CN106946986A - 百子莲y2sk2型脱水素蛋白及其编码基因和探针 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种百子莲(Agapanthus praecox)Y2SK2型脱水素蛋白及其编码基因和探针，所述百子莲Y2SK2型脱水素蛋白包括如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有百子莲Y2SK2型脱水素蛋白活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列，以及检测上述核酸序列的探针。本发明为改善百子莲和各类观赏花卉的抗逆能力提供了依据；为观赏植物分子辅助育种及种质资源保存奠定了理论基础，具有很大的应用价值。

Description

百子莲Y2SK2型脱水素蛋白及其编码基因和探针

技术领域

本发明涉及百子莲逆境胁迫响应过程中的一种重要保护蛋白Y2SK2型脱水素蛋白其编码基因和探针，具体涉及一种百子莲Y2SK2型脱水素蛋白及其编码基因和探针。

背景技术

脱水素(Dehydrin)属于细胞胚胎发育晚期丰度蛋白第二族(LEAII)，能够在植物胚胎发育后期以及处于干旱、低温、盐碱等逆境的植株中大量表达并发挥重要作用，有着高亲水性、无序性和抗氧化性的特点。大量植物会在胚胎发育形成的过程中和应激反应下积累脱水素，以应对如干旱、高温严寒和高盐等非生物胁迫环境。许多研究证实，在非生物胁迫下，植物脱水素的表达与积累和植物抗逆性之间存在着正相关关系。

百子莲(Agapanthus praecox)，单子叶多年生草本花卉，原产于非洲南部，别名蓝百合、非洲百合。其植株挺拔，叶形秀美，花量大、花期长、观赏价值高。是备受人们的喜爱的常用园林花卉，多用于庭院栽培和切花生产，在欧美地区有着“爱情花”的美誉。

近年来在对植物抗逆生理的分子研究中，已在小麦、大麦、水稻、玉米、大豆、棉花、枇杷、梨树、橡树等多种作物和果树中分离与克隆出脱水素基因。但对于观赏植物尤其是球根花卉中脱水素的克隆、表达模式及蛋白序列尚不清楚。目前，未有任何与百子莲脱水素蛋白结构及其编码基因序列相关的文献报道。

发明内容

针对现有技术的缺陷，发明目的在于填补百子莲Y2SK2型脱水素基因的克隆、表达模式分析以及百子莲Y2SK2型脱水素蛋白的空白，提供了一种百子莲Y2SK2型脱水素蛋白及其编码基因和探针。本发明公开了百子莲Y2SK2基因转化拟南芥后的生理效应及表达模式，为今后利用基因工程技术对Y2SK2基因表达的时空特性进行调控，从而为提高观赏花卉的抗逆能力和分子育种工作提供了理论依据，具有很大的应用价值。

在本实验的前期研究中，进行了百子莲胚性细胞超低温保存实验，并通过转录组学与蛋白组学的比较分析数据，筛选到百子莲Y2SK2型脱水素蛋白在转录与蛋白层面对超低温复合逆境均具有积极的响应。因此推断对保护植物在复合上逆境中的细胞活性具有重要的调控作用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种百子莲Y2SK2型脱水素蛋白，包括如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有百子莲Y2SK2型脱水素蛋白活性的由(a)衍生的蛋白质。

优选地，所述蛋白质为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的序列。

优选地，所述蛋白质为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。

第二方面，本发明提供了一种编码前述百子莲Y2SK2型脱水素蛋白的核酸序列。

优选地，所述核酸序列具体为：

(a)碱基序列如SEQ ID NO.3第1～561位所示；

或(b)与SEQ ID NO.3第1～561位所示的核酸有至少70％的同源性的序列；

或(c)能与SEQ ID NO.3第1～561位所示的核酸进行杂交的序列。

优选地，所述核酸序列具体为SEQ ID NO.3第1～561位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5′和/或3′端添加60个以内核苷酸形成的序列。

第三方面，本发明提供了一种用于检测前述百子莲Y2SK2型脱水素蛋白核酸序列的探针，所述探针为包含有所述核酸序列8～100个连续核苷酸的核酸分子，该探针可用于检测样品中是否存在编码百子莲Y2SK2型脱水素蛋白相关的核酸分子。

