CN109609509A - WRKY类转录因子基因CqWRKY1在调控节瓜抗旱性方面的应用 - Google Patents
WRKY类转录因子基因CqWRKY1在调控节瓜抗旱性方面的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了WRKY类转录因子基因CqWRKY1在调控节瓜抗旱性方面的应用，其中所述WRKY类转录因子基因CqWRKY1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明获得了节瓜CqWRKY1的编码序列信息，构建的节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1过表达植株的抗旱性增强，说明该基因正调控节瓜的抗旱性。因此，在后续的生产实践中，可以通过过表达节瓜中的WRKY类转录因子基因CqWRKY1，从而提高节瓜的抗旱性能。
Description
技术领域
本发明属于节瓜技术领域，具体涉及WRKY类转录因子基因CqWRKY1在调控节瓜抗旱性方面的应用。
背景技术
干旱是影响作物生长及产量的最重要的非生物因素之一，其严重干扰了植物的正常生理代谢，且由水分亏缺造成的植物生长减少和作物减产超过了其他逆境影响的总和。
节瓜(Benincasa hispida Cogn.var.Chieh-qua How)是葫芦科冬瓜属的重要蔬菜作物，也是我国岭南地区的名优瓜类蔬菜，深受消费者喜爱。近年来，节瓜在华南地区生产，特别是在春夏季，常常会面临高温天气而导致的干旱，影响了节瓜的产量与品种。目前节瓜基因组尚未公布，分子遗传研究较少，尚未分离与抗旱性相关的有益基因，抗旱机制研究较少。
WRKY类转录因子是广泛存在于植物界中的一类重要转录调控因子，其N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列，通过调节启动子中含W-box元件的基因的表达，参与植物对病原体的防卫反应、非生物胁迫、生长发育等过程，在植物抗旱性方面起到重要的作用。然而，目前关于WRKY类转录因子在节瓜抗旱性方面的研究尚未见报道。因此，开展WRKY类转录因子在节瓜抗旱性方面的研究，不仅可以在遗传水平方面揭示WRKY参与节瓜抗旱性的作用，也为节瓜抗旱性分子辅助育种提供理论支撑，具有重要研究价值。
发明内容
本发明的目的在于提供WRKY类转录因子基因CqWRKY1在调控节瓜抗旱性方面的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：WRKY类转录因子基因CqWRKY1在调控节瓜抗旱性方面的应用，其中所述WRKY类转录因子基因CqWRKY1的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
上述WRKY类转录因子基因CqWRKY1编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明所述WRKY类转录因子基因CqWRKY1是将节瓜幼苗真叶的总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对进行PCR扩增获得。
其中引物对具体为：
CqWRKY1-F：ATGGCCTCCTCTTCCGGGAG
CqWRKY1-R：CTAACATAGGAGAGATTGGA
本发明将CqWRKY1基因克隆到pEarleyGate 101载体上，获得pEarleyGate 101-CqWRKY1过表达载体，构建过程中的引物分别为：
CqWRKY1-F:ATGGCCTCCTCTTCCGGGAG；
CqWRKY1-R:CTAACATAGGAGAGATTGGA。
结果发现，植株缺水处理8天时，过表达植株的抗旱性明显高于对照，说明WRKY类转录因子基因CqWRKY1在正向调控节瓜的抗旱性。因此，在后续的生产实践中，可以通过过表达节瓜中的WRKY类转录因子基因CqWRKY1，从而提高节瓜的抗旱性能。
本发明具有如下优点：本发明利用电子克隆技术分离鉴定了节瓜CqWRKY1的编码序列信息；构建的节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1过表达植株的抗旱性增强，说明该基因正调控节瓜的抗旱性。因此，在后续的生产实践中，可以通过过表达节瓜中的WRKY类转录因子基因CqWRKY1，从而提高节瓜的抗旱性能。
附图说明
图1是实施例1中CqWRKY1基因的克隆，其中1-3是CqWRKY1基因的CDS扩增结果，M是DNA Marker条带；
图2是实施例2中节瓜CqWRKY1过表达阳性植株的检测；
图3是实施例3中CqWRKY1过表达植株在缺水胁迫下的抗旱性增强，其中A图代表干旱处理前植株的生长状况，B图为缺水8天的植株的生长情况，C图为恢复后的植株的生长情况。OE1和OE5分别代表过表达(Over expressing:OE)CqWRKY1基因的阳性纯合株系。
具体实施方式
下面结合实例具体进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例1WRKY类转录因子基因CqWRKY1及其编码蛋白的获取
