CN112430260A

CN112430260A - 胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36或其编码基因在调控植物愈伤组织形成中的应用

Info

Publication number: CN112430260A
Application number: CN202011321307.3A
Authority: CN
Inventors: 段俊; 何春梅; 俞振明; 曾丹琦
Original assignee: South China Botanical Garden of CAS
Current assignee: South China Botanical Garden of CAS
Priority date: 2020-11-23
Filing date: 2020-11-23
Publication date: 2021-03-02
Anticipated expiration: 2040-11-23
Also published as: CN112430260B

Abstract

本发明公开了胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36或其编码基因在调控植物愈伤组织形成中的应用。所述的胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明从铁皮石斛类原球茎中克隆得到属于铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白家族LEA_4亚家族的胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36的编码基因胚胎发育晚期丰富蛋白基因DoLEA36，胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36作为正调控因子参与了植物的愈伤组织的形成，通过转基因及功能鉴定证实超量表达胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36，转基因植株的愈伤组织诱导率增加。因此，胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36或其编码基因在植物组织再生过程中具有重要的理论意义及应用价值，特别是植物种质保存和利用愈伤组织产生活性物质等方面扮演者重要的角色。

Description

胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36或其编码基因在调控植物愈伤组织形成中的应用

技术领域：

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36或其编码基因在调控植物愈伤组织形成中的应用。

背景技术：

1981年首次发现了棉花种子中高丰度的胚胎发育晚期丰富蛋白(Lateembryogenesis abundantprotein，LEA)，随后在其他的物种如大豆(Glycine max，Lin etal.2004；Liu and Zheng2005)、玉米(Zea mays L.，Campbell et al.1998)、水稻(Oryzasativa L.，Xiao et al.2007)和烟草(Nicotiana rustica，RoyChoudhury et al.2007)等植物中也发现了LEA蛋白。高等植物的LEA家族一般是几十个成员，比如双子叶植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中一共鉴定到51个LEAs(Hundertmark and Hincha 2008)，毛果杨(Populus trichocarpa)中鉴定到53个(Lan et al.2013)，单子叶植物水稻(Oryzasativa L.)中鉴定到34个(Wang et al.2007)，玉米(Zea mays)中鉴定到83个基因(Li andCao 2016)，黄瓜(Cucumis sativus)中鉴定到79个(Altunoglu et al.2016)。但是在一些物种中，LEA家族的成员数量超过100，比如在欧洲油菜(Brassica napus)基因组中鉴定到108个LEAs(Liang et al.2016)。LEA家族成员可分成9个亚家族即AtM、dehydrin、LEA_1、LEA_2、LEA_3、LEA_4、LEA_5、PvLEA18和SMP。

研究表明，LEA受ABA和水分胁迫诱导(Moons et al.1997；Zegzouti etal.1997)，在种子在脱水过程中可能起到保护细胞结构、维持内环境稳定的作用。在植物的生长发育过程，遭遇逆境胁迫的条件下，LEAs的表达量升高。虽然LEA蛋白的具体作用机制尚不明确，但越来越多研究表明LEA参与植物各种非生物逆境胁迫，如干旱(Yu etal.2016)、盐胁迫(Chourey et al.2003；Xu et al.1996))和冷胁迫等(NDong etal.2002；Sutton et al.1992)。但LEA蛋白的其它功能如促进愈伤组织的形成未有报道。

在植物离体培养中，受到一些因素的刺激，植物细胞脱分化，并进一步增殖形成具有再生能力的细胞团，即愈伤组织。愈伤组织不仅是遗传转化、研究植物基因功能的重要材料，同时也是植物组织快繁的关键材料。此外，愈伤组织在植物种质保存和利用愈伤组织生产活性物质等方面扮演着重要的角色。

发明内容：

本发明的目的是提供铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36或其编码基因在调控植物愈伤组织形成中的应用。

