CN113880928A

CN113880928A - 一种紫花苜蓿胚胎发育晚期蛋白MsLEA1及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN113880928A
Application number: CN202111159468.1A
Authority: CN
Inventors: 安渊; 吕爱敏; 樊娜娜; 高鲤; 徐蕊
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2041-09-30
Also published as: CN113880928B

Abstract

本发明公开了一种紫花苜蓿胚胎发育晚期蛋白MsLEA1及其编码基因和应用，涉及植物基因工程领域，通过构建含有蛋白MsLEA1的编码基因的表达载体，并转化植物宿体，培育筛选得到转基因植株，本发明利用基因工程技术调控紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA1基因表达，从而提高了紫花苜蓿耐铝、抗旱性，为紫花苜蓿新品种的培育工作提供了重要的理论依据，具有很大的应用价值。

Description

一种紫花苜蓿胚胎发育晚期蛋白MsLEA1及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA1及其编码基因和应用。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是多年生豆科牧草，因其生长迅速、适口性好、营养价值高，被誉为‘牧草之王’，在畜牧业生产中具有重要作用。而干旱、盐胁迫是北方紫花苜蓿生长的主要限制因子；酸性土壤中高活性铝离子(Al³⁺)对苜蓿产生的毒害作用是南方苜蓿种植的主要限制因素。

胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogensis abundant proteins，LEA蛋白)是一类重要的逆境响应蛋白，参与调控植物响应逆境胁迫过程，增强植物的抗逆能力。LEA蛋白以分子伴侣的形式保护蛋白、酶活、核酸、磷脂结构等，提高转基因植物的抗逆能力。目前，有关LEA蛋白参与植物铝胁迫响应的研究报道相对空白。

因此，利用基因工程技术调控紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1基因表达，从而提高紫花苜蓿耐铝、抗旱性，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于填补紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA1基因的克隆、表达模式以及紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1蛋白的空白；

本发明提供了一种紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA1，所述蛋白包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1蛋白特征的蛋白质。

另一方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。

优选的，所述核酸序列具体为：(a)碱基序列如SEQ ID NO.1第1～600位所示；或(b)与SEQ ID NO.1第1～795位所示的核酸有至少70％的同源性的序列。

在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。

在本发明中，术语“紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白编码基因”指编码具有紫花苜蓿‘WL525’蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示的第1～600位核苷酸序列及其简并序列。

所述简并序列是指，位于SEQ ID NO.1所示的第1～600位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1所示的第1～600位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所示的序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的同源性至少70％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码天然紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA1的相同功能、SEQ ID NO.1所示序列的变异形式。

所述变异形式包括(但并不限于)：通常为1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加为60个以内核苷酸。

在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1基因产物的表达模式，即分析紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，根据本发明的紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1基因相关同源基因或同源蛋白。

本发明的紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

本发明还提供一种重组表达载体，包含所述紫花苜蓿胚胎发育晚期蛋白MsLEA1的编码基因SEQ ID NO.1所示序列、简并序列或变异形式。

优选的，所述重组表达载体为pHB-Flag-MsLEA1。

所述重组表达载体pHB-Flag-MsLEA1的制备方法为将MsLEA1的基因插入到质粒pHB-Flag上的BamHI与SpeI限制性酶切位点之间。

本发明还提供一种重组菌，其特征在于，通过将所述重组表达载体转化宿主细胞而获得。

优选的，所述宿主细胞为农杆菌GV3101。

本发明所述任一紫花苜蓿胚胎发育晚期蛋白MsLEA1的编码基因，重组表达质粒或重组菌在提高紫花苜蓿耐铝毒及抗旱中的应用。

本发明的优点在于：首次克隆紫花苜蓿‘WL525’干旱、铝胁迫过程中的重要响应蛋白MsLEA1的编码序列，并采用荧光实时定量PCR的方法分析MsLEA1基因的表达模式，烟草叶片表皮细胞瞬时表达分析MsLEA1蛋白的定位，为今后利用基因工程技术调控MsLEA1基因的时空表达，从而提高紫花苜蓿耐铝、抗旱性、新品种选育方面提供了理论依据，具有很大的应用价值。

附图说明

图1为本发明的紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1基因与蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)、大豆(Glycine max L.)LEA蛋白序列的同源比较结果(DNAMAN)和同源基因的进化树分析；

图2为紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1蛋白在烟草叶片表皮细胞中定位；

图3为紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1基因在非生物胁迫过程中的表达量变化；

图4为野生型与超表达MsLEA1基因的紫花苜蓿在铝胁迫下表型；

图5为野生型与超表达MsLEA1基因的紫花苜蓿在干旱胁迫下表型。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照使用试剂说明书所建议的条件。