(1)RNA提取和cDNA的克隆
选用的节瓜品种为新农民节瓜品种的自然授粉后代经过系谱法选育而来的纯合自交系材料。
温汤浸种种子6-8小时，然后在30-32℃的培养箱中催芽2-3天，待种子露白时播种。幼苗长到一叶一心后，对3株幼苗的真叶进行混合取样，加入液氮后用研钵裂解组织和细胞，并迅速转入2.0mL的离心管中，采用植物总RNA提取试剂盒(RNAprep pure TissueKit，TIANGEN)；用分光光度计检测RNA的浓度，同时琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。接下来，使用大连宝生物公司的逆转录试剂盒(PrimeScript Reverse Transcriptase kit，Takara)，反转录成cDNA。
(2)CqWRKY1基因的扩增
以节瓜总cDNA为模板，以CqWRKY1-F(ATGGCCTCCTCTTCCGGGAG，如SEQ ID NO：3所示)和CqWRKY1-R(CTAACATAGGAGAGATTGGA，如SEQ ID NO：4所示)为正向和反向引物，克隆获得CqWRKY1基因片段。
PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，58℃复性2分钟，72℃延伸45秒，34个循环后72℃8分钟。最终PCR产物进行测序，获得了CqWRKY1的序列，如图1所示，其中1-3是CqWRKY1基因的CDS扩增结果，M是DNA Marker条带。
通过NCBI-Blast和MEGA6.0软件比对发现，该序列与西瓜WRKY1-like(HM030879.1)、黄瓜WRKY33-like(NM_001280728.1)等同源性较高，且含有PolyA结构，表明CqWRKY1是一个编码WRKY类转录因子的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
该WRKY类转录因子基因CqWRKY1的核苷酸序列具体如下：
atggcctcctcttccgggagcgtagacacctctgctaattctcatccttctttcactttctctactcatccttttatgacttcttactctgaccttctcgcttcctccaacaacgatcctccttcctccgccgcaccccacgcttctctccgcggttccggtactggggttcctaaattcaaatccctccctcctccttctctccctctctctcctcctcccatgtctccttcttcctttttcgctattcctcctggcttgagtcccgctgagcttcttgattcccctgttcttctcagtgcttctcatgttctgccgtcgccgactaccgggagtttcccgtctcagtcgttgaattggaagagcaattctgggtgtaatcagcagagcattaaggaagaaaacaaatatttgtccaatttctcatttcaaactcaatcgtcaaagtttccgccgacgtcttttcagccttcatccaccacagctcctacgactcagggatggagttttcaagaacagcggaagaaagaggacggtttctcgtcggagaagaatatggtgaagccggagttcggatcgatgcggagcttctcaccggaatatggggttgttcaaaaccagagccaaaacaacggcagcggggagttgcagtctgactacggcaataattaccctcaacaatctcagacgttgaatcgaaggtcggacgacggctacaactggagaaaatacggccaaaaacaggttaaaggaagtgaaaatccgagaagctattataagtgcactttccccaattgcccaactaagaaaaaggttgaaagatccttagatggacagatcacggagattgtttacaaaggcagccataaccatgccaagccccaatccacgaggaggtcgtcactgtcgtcagccggttcttcccacgccctggtggctttgattccggctactaatgagatggcggaccaatcatttacaacccaaggcagcggccaattcgacggcgttgcaacgccggagaattcctcaatttcaatcggcgacgacgacttcgatcgaagctctcaaaagagcaaatccggaggggacgattttgatgaggacgaaccagaggctaagagatggcgaagggaaggtgacaacaatgaaggtatttcggcggtcggtagccggacggtgagagagccgagagtcgtcgtccaaaccaccagcgacatcgacattctggacgatggttaccggtggaggaagtacggccagaaagttgtgaagggaaacccaaatccaaggagttactacaaatgcacaaatccaggatgtccagtaagaaagcacgtggagagagcttcacatgatctaagagcagtgatcacaacttatgaagggaagcacaaccatgatgttccaccagcacgtggcagtggaagccattccctcagccgtccattccccagcaacgaccctccggccacggcgatccgcccatcggcagtgacccatcagtcaaacaacggggggcatttgcaaggtctaaggctgcagcaatcttcagagtcccaaacagcattcacagtggaaatggtgcaaaatgggaatggattttcattcccagaatttggaaactcaatgggaatgggagtaggatcctacatcaaccaaacacagcctaatgacaatttgttaatcagagctaaagaagagccaagagatcatgacatgttcatccaatctctcctatgttag。
该WRKY类转录因子基因CqWRKY1的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体如下：
MASSSGSVDTSANSHPSFTFSTHPFMTSYSDLLASSNNDPPSSAAPHASLRGSGTGVPKFKSLPPPSLPLSPPPMSPSSFFAIPPGLSPAELLDSPVLLSASHVLPSPTTGSFPSQSLNWKSNSGCNQQSIKEENKYLSNFSFQTQSSKFPPTSFQPSSTTAPTTQGWSFQEQRKKEDGFSSEKNMVKPEFGSMRSFSPEYGVVQNQSQNNGSGELQSDYGNNYPQQSQTLNRRSDDGYNWRKYGQKQVKGSENPRSYYKCTFPNCPTKKKVERSLDGQITEIVYKGSHNHAKPQSTRRSSLSSAGSSHALVALIPATNEMADQSFTTQGSGQFDGVATPENSSISIGDDDFDRSSQKSKSGGDDFDEDEPEAKRWRREGDNNEGISAVGSRTVREPRVVVQTTSDIDILDDGYRWRKYGQKVVKGNPNPRSYYKCTNPGCPVRKHVERASHDLRAVITTYEGKHNHDVPPARGSGSHSLSRPFPSNDPPATAIRPSAVTHQSNNGGHLQGLRLQQSSESQTAFTVEMVQNGNGFSFPEFGNSMGMGVGSYINQTQPNDNLLIRAKEEPRDHDMFIQSLLC-。
实施例2CqWRKY1过表达载体的构建与阳性植株的检测
(1)CqWRKY1过表达载体的构建
以CqWRKY1基因的cDNA为模板，PCR扩增1746bp的编码区，PCR扩增产物回收纯化，采用Gateway技术将CqWRKY1基因连接到过表达载体pEarleyGate 101质粒上，转化后挑选阳性克隆进行测序，正确的质粒转化农杆菌GV3101，以50mg/L的Rif和50mg/L的Kan作为抗性筛选，获得的单克隆经过PCR鉴定为阳性。通过农秆菌介导法，转化节瓜材料。
(2)过表达植株检测
根据过表达载体序列(pEarleyGate 101载体是由广东省农业科学院蔬菜研究所提供，用于(1)中制备过表达载体)和CqWRKY1的编码区(CDS)序列设计的特异性引物CqWRKY1-F:ATGGCCTCCTCTTCCGGGAG；CqWRKY1-R:CTAACATAGGAGAGATTGGA)。以转化空白载体为对照，PCR扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，能够扩增出目标条带的为阳性植株；另一方面，以转基因受体亲本的CqWRKY1基因的表达量为对照，CqWRKY1基因表达水平显著上升的植株为阳性植株，分别为过表达(Over expressing:OE)CqWRKY1基因的阳性纯合株系OE1和OE5(图2)。具体表达量检测步骤如下：
根据CqWRKY1的cDNA序列，设计实时定量PCR(qRT-PCR)引物：CqWRKY1-Q-F:CCTCCTCCTTCTCTCCCTCT；CqWRKY1-Q-R:AACGACT GAGACGGGAAACT。所用的内参引物为节瓜的Actin引物，Actin-Q-F：TCAACCCAAAGGCTAACAG；Actin-Q-R:CTTGTCCATCAGGCAGTTC。
将cDNA模板稀释5倍，配制20μL的反应体系：10μL SYBR Premix Ex Taq II(2×)，0.8μLForward Primer，0.8μLReverse Primer，2μLcDNA，0.4μLRox Reference Dye II，6.0μl ddH2O，然后在荧光定量PCR仪(ABI Prism 7500HT，Applied Biosystems)上进行扩增反应。
反应程序为：95℃，30sec，95℃，5sec，60℃，34sec，总共40个循环。然后在荧光定量PCR仪(ABI Prism 7500HT，Applied Biosystems)上进行扩增反应，以Ubiqutin基因作内参，计算基因的相对表达量。每个样品设置3个生物学重复，每个生物学重复包括3个技术重复定量。