第四方面，本发明提供了一种扩增前述百子莲Y2SK2型脱水素蛋白核酸序列的特异性引物对，所述引物对如下所示：

ORF-S：5′-ATGGACATGAGGGATCAGTATG-3′，

ORF-A:5′-TTACTGATGGGAGCCAGGG-3′。

第五方面，本发明提供了一种前述百子莲Y2SK2型脱水素蛋白编码基因的应用，所述基因的碱基序列如SEQ ID NO.3第1～561位所示，所述的应用包括改善植物抗逆能力。

在本发明中，在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。

在本发明中，术语“百子莲Y2SK2型脱水素蛋白编码序列”指编码具有百子莲Y2SK2型脱水素蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示的第1～561位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3所示的第1～561位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3所示的第1～561位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所示的序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的同源性至少70％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码天然百子莲Y2SK2型脱水素蛋白的相同功能、SEQ ID NO.3所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加为60个以内核苷酸。

在本发明中，术语“百子莲Y2SK2型脱水素”指具有百子莲Y2SK2型脱水素蛋白活性的SEQ ID NO.4所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然百子莲Y2SK2型脱水素蛋白相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括百子莲Y2SK2型脱水素蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的百子莲Y2SK2型脱水素的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与百子莲Y2SK2型脱水素相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用百子莲Y2SK2型脱水素的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“百子莲Y2SK2型脱水素保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1

本发明还包括百子莲Y2SK2型脱水素蛋白或多肽的类似物。这些类似物与百子莲Y2SK2型脱水素相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析百子莲Y2SK2型脱水素基因在拟南芥中的生理效应表达模式，即分析百子莲Y2SK2型脱水素基因在转基因拟南芥中的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

本发明检测样品中是否存在百子莲Y2SK2型脱水素相关核苷酸序列的检测方法，包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于百子莲Y2SK2型脱水素相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15～50个核苷酸。

此外，根据本发明的百子莲Y2SK2型脱水素的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选百子莲Y2SK2型脱水素的相关同源基因或同源蛋白。

为了得到与百子莲Y2SK2型脱水素相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选百子莲cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对百子莲Y2SK2相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自百子莲的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech,Stratagene,Palo Alto,Cal.。这种筛选方法可以识别与百子莲Y2SK2相关的基因家族的核苷酸序列

本发明的百子莲Y2SK2型脱水素相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)固相多肽合成，WH Freeman Co.,San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的百子莲Y2SK2型脱水素，通过各种常规筛选方法，可筛选出与百子莲Y2SK2型脱水素相关发生相互作用的物质，或抑制剂与拮抗剂等。

百子莲观赏价值极高，应用广泛，是优良的鲜切花品种，也是除了玫瑰以外最能表达爱意的爱情花，其市场需求也越来越大。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明首次克隆百子莲植物体内Y2SK2型脱水素的编码序列，并将其转化到模式植物拟南芥中，采用荧光实时定量PCR的方法分析Y2SK2基因在拟南芥中的生理效应和表达模式，为今后利用基因工程技术调控Y2SK2基因的时空表达，为改善百子莲和各类观赏花卉的抗逆能力提供了依据，为观赏植物分子辅助育种及种质资源保存奠定了理论基础，从而为体胚快繁、新品种选育方面提供了理论依据，具有很大的应用价值。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的百子莲Y2SK2型脱水素基因与麻风树(Jatropha curcas)dehydrinRab18-like基因mRNA的核苷酸序列的同源比较(GAP)结果；

图2为本发明的百子莲Y2SK2型脱水素蛋白与木薯(Manihot esculenta)dehydrin蛋白的氨基酸序列的同源比较(FASTA)结果，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出；

