CN113817746B

CN113817746B - 节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92及其应用

Info

Publication number: CN113817746B
Application number: CN202110833839.3A
Authority: CN
Inventors: 王敏; 彭庆务; 史绍琪; 何晓明; 江彪; 杨松光; 谢大森; 刘文睿; 刘微; 闫晋强
Original assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2021-07-22
Filing date: 2021-07-22
Publication date: 2022-11-29
Anticipated expiration: 2041-07-22
Also published as: CN113817746A

Abstract

本发明公开了一种节瓜bHLH类转录因子基因Cq‑bHLH92，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述节瓜bHLH类转录因子基因Cq‑bHLH92的编码蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。还公开了所述节瓜bHLH类转录因子基因Cq‑bHLH92或所述编码蛋白在调控节瓜苗期低温胁迫方面的应用。本发明通过外源注射Cq‑bHLH92过表达载体菌液的叶片抵抗低温胁迫的能力增强，说明该基因正调控节瓜的耐冷性，因而可以进一步在后续的生产实践中，可以通过过表达Cq‑bHLH92基因，从而提高节瓜的苗期耐冷性。

Description

节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92及其应用

技术领域

本发明属于节瓜技术领域，具体涉及一种节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92及其应用。

背景技术

bHLH(basic Helix-Loop-Helix)是广泛存在于真核生物体内的碱性螺旋-环-螺旋类转录调控因子，参与植物的生长发育、次生物质代谢以及非生物胁迫应答反应。其中，bHLH调控植物抵抗逆境胁迫，包括低温胁迫(Wang et al.，2011)、耐盐胁迫(Kavas etal.，2016)、缺铁胁迫(Rumen et al.，2012)等。低温胁迫包括冷害(低于20℃)胁迫和冻害(低于0℃)，对植物的生长发育造成了严重威胁。低温既可以直接影响植物生理代谢途径相关的基因表达，也可以间接诱导与其他胁迫相关基因的表达，从而引起其他胁迫对植物造成进一步的伤害。

节瓜(BenincasahispidaCogn.var.Chieh-qua How.)是葫芦科冬瓜属的重要蔬菜作物，也是我国岭南地区的名优瓜类蔬菜，深受消费者喜爱。节瓜原产于亚热带地区，喜温不耐冷，但是在早春栽培过程中，易遭受苗期低温冷害的伤害，导致叶片出现水浸状斑点、失绿黄化、节间变短、植株生长缓慢、衰老甚至死亡，严重制约着节瓜的早熟丰产。因此，探究节瓜苗期耐低温的分子机制，选育低温耐受的优异节瓜种质是解决当前问题的根本途径。

发明内容

本发明的目的在于提供节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92及其编码蛋白。

本发明的目的还在于提供上述节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92、其编码蛋白在调控节瓜苗期低温胁迫方面的应用。

本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92的编码蛋白，它的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

本发明上述节瓜BHLH类转录因子基因Cq-bHLH92的制备方法，包括以下步骤：将节瓜幼苗真叶的总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对进行PCR扩增获得。

其中引物对具体为：

Cq-bHLH92-F：ATGGATGATAGCTTTTCTGTG(如SEQ ID NO：3所示)

Cq-bHLH92-R：TTAGCTTTCAAATTCTGGACC(如SEQ ID NO：4所示)。

本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：上述的节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92或所述编码蛋白在调控节瓜苗期低温胁迫方面的应用。

本发明通过试验发现：将节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92克隆到pEarleyGate101载体上，获得pEarleyGate 101-Cq-bHLH92植物过表达载体，对苗期节瓜叶片进行菌液注射，低温胁迫观察叶片表型，结果表明，在低温胁迫环境中处理后，注射过Cq-bHLH92过表达载体的叶片仍然是绿色，黄化程度较对照明显减慢，对照叶片明显发黄，其中低温胁迫环境是指白天12℃、黑夜8℃处理7天，对照为正常植株，没有注释外源菌液。

本发明具有如下优点：

(1)本发明利用电子克隆技术分离鉴定了节瓜Cq-bHLH92的编码序列信息；

(2)本发明利用特异引物研究了Cq-bHLH92在不同逆境胁迫下的表达，发现节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92可以被多种胁迫因素诱导表达，但是在低温胁迫时表达量较高；