本发明从铁皮石斛类原球茎中克隆得到的属于铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白家族LEA_4亚家族的胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36的编码基因胚胎发育晚期丰富蛋白基因DoLEA36，胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36作为正调控因子参与了植物的愈伤组织的形成，通过转基因及功能鉴定证实超量表达胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36，转基因植株的愈伤组织诱导率增加。

因此，本发明提供了铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36或其编码基因在调控植物愈伤组织形成中的应用，所述的胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

优选，是在植物中超表达胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36的编码基因促进植物愈伤组织形成中的应用。

优选，所述的促进植物愈伤组织形成优选为促进拟南芥下胚轴愈伤组织形成。

优选，所述的胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

优选，所述的植物是拟南芥。

本发明从铁皮石斛类原球茎中克隆得到属于铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白家族LEA_4亚家族的胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36的编码基因胚胎发育晚期丰富蛋白基因DoLEA36，胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36作为正调控因子参与了植物的愈伤组织的形成，通过转基因及功能鉴定证实超量表达胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36，转基因植株的愈伤组织诱导率增加。因此，胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36或其编码基因在植物组织再生过程中具有重要的理论意义及应用价值，特别是植物种质保存和利用愈伤组织产生活性物质等方面扮演者重要的角色。

附图说明：

图1是DoLEA36全长。其中M为DL2000 DNAMarker，1为目的片段。

图2是DoLEA36在铁皮石斛不同发育时期的表达模式分析。(A)铁皮石斛不同发育时期。S1：类原球茎时期；S2：丛生芽时期；S3小苗时期。(B)DoLEA36在S1-S3时期的表达模式。

图3是pCAMBIA1302植物双元表达载体图。

图4是半定量PCR证明DoLEA36可在基因可在DoLEA36超表达转基因拟南芥株系(35S:DoLEA36)中正常转录；其中WT为野生型拟南芥，Line 5、Line 6和Line 7为筛选到的DoLEA36超表达转基因拟南芥株系编号。

图5是Western blot证明DoLEA36蛋白可在DoLEA36超表达转基因拟南芥株系(35S:DoLEA36)中正常表达；其中WT为野生型拟南芥，Line 5、Line 6和Line 7为筛选到的DoLEA36超表达转基因拟南芥株系编号。

图6是野生型拟南芥和DoLEA36超表达转基因拟南芥株系(35S:DoLEA36)的愈伤组织诱导率；其中WT为野生型拟南芥，Line 6和Line 7为筛选到的DoLEA36超表达转基因拟南芥株系编号。

图7是野生型拟南芥和DoLEA36超表达转基因拟南芥株系(35S:DoLEA36)愈伤组织图片；其中WT为野生型拟南芥，Line 6和Line 7为筛选到的DoLEA36超表达转基因拟南芥株系编号。

具体实施方式：

实施例1：DoLEA36的全长克隆

下列实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产品生产厂商的使用说明。

实施例中所用铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)从福建冠豸山收集得到，其种子无菌播种后得到的原球茎进一步增殖获得类原球茎，该类原球茎作为种质资源保存于中国科学院华南植物园的组培室内，培养在1/2MS+0.1％活性炭+2％蔗糖+0.2％琼脂粉pH 5.4的培养基上，在26±1℃,40μmol m^-2s^-1,12-h光照/12-h黑暗,60％相对湿度的培养室中。逆转录酶M-MLV购自Promega公司，其货号为：M1701；DNase I(RNaseFree)购自宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa中国)，其货号为D2215；普通PCR反应buffer为2×TSINGKE Master Mix(blue)购自擎科生物公司，其货号为TSE004-5ML；构建超表达载体采用高保真酶进行扩增，所用的高保真酶为KOD-401，购自东洋纺(上海)生物科技有限公司，其货号为：KOD-401；pMD18-T载体和Nco I酶均购自宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa中国)，其货号分别为D101A和1160BH；MS和LB培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