图3为野生型(WT)与Y2SK2转基因拟南芥植株在盐胁迫下表型观察；

图4为野生型(WT)与Y2SK2转基因拟南芥植株在盐胁迫下根系长度柱状图；

图5为野生型(WT)与Y2SK2转基因拟南芥植株在盐胁迫下莲座大小柱状图；

图6为野生型(WT)与Y2SK2转基因拟南芥植株在盐胁迫下单株重量柱状图；

图7为野生型(WT)与Y2SK2转基因拟南芥植株在渗透温胁迫下表型观察；

图8为野生型(WT)与Y2SK2转基因拟南芥植株在渗透胁迫下根系长度柱状图；

图9为野生型(WT)与Y2SK2转基因拟南芥植株在渗透胁迫下莲座大小柱状图；

图10为野生型(WT)与Y2SK2转基因拟南芥植株在渗透胁迫下单株重量柱状图；

图11为野生型(WT)与Y2SK2转基因拟南芥植株在低温胁迫下表型观察；

图12为野生型(WT)与Y2SK2转基因拟南芥植株在干旱胁迫下表型观察；

图13为野生型(WT)与Y2SK2转基因拟南芥植株正常生长条件下表型观察；

图14为野生型(WT)与Y2SK2转基因拟南芥中Y2SK2基因表达定量分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。

实施例1百子莲Y2SK2基因的克隆

1.植物材料的获得

取百子莲(Agapanthus praecox)叶片组织，用于提取RNA；

2.RNA的抽提

用“RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒”抽提总RNA(Trizol：Invitrogen)，用1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性，然后在分光光度计(Thermo Scientific NANODROP1000Spectrophotometer)上测定RNA的纯度及浓度；

3.基因的全长克隆

根据百子莲转录组测序(RNA-seq)的蛋白功能注释结果，获得百子莲Y2SK2基因核心片段。采用RACE方法(SMARTer^TMRACE cDNA Amplification Kit:Clonetech)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)PCR获得基因中间片段

将提取的RNA进行反转录(Prime ScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit:宝生物工程(大连)有限公司)，以第一链cDNA为模板，利用引物Dehydrin-L F(SEQ ID NO.1)和Dehydrin-L R(SEQ ID NO.2)进行PCR，

YSK-S(SEQ ID NO.1)：AACAGACGGACGCTTACGG

YSK-A(SEQ ID NO.2)：CAGTCCCTTCTTCTTCCTCCTC

运用上述引物对进行扩增，得到287bp片段，回收并连接到pMD18-T Simplevector载体上，用YSK-S和YSK-A作为引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。

将基因核心片段通过在NCBI网站进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对已有的数据库(GenBank)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的二穗短柄草、无芒隐子草和大麦的dehydrin基因的同源性很高，初步认为它是一个dehydrin基因。

(2)3′RACE

以3′RACE ready cDNA为模板，二轮巢式PCR完成3′末端序列的扩增。

第一轮：UPM+3’-GSP1(SEQ ID NO.5)：

5′-GTATGGGAACCGGGTCGGGCAGAT-3′

第二轮：NUP+3’-GSP2(SEQ ID NO.6)：

5′-AAGCACCCGGAGGAGCACCAGC-3′

UPM和NUP为试剂盒提供。3′RACE得到百子莲Y2SK2基因的3′末端序列(657bp)，回收，连接到pMD18-T Simple vector载体后用同上面一样的方法进行测序。

(3)5′RACE

以5′RACE ready cDNA为模板，通过二轮巢式PCR完成5′末端序列的扩增，

第一轮：UPM+5’-GSP1(SEQ ID NO.7)：

5′-GCTGGTGCTCCTCCGGGTGCTT-3′

第二轮：NUP+5’-GSP2(SEQ ID NO.8)：

5′-TGCCGTAAGCGTCCGTCTGTTGG-3′

UPM和NUP为试剂盒提供。5′RACE得到百子莲Y2SK2基因的5′末端序列(203bp)，回收连接后用同上面一样的方法进行测序，将通过上述3种方法获得的序列的测序结果进行拼接，将拼接序列提交BLAST分析，结果证明从百子莲中新得到的Dehydrin基因的确为一个脱水素蛋白相关的基因，将测序拼接结果结合NCBI的ORF(Open Reading Frame)Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测，发现了百子莲Y2SK2基因的起始密码子与终止密码子，并确定了百子莲Y2SK2基因的ORF区。根据获得的序列，分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物，对ORF区进行扩增。

