CN101824433A

CN101824433A - 控制拟南芥维管束发育的特异性基因及其应用

Info

Publication number: CN101824433A
Application number: CN200910236761A
Authority: CN
Inventors: 瞿礼嘉; 郭勇; 秦跟基; 康定明; 顾红雅
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2009-11-03
Filing date: 2009-11-03
Publication date: 2010-09-08
Anticipated expiration: 2029-11-03
Also published as: CN101824433B

Abstract

本发明公开了一种控制拟南芥维管束发育的特异性基因及其应用。所述基因编码如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质，其基因组基因是AT5g62940，相应的cNDA序列如序列表中SEQ ID No.1所示。研究表明，该基因编码的是一个定位在核内并且具有反式激活活性的转录因子，可能参与调控拟南芥束间形成层的形成和维管组织的发育，是在拟南芥中发现的第一个调控束间形成层形成的转录因子。在转基因植物中过量表达该基因可使植株的茎杆变粗；而抑制该基因在植物中的表达可抑制束间形成层的发生。由此，利用该基因可以调控植株的茎杆粗细，应用于次生生长强的木本植物的研究和品质改良，在林木花草茎杆粗细生长发育的调控方面应用前景广阔。

Description

控制拟南芥维管束发育的特异性基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种控制拟南芥维管束发育和茎粗细的基因及其在控制植物茎粗细方面的应用。

背景技术

树木的粗细是由于植物的输导和支持器官茎内的维管束组织内的维管束形成层的不断发育，也即维管束发育所形成的年轮是否不断增多的结果。因此，调控植物茎维管束形成层的发育特性，可以控制树木的粗细与农作物的抗倒伏性能，调控树木枝干和农作物茎的生长特性，促进树木成材与造型和农作物茎干的粗细生长的能力，协调光合产物的运输和分配，对树木的成材与造型，以及农作物茎干抗倒伏有重要的意义。

在植物的胚胎发生过程中，有一部分的分生组织前体细胞在根-下胚轴的轴性建立过程中分化形成束状结构，这部分分生组织细胞称之为原形成层。伴随着植物的生长，根中的胚胎原形成层细胞分化形成木质部和韧皮部，其排列方式和下胚轴中的相类似，而在茎端分生组织所形成的茎中由木质部和韧皮部所组成维管束呈环状排列在茎的周围。在维管束分化过程中，木质部和韧皮部之间的一小部分细胞仍然保持了分生组织的活性，这部分细胞通常称之为形成层。维管分生组织包括原形成层和形成层细胞，其原始细胞通常被限定在特定的位置。维管分生组织通过其极性的细胞分裂和分化作用参与了高度有序化的发育过程。这种分生组织原始细胞极性分裂分化的结果一方面通过垂周分裂形成新的形成层细胞从而维持自身的分裂活性，另一方面通过平周分裂产生多层的细胞，这些细胞可以分化成高度特化并且在空间上分割开来的木质部和韧皮部细胞。

维管分生组织活性对于维管系统的形成及其功能的维持至关重要，同时维管分生组织所产生的木质部又是木材的主要来源并且产生了绝大部分植物的生物量。但是相对于人们对于调控顶端分生组织发育的分子机制所进行的广泛研究来说，人们对于维管分生组织及其发育机制的研究却很少，对于维管分生组织细胞极性的建立及维持所必需的因子几乎还是一个未知数(Fisher and Turner，2007，Curr Biol，17，1061-1066)。这是由于维管分生组织活性的维持主要依赖于细胞-细胞相互作用，而在植物体中特别是深入到植物组织内部的维管分生组织中分析细胞-细胞相互作用还是比较困难的。

初生分生组织的活动使得植物具有不确定性的生长方式，从而在空间上发育形成了地上和地下的器官，这些器官在植物体整个生命活动中参与了植物的光合作用以及水分、营养物质和信号分子的运输。但是，随着植物体的生长，植物体表面积的扩大需要一定的生长特性与之相适应，这些生长特性包括起适当支撑作用和输导作用的组织的出现。这种在发育上的适应性对于多年生的植物尤其重要，由于这是它们能够多年生存的活力来源。在进化过程中，这种需求通过细胞壁超微结构以及植物结构的基础性改变而获得了极大的满足，从而保证了长距离的疏导和机械支持。

维管组织是由木质部和韧皮部组成的疏导水分和营养物质，并且具有一定支持功能的植物组织。在有次生生长的植物中维管组织包括来源于原形成层的初生木质部和初生韧皮部以及来源于维管形成层的次生木质部和次生韧皮部，大多数的裸子植物和木本双子叶植物都属于这类植物。在只有初生生长的植物中维管组织只包括来源于原形成层的初生木质部和初生韧皮部，大多数的蕨类植物和单子叶植物属于这类植物。

植物的次生生长是由次生分生组织(特别是维管形成层)的活动不断产生新的细胞组织所导致的生长。次生生长过程中产生的木材具有很重要的经济价值，它们可以作为可再生的能源，是制造纸浆、建筑业以及纺织业的原材料，因此在人们的生产生活中起着重要的作用。植物的次生生长过程起始于维管束内原形成层以及束间区域的薄壁组织细胞分化形成维管形成层原始细胞。形成层的活动产生了木质部和韧皮部，以及它本身的自我维持和细胞之间的信号传递，从而也伴随着茎的加粗过程(Savidge，2001，J Plant Growth Regul，20，52-77.)。

另外，茎杆粗壮对于农作物高产群体的抗倒伏性能具有重要作用。新中国成立60年来，矮秆、半矮秆小麦水稻品种的选育和利用，明显增强了品种的产量潜力。可以用各种物理或化学(烯效唑、甲基磺酸乙酯(EMS)、多效唑等)的方法处理植株，使植株茎粗。如适当浓度的烯效唑能促进发芽，使植株的茎变粗，增加生物量，提高可溶性糖、淀粉、叶绿素的含量，降低可溶性蛋白和游离氨基酸的含量。但是单纯依靠常规品种选育，效果有限。