(3)本发明通过外源注射Cq-bHLH92过表达载体菌液的叶片抵抗低温胁迫的能力增强，说明该基因正调控节瓜的耐冷性，因而可以进一步在后续的生产实践中，可以通过过表达Cq-bHLH92基因，从而提高节瓜的苗期耐冷性。

附图说明

图1是实施例1中节瓜Cq-bHLH92基因的克隆，其中1-3是Cq-bHLH92基因的CDS扩增结果，M是DNA Marker条带；

图2是实施例2中节瓜Cq-bHLH92基因在不同逆境胁迫下的表达，图中的C这个C代表对照，L代表低温，H代表高温，A代表脱落酸(ABA)，N代表氯化钠(NaCl)，P代表聚乙二醇(PEG)；

图3是实施例3中节瓜Cq-bHLH92在不同组织中的表达；

图4是实施例4中外源注射Cq-bHLH92过表达菌液的叶片耐冷性增强，其中A图代表低温处理前植株的生长状况，B图为低温胁迫7天后的生长情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92及其编码蛋白的获取

(1)RNA提取和cDNA的克隆

选用的节瓜品种为新农民节瓜品种的自然授粉后代经过系谱法选育而来的纯合自交系材料。

温汤浸种种子6～8小时，然后在30～32℃的培养箱中催芽2～3天，待种子露白时播种。幼苗长到一叶一心后，对3株幼苗的真叶进行混合取样，加入液氮后用研钵裂解组织和细胞，并迅速转入2.0mL的离心管中，采用植物总RNA提取试剂盒(RNAprep pure TissueKit，TIANGEN)；用分光光度计检测RNA的浓度，同时琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。接下来，使用大连宝生物公司的逆转录试剂盒(PrimeScript Reverse Transcriptase kit，Takara)，反转录成cDNA。

(2)Cq-bHLH92基因的扩增

以节瓜总cDNA为模板，以Cq-bHLH92-F(atggatgatagcttttctgtg，如SEQ ID NO：3)和Cq-bHLH92-R(ttagctttcaaattctggacc，如SEQ ID NO：4所示)为正向和反向引物，克隆获得节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92基因片段。

将cDNA模板稀释5倍，配制10μL的反应体系：5μLMix(2×)，1.0μL Forward Primer(Cq-bHLH92-F)，1.0μL Reverse Primer(Cq-bHLH92-R)，1.0μLcDNA，，2.0μLddH₂O进行PCR扩增反。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，58℃复性2分钟，72℃延伸45秒，34个循环后72℃8分钟。

最终PCR产物进行测序，获得了节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92的序列，如图1所示，其中1-3是Cq-bHLH92基因的CDS扩增结果，M是DNA Marker条带。

该节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92的核苷酸序列具体如下：

(如SEQ ID NO：1所示)。

该节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92的编码蛋白的氨基酸序列具体如下：

(如SEQ ID NO：2所示)。

实施例2节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92在不同逆境胁迫下的表达研究

根据实施例1中构建的节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92的cDNA序列，设计实时定量PCR(qRT-PCR)引物：

Cq-bHLH92-Q-F：GAGACAGATAAGTGCTTTC；

Cq-bHLH92-Q-R：CTTATCATTCTTAGTATTTTT。

所用的内参引物为节瓜的Actin引物，包括：

Actin-Q-F：TCAACCCAAAGGCTAACAG；

Actin-Q-R：CTTGTCCATCAGGCAGTTC。

将cDNA模板稀释5倍，配制20μL的反应体系：10μL SYBR Premix Ex Taq II(2×)，0.8μLForward Primer，0.8μLReverse Primer，2μLcDNA，0.4μLRoxReference Dye II，6.0μl ddH₂O，然后在荧光定量PCR仪(ABI Prism 7500HT，Applied Biosystems)上进行扩增反应。

反应程序为：95℃，30sec，95℃，5sec，60℃，34sec，总共40个循环。然后在荧光定量PCR仪(ABI Prism 7500HT，Applied Biosystems)上进行扩增反应，以Actin基因作内参，计算基因的相对表达量。