以SDS法提取铁皮石斛类原球茎RNA，提取得到的RNA用DNase I进行去基因组DNA处理，具体操作按照使用说明书进行。得到纯化后的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测RNA的完整性；然后在超微量核酸蛋白测定仪NanoDrop2000检测RNA的浓度和纯度，检测合格的RNA置于-80℃冰箱备用。采用Promega公司逆转录酶M-MLV进行逆转录得到cDNA。在铁皮石斛全基因组CDS拼接文件中查找得到DoLEA36的CDS核苷酸序列，根据序列信息涉及正向引物(5′-ATGGCAAACAAACCTCTTCT-3′)和反向引物(5′-TCACAGCTCCTCCTCGTGTC-3′)，以cDNA为模板，进行常规PCR扩增，PCR反应条件为：94℃4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃60sec，35个循环；72℃10min，对PCR产物进行电泳检测(图1)。回收PCR产物，胶回收采用HiPure GelPure DNA mini Ki(美吉，D2111-02)，具体操作详见说明书。回收片段连接pMD18-T载体，连接反应：PCR产物4.5μL，pMD18-T载体0.5μL，Solution I 5μL，共10μL体积，16℃连接3h。所有连接产物，转到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中(TaKaRa，D9057A)，加800mL LB液体培养基，复苏45min，涂于含100mg/L氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃培养至长出菌落(约10h)。挑取单菌落于含100mg/LAmp的LB液体培养基中扩增培养，进行PCR扩增，具体操作与CDS扩增方法一致，检测到的阳性重组子送交华大基因进行测序。扩增的目的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，开放阅读框从第1位到789位碱基，长789bp，将此开放阅读框命名为铁皮石斛胚胎发育晚期丰度蛋白基因DoLEA36，其编码262个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，将该蛋白命名为铁皮石斛胚胎发育晚期丰度蛋白DoLEA36。

实施例2：DoLEA36在铁皮石斛不同发育时期的表达模式分析

取在1/2MS+0.5g/LNAA+6g/L琼脂粉+20g/L蔗糖(pH 5.4)生长的类原球茎、丛生芽和小苗(见图2A)，液氮速冻5分钟，采用天恩泽RNAOut2.0试剂盒提取总RNA，具体方法参照说明书进行。cDNA合成采用Promega公司生产的M-MLV Reverse Transcriptase Kit，具体方法参照说明书进行。以铁皮石斛actin基因(NCBI登录号：JX294908)作为内参，内参qPCR上游引物为：5′-GCGGACGTTGATGATATTCAGCCTC-3′，下游引物为：5′-GAATGTGCTGAGGGAGGCAAGGATAG-3′。DoLEA36的qPCR引物为：5′-GTAGCACTGCTCTACTCCCTAC-3′和5′-GATTGAATCCTTAGCATCCTT-3′。荧光定量PCR采用美国BIO-RAD公司iTaq UniverslSYBR Green supermix反应试剂，PCR反应板和膜均采用美国BIO-RAD公司的产品。反应体系及反应程序按照说明书的操作步骤进行。每个样品设3-4个技术重复，每个反应管反应体系如下：

反应在ABI 7500Real-time PCR仪上进行，反应程序为95℃预变性2min；95℃变性15sec,60℃退火及延伸1min，反应40个循环。所得数据使用ABI 7500Real-time PCRsystem软件进行处理，利用2^-ΔΔCT方法(Livak and Schmittgen 2001)计算相对表达量。DoLEA36在S1(类原球茎时期)的表达量最高，其次是S3(小苗时期)，最后是S2(丛生芽时期)(图2B)。

