。降解菌株的鉴定：⑴生理生化鉴定：将待测菌株接种于LB固体平板上，参照《微生物学实验》(赵斌,何绍江.2002.)和《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(second edition)》(George MG,JuliaAB,Timothy GL.2004.)进行鉴定。⑵16S rDNA鉴定：由于同一种、属间细菌的16S rDNA序列直接具有高度的保守性，所以16S rDNA序列的同源性分析通常被用作细菌之间的系统分类。以各个菌株的总DNA为模板，采用PCR技术对降解群落中的纯培养菌株进行16S rDNA序列扩增，扩增引物采取通用引物：27-F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492-R(5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)(刘春光,杨峰山,卢星忠等.2010.)。PCR反应条件为：94℃5min；94℃1min，52℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min，反应体系为25μL。扩增的产物通过试剂盒(美国Axygen公司)回收，之后与pMD19-T载体(日本TaKaRa公司)连接，转化进大肠杆菌DH5α中，送到苏州金唯智公司进行测序，得到的结果通过Genbank进行同源性比对，从而确定到其分类地位。通过16S rDNA分析，YJY4被鉴定为Shewanella sp.。
菌株YJY4降解效果测定：⑴阿特拉津的测定：将培养液与三氯甲烷1:2比例混合，在摇床中充分震荡10min，随后离心(8000rpm)6min，用移液器吸取下层液体放入圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪将液体蒸干，之后用色谱级甲醇溶解残留物，过0.22μm有机相微孔滤膜，装入进样瓶中。检测条件(王静,李迎芳,裴丽娟等.2013.)：流动相甲醇：水＝60:40(V:V)；柱温30℃；流速0.8mL/min；检测波长225nm；进样量10μL。⑵氰尿酸的测定：将培养液离心，吸取上清液，过0.22μm无机相微孔滤膜，装入进样瓶中。检测条件(Zhang Y,Jiang Z,CaoB,et al.2011.)：流动相0.005mol/L磷酸氢二钾和0.002mol/L磷酸二氢钾混合液：甲醇＝95:5(V:V)；柱温35℃；流速1mL/min；检测波长200nm；进样量20μL。
本发明的有益效果为：本发明一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌利用富集培养法，从黑龙江省伊春市南岔区长期施用阿特拉津的玉米地中筛选出阿特拉津降解菌株YJY4，此菌株YJY4可以在32小时内将100mg/L的阿特拉津降解为无毒的氰尿酸。通过无机盐平板直接分离法，分离菌株YJY4。通过生理生化和16S rDNA鉴定，菌株YJY4被鉴定为Shewanella sp.，该菌株YJY4可以以阿特拉津为唯一氮源生长，降解实验表明，该菌株YJY4具有良好的阿特拉津降解效果，而且更接近于自然界中阿特拉津的降解方式。
菌株保藏信息：
菌种分类命名：希瓦氏菌(Shewanella sp.)
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年5月25日
保藏编号：CGMCC No.10859
请求保藏人对其培养物指定的名称、株号或符号：YJY4
该培养物是否混合培养物？如是请注明其组分以及能检查各组分存在的方法：否
该培养物的培养条件、检测存活条件(培养基成分、pH、温度等)：LB培养基；PH：7-9；温度：30℃。
该培养物是否危及人类健康或动、植物病原或污染环境？请详细注明：否
该培养物由何处、何种基物分离得到：从黑龙江省宜春市南岔区长期施用阿特拉津的玉米地中分离。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1为一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌的菌株YJY4在含有/不含有阿特拉津的培养基中的生长曲线。图中，I表示YJY-4在无机盐培养基中的生长情况，II表示在含有阿特拉津的MSM中的生长情况。
图2为一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌的HPLC分析菌株YJY4的阿特拉津降解曲线和氰尿酸生成曲线图。
图3为一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌的阿特拉津的降解过程图。
图4为一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌的YJY4降解效果测定实验中氰尿酸含量变化的100mg/L标样图。
图5为一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌的YJY4降解效果测定实验中氰尿酸含量变化12小时后的结果图。
图6为一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌的YJY4降解效果测定实验中氰尿酸含量变化24小时后的结果图。
图7为一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌的YJY4降解效果测定实验中氰尿酸含量变化36小时后的结果图。
图8为一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌的YJY4降解效果测定实验中阿特拉津含量变化的100mg/L标样图。