ORF-S(SEQ ID NO.9)：5′-ATGGACATGAGGGATCAGTATG-3′，

ORF-A(SEQ ID NO.10)：5′-TTACTGATGGGAGCCAGGG-3′。

以百子莲cDNA为模板进行PCR，扩增得到561bp编码百子莲Y2SK2蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.3)。

实施例2、百子莲Y2SK2基因的序列信息与同源性分析

本发明的百子莲Y2SK2基因全长开放读码框序列为561bp，详细序列见SEQ IDNO.3所示序列。根据开放读码框序列推导出百子莲Y2SK2蛋白的氨基酸序列，共186个氨基酸残基，分子量为19.216kDa，等电点(pI)为9.61，详细序列见SEQ ID NO.4所示序列；

将百子莲Y2SK2基因的开放读码框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现其在核苷酸水平上与二穗短柄草DHN-3基因(登录号：XM_003574949)具有85％的一致性，如图1所示(Query：百子莲Y2SK2蛋白的编码基因序列；Sbjct：二穗短柄草DHN-3基因mRNA序列)；在氨基酸水平上，其与黄瓜中的DHN1(登录号：XP_011653150.1)的序列一致性为50％，如图2所示(Query：百子莲Y2SK2蛋白的氨基酸序列；Sbjct：黄瓜DHN1蛋白的氨基酸序列)。ClustalX比对表明各序列在Y/S/K保守域之外的同源性较低，但在保守域内部则较高，表明了脱水素蛋白的Y/S/K功能片段具有高度的保守性。

由此可见，百子莲Y2SK2基因与其它已知物种的Dehydrin基因在核酸和蛋白水平上都存在较高的同源性。

实施例3、百子莲Y2SK2基因转化模式植物拟南芥

1.含目的基因(百子莲Y2SK2基因)的表达载体的构建

根据百子莲Y2SK2基因全长编码序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增在完整编码阅读框的引物，并在上下游引物上分别引入限制性内切酶位点(视选用的载体而定)，以构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将百子莲Y2SK2基因的编码区序列连接至中间载体(如pMD19-T)中进行测序，再将测序正确的百子莲Y2SK2基因的编码区序列进一步克隆到表达载体中(如pHB)，在鉴定阅读框正确的前提下将其转入根癌农杆菌中(如GV3101)，并对转化后的农杆菌进行PCR鉴定，以保证含有百子莲Y2SK2基因的植物表达载体成功转化入根癌农杆菌中。

2.根癌农杆菌介导转化拟南芥

(1)预摇农杆菌：挑阳性单克隆至25ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、25mg/L利福平的YEP液体培养基中，28℃，200rpm摇菌24h；

(2)扩培农杆菌：将预摇的农杆菌菌液以1:100扩培至含400mL卡那霉素抗性YEP培养基中，28℃，200rpm，培养13～16h，培养至吸光度OD600达到1.5-2.0之间收菌，收菌条件是23℃，5000rpm，8min；

(3)转化植株：(需要在转化前一天或是转化当天剪去植株上所有的角果和盛开以及露白的小花)配制500mL含5％蔗糖的1/2MS溶液，并加入50μL的6BA(100mg/L)和200μLSilwet L-77形成农杆菌转化buffer。取适量转化buffer溶液将步骤(2)收集的农杆菌沉淀悬起，摇匀后，将植株茎部及花序在该菌液中浸泡1min，之后取出沥干菌液，用不透光的黑色塑料袋包裹植株，避光培养24h后取出植株，正常培养，一周后可进行再次侵染。

3.转基因阳性株系的筛选

待转化后的植株角果全部成熟后收种子，在垫有滤纸的干燥培养皿中室温放置一周，使种子全部干燥，之后用50目的不锈钢筛过滤种子，除去角果，收集转基因T0代的种子并播种于穴盘中，用0.05％(v/v)草甘膦进行幼苗抗性筛选，获得T1代转基因植株，持续筛选直至获得T2代转基因植株。