实施例3：DoLEA36超表达转基因拟南芥的获得与鉴定1、胚胎发育晚期丰富蛋白基因DoLEA36超表达载体的构建

根据pCAMBIA1302载体上的序列，设计两个接头引物，上游引物接头：5′-CGAACGATAGCCATGG-3′，下游引物接头：5′-GTCAGATCTACCATGGT-3′。下划线表示NcoⅠ酶切位点。在DoLEA36的起始密码子和终止密码子附近设计引物(不包含终止密码子)，根据胚胎发育晚期丰富蛋白基因DoLEA36全长设计引物，保证基因的三联体密码子不移码。以铁皮石斛类原球茎的cDNA为模板，高保真扩增获得胚胎发育晚期丰富蛋白基因DoLEA36全长，扩增引物为DoLEA36-OxF(5′-GGACTCTTGACCATGGCAATGGCAAACAAACCTCTTCT-3′)和DoLEA36-OxR(5′-GTCAGATCTACCATGGTCAATCCTGTGCCAGTGTGGT-3′)。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的DNA片段。pCAMBIA1302质粒载体经NcoⅠ单酶切后获得含有粘性末端的线性质粒载体，具体操作按说明书进行。回收线性质粒载体，-20℃保存备用。采用Clontech公司的In-fusion试剂盒进行构建，50℃反应60min后立即放在冰上，将连上目的片段的载体转化DH5α，涂在含有50mg/L Kan的LB固体培养板上，37℃倒置培养12h。待长出菌落，挑取单菌落在含有50mg/L Kan的液体LB培养基上，37℃、220rpm培养14h，后进行菌液PCR验证阳性重组子。阳性克隆送至华大基因测序，测序正确的菌液，接种到含有50mg/L Kan的液体LB培养基上，37℃、220rpm培养14h，提取质粒并保存在-20℃冰箱备用。pCAMBIA1302载体是含有一个花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子(35S promoter)，将胚胎发育晚期丰富蛋白基因DoLEA36(如SEQID NO.1的第1位到786位碱基所示)接在此启动子后面，构建成胚胎发育晚期丰富蛋白基因DoLEA36超表达载体，将此重组表达载体命名为pCAMBIA1302-DoLEA36。

2、重组质粒pCAMBIA1302-DoLEA36转化到农杆菌EHA105

采用冻融法将重组质粒转入农杆菌EHA105。取1μL(浓度为1μg/μL)重组表达载体pCAMBIA1302-DoLEA36与农杆菌EHA105感受态细胞混匀，冰上放置30min，液氮速冻1min，迅速转到37℃孵化5min。加800μl无抗生素的LB培养基，于28℃，180rpm转速中培养3h。将培养物涂到含50mg/L Kan LB固体平板上，28℃倒置培养，直至菌落长出(约48h)。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，菌落PCR鉴定引物为DoLEA36-OxF和DoLEA36-OxR。能扩增得到目的条带的菌落为阳性克隆，在含50mg/LKan LB液体培养基上培养至OD₆₀₀为1左右，加入适量的无菌甘油(终浓度为25～30％)，液氮速冻2min，-80℃保存备用。

3、农杆菌介导的花序侵染法转化拟南芥

从-80℃冰箱中取出保存的菌种，在含50mg/L Kan LB固体平板上划线进行活化农杆菌，挑取单菌落于100ml LB液体培养基中(含50mg/LKan)，28℃、180rpm振荡培养过夜(约16h)，至OD₆₀₀＝0.8-1.0。室温5000rpm离心10min收集菌液。用100ml渗透培养基(1/2MS+0.5g/LMES+5％蔗糖，pH 5.7)重悬农杆菌，并加入20μl表面活性剂Silwet L-77。用大约4-5周，开始抽苔至10cm左右时(即刚开花，形成1-2个角果时)的拟南芥进行花序侵染转化。将所有的花序浸泡在农杆菌重悬液中浸泡1min，斜置晾干。黑暗共培养1天后，在光照条件下培养。直至种子成熟，收集T₀代种子。待种子成熟后进行下一步的培养筛选工作或保存在-20℃冰箱中。