将生长到一叶一心的节瓜幼苗从培养盆中带根拔出，清洗干净，放置在无添加的水培溶液中待处理。配制水培溶液(对照)，将脱落酸(ABA，200mg/L)、聚乙二醇(PEG，10％)、NaCl(100mmol/)加入到溶液中，结合高温(40℃)和低温(8℃)进行幼苗的非生物胁迫处理。处理后分别在0h、6h、24h 5个时间节点采集幼苗的真叶及子叶，3次生物学重复，每个生物学重复包括3个技术重复定量。分别在正常条件下，低温(L)，高温(H)，脱落酸(A)，氯化钠(N)，聚乙二醇(P)条件下检测Cq-bHLH92的表达量变化。

图中的C代表对照，L代表低温，H代表高温，A代表脱落酸(ABA)，N代表氯化钠(NaCl)，P代表聚乙二醇(PEG)。0，6，24分别代表胁迫后的时间。

结果如图2所示，从图2中可以得出Cq-bHLH92易受ABA和低温胁迫诱导表达，其中最易受低温胁迫诱导表达。

实施例3节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92在不同组织中的表达：

提取节瓜不同组织(茎、叶、花、卷须、雌花、雄花)的RNA，并反转成cDNA。利用引物Cq-bHLH92-Q-F：GAGACAGATAAGTGCTTTC；Cq-bHLH92-Q-R：CTTATCATTCTTAGTATTTTT结合qRT-PCR技术研究Cq-bHLH92在不同组织间的表达差异。

PCR条件与实施例2相同。

结果表明，Cq-bHLH92在卷须、顶芽和子房中表达量较高，其中在卷须中表达量最高。

实施例4节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92过表达载体的构建与外源菌液的注射

以实施例1中构建的节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92的cDNA为模板，PCR扩增867bp的编码区，PCR扩增产物回收纯化，采用Gateway技术将Cq-bHLH92基因连接到过表达载体pEarleyGate 101质粒上，转化后挑选阳性克隆进行测序，正确的质粒转化农杆菌GV3101，以50mg/L的Rif和50mg/L的Kan作为抗性筛选，获得的单克隆经过PCR鉴定为阳性。

将含有Cq-bHLH92质粒的农杆菌过夜培养(150μL菌液+30mL液体培养基)后，离心(5000g，8分钟)得到菌体沉淀。接着用MES溶液(10mmol/L MES+10mmol/L MgCl₂+200μmol/LAS)重悬，最终调整悬浮液OD600值为0.6～0.8，黑暗条件下室温静置2小时备用。用1mL注射器将悬浮液注射到两叶一心时期节瓜幼苗平展的叶片背面，使叶片呈水侵状。注射后将节瓜幼苗置于气候箱(day：12℃；night：8℃)，低温处理7天，以未注射的节瓜幼苗作为对照，观察植株表型。

结果表明，在低温胁迫处理7天之后，对照组(未进行外源菌液注释的幼苗)的叶片已经发黄，而注射菌液的叶片部位颜色仍为绿色。叶片发黄是节瓜低温胁迫时的主要表型特征，过表达节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92的叶片在低温胁迫时的持绿时间延长，说明节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92在节瓜抵御低温冷害方面发挥重要作用。

以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。

序列表

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 一种节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 870

<212> DNA

<213> 碱性螺旋-环-螺旋类转录调控因子(basic Helix-Loop-Helix)