从图2中可以看出，过表达植株的表达量显著高于对照。
实施案例3过表达植株的抗旱性鉴定
将过表达基因CqWRKY1的T2纯系节瓜种子(T0代阳性植株经过自交授粉得到T1代植株，然后T1代经过自交授粉得到T2代植株，经过qPCR检测获得纯系过表达种子)和对照种子在相同条件下进行催芽，之后播种在灭菌的基质中。待长到一叶一心时，进行干旱缺水处理8天，观察植株的生长状况。之后接着加水恢复3天，结果如图3所示。
从图3中可以看出，在干旱胁迫下，转基因植株的抗性明显高于对照，说明CqWRKY1在调控节瓜抗旱性方面有一定的正向作用。但是在生产上可以通过过表达CqWRKY1基因，以增强CqWRKY1基因的表达量，从而达到提高节瓜抗旱性的效果。
以上所述仅是本发明的非限定实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思和不做出创造性劳动的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所
<120> WRKY类转录因子基因CqWRKY1在调控节瓜抗旱性方面的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1746
<212> DNA
<213> 节瓜(Benincasa hispida Cogn. var. Chieh-qua How)
<400> 1
atggcctcct cttccgggag cgtagacacc tctgctaatt ctcatccttc tttcactttc 60
tctactcatc cttttatgac ttcttactct gaccttctcg cttcctccaa caacgatcct 120
ccttcctccg ccgcacccca cgcttctctc cgcggttccg gtactggggt tcctaaattc 180
aaatccctcc ctcctccttc tctccctctc tctcctcctc ccatgtctcc ttcttccttt 240
ttcgctattc ctcctggctt gagtcccgct gagcttcttg attcccctgt tcttctcagt 300
gcttctcatg ttctgccgtc gccgactacc gggagtttcc cgtctcagtc gttgaattgg 360
aagagcaatt ctgggtgtaa tcagcagagc attaaggaag aaaacaaata tttgtccaat 420
ttctcatttc aaactcaatc gtcaaagttt ccgccgacgt cttttcagcc ttcatccacc 480
acagctccta cgactcaggg atggagtttt caagaacagc ggaagaaaga ggacggtttc 540
tcgtcggaga agaatatggt gaagccggag ttcggatcga tgcggagctt ctcaccggaa 600
tatggggttg ttcaaaacca gagccaaaac aacggcagcg gggagttgca gtctgactac 660
ggcaataatt accctcaaca atctcagacg ttgaatcgaa ggtcggacga cggctacaac 720
tggagaaaat acggccaaaa acaggttaaa ggaagtgaaa atccgagaag ctattataag 780
tgcactttcc ccaattgccc aactaagaaa aaggttgaaa gatccttaga tggacagatc 840
acggagattg tttacaaagg cagccataac catgccaagc cccaatccac gaggaggtcg 900
tcactgtcgt cagccggttc ttcccacgcc ctggtggctt tgattccggc tactaatgag 960
atggcggacc aatcatttac aacccaaggc agcggccaat tcgacggcgt tgcaacgccg 1020
gagaattcct caatttcaat cggcgacgac gacttcgatc gaagctctca aaagagcaaa 1080
tccggagggg acgattttga tgaggacgaa ccagaggcta agagatggcg aagggaaggt 1140
gacaacaatg aaggtatttc ggcggtcggt agccggacgg tgagagagcc gagagtcgtc 1200
gtccaaacca ccagcgacat cgacattctg gacgatggtt accggtggag gaagtacggc 1260
cagaaagttg tgaagggaaa cccaaatcca aggagttact acaaatgcac aaatccagga 1320
tgtccagtaa gaaagcacgt ggagagagct tcacatgatc taagagcagt gatcacaact 1380