近几年，开展了一些关于茎粗相关功能基因的研究。如苹果属显性茎粗主基因Dw的RAPD分子标记(张开春等，农业生物技术学报，1999年第7卷第2期Vol.7No.21999)；半矮秆春小麦茎粗基因Rht1和Rht2的相关研究，小麦Rht8茎粗基因的遗传(向平，国外作物育种1996)等。从这些背景资料可以看出，植株茎粗相关功能基因在作物生产中的重要性显而易见，具有控制这一性状的功能基因在生产上的用途是广阔的。

发明内容

本发明的目的是寻找调控维管组织发育的因子，进而提供一种控制植株径粗细的方法，特别是提供一种使植物茎杆变粗的方法。

通过对拟南芥插入激活突变体库进行筛选，本发明发现AT5g62940基因对维管组织的发育起到非常重要的作用，其编码一个定位在核内并且具有反式激活活性的转录因子，具有Dof结构域，属于Dof转录因子家族，命名为HCA2/AtDof5.6。AT5g62940基因的cDNA序列如序列表中SEQ ID No.1所示，其开放阅读框架为自5’端第178-1296位碱基，编码的蛋白质序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

研究表明，HCA2/AtDof5.6基因在拟南芥花序茎发育的早期即开始发挥作用，它可以促进拟南芥花序茎顶端的维管组织即发育早期的维管组织中束间薄壁组织细胞的平周分裂，进而在这些维管组织中促进束间形成层的形成。HCA2/AtDof5.6可能参与调控拟南芥束间形成层的形成和维管组织的发育，这是在拟南芥中发现的第一个调控束间形成层形成的转录因子。过量表达At5g62940基因的转基因植株表现出矮小、茎杆变粗的表型，而且其花序茎基部的横切显示其维管形成层基本上连接在一起，表现出较高的形成层活性；而利用嵌合抑制子沉默技术构建的HCA2/AtDof5.6嵌合抑制子导致植物维管组织的发育发生缺陷，抑制束间形成层的发生，这和在过量表达At5g62940基因的转基因植株中观察到的表型几乎完全相反。

在上述研究成果的基础上，又鉴于拟南芥是国际公认的分子生物学研究的模式植物，序列表中SEQ ID No.2氨基酸序列的编码基因可以应用于控制植物茎杆的粗细。例如，将AT4g31670基因在转基因植物中过量表达，使得植株茎杆变粗。

使植株茎杆变粗的方法一般是，将序列表中SEQ ID No.2氨基酸序列的编码基因导入植物细胞、组织或器官中，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，使所述基因在植株内过量表达，获得茎杆变粗的转基因植株。

在上述是植株茎杆变粗的方法中，所述SEQ ID No.2氨基酸序列的编码基因可以是该基因的cDNA序列(SEQ ID No.1)，也可以是该基因的基因组基因序列，还可以是与所述cDNA序列或基因组基因序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列，是将所述基因的cDNA序列或基因组基因序列利用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。

编码本发明HCA2/AtDof5.6的基因或其同源序列可通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官。用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA系列载体、Gateway^TW系列载体或其它衍生植物表达载体，所述出发载体还可以是可在原核生物中复制的载体，如pUC系列载体或pBluescript系列载体等。

使用编码本发明HCA2/AtDof5.6的基因或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。这些启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以包含ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。但从转基因植物的安全性考虑，也可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。

植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca²⁺、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。

维管形成层的活动对于木本植物的发育异常重要，是木本植物增粗以及木材形成的基础，因此，研究维管形成层的调控机制具有重大的经济意义。本发明的成果可应用于次生生长强的木本植物的研究和品质改良，应用前景广阔。

附图说明

图1是实施例中长日照条件下生长六周的拟南芥野生型和hca2突变体植株的照片和高度比较图，其中A是植株照片，B是植株最终高度的柱形比较图。

图2是实施例中实时定量RT-PCR检测的At5g62940和At5g62950在野生型和hca2突变体中的表达量柱状示意图。

图3是实施例中At5g62940基因过量表达的转基因植株和At5g62950降低表达的SALK突变体植株的表型比较，其中A是各转基因植株的照片：4Enhancers-HCA2-20和4Enhancers-HCA2-26代表用4个35S增强子驱动的At5g62940过量表达的转基因植株，SALK_117570是At5g62950表达降低的突变体植株，HCA2RNAi2/hca2代表hca2突变体中转入HCA2RNAi载体的植株，而At5g62950OE1/hca2代表hca2突变体中转入At5g62950过量表达载体的植株；B和C是HCA2过量表达转基因植株花序茎基部横切甲苯胺蓝染色后的结果，bar＝100μm；D-F显示的是SALK_117570以及在hca2背景下降低表达At5g62940和过量表达At5g62950之后花序茎基部的结构，bar＝200μm；其中：Fc，束中形成层；Ic，束间形成层；Vb，维管束。

图4是实施例中At5g62940和At5g62950在各种转基因植株和SALK_117570中的表达量柱形示意图，其中：WT代表野生型植株，4Enhancers-HCA2-20和4Enhancers-HCA2-26代表用4个35S增强子驱动的At5g62940过量表达的转基因植株，HCA2RNAi2/hca2代表hca2突变体中转入HCA2RNAi载体的植株，SALK_117570是At5g62950表达降低的突变体植株，而At5g62950OE1/hca2代表hca2突变体中转入At5g62950过量表达载体的植株。