实施例1、紫花苜蓿MsLEA1基因的克隆

1.植物材料的获得

取正常生长的紫花苜蓿‘WL525’的叶片组织，提取RNA；

2.RNA的抽提

用北京全式金生物公司“TransZol Up植物总RNA提取试剂盒”抽提总RNA，凝胶电泳鉴定RNA的完整性，分光光度计(Nanodrop 2000)测定RNA的纯度及浓度；

3.基因的全长克隆

根据实验室前期转录组分析提供的核酸序列及蛋白功能注释结果，获得紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1基因全长。

将提取的RNA进行反转录(TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix)，获得cDNA。以第一链cDNA为模板，利用引物MsLEA1-F(5'-TCAACAATGGCATCATTTACCC-3')和MsLEA1-R(5'-AAATTAGCATATCCAATAAA-3')进行PCR，扩增得到750bp片段，回收并连pMD18-T载体，用M13-47和RV-M作为通用引物，送上海生工测序。

将测序结果结合NCBI的ORF Finding(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf)预测，发现了紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1基因的ORF阅读框。扩增得到600bp紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.1)。测序结果在NCBI网站进行BLAST比对数据库(GenBank,http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，其核酸序列及编码蛋白与已知的蒺藜苜蓿、大豆的LEA基因的同源性很高，初步认为它是一个LEA基因。

实施例2、紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1基因的序列信息与同源性分析

本发明的紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1全长开放读码框序列为600bp，详细序列见SEQID NO.1所示序列。根据开放读码框序列推导出紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1蛋白的氨基酸序列，共199个氨基酸，分子量为21.02kDa，等电点(pI)为8.98，详细序列见SEQ ID NO.2所示序列。

将紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1的开放读码框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在NCBI中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与蒺藜苜蓿LEA基因在氨基酸水平相似性极高，如图1A所示。进化树分析显示紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1蛋白与其它已知物种的LEA蛋白存在较高的同源性。

实施例3、紫花苜蓿MsLEA1蛋白烟草叶片亚细胞定位分析

分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物MsLEA1-F(5'-CGGGATCCATGGCATCATTTACCCTTGT-3')、MsLEA1-R(5'-GGACTAGTATTCTTTTTGTTCATGTTC-3')，并在基因全长序列两侧分别引入BamHI与SpeI酶切位点。将带有酶切位点目的片段质粒与pHB-YFP双元转化载体进行BamHI与SpeI双酶切，回收酶切后的pHB载体与MsLEA1片段，T4连接酶在16℃连接12-14h，并将重组载体转化农杆菌GV3101。

将经鉴定的GV3101菌株，接种于5mL YEP(含Kan 50mg/L)中，28℃180rpm培养至OD600为0.5左右；取菌液1mL加入50mL YEP液体培养基中，28℃培养至OD600为0.5左右；取10mL菌液，4000rpm离心10min；用MS液体培养基悬浮菌体至OD600约为0.6，并加入AS和MES，室温放置3h；注射烟草叶片，暗培养48h，于激光共聚焦显微镜，514nm激发波长下进行观察(图2)。

实施例4、紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1基因在铝、干旱、盐处理下的表达变化

1.材料的获得：对紫花苜蓿‘WL525’铝、干旱、盐处理，分别于0h、0.5h、1h、3h、6h、9h、12h和24h进行取样。将样品分别用铝铂纸包好后放入液氮，然后转入-80℃超低温冰箱中贮存待用；

2.RNA的提取、RNA的完整性、纯度、浓度的测定及cDNA的获得参照实施例1；

3.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在各组织中的表达量，根据已经获得的紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1基因序列，设计用于Real-time PCR中MsLEA1基因定量分析的特异性引物，引物qMsLEA1-F(5’-CAAACAAGGAGCAGGAGTCAG-3’)，引物qMsLEA1-R(5’-CACTGTCAGCAGCATTACTGG-3’)，内参基因EF-α引物为EF-F(5’-GCACCAGTGCTCGATTGC-3’)，EF-R(5’-TCGCCTGTCAATCTTGGTAACAA-3’)；

4.目的基因及内参基因的标准曲线：用ddH2O将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-timePCR扩增，绘制溶解曲线和标准曲线；分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的PCR扩增产物；通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数；

5.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析：以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参照基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Bio-Rad CFX实时荧光定量仪进行Real-time PCR反应，反应体系为20μL，反应程序：94℃预变性20s，94℃15s；55℃15s；72℃15s；40个cycles。

