CN107619436A - 一种抗逆蛋白及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种分离的蛋白，所述蛋白在植物体内的表达水平与所述植物的抗逆性相关，所述蛋白为如下（1）或（2）蛋白质；（1）氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的蛋白质；（2）与（1）蛋白质具有至少80%同源性、且具有（1）蛋白质功能的蛋白质。该蛋白质可以用于提高植物，特别是饲草植物的抗逆性，增加饲草植物的经济效益。

Description

一种抗逆蛋白及其编码基因

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种抗逆蛋白及其编码基因。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa.)是非常重要的饲用草种，为豆科多年生草本植物，具有发达的根茎和匍匐茎，生长速度快、再生能力强、耐热、耐践踏、质地纤细、色泽好，适口性好，蛋白质含量高等优点，作为一种优质的植物性蛋白资源，因其独特的氮素利用方式，与禾谷类作物相比它可以大大提高粗蛋白的产出，是解决奶业发展中蛋白饲料资源短缺的重要途径和有效方法。

脱水素(dehydrin)属于LEA-Ⅱ家族，是植物体内的一种具有高度热稳定性、亲水性的LEA 蛋白(late embryogensis abundant proteins)，能够在植物胚胎发育后期以及逆境下大量表达，广泛存在于植物界。它能在植物处于干旱等逆境条件下表达，其在逆境下表达的强弱与植物抗逆能力有密切联系，在抗性植株中的表达量要高于对逆境敏感的植株。由此显示，它与植物的抗旱性有着密切的关系。

脱水素的编码基因已从多种植物中克隆出来，包括：拟南芥、水稻、大麦、橡树、红海榄等。但对于饲草植物脱水素的克隆、表达模式及蛋白序列尚不清楚。目前，未有任何与紫花苜蓿脱水素编码基因序列相关的文献报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗逆蛋白及其编码基因，以用于提高植物，特别是饲草植物的抗逆性。

第一方面，本发明提供了一种分离的蛋白质，所述蛋白质为如下(1)或(2)的蛋白质； (1)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的蛋白质；(2)与(1)中蛋白质具有至少80％同源性、且具有(1)中蛋白质功能的蛋白质。

于本发明的一个实施例中，所述蛋白质在植物体内的表达水平与所述植物的抗逆性相关。

于本发明的一个实施例中，所述抗逆性包括耐Al胁迫和/或耐盐胁迫。

于本发明的一个实施例中，所述植物具体为紫花苜蓿。

第二方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码如第一方面所述的蛋白质。

于本发明的一个实施例中，所述多核苷酸具体为SEQ ID NO：1中的1～630位所示的多核苷酸。

第三方面，本发明提供了一种重组表达载体，包含如第二方面所述分离的多核苷酸。

第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如第三方面所述重组表达载体或基因组中整合有外源的如第二方法所述分离的多核苷酸。

第五方面，本发明提供了如第一方面所述蛋白质的制备方法，选自以下之任一：(1)利用化学合成方法合成所述蛋白质；(2)在合适的条件下培养如第四方面所述宿主细胞，使之表达所述蛋白质，而后分离及纯化获得所述蛋白质。

第六方面，本发明提供了如第一方面所述蛋白质或其编辑基因在培育抗逆植物中的用途。

第七方面，本发明提供了一种用于检测植物体内如第二方面所述多核苷酸表达量的引物对，所述引物对中的上游引物如SEQ ID NO：5所示，所述引物对中的下游引物如序列SEQ ID NO：6所示。

第八方面，本发明提供了一种提高植物抗逆能力的方法，包括如下步骤：(a)将第三方面所述的重组表达载体导入所述植物；或(b)将第二方面所述的多核苷酸整合至所述植物的基因组中。

于本发明的一个实施例中，所述步骤(a)包括如下步骤：将所述重组表达载体转化农杆菌；将含有所述重组表达载体的农杆菌转化所述植物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

分离了一种抗逆蛋白及其编码基因，该抗逆蛋白在植物体内的表达水平与该植物的抗逆性相关，可以用于提高植物，特别是饲草植物的抗逆性，增加饲草植物的经济效益。

附图说明

图1为本发明的紫花苜蓿“WL-525HQ”MsDHN1基因与蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)Dehydrin基因mRNA的核苷酸序列的同源比较结果；