4.转基因拟南芥植株Y2SK2基因表达差异

剪切拟南芥野生型与T2代的Y2SK2转基因植株的叶片0.2g，提取RNA、制备cDNA并进行实时定量PCR分析。Real-time PCR中Y2SK2基因定量分析的特异性引物为：

rtYSK-S(SEQ ID NO.11)：5′-GGAGGAGGAAGAAGAAGG-3′，

rtYSK-A(SEQ ID NO.12)：5′-GCGGTAGTCGTAGTAGTC-3′，

内参基因为拟南芥UBQ5基因，引物为：

UBQ5-F(SEQ ID NO.13)：5′-GACGCTTCATCTCGTCC-3′，

UBQ5-R(SEQ ID NO.14)：5′-CCACAGGTTGCGTTAG-3′。

以SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12目标基因的特异性引物，内参基因引物为引物对野生型和转基因型拟南芥cDNA进行RT-PCR后，采用2^-△ΔCt法作相对定量分析，结果表明转基因拟南芥中Y2SK2的表达量较高，是内参基因UBQ5的8.91倍，误差线为Standard Error，而野生型植物中无Y2SK2基因表达(图14)。

实施例4、拟南芥Y2SK2转基因植株逆境胁迫表型观察

将野生型与T2代Y2SK2转基因型拟南芥植株在1/2MS培养基上生长3d后分别转移到加有100mM、150mM、200mM氯化钠的盐胁迫培养基，和加有300mM、400mM、500mM甘露醇的1/2MS高渗透胁迫培养基上，分别进行盐胁迫和渗透胁迫处理。在气温22℃、光强6000勒克斯、光周期16小时、光照/8小时黑暗的人工气候箱中生长10天后，进行照片拍摄和相关表型指标的测量统计。同时在土壤中播种将野生型与T2代Y2SK2转基因型拟南芥，进行干旱和低温胁迫处理的对比并观察表型。

如图3—6所示的结果表明，胁迫处理10天后，在不同胁迫条件下，分别取转基因和野生型拟南芥各20株进行表型指标测定，结果表明Y2SK2转基因拟南芥在氯化钠胁迫处理下表现出较好的抗逆能力，其根的生长速度较野生型植株有所提高(图4)，莲座尺寸较野生型植株有明显增大(图5)，单株鲜重显著高于野生型植株(图6)；如图7—10所示的结果表明，在甘露醇胁迫处理下，转基因植株表型同样优于野生型植株，在300mM甘露醇胁迫处理下，Y2SK2转基因拟南芥根生长速度显著高于野生型植株(图8)，莲座尺寸较野生型植株有明显增大(图9)，Y2SK2转基因型单株重量较野生型植株单株重量有一定提高(图10)。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学

<120> 百子莲Y2SK2型脱水素蛋白及其编码基因和探针

<130> DAG28910

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

aacagacgga cgcttacgg 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

cagtcccttc ttcttcctcc tc 22

<210> 3

<211> 981

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

acatgggatc ataaaatcaa aagatcagtt gaaaagagag agaggaaaag aacaagaaaa 60

ccatttcgag agaatttgat cagttttgga gagcgatgga catgagggat cagtatggga 120

accgggtcgg gcagatggat gcctacggca acccgatcca acagacggac gcttacggca 180

acccgttacc ggcccgcgag ggctacgggc atggcacggg tgtcggaggg cacgggaccg 240

gcggcactgg ctacgccggt accgggcatg acacgggcat cggaggtcat gggaccggta 300

caggctacac ggggaccggt gggcaggcgc agctgaagca cccggaggag caccagcgcg 360

gcgggatttt gcgccgctcc ggtagctcca gctccagctc ctcggaggat gacggcatgg 420

gggggaggag gaagaagaag ggactgaagg agaagatcaa ggagaagctc cctggcaccc 480

acaagaccga cgagtacggg cacgggcaag ccaccacggg cgcggggtat ggaaccacca 540

ccaccggcac ggggtacgga gggactacta cgactaccgc aacagggcgc catgagccgg 600

agaagaaggg ggtgatggaa aagatcaagg agaagctccc tggctcccat cagtaaatca 660

tatgtatatt tcacttaatt aaaaaggctc actcatgtta gtgaatgtgg gctagttttt 720

agtatgtgca tgttttgctt tgggaataag tggcatgcag ccatgagcat gcaccgcttg 780

cattttgcat gtgcgagcgt gcttggggct gcagtgtgtg cgcgcttctt gttgctgttg 840

tttttatgtg cgtgtgattg gggaggttat atcctgttta tgctatgtaa ttcatagact 900

atattttata tatcatatat gttataaagt aaaattagtg atagtcaaaa aaaaaaaaaa 960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 981