图5是实施例中野生型和35S:HCA2SRDX转基因植株中基因表达量和花序基部切片的比较图，其中，A是野生型和35S:HCA2SRDX转基因植株中HCA2和HCA2SRDX的表达情况比较；B-D分别是野生型和35S:HCA2SRDX转基因植株花序茎基部横切切片，bar＝100μm；C，皮层；If，束间纤维；Pc，形成层；Ph，韧皮部；Xy，木质部；Fc，束中形成层；Ic，束间形成层。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明。

一、高形成层活性突变体hca2的筛选

拟南芥中没有内源的标签因子，T-DNA整合成为主要的插入诱变方法。拟南芥已经通过T-DNA标签得到了成千上万的突变体。经过TAIL-PCR(Thermal Asymmetric InterlacedPCR，Yaoguang Liu et al，1998，Plant Molecular Biology Reporter 16：175-181，热不对称交错多聚酶链式反应)技术扩增并测定标签插入位点的两端序列，用Blast2.0软件将测定序列和拟南芥的全基因组序列比较，找出突变位点，种植突变体，通过表型分析以及各种不同的环境条件的筛选，在大量突变体当中筛选出控制拟南芥茎中形成层发育，进而控制茎粗细性状的基因。激活标签载体pSKI015转化拟南芥所生成的T-DNA插入突变体库的构建参见文献Qin et al.，2003，Plant Sci，165，941-949.和Qin et al.，2005，Plant Cell，17，2693-2704。

(一)、材料

拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚生态型(Col-0)；质粒pSKI015；各种常用抗生素；根癌土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)为GV3101。

(二)、方法

1.植物生长和转化

拟南芥在温室中22℃生长，每天光照16小时，黑暗8小时。

我们采用的Ti质粒是pSKI015，质粒中的T-DNA区域含有BAR基因，赋予除草剂抗性。还含有在原核系统中用来筛选的Amp抗性基因，在T-DNA右边缘附近有串联的4个35S增强子，有可能在插入拟南芥基因组后增强侧翼或附近某个基因的表达，从而获得某种功能，做为插入基因失活的一个额外的补充。

转化拟南芥的方法主要采用农杆菌介导的转化方法。十多年前科学家发明了种子浸染转化法，后来采用农杆菌培养侵染植物茎尖成整株植物进行真空抽滤，这些方法都代替了以前组织培养和植物再生方法，缩短了组织培养的步骤。我们实验使用的转化方法是花浸法(flaral dip)，比真空抽滤更为简便，转化效率也不会降低，野生的拟南芥(Columbia)长到一定阶段，有一些未成熟的花苞，将已开的花剪掉，做为待转化植物。带有pSKI015的农杆菌经鉴定后28℃摇到稳定期(OD₆₀₀≈2.0)离心后重新悬浮在浸染培养基中。浸染培养基中必不可少的提高转化效率的是蔗糖和Surfactant两种物质。将含有大量未开花苞的拟南芥倒置在农杆菌的浸染培养基的浸泡液中十五分钟，然后暗培养一定时间后继续开花，结籽，将种子收集，其中就有转基因株系。

2.转基因植物的筛选和PCR检测

转化植物的子代用抗生素等标记筛选出来。我们使用的是除草剂PPT，采用一定浓度的PPT(100mg/ml)加入培养基中，使不含有T-DNA插入的种子不萌发或不生长，而含有T-DNA插入的种子因为含有完整的BAR基因而正常生长起来。在这些植物中，T-DNA插入一般为单倍体，是隐性突变，所以表型一般不易发现。

用CATB法提取植物叶片的总DNA，利用pSKI015载体上BAR基因的引物进行PCR检测：

5’引物：5’-TCGACTCTAGCGAATTCCTC-3’，

3’引物：5’-ATAGGCGTCTCGCATATCTC-3’；

并用拟南芥中COP1的引物同时进行PCR作为正对照：

5’引物：5’-TGACTATGCTCTGTTTCAGCT-3’，

3’引物：5’-TTAGTAAACCAAGGAAACACCA-3’

反应条件为：94℃50s，60℃60s，72℃90s，35个循环，PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

3.T-DNA插入侧翼序列的扩增和测序

我们采用TAIL-PCR方法，即热不对称性交错PCR(Thermal Asymmetry Interlace PCR)，TAIL-PCR包含三轮连续的半嵌套式插入序列特异引物和一个小的可退火在附近侧翼序列上的随机引物，很容易扩增出插入位点侧翼序列，这种方法不需要在PCR之前进行很多复杂的操作，而且产生高纯度的特异产物，可以直接用作杂交探针和测序模板，即具有高效、灵敏、简便、特异的优点。

将确定含有BAR基因的植株用TAIL-PCR扩增T-DNA插入侧翼序列(Liu，1995)，所用的三个特异引物是根据T-DNA的左边缘附近的序列设计的，分别为：

DL1：5’-GACAACATGTCGAGGCTCAGCAGG-3’；

DL2：5’-TGGACGTGAATGTAGACACGTCGA-3’；

DL3：5’-GCTTTCGCCTATAAATACGACGG-3’。

所用的随机简并引物有两个：

AD2：5’-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3’；

AD2-2：5’-NGTGCA(G/C)(A/T)GTNT(A/T)GAA-3’。

大量扩增第三轮PCR产物，用低熔点琼脂糖将每条条带进行回收，加两倍体积的水在65℃温浴使胶块熔化，用酚、氯仿各抽提一遍。再用2-2.5倍体积乙醇和1/10体积醋酸钠(NaAc)沉淀。12,000转，离心20分钟后沉淀，用70％、100％乙醇各洗一遍，抽干。溶于水中，定量后可用来测序。