图2为本发明的紫花苜蓿“WL-525HQ”蛋白与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)dehydrin 蛋白的氨基酸序列的同源比较(FASTA)结果，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

图3a为紫花苜蓿“WL-525HQ”和“WL-440HQ”的根组织中MsDHN1基因在Al胁迫下的表达量变化；

图3b为紫花苜蓿“WL-525HQ”和“WL-440HQ”的叶组织中MsDHN1基因在Al胁迫下的表达量变化；

图4为紫花苜蓿“WL-525HQ”MsDHN1阳性单克隆菌斑PCR验证；

图5a为野生型与MsDHN1转基因拟南芥在Al胁迫下的表型观察结果；

图5b为野生型与MsDHN1转基因拟南芥在Al胁迫下的植株根长；

图6a为野生型与MsDHN1转基因拟南芥在100mM盐胁迫下表型观察结果；

图6b为野生型与MsDHN1转基因拟南芥在200mM盐胁迫下表型观察结果；

图6c为野生型与MsDHN1转基因拟南芥在300mM盐胁迫下表型观察结果；

图7a为野生型与MsDHN1转基因拟南芥在不同浓度盐胁迫下的表型观察结果；从上到下依次盐浓度依次为0mM、80mM、100mM；

图7b为野生型与MsDHN1转基因拟南芥在不同浓度盐胁迫下的植株根长；从左至右盐浓度依次为0mM、80mM、100mM。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress， San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

本发明实施例的目的在于填补紫花苜蓿“WL-525HQ”脱水素基因MsDHN1的克隆、表达模式分析以及基因的功能分析的空白。

本发明实施例提供了一种分离的蛋白，所述蛋白质为如下(1)或(2)的蛋白质；(1)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的蛋白质；(2)与(1)中蛋白质具有至少80％同源性、且具有(1)中蛋白质功能的蛋白质。

SEQ ID NO：4所示序列具体为：

MAEENQNKYEETTATNSETE IKDRGVFDFLGGKKKDEEHIKPQEDAVATDFSHKVTLYEAPSETKVEEKEEGEKKHTSLLEK LHRSDSSSSSSSEEEVDGERRKKKKKEKKEKKEDTSVPVEKVDVVDGTTASTEEKKGFLDKIKEKLPGHKKTDDVTTPPPVVVAPAVPSAETTTTTASHDQGEKKGILEKIKEKIPGYHPKTATEHEDNKDHHKDETTSH*。

具体的，所述(2)中的蛋白质具体指：氨基酸序列如SEQ ID No：4所示的蛋白质经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50个，也可以是1-30个，也可以是1-20个，也可以是1-10个，也可以是1-5个，也可以是1-3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个，也可以是1-30个，也可以是1-20个，也可以是1-10个，也可以是1-5个，也可以是1-3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸序列如SEQ ID： 4所示的蛋白质功能的蛋白质。所述(2)中的蛋白质的氨基酸序列可与SEQ ID No：4可具有80％以上同源性；在一个例子中，可具有85％以上同源性；在一个例子中，可具有90％以上同源性；在一个例子中，可具有93％以上同源性；在一个例子中，可具有95％以上同源性；在一个例子中，可具有97％以上同源性；在一个例子中，可具有99％以上同源性。

具体地，所述蛋白质在植物体内的表达水平与所述植物的抗逆性相关。

更具体地，蛋白在植物体内的表达水平与所述植物的耐Al胁迫和/或耐盐胁迫相关。在一个例子中，所述植物具体为紫花苜蓿。更具体地，所述紫花苜蓿为紫花苜蓿“WL-525HQ”。

可以从紫花苜蓿“WL-525HQ”的组织中分离出该蛋白。紫花苜蓿“WL-525HQ”是紫花苜蓿中最为耐Al的品种之一。通过蛋白免疫印迹和基因表达分析，确定脱水素Dehydrin-0037 与紫花苜蓿“WL-525HQ”耐Al密切相关。

本发明实施例提供的蛋白属于一种脱水素蛋白，具体为Dehydrin-0037。

本发明实施例还提供了如上文所述蛋白质的制备方法，选自以下之任一：(1)利用化学合成方法合成所述蛋白质；(2)在合适的条件下培养如第四方面所述宿主细胞，使之表达所述蛋白质，而后分离及纯化获得所述蛋白质。