tatgaaggga agcacaacca tgatgttcca ccagcacgtg gcagtggaag ccattccctc 1440
agccgtccat tccccagcaa cgaccctccg gccacggcga tccgcccatc ggcagtgacc 1500
catcagtcaa acaacggggg gcatttgcaa ggtctaaggc tgcagcaatc ttcagagtcc 1560
caaacagcat tcacagtgga aatggtgcaa aatgggaatg gattttcatt cccagaattt 1620
ggaaactcaa tgggaatggg agtaggatcc tacatcaacc aaacacagcc taatgacaat 1680
ttgttaatca gagctaaaga agagccaaga gatcatgaca tgttcatcca atctctccta 1740
tgttag 1746
<210> 2
<211> 581
<212> PRT
<213> 节瓜(Benincasa hispida Cogn. var. Chieh-qua How)
<400> 2
Met Ala Ser Ser Ser Gly Ser Val Asp Thr Ser Ala Asn Ser His Pro
1 5 10 15
Ser Phe Thr Phe Ser Thr His Pro Phe Met Thr Ser Tyr Ser Asp Leu
20 25 30
Leu Ala Ser Ser Asn Asn Asp Pro Pro Ser Ser Ala Ala Pro His Ala
35 40 45
Ser Leu Arg Gly Ser Gly Thr Gly Val Pro Lys Phe Lys Ser Leu Pro
50 55 60
Pro Pro Ser Leu Pro Leu Ser Pro Pro Pro Met Ser Pro Ser Ser Phe
65 70 75 80
Phe Ala Ile Pro Pro Gly Leu Ser Pro Ala Glu Leu Leu Asp Ser Pro
85 90 95
Val Leu Leu Ser Ala Ser His Val Leu Pro Ser Pro Thr Thr Gly Ser
100 105 110
Phe Pro Ser Gln Ser Leu Asn Trp Lys Ser Asn Ser Gly Cys Asn Gln
115 120 125
Gln Ser Ile Lys Glu Glu Asn Lys Tyr Leu Ser Asn Phe Ser Phe Gln
130 135 140
Thr Gln Ser Ser Lys Phe Pro Pro Thr Ser Phe Gln Pro Ser Ser Thr
145 150 155 160
Thr Ala Pro Thr Thr Gln Gly Trp Ser Phe Gln Glu Gln Arg Lys Lys
165 170 175
Glu Asp Gly Phe Ser Ser Glu Lys Asn Met Val Lys Pro Glu Phe Gly
180 185 190
Ser Met Arg Ser Phe Ser Pro Glu Tyr Gly Val Val Gln Asn Gln Ser
195 200 205
Gln Asn Asn Gly Ser Gly Glu Leu Gln Ser Asp Tyr Gly Asn Asn Tyr
210 215 220
Pro Gln Gln Ser Gln Thr Leu Asn Arg Arg Ser Asp Asp Gly Tyr Asn
225 230 235 240
Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Gln Val Lys Gly Ser Glu Asn Pro Arg
245 250 255
Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr Phe Pro Asn Cys Pro Thr Lys Lys Lys Val
260 265 270
Glu Arg Ser Leu Asp Gly Gln Ile Thr Glu Ile Val Tyr Lys Gly Ser
275 280 285
His Asn His Ala Lys Pro Gln Ser Thr Arg Arg Ser Ser Leu Ser Ser
290 295 300
Ala Gly Ser Ser His Ala Leu Val Ala Leu Ile Pro Ala Thr Asn Glu
305 310 315 320
Met Ala Asp Gln Ser Phe Thr Thr Gln Gly Ser Gly Gln Phe Asp Gly
325 330 335