还可将第三轮PCR产物直接与pBS产生的T-vector用T₄-DNA连接酶连接，筛选出有插入的阳性克隆。提质粒测序。

4.序列的比对和分析

得到大量的插入位点侧翼序列，就需要进行序列分析，首先用BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)与数据库中的序列进行比对，到EMBL或Gene bank中比对出匹配的序列，从而确定T-DNA插入位点究竟在哪条染色体的什么部位，附近的开放读码框架ORF，已经翻译出蛋白质的可能功能，与已知蛋白的同源比较等等。

5.表型分析

种植突变体，同时种植野生型拟南芥为对照。我们筛选到一例维管组织发育发生改变的突变体，在其花序茎中缺乏维管束和束间纤维交替出现的结构，各个维管束中的束中形成层已经和束间新形成的束间形成层连接而呈现出连续的环状的维管形成层结构，相应的在维管形成层的内外分别形成连续的韧皮部和木质部。这样的结构表明在突变体的花序茎中存在一种非典型性的形成层结构，出现了高活动性的形成层结构，这与之前曾经报道的hca突变体(Pineau et al.，2005，Plant J，44，271-289.)的表型类似，因此将其命名为hca2(highcambial activity 2)。如图1所示，图1A为拟南芥植株在开花期和结荚期的形态照片，其中从左到右依次是野生拟南芥WT、杂合突变体hca2+/-和纯合突变体hca2-/-植株的形态照片。野生型植株花序茎的长度是27.86±2.33cm，而纯合突变体花序茎的长度只有9.23±0.86cm，纯合突变体花序茎的长度大概是野生型的30％左右(见图1B)。由图中可以看出，突变体植株在开花期和结荚期与野生型比较，表现出明显的矮化和茎杆变粗的表型特征。

序列分析和比较显示，在hca2突变体中，T-DNA插入了拟南芥第五染色体的第25262703碱基处，插入了基因AT5g62950的第四个外显子中。

二、造成突变体表型的基因的确定

为了确定是哪一个基因的改变导致了上述的hca2突变体表型，我们检测了T-DNA插入位点附近基因的表达水平。

在插入位点上下游各10kb的范围内一共有六个基因(At5g62920，At5g62930，At5g62940，At5g62950，At5g62960和At5g62970)，根据这六个基因在数据库中的编码序列设计了6对引物，然后提取野生型和hca2突变体植株的RNA，用TRIzol Kit(Invitrogen)法：(1)将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积的10％；(2)将匀浆样品在15～30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；(3)4℃12000rpm离心10min，取上清；(4)每使用1ml TRIzol加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置3min；(5)4℃12000rpm离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相、中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用TRIzol试剂的60％。把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白，可保留有机相，进行进一步操作；(6)每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10min；(7)4℃不超过12000×g离心10min，去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀；(8)加1ml 75％乙醇(配乙醇溶液用DEPC处理过的水)洗涤沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml乙醇；(9)4℃不超过7500×g离心5min，弃上清；(10)室温放置晾干或真空抽干(不要晾的过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干5-10min左右。)加25-200μl DEPC水或0.5％SDS溶液，55-60℃放置10min溶解RNA(如果后面需进行酶反应，请勿使用SDS溶液)；(11)TRIzol法提取的RNA可用于芯片杂交，或经DNase I处理后用作反转录反应。利用反转录酶反转录生成cDNA:DNase I处理RNA样品

200μl反应体系：

RNA 10μg～20μg

10×反应缓冲液 20μl

DNase I 2μl

RNase抑制剂 1μl

DEPC水补足体积至200μl，混匀。

(1)37℃水浴反应30min；(2)向反应体系中加入200μl DEPC水，用400μl的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，4℃12000rpm离心10min；(3)取上清，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，4℃12000rpm离心10min；(6)取上清，加入40μl 3M醋酸钠(pH5.2)，1ml无水乙醇，-20℃沉降过夜；(7)4℃12000rpm离心30min；(8)倒去上清，保留沉淀，分别用70％和100％的乙醇洗一次，4℃12000rpm离心10min；(9)吹干沉淀，用适量体积的DEPC水溶解。待用。

RT-PCR前的反转录反应采用20μl反应体系：

Oligo(dT)(600ng/μl) 1μl

RNA 5μg

dNTP(10mM) 1μl

用DEPC水补足体积至13μl，混匀。

(1)65℃水浴使RNA变性，5min后迅速置于冰上冷却，防止复性；(2)接着加入：

5×第一链合成缓冲液 4μl

0.1M DTT 1μl

RNase抑制剂 1μl

SuperScript III型反转录酶(200U/μl) 1μl

(3)混匀，50℃水浴保温1hr；(4)70℃水浴15min使酶失活；(5)加入2μl RNase H 37℃保温30min，离心，-20℃保存；获得cDNA，然后，以cDNA为模板进行RT-PCR和实时定量RT-PCR反应。实时定量RT-PCR采用20μl反应体系：

2×SYBR Green MIX 5μl

Primer-1(2.5μM) 1μl

Primer-2(2.5μM) 1μl

cDNA 2μl

ddH₂O补足体积至10μl。每个基因做三个重复。

实时定量RT-PCR反应程序

95℃ 3min

94℃ 20sec

58℃ 20sec

72℃ 20sec

Plate read

78℃～86℃ 1sec

Plate read

Go to step 2 44 cycles

72℃ 5min

Melting curve from 58℃ to 95℃，read every 0.2℃。

反应结束后，用2^-ΔΔC(t)的方法分析基因表达的差异。RT-PCR结果显示和野生型相比，突变体中除了At5g62940和At5g62950外其他基因的表达量都没有发生明显的变化，更进一步利用反转录的cDNA为模板，对At5g62940和At5g62950基因进行实时定量RT-PCR分析，发现在hca2突变体中At5g62940基因的表达量显著升高，而At5g62950基因没有表达，见图2。说明T-DNA的插入导致AT5g62950基因的表达受到破坏，同时引起其上游基因At5g62940的过量表达。AT5g62940基因的cDNA序列见序列表SEQ ID No.1，AT5g62940基因编码的蛋白质序列见序列表SEQ ID No.2。