4、转基因植株的鉴定

提取野生型拟南芥和T1代小苗叶片RNA并逆转录成cDNA，以ddH₂O₂调至相同浓度，并以拟南芥AtUBQ10作为参考，其引物为AtUBQ10F(5′-GATCTTTGCCGGAAAACAATTGGAGGATGGT-3′)和AtUBQ10R(5′-CGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAACAGG-3′)。以构超表达载体的引物进行PCR扩增，如图4所示，转基因株系Line 6和Line 7均可以扩增到条带，而野生型则没有该条带，说明DoLEA36已经嵌入到拟南芥的基因组中。

为了进一步证明DoLEA36在转基因株系中可以正常表达，因此进行Western blot验证。如图5所示，在转基因株系均可看到GFP带，证明DoLEA36可在转基因株系中正常表达。具体Westernblot步骤如下：

拟南芥野生型和转基因株系液氮碾磨至粉碎，加入Extraction Buffer 200μL，4℃14,000g离心20min，得到的上清即为总蛋白液，过液氮后-80℃保存备用。ExtractionBuffer具体配方如下：

电泳和转膜等相关仪器设备均采用Bio Rad公司的产品。使用的anti-GFP一抗和鼠二抗均购自Thermo Fisher Scientific公司，其货号分别为cat#GF28R和#62-6520。具体方法参照中国科学院华南植物园表观遗传研究组的方法进行，使用分离胶浓度为12％，具体配方如下：

按表中所列顺序依次加入上述药品，轻轻摇匀，在室温下凝结30min，后加入浓缩胶，浓缩胶配方如下：

插入梳子，待凝固后拔出梳子，放入加有电泳缓冲液的电泳槽中，加入上样蛋白(每孔能加入30-40μl)，先用低电压(90V)跑一会跑出浓缩胶，再用高电压120V进行电泳大约2h，电泳结束后取出凝胶做好标记先用甲醇漂洗几分钟后就行转膜，用PVDF膜，压膜过程中防止膜与滤纸之间有气泡。之后放入转膜缓冲液中进行转膜，转膜电压为100V电流不超过300mA，转膜2h后取出PVDF膜先用5％的脱脂奶粉进行封闭室温小转速1h，之后倒出奶粉加入一抗(GFP抗体)小转速1h，之后用TBST缓冲液进行清洗3次/10min之后加入二抗小转速1h，之后TBST缓冲液进行清洗3次/10min，显影，在ChemiDocTM MP Imaging system(Bio-Rad)拍照。

实施例4：超表达DoLEA36对转基因植株愈伤组织形成的影响

转基因株系和野生型种子经现配的1％NaClO消毒10min后，无菌水漂洗6次后播种在1/2MS+15g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的固体培养基(pH值5.7)中。4℃黑暗同步化2天，移至培养室，在22±2℃，16-h光照/8-h黑暗条件下培养。取6天大小的小苗进行愈伤组织诱导实验，用锋利的手术刀切在子叶和下胚轴连接约0.7mm处以及下胚轴和根连接处0.7mm，用牙签小心挑起不含子叶和根的下胚轴移至1/2MS+15g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的固体培养基(pH值5.7)中，黑暗培养2天，后转移到光照培养12天，统计野生型拟南芥和转基因株系的愈伤组织诱导率。如图6，DoLEA36超表达株系的愈伤组织诱导率显著高于野生型的诱导率。DoLEA36超表达株系的愈伤组织比野生型愈伤组织的大(图7)。因此DoLEA36参与到愈伤组织诱导，促进植物愈伤组织的形成。

序列表

<110> 中国科学院华南植物园

<120> 胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36或其编码基因在调控植物愈伤组织形成中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 789

<212> DNA

<213> 铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)