6.采用2-△△Ct法作相对定量分析，结果表明在多种非生物胁迫下，紫花苜蓿‘WL525’MsLEA1表达水平显著上升(图3)。

实施例5、MsLEA1基因转化紫花苜蓿

1.构建植物表达载体

引入的酶切位点参照实施例3。将带有酶切位点目的片段质粒与pHB-Flag双元转化载体进行BamHI与SpeI双酶切，回收酶切后的pHB-Flag载体与MsLEA1片段，用T4连接酶16℃连接过夜，并将载体转化农杆菌GV3101。

2.转化紫花苜蓿

(1)预摇农杆菌：挑阳性单克隆至5mL含50mg/L Kan、50mg/L庆大霉素、25mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养24h；

(2)扩繁农杆菌：将预摇的农杆菌菌液以1:100扩培至含相同抗性YEP培养基中，28℃，200rpm，培养13-16h，培养至OD600达0.6左右，18℃，3500rpm，15min集菌；

(3)叶片法转化紫花苜蓿：用SM4液体培养基重悬菌体至OD600＝0.2-0.4。将叶片剪成约0.5cm2的小块，放入重悬液，抽真空10min，超声1min，抽真空10min；于无菌滤纸上晾干，然后将侵染后的叶片放在SM4共培养培养基中于黑暗处培养5d。将共培养5d后的叶片转移至SM4筛选培养基，光下培养30d，每2周继代一次。转移至相同抗性的MSBK培养基上培养2周。转移至MSS培养基，生长6-8周。转移至MSR生根培养基直至长成完整植株(详细的转化过程参照Agrobacterium Protocols-Methods in Molecular Biology 1223)。

3.转基因阳性株系的筛选

提基因组DNA、RNA鉴定阳性植株。

实施例6、超表达MsLEA1苜蓿铝胁迫、干旱胁迫分析

铝处理：将生长状态一致的野生型和转基因植株的茎剪成4-5cm的小段(含有茎结和小芽点)，扦插在1/2Hoagland’s(pH5.8)营养液中，每隔2d换一次营养液，直至长出第一片新叶(约15d)；将营养液换成1/2Hoagland’s(pH4.5)适应生长2d；然后移入1/2Hoagland’s(pH4.5)、1/2Hoagland’s+100μM Al(pH4.5)营养液，进行铝处理，分别于1d、3d、6d取样测定相应生理指标(图4)。

干旱处理：将生长状态一致的野生型和转基因紫花苜蓿茎剪成4-5cm的小段(含有茎结、小芽点)，扦插在蛭石：草炭体积比为1:2的基质中，培养至生长状态一致，约30d后进行干旱处理，取样测定相应生理指标(图5)。以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种紫花苜蓿胚胎发育晚期蛋白MsLEA1，其特征在于，所述蛋白MsLEA1包括如SEQID NO.2所示的氨基酸序列多肽，以及所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过缺失、插入和/或取代氨基酸且具有MsLEA1蛋白功能的变异形式多肽。

2.一种编码权利要求1所述紫花苜蓿胚胎发育晚期蛋白MsLEA1的编码基因，其特征在于，所述编码基因包括如核苷酸序列SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列、所述核苷酸序列SEQID NO：1的简并序列、变异序列、以及能与所述核苷酸序列SEQ ID NO：1杂交的序列。

3.根据权利要求2所述的紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA1的编码基因，其特征在于，所述简并序列与所述核苷酸序列SEQ ID NO：1所示的第1～600位核苷酸序列具有至少70％的同源性。

4.根据权利要求2所述的紫花苜蓿‘WL525’胚胎发育晚期蛋白MsLEA1的编码基因，其特征在于，所述变异序列包括与所述序列SEQ ID NO：1相比存在1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加1～60个核苷酸而形成的序列。

5.一种重组表达载体，其特征在于包含权利要求2所述紫花苜蓿胚胎发育晚期蛋白MsLEA1的基因。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pHB-Flag-MsLEA1。

7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体pHB-Flag-MsLEA1的制备方法为将MsLEA1的基因插入到质粒pHB-Flag上的BamHI与SpeI限制性酶切位点之间。

8.一种重组菌，其特征在于，通过将权利要求5所述重组表达载体转化宿主细胞而获得。

9.根据权利要求8所述的一种重组菌，其特征在于，所述宿主细胞为农杆菌GV3101。

10.根据权利要求2～4所述任一紫花苜蓿胚胎发育晚期蛋白MsLEA1的编码基因，权利要求5～7所述任一重组表达载体或权利要求8或9重组菌在提高紫花苜蓿耐铝毒及抗旱中的应用。