<210> 4

<211> 186

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 4

Met Asp Met Arg Asp Gln Tyr Gly Asn Arg Val Gly Gln Met Asp Ala

1 5 10 15

Tyr Gly Asn Pro Ile Gln Gln Thr Asp Ala Tyr Gly Asn Pro Leu Pro

20 25 30

Ala Arg Glu Gly Tyr Gly His Gly Thr Gly Val Gly Gly His Gly Thr

35 40 45

Gly Gly Thr Gly Tyr Ala Gly Thr Gly His Asp Thr Gly Ile Gly Gly

50 55 60

His Gly Thr Gly Thr Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Gly Gln Ala Gln Leu

65 70 75 80

Lys His Pro Glu Glu His Gln Arg Gly Gly Ile Leu Arg Arg Ser Gly

85 90 95

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Glu Asp Asp Gly Met Gly Gly Arg Arg

100 105 110

Lys Lys Lys Gly Leu Lys Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Thr

115 120 125

His Lys Thr Asp Glu Tyr Gly His Gly Gln Ala Thr Thr Gly Ala Gly

130 135 140

Tyr Gly Thr Thr Thr Thr Gly Thr Gly Tyr Gly Gly Thr Thr Thr Thr

145 150 155 160

Thr Ala Thr Gly Arg His Glu Pro Glu Lys Lys Gly Val Met Glu Lys

165 170 175

Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Ser His Gln

180 185

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

gtatgggaac cgggtcgggc agat 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

aagcacccgg aggagcacca gc 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

gctggtgctc ctccgggtgc tt 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 8

tgccgtaagc gtccgtctgt tgg 23

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 9

atggacatga gggatcagta tg 22

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 10

ttactgatgg gagccaggg 19

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 11

ggaggaggaa gaagaagg 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 12

gcggtagtcg tagtagtc 18

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 13

gacgcttcat ctcgtcc 17

<210> 14

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 14

ccacaggttg cgttag 16

Claims (9)

1.一种百子莲Y2SK2型脱水素蛋白，其特征是，包括如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有百子莲Y2SK2型脱水素蛋白活性的由(a)衍生的蛋白质。

2.如权利要求1所述的百子莲Y2SK2型脱水素蛋白，其特征是，所述蛋白质为SEQ IDNO.4所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的序列。

3.如权利要求2所述的百子莲Y2SK2型脱水素蛋白，其特征是，所述蛋白质为SEQ IDNO.4所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。

4.一种编码权利要求1所述百子莲Y2SK2型脱水素蛋白的核酸序列。

5.如权利要求4所述的编码所述百子莲Y2SK2型脱水素蛋白的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为：

(a)碱基序列如SEQ ID NO.3第1～561位所示；

或(b)与SEQ ID NO.3第1～561位所示的核酸有至少70％的同源性的序列；

或(c)能与SEQ ID NO.3第1～561位所示的核酸进行杂交的序列。

6.如权利要求4所述的编码所述百子莲Y2SK2型脱水素蛋白的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为SEQ ID NO.3第1～561位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5′和/或3′端添加60个以内核苷酸形成的序列。

7.一种用于检测如权利要求4所述编码百子莲Y2SK2型脱水素蛋白的核酸序列的探针，其特征在于，所述探针为包含有所述核酸序列8～100个连续核苷酸的核酸分子。

8.一种扩增如权利要求4所述，编码百子莲Y2SK2型脱水素蛋白的核酸序列的特异性引物对，其特征是，所述引物对如下所示：

ORF-S(SEQ No.9)：5′-ATGGACATGAGGGATCAGTATG-3′，

ORF-A(SEQ No.10)：5′-TTACTGATGGGAGCCAGGG-3′。

9.一种如权利要求1所述百子莲Y2SK2型脱水素蛋白编码基因的应用，其特征在于，所述基因的碱基序列如SEQ ID NO.3第1～561位所示，所述的应用包括改善植物抗逆能力。