为了确定到底是过量表达At5g62940基因或者是At5g62950的敲除导致了突变体的表型，我们根据数据库中提供的At5g62940和At5g62940基因的cDNA序列在其编码区两端分别设计引物，以野生型植株叶片的cDNA为模板，扩增这两个基因的cDNA序列。然后将扩增的到的片段连入pBS载体，测序并与数据库中的序列相比对以确定其正确性。接下来用扩增得到的cDNA序列分别构建过量表达载体和RNAi载体。

HCA2/AtDof5.6的4Enhancers-HCA2过量表达载体的构建的方法：用Pst I和Kpn I双酶切pQG110得pQG110；Pst I和Sal I双酶切pBS-4Enh(+)得pB4Enh；Sal I和BamH I双酶切pBS-ProHCA2(-)得pAProHCA2；BamH I和KpnI双酶切pBS-HCA2(+)得pBHCA2；回收各片断，用T4连接酶进行连接后即得pQ4EnhProHCA2，转化DH5α感受态细胞，PCR筛选阳性克隆之后，培养阳性克隆，提质粒并用酶切鉴定其正确性。过量表达载体构建好后，按前述方法转入农杆菌，然后用农杆菌转化拟南芥野生型和hca2突变体。

由花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的At5g62940基因的RNAi载体HCA2 RNAi的构建方法：为了构建HCA2基因的RNAi载体，根据HCA2的cDNA序列，然后在3’端的部分设计了一对引物：

HCA2-3：5′-GGG AGT GAA CAA TGA CAA CCT G-3′

HCA2-4：5′-ATT CCA CGA CGA ACC TAA ACC-3′

通过PCR扩增得到HCA2基因3’端的一段400bp左右的片段，将其命名为HCA2Frag。将上面所得PCR产物连接到用EcoRV单酶切的pBS平末端载体中，PCR筛选得到正向和反向插入的各种克隆载体，分别命名为(+)和(-)。然后通过测序跟NCBI数据库中的序列进行比对以确定克隆片段的正确性。再用BamH I和Kpn I双酶切本实验室构建的用于构建植物RNAi载体的模板载体pQG110得到pQG110；用BamH I和Hind III双酶切pBS-HCA2Frag反向插入质粒得pAHCA2Frag；用Hind III和EcoR I双酶切pBS-GUS正向插入质粒得pBGUS；用EcoR I和Kpn I双酶切pBS-HCA2Frag正向插入质粒得pBHCA2Frag；回收各片断，连接后即得pQHCA2RNAi载体。转化DH5α感受态细胞，PCR筛选阳性克隆之后，培养阳性克隆，提质粒并用酶切鉴定其正确性。将正确的质粒按前述方法转化进入农杆菌GV3101，然后按前述方法用含有At5g62940基因的RNAi载体HCA2RNAi的农杆菌GV3101转化hca2突变体。

At5g62950的过量表达载体At5g62950OE1的构建方法：用BamH I和Kpn I分别酶切前段叙述的本实验室已构建的过量表达载体模板载体pQG110和pBS-At5g62950，回收各片断，连接后得到pQ35SAt5g62950。转化DH5α感受态细胞，PCR筛选阳性克隆之后，培养阳性克隆，提质粒并用酶切鉴定其正确性。将正确的质粒按前述方法转化进入农杆菌GV3101，然后按前述方法用含有At5g62950基因的过量表达载体的农杆菌GV3101转化野生型拟南芥。

首先，我们既检测了用4个35S增强子驱动的At5g62940基因过量表达的转基因植株，又检测了使得At5g62950降低表达的SALK突变体(SALK_117570)。结果如图3A-D所示，4个35S增强子驱动的At5g62940基因过量表达的转基因植株表现出矮小的表型(重现了hca2突变体的表型)，而且其花序茎基部的横切也显示其维管形成层也基本上连接在一起，表现出较高的形成层活性(切片方法见后)；而插入到At5g62950基因第一个内含子上的SALK突变体SALK_117570却仍然表现出野生型的表型。同时，实时定量RT-PCR的分析显示在4×35S增强子驱动的At5g62940基因过量表达的转基因植株中At5g62940基因确实是过量表达了的，而在SALK_117570突变体中At5g62950基因的表达量显著降低(见图4)。这样的结果就表明只有通过过量表达At5g62940基因而不是通过降低表达At5g62950基因才能够重现高形成层活性和矮化的表型。

为了更进一步的确定是At5g62940基因的过量表达而不是At5g62950基因的敲除所引起的hca2突变体的表型，我们在hca2突变体中转入了由花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子所驱动的At5g62940基因的RNAi载体和At5g62950的过量表达载体。

在hca2突变体背景下转入RNAi载体的大部分转基因植株不仅在整体上而且在维管组织的排列形式上都恢复到了野生型的结构(图3A，E和F)，实时定量RT-PCR的结果也表明在转基因植株中At5g62940基因基本上恢复到野生型的水平(图4)，而转入了过量表达载体的转基因植株仍然具有突变体的表型，也就是说，hca2突变体中转入HAC2RNAi载体(即由CaMV35S启动子所驱动的At5g62940基因的RNAi载体)可以恢复表型，而转入At5g62950过量表达载体不能恢复表型。以上的这些证据充分的说明hca2突变体的表型是由于过量表达At5g62940基因所引起的。

进一步的研究表明，At5g62940基因编码一个核定位的Dof转录因子，具有转录激活活性，将其命名为HCA2/AtDof5.6，其可能通过改变细胞分裂素和生长素的响应来调控束间形成层的形成和维管组织的发育，这是在拟南芥中发现的第一个参与调控束间形成层形成的转录因子。

