CN106084021B

CN106084021B - 百子莲生长素响应因子ApARF1及其编码基因和探针

Info

Publication number: CN106084021B
Application number: CN201610298273.8A
Authority: CN
Inventors: 张荻; 杨舟; 陈冠群; 张敏涛; 张莹
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2016-05-06
Filing date: 2016-05-06
Publication date: 2019-06-21
Anticipated expiration: 2036-05-06
Also published as: CN106084021A

Abstract

本发明涉及一种百子莲生长素响应因子ApARF1及其编码基因和探针，所述蛋白质为如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有百子莲ApARF1蛋白活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列，以及检测上述核酸序列的探针；本发明为利用基因工程技术调控百子莲生长素信号转导途径，从而达到控制其生长发育、器官形态建成的目的，为分子育种提供了理论依据，具有很大的应用价值。

Description

百子莲生长素响应因子ApARF1及其编码基因和探针

技术领域

本发明百子莲生长素响应因子ApARF1及其编码基因和探针，具体涉及一种百子莲生长素响应因子ApARF1及其编码基因和探针。

背景技术

生长素是植物体内重要的生长调节分子，参与植物根和茎的生长和发育、器官的衰老、维管束组织的形成和分化发育、维持顶端优势、胚胎中轴的建立、植物的向地和向光反应以及刺激花器官生长等生长和发育诸多过程，在植物整个生命周期过程中发挥重要的作用。生长素响应因子(ARF)是一类调控生长素响应基因表达的转录因子，在生长素的信号传导过程中处于中心位置，它能够与生长素响应元件特异结合，促进或抑制基因的表达。

体细胞胚胎发生(体胚)是植物分子育种与离体快繁最有效的技术体系，已有研究表明植物体胚诱导主要依赖于外源生长素调控，且外源生长素类物质毒莠定对单子叶球根花卉体胚诱导具特效性。百子莲为热带多年生花卉，花量大、花期长、观赏价值高，具有地下块茎组织。我们前期建立的百子莲体胚体系表明生长素信号对百子莲体胚诱导、体胚形态、体胚数量与体胚成苗具有决定性作用。另外，应用外源调控物质打断生长素极性运输对百子莲花期、植株矮化、花序形态均有明显的调控作用。因此，生长素信号对花卉产业化生产与育种改良工作具有至关重要的作用。

ARF的编码基因已从多种植物中克隆出来，包括：拟南芥、水稻、玉米、葡萄、蓖麻等。但对于观赏植物，尤其是球根花卉中，ARF的克隆、表达模式及蛋白序列尚不清楚。目前，未有任何与百子莲ARF蛋白及其编码基因序列相关的文献报道。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于填补百子莲生长素响应因子ApARF1基因的克隆、表达模式分析以及百子莲ApARF1蛋白的空白，提供了一种百子莲生长素响应因子ApARF1及其编码基因和探针；本发明公开了百子莲ApARF1基因转化拟南芥后的生理效应及表达模式，为今后利用基因工程技术对ApARF1基因表达的时空特性进行调控，从而为体胚发生、株型调控提供了理论依据，具有很大的应用价值。

第一方面，本发明提供一种如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有百子莲ApARF1蛋白活性的由(a)衍生的蛋白质。

优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20个以内氨基酸而得到的序列。

进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。

第二方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。

优选的，所述核酸序列具体为：(a)碱基序列如SEQ ID NO.3第1～1770位所示；或(b)与SEQ ID NO.3第1～1770位所示的核酸有至少70％的同源性的序列；或(c)能与SEQ IDNO.3第1～1770位所示的核酸进行杂交的序列。

优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID NO.3第1～1770位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加60个以内核苷酸形成的序列。

第三方面，本发明提供一种检测上述核酸序列的探针，所述探针为具有上述核酸序列8～100个连续核苷酸的核酸分子，该探针可用于检测样品中是否存在编码百子莲生长素响应因子ApARF1相关的核酸分子。

第四方面，本发明提供一种用于扩增所述核酸序列的特异性引物对，如SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10所示。

第五方面，本发明提供一种所述核酸序列在调控植物生长素表达中的应用。

在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。

在本发明中，术语“百子莲生长素响应因子ApARF1蛋白编码序列”指编码具有百子莲ApARF1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示的第1～1770位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3所示的第1～1770位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3所示的第1～1770位核苷酸序列同源性低至约 70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所示的序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的同源性至少70％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码天然百子莲生长素响应因子ApARF1蛋白的相同功能、SEQ IDNO.3所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′端添加为60个以内核苷酸。

在本发明中，术语“百子莲生长素响应因子ApARF1”指具有百子莲ApARF1蛋白活性的SEQ ID NO.4所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然百子莲ApARF1蛋白相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括百子莲ApARF1蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的百子莲生长素响应因子ApARF1的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与百子莲ApARF1相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用百子莲ApARF1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“百子莲ApARF1保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1

发明还包括百子莲ApARF1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与百子莲ApARF1相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析百子莲ApARF1基因在拟南芥中的生理效应及表达模式，即分析百子莲ApARF1基因编码的蛋白功能。