利用化学方法合成可以采用固相技术，通过直接合成肽而加以生产。在体外合成该蛋白可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City， CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。在本发明实施例中可以通过化学合成将突变引入本发明实施例提供的蛋白的序列中。

本发明实施例还提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码如上文所述的蛋白质。所述多核苷酸可以从紫花苜蓿“WL-525HQ”的组织中提取出来。所述多核苷酸具体为MsDHN1基因。

在一个示例中，所述多核苷酸具体为SEQ ID NO：1中的1～630位所示的多核苷酸。SEQ ID NO：1所示序列具体为：

ATGGCTGAGGAGAATCAGAACAAGTACGAGGAAACCACCGCAACCAACTCTGAAACAGAGATCAAAGACAGGGGTGTTTTTGATTTTCTAGGTGGTAAGAAAAAGGATGAAGAACATATTAAGCCTCAAGAGGATGCTGTTGCAACTGATTTTAGTCACAAGGTGACTTTGTATGAAGCTCCATCAGAGACCAAAGTAGAAGAAAAAGAAGAAGGTGAAAAGAAACACACCAGCCTCTTGGAGAAACTTCACCGATCTGATAGCTCTTCAAGCTCTTCGAGTGAGGAGGAAGTTGATGGAGAGAGGAGGAAAAAGAAGAAGAAAGAAAAGAAGGAGAAGAAGGAGGACACATCAGTGCCAGTAGAGAAAGTTGATGTTGTTGATGGAACAACAGCAAGCACTGAAGAGAAGAAAGGTTTCCTGGACAAAATTAAGGAGAAGCTTCCAGGACACAAGAAAACTGACGATGTAACAACTCCACCACCTGTTGTTGTTGCTCCTGCTGTGCCATCTGCTGAGACAACAACAACAACAGCTAGTCATGATCAAGGAGAGAAGAAAGGTATTTTGGAAAAGATCAAAGAGAAGATACCTGGTTATCACCCTAAGACTGCTACTGAACATGAAGACAACAAAGATCATCACAAGGATGAGACTACTTCTCATTGA。

发明人通过Al胁迫下紫花苜蓿基因芯片分析，获得了一个新基因的EST序列，它与蒺藜苜蓿SK3型脱水素蛋白基因相似性极高，表明该基因编码脱水素蛋白。RT-PCR结果证明，该基因随着Al胁迫程度的增大而表达量升高，在紫花苜蓿“WL-525HQ”中的表达量显著高于 Al敏感紫花苜蓿品种中的表达量，由此显示了该脱水素基因在紫花苜蓿“WL-525HQ”的耐Al 胁迫的过程中起到了重要的作用。

在本发明实施例中紫花苜蓿“WL-525HQ”的MsDHN1基因相关核苷酸全长序列或其片段可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明实施例所记载的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

此外，可以根据本发明实施例记载的的紫花苜蓿“WL-525HQ”的MsDHN1核苷酸序列，在核酸同源性或基础上，筛选紫花苜蓿“WL-525HQ”的MsDHN1相关同源基因。

在一个示例中，所述SEQ ID NO：1中的1～630位所示的多核苷酸通过包括如下步骤的方法获得：以紫花苜蓿的cDNA为模板进行PCR扩增，所述PCR扩增的上游引物如序列SEQID NO：2所示，具体为：5'-ATGGCTGAGGAGAATCAGAACA-3'；所述PCR扩增的下游引物如序列SEQ ID NO：3所示，具体为5'-TCAATGAGAA GTAGTCTCAT CCTTG-3'。

需要说明的是，在本发明实施例中，“分离的多核苷酸”、“纯化的多核苷酸”可以是指，该多核苷酸已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，也可以指该多核苷酸已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。

在本发明实施例中，可用实时荧光定量PCR的方法分析紫花苜蓿“WL-525HQ”的组织中 MsDHN1基因产物的表达模式，即分析MsDHN1基因的mRNA转录物在紫花苜蓿“WL-525HQ”组织细胞中是否存在以及存在的数量。

可以用探针与PCR扩增产物进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。其中，PCR扩增引物对应于紫花苜蓿“WL-525HQ”的MsDHN1相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15～50个核苷酸。