三、HCA2/AtDof5.6嵌合抑制子导致植物维管组织的发育发生缺陷

为了更进一步的研究HCA2/AtDof5.6的功能，我们利用嵌合抑制子沉默技术将HCA2/AtDof5.6和SRDX基序抑制结构域融合形成显性的抑制子。该基序是从拟南芥SUPERMAN基因中分离得到的，含有12个氨基酸残基：LDLDLELRLGFA，将该基序融合在转录因子的C末端时，就可以在转基因拟南芥中作为显性的抑制子起作用，这样即便是有冗余的转录因子存在的情况下也可以抑制其下游目标基因的表达，从而产生显性的类似于缺失突变体的表型(Hiratsu et al.，2003，Plant J，34，733-739.；Hiratsu et al.，2004，BiochemBiophys Res Comm，321，172-178.)。

35S:HCA2SRDX载体是将不含有终止密码子的HCA2/AtDof5.6编码序列和编码SRDX基序的序列融合后构建到花椰菜花叶病毒35S启动子的载体中。35S:HCA2SRDX载体的构建方法是：根据EAR基序抑制结构域SRDX的序列，分别合成了它的正义链和反义链：

SRDX-1：5′GAT CTG GAT CTA GAA CTC CGT TTG GGT TTC GCT TAA3′

SRDX-2：5′TTA AGC GAA ACC CAA ACG GAG TTC TAG ATC CAG ATC3′

将两条链退火之后配对形成双链结构，然后将其连入到pCAMBIA1390载体中就得到pCAMBIA1390SRDX载体，通过测序验证其正确性。

同时用HCA2-1和HCA2NS引物扩增不含有终止密码子的HCA2编码序列

HCA2-1：5′-ATG GGT CTC ACT TCT CTT CAA-3′

HCA2NS：5′-AAC CAA GGA GTT TGT TTT AGT G-3′

将其插入到EcoRV单酶切的pBS载体中得到pBS-HCA2NS载体，筛选阳性克隆并通过PCR鉴定方向，测序验证其正确性。接着用Pst I和Spe I双酶切pCAMBIA1390SRDX得pCAMBIA1390SRDX；Pst I和Kpn I双酶切pQG110得35S Promoter；Kpn I和Spe I双酶切pBS-HCA2NS(-)得pA81DzfNS；回收各片段后连接得35S:HCA2SRDX载体。将其转入DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆PCR鉴定，然后提质粒在通过酶切鉴定其正确性。将正确的质粒转入到农杆菌中。首先是制备农杆菌感受态：

LB培养基(1L)：

胰蛋白胨(Tryptone) 10g

酵母提取物(Yeast Extract) 5g

NaCl 10g

琼脂粉 15g(固体培养基)

(1)将新鲜的农杆菌单菌落接种到10ml液体LB培养基中，28℃过夜振荡培养；(2)取1ml菌液转移到200ml液体LB培养基中，在1l三角瓶中28℃振荡培养10hr左右；(3)室温5000rpm离心10min，倒掉上清，用5ml pH8.0的TE悬浮；(4)再离心，去掉上清(沉淀成粉红色)；(5)将细胞悬浮到1/10体积的LB+甘油混合物中(甘油终浓度为25％)(4ml＝2ml LB+2ml 50％甘油)；(6)250μl/管分装感受态；(7)用液氮速冻，然后保存到-70℃冰箱。待用。然后将构建好的载体质粒转化农杆菌：(1)取出-70℃保存的农杆菌感受态细胞，至于冰上，待其融化之后加入6～7μl质粒，混匀；(2)冰上放置5min；(3)置于液氮中速冻，继续用液氮处理5min；(4)37℃水浴热激5min；(5)加入1ml不含抗生素的LB液体培养基，置于28℃摇床中复苏4hr左右；(6)室温5000rpm离心5min，弃去上清；(7)加入200μl新鲜的LB培养基，混匀后涂板，置于28℃温箱中温育。然后用农杆菌转化野生型拟南芥植株。

转化野生型拟南芥植株，转化方法：

农杆菌侵染培养液1L：

MS混合物 2.2g

蔗糖 50g

Silwet L77 200μl

(1)从平板上挑取筛选为阳性的农杆菌单菌落接入含有50mg/l庆大霉素、10mg/l利福平和50mg/l相应筛选抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养24hr左右；(2)按1∶50的比例转接到250ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃继续震荡培养20hr左右；(3)28℃，5000rpm离心10min收集菌体；(4)用100ml农杆菌侵染培养液重悬菌体；(5)将100ml农杆菌侵染培养液倒入适当的容器，然后将已剪去已开的花(以露白为准)和角果的拟南芥植株倒置，使其全部花蕾完全浸入菌液中，保持15min，取出后平放，暗培养24hr；(6)将植株正常放置，置于温室里生长，待种子成熟后收获。然后通过潮霉素筛选转基因植株，获得转化HCA2/AtDof5.6嵌合抑制子的转基因植株，对这些植株的表型分析发现大部分的转基因植株具有明显的表型。和野生型植株相比，光下生长的35S:HCA2SRDX转基因植株幼苗的下胚轴比野生型要长很多，而且子叶向下卷曲。随着植株的生长，转基因植株的叶柄比野生型要长，叶片变的细长。

同时，提取个野生型和转基因植株的RNA，利用反转录酶合成cDNA(同前段叙述方法)，通过实时定量RT-PCR技术检测了35S:HCA2SRDX转基因植株花序茎中HCA2SRDX转基因的表达量以及内源的HCA2/AtDof5.6基因的表达量，结果显示，在这些转基因植株中HCA2SRDX都有不同程度的表达，而HCA2/AtDof5.6的表达量和野生型相比几乎没有很明显的变化，而在野生型植株中没有HCA2SRDX的表达；同时，通过对不同株系的转基因植株的表达量的分析，也发现HCA2SRDX的表达量和其表型的严重程度是相关的(图5A)。这就表明35S:HCA2SRDX转基因植株的表型并不是由于共抑制作用所造成的。