本发明检测样品中是否存在百子莲ApARF1相关核苷酸序列的检测方法，包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于百子莲ApARF1相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15～50个核苷酸。

此外，根据本发明的百子莲ApARF1核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选百子莲ApARF1相关同源基因或同源蛋白。

为了得到与百子莲ApARF1相关基因的点阵，可以用DNA探针筛选百子莲cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对百子莲ApARF1相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自百子莲的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech,Stratagene,Palo Alto,Cal.。这种筛选方法可以识别与百子莲ApARF1相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的百子莲ApARF1相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)固相多肽合成，WH Freeman Co.,San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的百子莲生长素响应因子ApARF1，通过各种常规筛选方法，可筛选出与百子莲生长素响应因子ApARF1蛋白相关发生相互作用的物质，或抑制剂与拮抗剂等。

百子莲观赏价值极高，应用广泛，其花葶挺拔是优良的鲜切花品种，也是除了玫瑰以外最能表达爱意的爱情花，其市场需求也越来越大。本发明首次克隆百子莲植物体内生长素响应因子ApARF1的编码序列，并将其转化到模式植物拟南芥中，采用荧光实时定量PCR的方法分析ApARF1基因在拟南芥中的生理效应和表达模式，为今后利用基因工程技术调控ApARF1基因的时空表达，从而为体胚快繁、新品种选育方面提供了理论依据，具有很大的应用价值。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的百子莲ApARF1基因与美花烟草ARF1基因mRNA的核苷酸序列的同源比较(GAP)结果；

图2为本发明的百子莲ApARF1蛋白与美花烟草ARF1蛋白的氨基酸序列的同源比较(FASTA)结果，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

图3为野生型与ApARF1转基因拟南芥植株生长状况表型观察；

图4为野生型与ApARF1转基因拟南芥ApARF1基因表达定量分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、百子莲ApARF1基因的克隆

1.植物材料的获得

取百子莲(Agapanthus praecox ssp.Orientalis)(Zhang D.,Zhuo L.H.,ShenX.H.Sporogenesis and gametogenesis in Agapanthus praecox Willd.orientalis(Leighton)Leighton and their systematic implications.Plant Syst.Evol.2010,288:1-11.)成年苗叶片组织，用于提取RNA；

2.RNA的抽提

用“RNA prep pure植物总RNA提取试剂盒”抽提总RNA(Trizol：Invitrogen)，用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计(Thermo Scientific NANODROP1000Spectrophotometer)上测定RNA的纯度及浓度；

3.基因的全长克隆

根据百子莲转录组测序(RNA-seq)的蛋白功能注释结果，获得百子莲ApARF1基因核心片段。采用RACE方法(SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit:Clonetech)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)RT-PCR获得基因中间片段

将提取的RNA进行反转录(Prime ScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit：宝生物工程(大连)有限公司)，以第一链cDNA为模板，利用引物ARF1-F(SEQ ID NO.1)和ARF1-R(SEQ ID NO.2)进行PCR：

SEQ ID NO.1：5′-ATGCGTAATAACTGGTGTTG-3′

SEQ ID NO.2：5′-CATGTTCCCTTCATCGTC-3′

扩增得到781bp片段，回收并连接到pMD19-T Simple vector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序，测序结果通过在NCBI网站进行 BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对已有的数据库(GenBank)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的美花烟草、大豆和葡萄的ARF1基因的同源性很高，初步认为它是一个ApARF1基因；

(2)3′RACE

二轮巢式PCR完成3′末端序列的扩增。

第一轮：UPM+3’-GSP1(SEQ ID NO.5)：

5′-GGTTGAAATGACCGCAAAAGTGAGGC-3′，

第二轮：NUP+3’-GSP2(SEQ ID NO.6)：

5′-GGTTGGGGAGTCATTTACACCGACGA-3′:

UPM和NUP为试剂盒提供。3′RACE得到百子莲ApARF1的3′末端序列(209bp)，回收，连接到pMD19-T Simple vector载体上，用RV-M和M13-47作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序，测序结果通过在NCBI网站进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对已有的数据库(GenBank)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的美花烟草、大豆的ARF基因的同源性很高；

(3)5′RACE

以5′RACE ready cDNA为模板，通过二轮巢式PCR完成5′末端序列的扩增，

第一轮：UPM+5’-GSP1(SEQ ID NO.7)：

5′-ATCGTCGGTGTAAATGACTCCCCAAC-3′，

第二轮：NUP+5’-GSP2(SEQ ID NO.8)：

5′-CCTGAGACTTGCTTGGGTTGTTGACA-3′，

UPM和NUP为试剂盒提供。5′RACE得到百子莲ApARF1基因的5′末端序列(1392bp)，回收连接后用同上面一样的方法进行测序，将通过上述3种方法获得的序列的测序结果进行拼接，将拼接序列提交BLAST分析，结果证明从百子莲中新得到的ApARF1基因的确为一个生长素响应因子基因，将测序结果结合NCBI的ORF Finding(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf)预测，发现了百子莲ApARF1基因的起始密码子与终止密码子，根据获得的序列，分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物