本发明实施例提供了一种用于检测植物体内如上文所述的多核苷酸表达量的引物对，所述引物对中的上游引物如SEQ ID NO：5所示，具体为5′ -AGAAGGAGGACACATCAGTGC-3′；所述引物对中的下游引物如序列SEQ ID NO：6所示，具体为5′-GGAGCAACAACAACAGGTGG-3′。

当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明实施例提供了一种重组表达载体，包含如上文所述分离的多核苷酸。

本发明实施例提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上文所述重组表达载体或基因组中整合有外源的如第二方法所述分离的多核苷酸。

本发明实施例提供了如上文所述蛋白质在培育抗逆植物中的用途。

本发明实施例提供了一种提高植物抗逆能力的方法，包括如下步骤：(a)将如第四方面所述的重组表达载体导入所述植物；或(b)将如第二方面所述的多核苷酸整合至所述植物的基因组中。

在一个示例中，所述步骤(a)包括如下步骤：将所述重组表达载体转化农杆菌；将含有所述重组表达载体的农杆菌转化所述植物。

本发明实施例公开了紫花苜蓿“WL-525HQ”脱水素基因MsDHN1核酸序列在紫花苜蓿紫花苜蓿“WL-525HQ”的AL胁迫过程中的表达模式，为今后利用基因工程技术对MsDHN1基因表达的时空特性进行调控，从而为提高紫花苜蓿耐AL胁迫能力与育种工作提供了理论依据，具有很大的应用价值。

紫花苜蓿“WL-525HQ”作为常用饲草，应用极为广泛，其市场需求也很大。本发明实施例首次克隆紫花苜蓿“WL-525HQ”在AL胁迫过程中的保护性蛋白Dehydrin-0037的编码序列，并采用荧光实时定量PCR的方法分析MsDHN1基因的表达模式，为今后利用基因工程技术调控MsDHN1基因的时空表达，从而为提高饲草抗旱性、新品种选育方面提供了理论依据，具有很大的应用价值。

下文以具体实施例对本发明实施例的技术方案进行更具体地说明。

实施例1、紫花苜蓿“WL-525HQ”MsDHN1基因的克隆

11.植物材料的获得

取紫花苜蓿“WL-525HQ”叶片组织，用于提取RNA；

12.RNA的抽提

用北京全式金生物公司的植物总RNA提取试剂盒抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定 RNA的完整性，然后在分光光度计(Thermo Scientific NANODROP1000Spectrophotometer) 上测定RNA的纯度及浓度；

13.基因的全长克隆

根据紫花苜蓿“WL-525HQ”AL胁迫基因芯片结果分离得到的EST序列及蛋白功能注释结果，获得紫花苜蓿“WL-525HQ”MsDHN1基因核心片段。蒺藜苜蓿的基因组已经测序，根据两者之间的相似性，直接PCR获得cDNA全长。

将提取的RNA进行反转录(Prime ScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit:宝生物工程 (大连)有限公司)，以第一链cDNA为模板，利用引物DHN-F(序列如SEQ ID NO：2所示，具体为5'-ATGGCTGAGGAGAATCAGAACA-3')和DHN-R(序列如SEQ ID NO：3所示，具体为5'-TCAATGAGAA GTAGTCTCAT CCTTG-3')进行PCR扩增，得到长度为669bp 的MsDHN1基因片段，序列如SEQ ID NO：1所示。回收MsDHN1基因片段并连接到pMD18-T Simple vector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，进行测序，测序结果通过在NCBI 网站进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对已有的数据库(GenBank)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的大豆、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)Dehydrin基因的同源性很高，可以初步认为扩增得到的MsDHN1基因是一个Dehydrin基因。其中，扩增得到的MsDHN1 基因和蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)Dehydrin基因mRNA的核苷酸序列的同源比较结果如图1所示。

实施例2、紫花苜蓿“WL-525HQ”MsDHN1基因的序列信息与同源性分析

本发明实施例的紫花苜蓿“WL-525HQ”MsDHN1基因全长开放读码框序列为669bp，详细序列见SEQ ID NO：1所示序列。根据开放读码框序列推导出紫花苜蓿“WL-525HQ”MsDHN1蛋白的氨基酸序列，共222个氨基酸残基，分子量为24.87kDa，等电点(pI)为5.63，详细序列见SEQ ID NO：4所示序列。