特别是，对野生型和转基因植株的花序茎基部进行树脂切片，切片的方法和过程为：首先是实验材料的包埋：(1)取合适样品在戊二醛固定液中固定；

100ml 4％戊二醛固定液的配置：

50％戊二醛 8ml

0.2M磷酸缓冲液 6.25ml

ddH₂O 85.75ml

(2)500mmHg抽真空3～4hr，待材料沉至液面下，30min到1hr可拨动一下材料，固定后的材料可置于4℃过夜；

(3)用磷酸缓冲液洗两次，每次30min；

0.2M磷酸缓冲液(pH6.8)200ml：

NaH₂PO₄·2H₂O 3.12g

Na₂HPO₄·12H₂O 7.16g

ddH₂O补足200ml，调pH值至6.8

(4)用15％、30％、50％、70％、85％、95％、100％、100％乙醇逐级脱水，每次30min左右；(5)100％乙醇∶树脂＝2∶1浸3-4hr，浸树脂时每步先润洗10min；(6)100％乙醇∶树脂＝1∶2浸3-4hr；(7)用100％树脂润洗两次，第二次浸泡过夜；(8)更换一次新鲜100％树脂，1hr后即可包埋；(9)55℃聚合24hr以上。树脂包埋及切片：树脂使用前要现配，将各种物质加在一起后振荡混匀，4℃冰箱中放置。

树脂的配制：

VCD(Vinylcyclophene Dioxide(ERL 4206)) 10g

DER(Diglycidyl Ether of Polypropylene Glycol) 6g

NSA(Nonenyl Succinic Anhydride) 26g

DAME(Dimethylaminoethanol) 0.4g

载玻片的处理：新玻片置于洗液中浸泡24hr以上，流水冲洗，ddH₂O冲洗5次，95％乙醇浸泡2hr以上。盖玻片较薄较脆，时间应相应缩短。实验前准备好42℃展片台。

(1)用单面刀片修整包埋好组织的树脂块，要接触玻璃刀的一面修成矩形；(2)将载玻片放在水平台上，滴一滴明胶，用干净的手套抹匀(注意留出做标记的位置)。稍干后加400μl ddH₂O于载玻片上，水面大小相当于盖玻片；(3)切出0.5～5μm的组织切片，一般采用的是2～5μm，注意玻璃刀上不要有太多划痕，否则会影响组织结构的观察；(4)将切片飘浮在水面上展平，规则排列；(5)将此载玻片放在42℃展片台上，展片约5min，待多余水挥发后即可放置42℃恒温箱8hr以上(最好24hr以上)，装入切片盒内4℃存放待用；(6)应用Spurr树脂的切片染色比较困难，需要先将树脂脱掉后再染色；(7)配制氢氧化钠无水乙醇饱和溶液，放置2～3d，至溶液变成暗黄棕色为止；(8)将切片浸入上述溶液1hr；(9)移至无水酒精4次，每次5min；(10)流水洗5min；(11)染色最好在染缸中进行，一次一片，染5sec(刚从4℃取出的染液上色较慢，15sec为宜)，迅速拿出自来水冲洗载玻片背面，水流不要过大，随时镜检(自来水分色效果较好)；(12)42℃恒温箱烤片8hr以上；(13)及时用香柏油或环氧树脂封片，不要加太多，大盖玻片加40μl即可，小盖玻片20μl。最好在封片后立刻照相，因时间长了会褪色。

通过对花序茎基部的维管组织分析表明，尽管六周大小的野生型植株没有或者几乎形成很少量的束间形成层，但是再生长两周之后在维管组织的束间区域已经可以看到通过平周分裂所形成的束间形成层，这些束间形成层是通过束中形成层边沿起始并且延伸之后形成的(图5B)。然而，对于八周大小的35S:HCA2SRDX转基因植株的分析表明，在这类植株的维管束之间几乎没有发现分裂中的束间胞壁组织细胞(图5C和D)，这就表明在嵌合抑制的转基因植株的花序茎中束间形成层并还没有开始形成。因此，对HCA2/AtDof5.6嵌合抑制转基因植株的分析表明抑制HCA2/AtDof5.6下游基因的表达可以抑制束间形成层的发生，这和在过量表达HCA2/AtDof5.6的hca2突变体中观察到的表型几乎是完全相反的。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>北京大学