<400> 1

atggatgata gcttttctgt ggaatactgg cataacgatt tcttttggct cgacgctccc 60

atttctgtcc ccgtccccgc ctccacctcc gctcccgcga gacagataag tgctttcgta 120

ccatatctaa ctcgaccggc taccggattg ggacaagaaa acaatccaac aactagtgct 180

gccgccgcca ctgtcaccac caccagcagc agctataatt ctaggaatgt caacaagagg 240

atggttgagt attggaggaa acattggcat gaaaagaaag aaccaacttc cctaggagat 300

tttgagagag aaaaatgtca ccggcacatg ttgaacgaga ggatgaggag agagaaacag 360

aaacagagtt atttggcact tcactccatg ctcccaaaaa atactaagaa tgataagaac 420

tcgatcattc aaagcgcgac gagaacaata caagaaatga aagccttaga gaagacttta 480

aagagaagga acttagagtt ggagatggca atagcaagga agaagaaaga aaaggaaaaa 540

gggacaacac caataataaa tgtagcattg tccaaccctt cttgtgggat caactcgatg 600

ctggctgttc tcaattttct caaaactgtt ggagtaaatt ccaaagccat tcatgccact 660

ttcttcaact ctcaattttc agcccaatta gccattgata cccatatggg agctgccgaa 720

gtagaaagag cattgcaggt gacgctagac gaagccgaaa ggaaatttca aaggcaatgc 780

aaggaaggat ccaaagaaat aaaagaaacc cattttaatt ttaacaatag tagagggacc 840

caccatgtgg gtccagaatt tgaaagctaa 870

<210> 2

<211> 289

<212> PRT

<213> 碱性螺旋-环-螺旋类转录调控因子(basic Helix-Loop-Helix)

<400> 2

Met Asp Asp Ser Phe Ser Val Glu Tyr Trp His Asn Asp Phe Phe Trp

1 5 10 15

Leu Asp Ala Pro Ile Ser Val Pro Val Pro Ala Ser Thr Ser Ala Pro

20 25 30

Ala Arg Gln Ile Ser Ala Phe Val Pro Tyr Leu Thr Arg Pro Ala Thr

35 40 45

Gly Leu Gly Gln Glu Asn Asn Pro Thr Thr Ser Ala Ala Ala Ala Thr

50 55 60

Val Thr Thr Thr Ser Ser Ser Tyr Asn Ser Arg Asn Val Asn Lys Arg

65 70 75 80

Met Val Glu Tyr Trp Arg Lys His Trp His Glu Lys Lys Glu Pro Thr

85 90 95

Ser Leu Gly Asp Phe Glu Arg Glu Lys Cys His Arg His Met Leu Asn

100 105 110

Glu Arg Met Arg Arg Glu Lys Gln Lys Gln Ser Tyr Leu Ala Leu His

115 120 125

Ser Met Leu Pro Lys Asn Thr Lys Asn Asp Lys Asn Ser Ile Ile Gln

130 135 140

Ser Ala Thr Arg Thr Ile Gln Glu Met Lys Ala Leu Glu Lys Thr Leu

145 150 155 160

Lys Arg Arg Asn Leu Glu Leu Glu Met Ala Ile Ala Arg Lys Lys Lys

165 170 175

Glu Lys Glu Lys Gly Thr Thr Pro Ile Ile Asn Val Ala Leu Ser Asn

180 185 190

Pro Ser Cys Gly Ile Asn Ser Met Leu Ala Val Leu Asn Phe Leu Lys

195 200 205

Thr Val Gly Val Asn Ser Lys Ala Ile His Ala Thr Phe Phe Asn Ser

210 215 220

Gln Phe Ser Ala Gln Leu Ala Ile Asp Thr His Met Gly Ala Ala Glu

225 230 235 240

Val Glu Arg Ala Leu Gln Val Thr Leu Asp Glu Ala Glu Arg Lys Phe

245 250 255

Gln Arg Gln Cys Lys Glu Gly Ser Lys Glu Ile Lys Glu Thr His Phe

260 265 270

Asn Phe Asn Asn Ser Arg Gly Thr His His Val Gly Pro Glu Phe Glu

275 280 285

Ser

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggatgata gcttttctgt g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggatgata gcttttctgt g 21

Claims

1.节瓜bHLH类转录因子Cq-bHLH92或节瓜bHLH类转录因子Cq-bHLH92编码的蛋白在调控节瓜苗期低温胁迫中的应用，其中所述节瓜bHLH类转录因子Cq-bHLH92的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述节瓜bHLH类转录因子Cq-bHLH92编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示，所述低温胁迫是指白天12℃、黑夜8℃处理7天。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是：将节瓜bHLH类转录因子Cq-bHLH92克隆到pEarleyGate 101载体上，获得pEarleyGate 101-Cq-bHLH92植物过表达载体，对苗期节瓜叶片进行菌液注射，低温胁迫观察叶片表型，结果表明，在低温胁迫环境中处理后，注射过Cq-bHLH92过表达载体的叶片仍然是绿色，黄化程度较对照明显减慢，对照叶片明显发黄，对照为正常植株，没有注释外源菌液。