将紫花苜蓿“WL-525HQ”MsDHN的开放读码框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与蒺藜苜蓿Dehydrin基因(MTR_3g117290)在核苷酸水平上具有86.81％的相同性，如图1所示；在氨基酸水平上，它与蒺藜苜蓿Dehydrin基因也有83.48％相似性，如图2所示。由此可见，紫花苜蓿“WL-525HQ”MsDHN基因与其它已知物种的Dehydrin基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。

实施例3、紫花苜蓿“WL-525HQ”MsDHN1基因在Al胁迫不同阶段的表达差异性

31.材料的获得：对紫花苜蓿“WL-525HQ”Al胁迫不同阶段(0h、3h、6h、12h、24h) 材料的叶片进行取样。将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用；

32.RNA的提取：利用RNA prep pure植物总RNA提取(北京全式金)；提取紫花苜蓿“WL-525HQ”不同样品组织中的总RNA；

33.RNA的完整性、纯度、浓度的确定：用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.2％；0.5×TBE 电泳缓冲液；150v，15min)检测完整性，电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则表示rRNA样品的降解；纯度较好的RNA，A260/A280以及A260/A230 约为2.0左右，用分光光度计测定OD值并计算RNA含量；

34.cDNA的获得：以500ng的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用；

35.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在各器官与组织中的表达量，根据已经获得的紫花苜蓿“WL-525HQ”MsDHN1基因序列，利用引物设计软件设计用于Real-time PCR中MsDHN1基因定量分析的特异性引物，上游引物和下游引物分别为qDHN-F(SEQ ID NO：5所示，具体为5′-AGAAGGAGGACACATCAGTGC-3′)和qDHN-R(SEQ ID NO：6所示，具体为5′-GGAGCAACAACAACAGGTGG-3′)；内参基因为EF延伸因子基因，引物为EF-F(SEQ IDNO：7所示，具体为5′-GCACCAGTGCTCGATTGC-3′) 和EF-R(SEQ ID NO：8所示，具体为5′-TCGCCTGTCAATCTTGGTAACAA-3′)；

36.制作目的基因及内参基因的标准曲线：用EASY Dilution(试剂盒提供)将标准品 cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-time PCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线；分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的 PCR扩增产物；通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数；

37.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析：以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参照基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-time PCR反应在BIO-RAD Chromo 4实时定量仪上进行，反应体系为20μL，反应采用三步法，94℃变性20s，接着40个循环：94℃ 15s；58℃ 15s；72℃ 25s；每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生；

38.采用2-ΔΔCt法作相对定量分析，结果表明紫花苜蓿“WL-525HQ”随着Al胁迫时间的增长，其MsDHN1表达水平显著上升。具体如图3a和图3b所示。从图3b可知，紫花苜蓿“WL-525HQ”叶片在Al胁迫的12小时表达水平为对照植株的3倍。如图3a可知，紫花苜蓿“WL-525HQ”根部在Al胁迫的6小时表达水平为对照植株的2倍，说明该基因Al胁迫响应显著相关，具有明显的时空差异性。

实施例4、紫花苜蓿“WL-525HQ”MsDHN1基因转化模式植物拟南芥

41.构建转化载体

分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物：MsDHN1-BaF(SEQ ID NO：9所示，具体为5′-CGGGATCCATGGCTGAGGAGAATCAGAACA-3′)和MsDHN1-SpR(SEQ ID NO：10所示，具体为5′-GGACTAGTTCAATGAGAAGTAGTCTCATCCTTG-3′)。并在基因全长序列两侧分别引入Bam HI与Spe I酶切位点，以紫花苜蓿“WL-525HQ”cDNA为模板进行PCR。回收PCR产物并连接到pMD18-T Simple vector载体上，挑取单克隆菌斑进行PCR验证。提取阳性克隆菌液质粒。将目的片段质粒与PHB双元转化载体进行Bam HI 与Spe I双酶切，回收酶切后的PHB载体与MsDHN1片段，应用T4连接酶在16℃水浴中将 Dehydrin-L与PHB载体连接过夜构建转化载体，并将载体转化农杆菌GV3101。载体转化后的农杆菌GV3101涂布于Kan抗性YEP固体培养基，培养后，对单克隆进行菌落PCR，PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示。