<120>控制拟南芥维管束发育的特异性基因及其应用

<130>JSP090367

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1560

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

gaggagaaga agggtcctct tcttgtttcc ttcttattca catcccaacc ccaaactctt 60

ccttgcctca tcatctctca catttctctc ttctccttct ctctctagat tttgttcagg 120

aacttgtctt aaaaactctc actctccctc aaactaaaca aacatacaga acacaaaatg 180

ggtctcactt ctcttcaagt ttgcatggat tctgattggc tccaggaatc cgagtcatca 240

ggaggaagca tgttagactc ttcaacgaat tctccgtcag cagccgacat actagcagct 300

tgcagcacta gaccacaagc ctcggccgtg gctgtagccg ctgcagctct gatggacggt 360

ggaaggaggc tgcgtccacc tcacgaccat cctcaaaagt gtcctcgttg cgagtcaaca 420

catactaagt tctgttacta caataactac agcctctctc agcctcgtta cttctgcaag 480

acttgtcgcc gttactggac aaaaggcgga actctaagga atattccggt tggtggtgga 540

tgccgtaaaa acaagaaacc atcttcctct aattcctcct cctccacttc ttccggcaaa 600

aaaccatcca acatcgttac cgccaatacc tctgatctta tggctttagc acattctcat 660

caaaattacc aacattctcc tctagggttt tcacattttg gtgggatgat ggggtcttac 720

tcaactccgg agcatggtaa cgttggtttc ttggagagca agtatggcgg tttgctttcg 780

cagagcccta gacctattga tttcttggac agtaagtttg atctcatggg agtgaacaat 840

gacaacctgg tcatggttaa tcatggaagt aacggagatc atcatcatca tcataatcat 900

cacatgggtc tgaatcacgg tgtaggtctt aacaacaaca acaacaatgg tggatttaat 960

gggatttcta cgggaggcaa tggaaatggt ggtggtctca tggatatatc gacatgccaa 1020

agacttatgc tatctaatta tgatcatcac cattacaatc atcaagaaga tcatcaaagg 1080

gtagcaacaa taatggatgt gaagccaaat ccgaagttgt tatcgcttga ttggcagcaa 1140

gatcaatgct actccaatgg tggtggtagc ggaggcgcag gaaaatccga cggtggtgga 1200

tacggcaatg gtggttatat caacggttta ggttcgtcgt ggaatggttt gatgaatggc 1260

tatggaacgt ccactaaaac aaactccttg gtttgataag ttaatcagaa cttctttttt 1320

cttgtcgtca tcaactagta gtagtagtaa tagtagttgg agactagaga agcacttcaa 1380

attatttatg ggtttgtttg ctaagccagt tttactttcg taattggtgg ttatttacga 1440

gagtaatctt aattagtaat cttgactaga gtattcagag agatatttcg tttgtgtgtg 1500

ttcgtgtggt tgaggtgtaa tgtttcttga tatatataag tagtgcccat ttacttttgg 1560

<210>2

<211>372

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

Met Gly Leu Thr Ser Leu Gln Val Cys Met Asp Ser Asp Trp Leu Gln

1 5 10 15

Glu Ser Glu Ser Ser Gly Gly Ser Met Leu Asp Ser Ser Thr Asn Ser

20 25 30

Pro Ser Ala Ala Asp Ile Leu Ala Ala Cys Ser Thr Arg Pro Gln Ala

35 40 45

Ser Ala Val Ala Val Ala Ala Ala Ala Leu Met Asp Gly Gly Arg Arg

50 55 60

Leu Arg Pro Pro His Asp His Pro Gln Lys Cys Pro Arg Cys Glu Ser

65 70 75 80

Thr His Thr Lys Phe Cys Tyr Tyr Asn Asn Tyr Ser Leu Ser Gln Pro

85 90 95

Arg Tyr Phe Cys Lys Thr Cys Arg Arg Tyr Trp Thr Lys Gly Gly Thr

100 105 110

Leu Arg Asn Ile Pro Val Gly Gly Gly Cys Arg Lys Asn Lys Lys Pro

115 120 125

Ser Ser Ser Asn Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Gly Lys Lys Pro Ser

130 135 140

Asn Ile Val Thr Ala Asn Thr Ser Asp Leu Met Ala Leu Ala His Ser

145 150 155 160

His Gln Asn Tyr Gln His Ser Pro Leu Gly Phe Ser His Phe Gly Gly

165 170 175

Met Met Gly Ser Tyr Ser Thr Pro Glu His Gly Asn Val Gly Phe Leu

180 185 190

Glu Ser Lys Tyr Gly Gly Leu Leu Ser Gln Ser Pro Arg Pro Ile Asp

195 200 205

Phe Leu Asp Ser Lys Phe Asp Leu Met Gly Val Asn Asn Asp Asn Leu

210 215 220

Val Met Val Asn His Gly Ser Asn Gly Asp His His His His His Asn

225 230 235 240

His His Met Gly Leu Asn His Gly Val Gly Leu Asn Asn Asn Asn Asn

245 250 255

Asn Gly Gly Phe Asn Gly Ile Ser Thr Gly Gly Asn Gly Asn Gly Gly

260 265 270

Gly Leu Met Asp Ile Ser Thr Cys Gln Arg Leu Met Leu Ser Asn Tyr

275 280 285

Asp His His His Tyr Asn His Gln Glu Asp His Gln Arg Val Ala Thr

290 295 300

Ile Met Asp Val Lys Pro Asn Pro Lys Leu Leu Ser Leu Asp Trp Gln

305 310 315 320

Gln Asp Gln Cys Tyr Ser Asn Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gly Lys

325 330 335

Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Gly Asn Gly Gly Tyr Ile Asn Gly Leu Gly

340 345 350

Ser Ser Trp Asn Gly Leu Met Asn Gly Tyr Gly Thr Ser Thr Lys Thr

355 360 365

Asn Ser Leu Val

370

Claims

1.一种调控植株茎杆粗细的方法，在转基因植物中过量表达序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的编码基因，使植株的茎杆变粗；或者抑制该基因在植物中的表达，使植物茎杆变细。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调控植株茎杆粗细的方法是使植株茎杆变粗的方法，将序列表中SEQ ID No.2氨基酸序列的编码基因导入植物细胞、组织或器官中，再将该植物细胞、组织或器官培育成植株，并使所述基因在转基因植株内过量表达。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述序列表中SEQ ID No.2氨基酸序列的编码基因是其cDNA序列或基因组基因序列。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述序列表中SEQ ID No.2氨基酸序列的编码基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官中。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，用于构建所述植物表达载体的出发载体是一种可用于农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体，或者是可在原核生物中复制的载体。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在用所述基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前加上一种增强型、组成型、组织特异性或诱导型启动子。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在用所述基因构建植物表达载体时添加翻译增强子和/或转录增强子。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述植物表达载体中加入一种或多种选择性标记基因，所述选择性标记基因包括但不限于：可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶的基因、发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物和抗化学试剂标记基因。