图9为一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌的YJY4降解效果测定实验中阿特拉津含量变化12小时后的结果图。
图10为一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌的YJY4降解效果测定实验中阿特拉津含量变化24小时后的结果图。
图11为一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌的YJY4降解效果测定实验中阿特拉津含量变化36小时后的结果图。
图12为一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌的菌株YJY4中atz基因blast结果图。
图13为一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌的已发表的阿特拉津降解菌汇总及与菌株YJY4的比较图。
具体实施方式
在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
实施例一
1 材料和方法
1.1 实验仪器
Waters-600高效液相色谱-2487双通道紫外检测器(美国Waters)，KQ-500DB型数控超声波清洗仪(江苏舒美)，C1000TouchTMPCR仪(美国Bio-Rad)，Smart GelⅣ凝胶成像分析仪(北京赛智)，AllegraTM64R Centrifuge高速低温台式离心机(美国Beckman)，DHP-9162恒温培养箱(上海精宏)，HZQ-X100恒温震荡培养箱(哈尔滨东联)。
1.2 材料
1.2.1 供试土样
本实验所用的土样采集自黑龙江省伊春市南岔区长期施用阿特拉津的玉米田表层土(0-15厘米)。将土壤样品过20目筛以去除石块和植物碎屑，然后装入封口袋中4℃保存。
1.2.2 试剂
阿特拉津原药(2-氯-4-二乙胺基-6-异丙胺基-1，3，5-三嗪)(纯度≥98％)和氰尿酸(2，4，6-三羟基-1，3，5-三嗪)购自国药集团化学试剂有限公司(纯度≥98％)。其他常规试剂均为分析纯或更高纯度，用于液相色谱的试剂均为色谱级。
1.2.3 培养基
LB培养基：胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母粉5g，用蒸馏水定容到1L，pH 7.0。
无机盐培养基(MSM)：KH2PO40.9g，Na2HPO4·12H2O 6.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl0.4g，葡萄糖3g作为唯一碳源，微量元素溶液1ml(微量元素溶液(g/L)：Na2B4O7·10H2O0.4，Na2MoO4·2H2O 0.5，CuSO4·5H2O 0.8，FeSO4·7H2O 2g，MnSO4·H2O 2g，ZnSO4·7H2O10g，EDTA 5g)，按照实验需要加入适量的阿特拉津或氰尿酸。配置固体培养基时加入2％的琼脂粉。灭菌条件：120℃高压灭菌20分钟。
1.3 降解菌的富集、驯化与分离
称取5g土样加入到100mL以阿特拉津为唯一氮源的MSM液体培养基中，阿特拉津初始浓度为50mg/L，置于摇床中，30℃，150r/min振荡培养7天。7天之后将培养液以10％接种到新的以阿特拉津为唯一氮源的MSM液体培养基中，同时将阿特拉津浓度提升至100mg/mL，以此类推不断升高阿特拉津浓度。8次富集培养之后，将菌液分半稀释10-3、10-4、10-5，划线培养于含有阿特拉津的MSM固体培养基中，5天之后挑取颜色、形态不相同的菌落进行纯化。
1.4 降解菌株的鉴定
1.4.1 生理生化鉴定
将待测菌株接种于LB固体平板上，参照《微生物学实验》(赵斌,何绍江.2002.)和《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(second edition)》(George MG,JuliaAB,Timothy GL.2004.)进行鉴定。
1.4.2 16S rDNA鉴定
以各个菌株的总DNA为模板，采用PCR技术对降解群落中的纯培养菌株进行16SrDNA序列扩增，扩增引物采取通用引物：27-F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492-R(5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)(刘春光,杨峰山,卢星忠等.2010.)。PCR反应条件为：94℃5min；94℃1min，52℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min，反应体系为25μL。扩增的产物通过试剂盒(美国Axygen公司)回收，之后与pMD19-T载体(日本TaKaRa公司)连接，转化进大肠杆菌DH5α中，送到苏州金唯智公司进行测序，得到的结果通过Genbank进行同源性比对，从而确定到其分类地位。
1.5 菌株YJY4降解效果测定
1.5.1 阿特拉津的测定
将培养液与三氯甲烷1:2比例混合，在摇床中充分震荡10min，随后离心(8000rpm)6min，用移液器吸取下层液体放入圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪将液体蒸干，之后用色谱级甲醇溶解残留物，过0.22μm有机相微孔滤膜，装入进样瓶中。检测条件(王静,李迎芳,裴丽娟等.2013.)：流动相甲醇：水＝60:40(V:V)；柱温30℃；流速0.8mL/min；检测波长225nm；进样量10μL。
1.5.2 氰尿酸的测定
将培养液离心，吸取上清液，过0.22μm无机相微孔滤膜，装入进样瓶中。检测条件(Zhang Y,Jiang Z,Cao B,et al.2011.)：流动相0.005mol/L磷酸氢二钾和0.002mol/L磷酸二氢钾混合液：甲醇＝95:5(V:V)；柱温35℃；流速1mL/min；检测波长200nm；进样量20μL。