42.MsDHN1转化拟南芥

421.预摇农杆菌：挑阳性单克隆至25ml含50mg/L Kan、50mg/L庆大霉素、25mg/LRif的YEP液体培养基中，28℃，200rpm摇菌24h；

422.扩培农杆菌：将预摇的农杆菌菌液以1:100扩培至400mL Kan抗性YEP培养基中， 28℃，200rpm，培养13-16h，培养至吸光度OD600达到1.5-2.0之间收菌，收菌条件是23℃， 5000rpm，8min；

423.转化植株：(需要在转化前一天或是转化当天剪去植株上所有的角果和盛开以及露白的小花)配制500mL含5％蔗糖的1/2MS溶液，用少量MS溶液将收集的农杆菌沉淀悬起，摇匀，向剩余的蔗糖溶液中加入0.04％(v/v)的Silwet L-77与10μL 6-BA(母液为1mg/mL)，搅匀，在转化前将二者混匀，将植株茎部及花序浸泡在菌液中50s，取出沥干菌液，放入一次性塑料袋中，密封保湿。将所有植株转化完毕后，罩上黑盒子，避光培养24h。之后取出植株，将植株直立放置，浇水培养，保证植株水分充足。

43.转基因阳性株系的筛选

转化后的植株待角果全部成熟后收种子，在垫有滤纸的干燥培养皿中室温放置一周，使种子全部干燥，之后用50目的不锈钢筛过滤种子，除去角果，收集转基因T0代种子并播种于穴盘中，用0.05％(v/v)草甘膦进行幼苗抗性筛选，获得T1代转基因植株，持续筛选直至获得T3代纯合体转基因植株。

实施例5、拟南芥MsDHN1转基因植株干旱胁迫生理学研究

51.拟南芥MsDHN1转基因植株Al胁迫下表型观察

将拟南芥野生型与MsDHN1转基因种子点在pH4.5，pH4.5+1.2mM Al培养基中，培养皿于气温22℃、光强6000勒克斯、光周期16小时光照/8小时黑暗的人工气候箱中，同时进行胁迫处理进行表型对比观察。Al胁迫14天时的观察结果图6a和6b所示，野生型(WT) 与MsDHN1转基因拟南芥植株(MsDHN1-8和MsDHN1-9)表型具有显著性差异；野生型植物根长显著低于MsDHN1转基因植株，植株生长情况也相对弱。说明MsDHN1转基因植物在具有更好的抗Al性。需要说明的是，根长为观测植株是否耐铝胁迫的直观数据，根长越长表示耐铝能力越强。

52.拟南芥MsDHN1转基因植株盐胁迫下表型观察

将拟南芥野生型与MsDHN1转基因种子点在MS，MS+80mM NACl，MS+100mM NACl 培养基中，培养皿于气温22℃、光强6000勒克斯、光周期16小时光照/8小时黑暗的人工气候箱中，同时进行胁迫处理进行表型对比观察。盐胁迫14天时的观察结果图7a、7b所示，野生型与MsDHN1转基因拟南芥植株表型具有显著性差异；野生型植物根长显著低于 MsDHN1转基因植株，植株生长情况也相对弱。说明MsDHN1转基因植物在具有更好的抗盐性。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种抗逆蛋白及其编码基因

<130> 174219

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctgagg agaatcagaa caagtacgag gaaaccaccg caaccaactc tgaaacagag 60

atcaaagaca ggggtgtttt tgattttcta ggtggtaaga aaaaggatga agaacatatt 120

aagcctcaag aggatgctgt tgcaactgat tttagtcaca aggtgacttt gtatgaagct 180

ccatcagaga ccaaagtaga agaaaaagaa gaaggtgaaa agaaacacac cagcctcttg 240

gagaaacttc accgatctga tagctcttca agctcttcga gtgaggagga agttgatgga 300

gagaggagga aaaagaagaa gaaagaaaag aaggagaaga aggaggacac atcagtgcca 360

gtagagaaag ttgatgttgt tgatggaaca acagcaagca ctgaagagaa gaaaggtttc 420

ctggacaaaa ttaaggagaa gcttccagga cacaagaaaa ctgacgatgt aacaactcca 480

ccacctgttg ttgttgctcc tgctgtgcca tctgctgaga caacaacaac aacagctagt 540

catgatcaag gagagaagaa aggtattttg gaaaagatca aagagaagat acctggttat 600

caccctaaga ctgctactga acatgaagac aacaaagatc atcacaagga tgagactact 660

tctcattga 669

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggctgagg agaatcagaa ca 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcaatgagaa gtagtctcat ccttg 25