Val Ala Thr Pro Glu Asn Ser Ser Ile Ser Ile Gly Asp Asp Asp Phe
340 345 350
Asp Arg Ser Ser Gln Lys Ser Lys Ser Gly Gly Asp Asp Phe Asp Glu
355 360 365
Asp Glu Pro Glu Ala Lys Arg Trp Arg Arg Glu Gly Asp Asn Asn Glu
370 375 380
Gly Ile Ser Ala Val Gly Ser Arg Thr Val Arg Glu Pro Arg Val Val
385 390 395 400
Val Gln Thr Thr Ser Asp Ile Asp Ile Leu Asp Asp Gly Tyr Arg Trp
405 410 415
Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val Val Lys Gly Asn Pro Asn Pro Arg Ser
420 425 430
Tyr Tyr Lys Cys Thr Asn Pro Gly Cys Pro Val Arg Lys His Val Glu
435 440 445
Arg Ala Ser His Asp Leu Arg Ala Val Ile Thr Thr Tyr Glu Gly Lys
450 455 460
His Asn His Asp Val Pro Pro Ala Arg Gly Ser Gly Ser His Ser Leu
465 470 475 480
Ser Arg Pro Phe Pro Ser Asn Asp Pro Pro Ala Thr Ala Ile Arg Pro
485 490 495
Ser Ala Val Thr His Gln Ser Asn Asn Gly Gly His Leu Gln Gly Leu
500 505 510
Arg Leu Gln Gln Ser Ser Glu Ser Gln Thr Ala Phe Thr Val Glu Met
515 520 525
Val Gln Asn Gly Asn Gly Phe Ser Phe Pro Glu Phe Gly Asn Ser Met
530 535 540
Gly Met Gly Val Gly Ser Tyr Ile Asn Gln Thr Gln Pro Asn Asp Asn
545 550 555 560
Leu Leu Ile Arg Ala Lys Glu Glu Pro Arg Asp His Asp Met Phe Ile
565 570 575
Gln Ser Leu Leu Cys
580
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 节瓜(Benincasa hispida Cogn. var. Chieh-qua How)
<400> 3
atggcctcct cttccgggag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 节瓜(Benincasa hispida Cogn. var. Chieh-qua How)
<400> 4
atggcctcct cttccgggag 20
Claims (3)
1.WRKY类转录因子基因CqWRKY1在调控节瓜抗旱性方面的应用，其中所述WRKY类转录因子基因CqWRKY1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述基因CqWRKY1编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述WRKY类转录因子基因CqWRKY1是将节瓜幼苗真叶的总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，用如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对进行PCR扩增获得。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111304223A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-06-19 | 南京林业大学 | 一种春兰CgWRKY24基因及其应用 |
| CN111304223B (zh) * | 2020-04-16 | 2022-04-26 | 南京林业大学 | 一种春兰CgWRKY24基因及其应用 |
| CN113817746A (zh) * | 2021-07-22 | 2021-12-21 | 广东省农业科学院蔬菜研究所 | 节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92及其应用 |
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