ORF-F(SEQ ID NO.9)：5′-ATGGATGAGAAAAAGCTAGAGCTGAGGCT-3′，

ORF-R(SEQ ID NO.10)：5′-TCACTTCTTGTTGATTGTTCCCAAGCG-3′，

以百子莲cDNA为模板进行PCR，扩增得到1770bp百子莲ApARF1蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.3)。

实施例2、百子莲ApARF1基因的序列信息与同源性分析

本发明新的百子莲ApARF1基因全长开放读码框序列为1770bp，详细序列见SEQ IDNO.3所示序列。根据开放读码框序列推导出百子莲ApARF1蛋白的氨基酸序列，共589个氨基酸残基，分子量为65.99kDa，等电点(pI)为6.36，详细序列见SEQ ID NO.4所示序列；

将百子莲ApARF1的开放读码框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与美花烟草ARF1基因(登录号：XP_009786487.1)在核苷酸水平上具有98％的相同性，如图1所示(Query：百子莲ApARF1的编码基因序列；Sbjct：桑树ARF1的mRNA序列)；在氨基酸水平上，它与美花烟草ARF1基因(登录号：XP_009786487.1)也有47％的一致性和61％的相似性，如图2所示(Query：百子莲ApARF1蛋白的氨基酸序列；Sbjct：美花烟草ARF1蛋白的氨基酸序列)。由此可见，百子莲ApARF1基因与其它已知物种的ARF基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。

实施例3、百子莲ApARF1基因转化模式植物拟南芥

1.含目的基因(百子莲ApARF1基因)的表达载体的构建

根据百子莲ApARF1基因全长编码序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增在完整编码阅读框的引物，并在上下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将百子莲ApARF1基因的编码区序列连接至中间载体(如pMD19-T)中进行测序，再将测序正确的百子莲ApARF1基因的编码区序列进一步克隆到表达载体中(如pHB)，在鉴定好阅读框正确的前提下将其转入根癌农杆菌中(如GV3101)，并对转化后的农杆菌进行PCR鉴定，以保证含有百子莲ApARF1基因的植物表达载体成功转化入根癌农杆菌中。

1.根癌农杆菌介导转化拟南芥

(1)预摇农杆菌：挑阳性单克隆至25ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、25mg/L利福平的YEP液体培养基中，28℃，200rpm摇菌24h；

(2)扩培农杆菌：将预摇的农杆菌菌液以1:100扩培至含400mL卡那霉素抗性YEP培养基中，28℃，200rpm，培养13～16h，培养至吸光度OD600达到1.5-2.0之间收菌，收菌条件是23℃，5000rpm，8min；

(3)转化植株：(需要在转化前一天或是转化当天剪去植株上所有的角果和盛开以及露白的小花)配制500mL含5％蔗糖的1/2MS溶液，用少量MS溶液将收集的农杆菌沉淀悬起，摇匀，向剩余的蔗糖溶液中加入0.04％(v/v)的Silwet L-77与10μL 6-BA(母液为1mg/mL)，搅匀，在转化前将二者混匀，将植株茎部及花序浸泡在菌液中30s，取出沥干菌液，放入一次性塑料袋中，密封保湿。将所有植株转化完毕后，罩上黑盒子，避光培养24h。之后取出植株，将植株直立放置，浇水培养，保证植株水分充足。

3.转基因阳性株系的筛选

转化后的植株待角果全部成熟后收种子，在垫有滤纸的干燥培养皿中室温放置一周，使种子全部干燥，之后用50目的不锈钢筛过滤种子，除去角果，收集转基因T0代种子并播种于穴盘中，用0.05％(v/v)草甘膦进行幼苗抗性筛选，获得T1代转基因植株，持续筛选直至获得T3代纯合体转基因植株。野生型与ApARF1转基因拟南芥植株的表型具有显著性差异(图3)；ApARF1转基因植物生长明显快于野生型植株，说明ApARF1对生长素具有正调控作用。

4.转基因拟南芥植株ApARF1基因表达差异

剪切拟南芥野生型与ApARF1转基因植株的叶片0.2g，提取RNA、制备cDNA并进行实时定量PCR分析。Real-time PCR中ApARF1基因定量分析的特异性引物为：

qT-F(SEQ ID NO.11)：5′-TTCAGAGTCCATAGTTCCTTAT-3′，

qT-R(SEQ ID NO.12)：5′-AACCTTGAGATGCTTCCA-3′，

内参基因为拟南芥UBQ5基因，引物为：

UBQ5-F(SEQ ID NO.13)：5′-GACGCTTCATCTCGTCC-3′，

UBQ5-R(SEQ ID NO.14)：5′-CCACAGGTTGCGTTAG-3′。

采用2^-△△Ct法作相对定量分析，结果表明转基因拟南芥中ApARF1的表达量较高，是内参基因UBQ5的2.6倍，是野生型植物的3894倍(图4)。表明ApARF1没有在野生型植株中表达。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一种如下(a)的蛋白质：

(a)由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸。

3.如权利要求2 所述的核酸，其特征是，所述核酸的序列具体为：碱基序列如SEQ IDNO.3第1～1770位所示。

4.一种如权利要求2所示的核酸在调控植物生长素表达中的应用。