<210> 4

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Glu Glu Asn Gln Asn Lys Tyr Glu Glu Thr Thr Ala Thr Asn

1 5 10 15

Ser Glu Thr Glu Ile Lys Asp Arg Gly Val Phe Asp Phe Leu Gly Gly

20 25 30

Lys Lys Lys Asp Glu Glu His Ile Lys Pro Gln Glu Asp Ala Val Ala

35 40 45

Thr Asp Phe Ser His Lys Val Thr Leu Tyr Glu Ala Pro Ser Glu Thr

50 55 60

Lys Val Glu Glu Lys Glu Glu Gly Glu Lys Lys His Thr Ser Leu Leu

65 70 75 80

Glu Lys Leu His Arg Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Glu Glu

85 90 95

Glu Val Asp Gly Glu Arg Arg Lys Lys Lys Lys Lys Glu Lys Lys Glu

100 105 110

Lys Lys Glu Asp Thr Ser Val Pro Val Glu Lys Val Asp Val Val Asp

115 120 125

Gly Thr Thr Ala Ser Thr Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Asp Lys Ile

130 135 140

Lys Glu Lys Leu Pro Gly His Lys Lys Thr Asp Asp Val Thr Thr Pro

145 150 155 160

Pro Pro Val Val Val Ala Pro Ala Val Pro Ser Ala Glu Thr Thr Thr

165 170 175

Thr Thr Ala Ser His Asp Gln Gly Glu Lys Lys Gly Ile Leu Glu Lys

180 185 190

Ile Lys Glu Lys Ile Pro Gly Tyr His Pro Lys Thr Ala Thr Glu His

195 200 205

Glu Asp Asn Lys Asp His His Lys Asp Glu Thr Thr Ser His

210 215 220

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agaaggagga cacatcagtg c 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggagcaacaa caacaggtgg 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcaccagtgc tcgattgc 18

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcgcctgtca atcttggtaa caa 23

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgggatccat ggctgaggag aatcagaaca 30

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggactagttc aatgagaagt agtctcatcc ttg 33

Claims (13)

1.一种分离的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为如下(1)或(2)的蛋白质；

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的蛋白质；

(2)与(1)中蛋白质具有至少80％同源性、且具有(1)中蛋白质功能的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质在植物体内的表达水平与所述植物的抗逆性相关。

3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，所述抗逆性包括耐Al胁迫和/或耐盐胁迫。

4.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，所述植物具体为紫花苜蓿。

5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述蛋白质。

6.根据权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸具体为SEQ ID NO：1中的1～630位所示的多核苷酸。

7.一种重组表达载体，包含如权利要求5或6所述分离的多核苷酸。

8.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如权利要求7所述重组表达载体或基因组中整合有外源的如权利要求5或6所述分离的多核苷酸。

9.如权利要求1-4之任一所述蛋白质的制备方法，其特征在于，选自以下之任一：

(1)利用化学合成方法合成所述蛋白质；

(2)在合适的条件下培养如权利要求8所述宿主细胞，使之表达所述蛋白质，而后分离及纯化获得所述蛋白质。

10.如权利要求1-4之任一所述蛋白质或其编码基因在培育抗逆植物中的用途。

11.一种用于检测植物体内如权利要求5-6所述的多核苷酸表达量的引物对，所述引物对中的上游引物如SEQ ID NO：5所示，所述引物对中的下游引物如序列SEQ ID NO：6所示。

12.一种提高植物抗逆能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)将如权利要求7所述的重组表达载体导入所述植物；

或(b)将如权利要求5-6所述的多核苷酸整合至所述植物的基因组中。

13.根据权利要求12所述的提高植物抗逆能力的方法，其特征在于，所述步骤(a)包括如下步骤：

将所述重组表达载体转化农杆菌；

将含有所述重组表达载体的农杆菌转化所述植物。