<400> 1

atggcaaaca aacctcttct tctcatacta acagtagcac tgctctactc cctacatacg 60

gcttcgacgg aagcagcgtc gacggcgaag accggcgctg acgaaagcgt actggtgacc 120

ggcgaaggag ataaagagaa cgaagcatcg gagtcatggg cgacttgggc caaagacaag 180

atttcagagg gcttaggtat caagcatcaa caggtagatg agacggagga gaaggctgag 240

gaagcagctc ggaaggcgca agaagcaggg catgcggcca aggacaccac tggcggaatt 300

gcttcagatg tgggggaata caccaaggag aagaccggag atgctaagga ttctgtcaag 360

gagaagaccg gagatgctaa ggattcggtg aaggatgcta aggattcaat ctcagggaag 420

gtgaaggaca gcacagccag aacagccagc caaaccaaac aaaagaccgg cgaagctaca 480

gaggccacaa agcaaacaac cacagaggcg acgagcaaag cagcagagaa ggcgtcggcg 540

gtgaaggacg ccaccatcga caaggcgaag gaggctgcag cggcgaccaa ggataaggca 600

ggcaaagcac aagaggcgac cactagtaca gccggggaag cggcgaacaa agtgaaggaa 660

ggctatgatg ctgcaaagtc taaggcaggg gagaagctgg atgcggctaa ggagacgctg 720

tcgtccaatt acgaggctgc caaggagaag gttgtgggag ggtcgcagag acacgaggag 780

gagctgtga 789

<210> 2

<211> 262

<212> PRT

<213> 铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)

<400> 2

Met Ala Asn Lys Pro Leu Leu Leu Ile Leu Thr Val Ala Leu Leu Tyr

1 5 10 15

Ser Leu His Thr Ala Ser Thr Glu Ala Ala Ser Thr Ala Lys Thr Gly

20 25 30

Ala Asp Glu Ser Val Leu Val Thr Gly Glu Gly Asp Lys Glu Asn Glu

35 40 45

Ala Ser Glu Ser Trp Ala Thr Trp Ala Lys Asp Lys Ile Ser Glu Gly

50 55 60

Leu Gly Ile Lys His Gln Gln Val Asp Glu Thr Glu Glu Lys Ala Glu

65 70 75 80

Glu Ala Ala Arg Lys Ala Gln Glu Ala Gly His Ala Ala Lys Asp Thr

85 90 95

Thr Gly Gly Ile Ala Ser Asp Val Gly Glu Tyr Thr Lys Glu Lys Thr

100 105 110

Gly Asp Ala Lys Asp Ser Val Lys Glu Lys Thr Gly Asp Ala Lys Asp

115 120 125

Ser Val Lys Asp Ala Lys Asp Ser Ile Ser Gly Lys Val Lys Asp Ser

130 135 140

Thr Ala Arg Thr Ala Ser Gln Thr Lys Gln Lys Thr Gly Glu Ala Thr

145 150 155 160

Glu Ala Thr Lys Gln Thr Thr Thr Glu Ala Thr Ser Lys Ala Ala Glu

165 170 175

Lys Ala Ser Ala Val Lys Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ala Lys Glu Ala

180 185 190

Ala Ala Ala Thr Lys Asp Lys Ala Gly Lys Ala Gln Glu Ala Thr Thr

195 200 205

Ser Thr Ala Gly Glu Ala Ala Asn Lys Val Lys Glu Gly Tyr Asp Ala

210 215 220

Ala Lys Ser Lys Ala Gly Glu Lys Leu Asp Ala Ala Lys Glu Thr Leu

225 230 235 240

Ser Ser Asn Tyr Glu Ala Ala Lys Glu Lys Val Val Gly Gly Ser Gln

245 250 255

Arg His Glu Glu Glu Leu

260

Claims

1.铁皮石斛胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36或其编码基因在调控植物愈伤组织形成中的应用，所述的胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是在植物中超表达胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36的编码基因促进植物愈伤组织形成中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的促进植物愈伤组织形成为促进拟南芥下胚轴愈伤组织形成。

4.根据权利要求1、2或3所述的应用，其特征在于，所述的胚胎发育晚期丰富蛋白DoLEA36的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的植物是拟南芥。