2 结果和分析
2.1 菌株YJY4的纯培养菌株分离
经过2个多月的驯化，观察到500mg/L阿特拉津的锥形瓶中白色沉淀大部分已经消失，且培养液趋于澄清。将阿特拉津浓度为500mg/L的培养液采用稀释平板涂布法将培养液涂布在阿特拉津MSM固体平板上，挑取颜色、形态各不相同的菌落进行纯化，并结合常规镜检方法进行分析，最终得到YJY4菌株。
2.2 生理生化实验鉴定
常规的细菌生理生化鉴定结果如表1所示。
表1：降解菌株YJY4的生理生化鉴定
2.3 16S rDNA基因序列分析
由于同一种、属间细菌的16S rDNA序列直接具有高度的保守性，所以16S rDNA序列的同源性分析通常被用作细菌之间的系统分类。通过16S rDNA分析，YJY4被鉴定为Shewanella sp。该菌株的16S rDNA序列的Blast结果和GenBank登录号如表2所示。
表2：YJY4菌株16S rDNA序列分类鉴定
2.4 YJY4菌株生长曲线测定
绘制YJY4菌株在以阿特拉津为唯一氮源的培养基中的生长曲线，结果如图1所示，发现菌株YJY4能够在以阿特拉津为唯一氮源的培养基中生长。菌株YJY4在含有阿特拉津的培养基中大约需要8-10小时的延迟期，延迟期内菌株生长迟缓，8-10小时后进入对数期生长。菌株YJY4在28小时后都达到最大值。
2.5 YJY4菌株的阿特拉津降解特性
2.5.1 YJY4菌株的降解能力检测
将YJY4菌株利用无菌水制备成OD600≈1.0％的菌悬液，按1％的接种量接种于含有100mg/L阿特拉津的MSM培养基中，30℃，150r/min振荡培养，每隔4h取样一次，处理样品之后通过高效液相色谱检测其阿特拉津和氰尿酸的浓度，结果如图2所示，YJY4菌株对阿特拉津有很好的降解效果，随着培养时间的不断增加，阿特拉津的浓度不断减少，在36小时内YJY4菌株可以降解99％以上的阿特拉津。此外，培养基内氰尿酸的含量也在随着培养时间的增加而增加，大约28小时后氰尿酸的浓度基本保持稳定，这说明YJY4菌株不能利用氰尿酸作为唯一氮源生长而且氰尿酸可能是YJY4菌株降解阿特拉津后的终产物。
2.5.2 YJY4菌株的阿特拉津降解特性检测
将YJY4菌株接种到以100mg/L阿特拉津为唯一氮源的MSM培养基和100mg/L氰尿酸为唯一氮源的MSM培养基中，30℃，150r/min振荡培养，48h后取样，处理样品之后通过高效液相色谱检测阿特拉津和氰尿酸的残留量，结果如表3所示，菌株YJY4可以利用阿特拉津为唯一氮源生长。高效液相色谱检测表明培养之后所有培养基内氰尿酸的含量基本保持不变，这证明菌株YJY4不能在以氰尿酸为唯一氮源的情况下生长，这解释了随着培养时间的增加，阿特拉津含量不断减少，氰尿酸不断增加的现象。
表3 YJY4菌株利用阿特拉津和潜在代谢产物的能力
目前，已有多种阿特拉津降解菌株被国内外研究人员从不同土壤中筛选出，如：Pseudomonas sp.ADP(Behki R M,Khan S U.1986.)、Arthrobactersp.AD26(Q L,Y L,X Z,et al.2008.)、Bacillus sp.HB-6(Jinhua Wang,Lusheng Zhu,Qi Wang,et al.2014.)、Pseudaminobactersp.(E T,H Z,SM N,et al.2000.)、Rhodococcussp.(Behki R.1993.)、Klebsiellsp.A1和Comamonas sp.A2(C Y.2010.)等，且其中大多数菌株能够利用阿特拉津为唯一氮源生长。但是，这些降解菌都受到氮抑制(王志刚,张颖,郭火生等.2014.)作用，在含有其他氮源的情况下，对阿特拉津的降解效果影响巨大。本实验筛选出的阿特拉津降解菌株YJY4可以在32小时内将阿特拉津彻底降解为无毒无害的氰尿酸，与上述以阿特拉津为唯一氮源生长的阿特拉津降解菌相比，具有明显的降解优势和实际价值。所以，阿特拉津降解菌株YJY4是一种重要的阿特拉津生物修复手段。本实验通过富集培养法，从长期使用阿特拉津的田地中分离得到可以高效降解阿特拉津的菌株YJY4，该菌株YJY4在32小时内能将100mg/L的阿特拉津基本降解完全。通过分离培养，对菌株YJY4的作用底物进行检测，发现菌株YJY4可以在以阿特拉津为唯一氮源的情况下生长。根据生理生化鉴定和16S rDNA序列分析，将菌株YJY4鉴定为Shewanella sp.，保藏编号：CGMCC No.10859。菌株YJY4同时具有降解其他三氮苯类除草剂的潜力，为三氮苯类除草剂的生物修复的后续工作提供实践依据。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。

Claims (1)

1.一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌，利用富集培养法，从黑龙江省伊春市南岔区长期施用阿特拉津的玉米地中筛选出阿特拉津降解菌株YJY4，其特征在于：菌株YJY4可以在32小时内将100mg/L的阿特拉津降解为无毒的氰尿酸；通过无机盐平板直接分离法，分离菌株YJY4；通过生理生化和16S rDNA鉴定，菌株YJY4被鉴定为Shewanellasp.，菌株YJY4可以以阿特拉津为唯一氮源生长，降解实验表明，该菌株YJY4具有良好的阿特拉津降解效果，而且更接近于自然界中阿特拉津的降解方式；
菌株保藏信息：
菌种分类命名：希瓦氏菌(Shewanella sp.)；
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
保藏日期：2015年5月25日；
保藏编号：CGMCC No.10859。
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