CN103910327A

CN103910327A - 光下裂解水的方法

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Publication number: CN103910327A
Application number: CN201210593691.1A
Authority: CN
Inventors: 陈根云; 米华玲; 蔡伟明; 孙卫宁; 朱新广
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2012-12-31
Filing date: 2012-12-31
Publication date: 2014-07-09

Abstract

本发明提供利用LEAT蛋白与醌，在光照条件下使水裂解放出氧的方法。该方法还能进一步产生其它化学品，例如氢。上述方法能持续地实现光能转化为化学能，具备极高的产业价值；操作简便、条件温和、能耗低、零污染、成本低且高效。本发明还提供鉴定LEAT蛋白的方法、改造野生型荧光蛋白增强其传递光能活性的方法以及将光能转化为化学能的方法。本发明还提供LEAT蛋白以及包含所述LEAT蛋白的组合物。

Description

光下裂解水的方法

技术领域

本发明涉及光下裂解水的领域。具体地说，本发明涉及利用一系列能够吸收和传递光能的蛋白使得水裂解，进而获得氢的方法。

背景技术

近几十年来，随着全球能源需求的持续增长以及以石油和煤为代表的矿物燃料资源的逐渐耗竭，寻找新能源的研究越来越受到人们的关注。氢能作为二次能源，具有清洁、高效、安全、可贮存、可运输等诸多优点，已普遍被人们认为是一种最理想的无污染绿色能源，因此受到了各国的高度重视。

目前，制氢的方法主要有以下几种：

1.电解水制氢

电解水制氢是目前应用较广且比较成熟的方法。将水作为原料制氢的过程是氢与氧燃烧生成水的逆过程，因此只要提供一定形式一定能量，则可使水分解。提供电能使水分解制氢的效率一般在75-85％，其工艺过程简单，无污染。但该方法存在耗电量高等明显缺陷，其应用受到相当限制。

此外，利用光电制氢的方法，即，太阳能氢能系统在国外已有实验性研究。但太阳电池转换能量效率，成本及使用寿命仍是无法克服的障碍。

我国目前的电解制氢装置均为小型电解制氢设备，其目的也非制备氢气作为能源。

2.矿物燃料制氢

以煤、石油及天然气为原料制氢是当今制氢的主要方法。该方法在我国都具有成熟的工艺，并建有工业生产装置。

(1)煤为原料制取氢气

以煤为原料制氢的方法主要有两种：一是煤的焦化(或称高温干馏)，二是煤的气化。焦化是指煤在隔绝空气条件下，在900-1000℃制取焦碳副产品为焦炉煤气。焦炉煤气组成中含氢。煤的气化是指煤在高温常压或加压下，与气化剂反应转化成气体产物。气化剂为水蒸汽或氧(空气)，气体产物中含有氢等组分，其含量随不同气化方法而异。

(2)以天然气或轻质油为原料制取氢气

该法是在催化剂存在下与水蒸汽反应转化制得氢气。反应在800-820℃下进行。

(3)以重油为原料部分氧化法制取氢气

重油原料包括有常压、减压渣油及石油深度加工后的燃料油，重油与水蒸汽及氧气反应制氢。

以上矿物燃料制氢的方法均存在成本偏高、能耗大、操作复杂以及有污染等缺陷。

1972年，日本东京大学Fujishima A和Honda K两位教授首次报告发现TiO₂单晶电极光催化分解水从而产生氢气这一现象，从而揭示了利用太阳能直接分解水制氢的可能性，开辟了利用太阳能光下裂解水制氢的道路。随着电极电解水向半导体光催化分解水制氢的多相光催化(heterogeneous photocatalysis)的演变和TiO₂以外的光催化剂的相继发现，兴起了光下裂解水制氢的研究，并在光催化剂的合成、改性等方面取得较大进展。光催化水裂解生成H₂和O₂是高能垒反应，该类反应的△G>0(△G=237kJ/mo1)，此类反应将光能转化为化学能。目前使用的光催化剂主要有：钽酸盐、铌酸盐、钛酸盐、多元硫化物等等。

但是，迄今为止，人们所研究和发现的光催化剂和光催化体系仍然存在诸多问题，例如，光催化剂大多仅在紫外光区稳定有效，能够在可见光区使用的光催化剂不但催化活性低，而且几乎都存在光腐蚀现象，需使用牺牲剂进行抑制，能量转化效率低，这些都阻碍了光下裂解水的实际应用。

在另一方面，太阳能是人类取之不尽用之不竭的可再生能源，也是清洁能源，不产生任何的环境污染。在太阳能的有效利用当中；大阳能光电利用是近些年来发展最快，最具活力的研究领域，是其中最受瞩目的项目之一。

光电池，是一种在光的照射下产生电动势的半导体元件。其能将可见光转化为直流电。有的光电池还可以将红外光和紫外光转化为直流电。光电池是太阳能电力系统内部的一个组成部分，太阳能电力系统在替代现在的电力能源方面正有着越来越重要的地位。最早的光电池是用掺杂的氧化硅来制作的。其它的材料，例如CIS，CdTe和GaAs，也已经开发用来作为光电池的材料。但目前光电池所用的材料往往比较昂贵，光电池的成本居高不下，从而限制了其广泛应用。

此外，现有技术中将光能转化为化学能的过程不能持续进行，因而不具备产业价值。

综上所述，本领域急需操作简便、零污染、低成本、高效、持续的光下裂解水方法，从而能简便地将光能转化为化学能，进了转变为电能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用光裂解水的方法。

本发明的另一目的在于提供一种产生氢的方法。

本发明还有另一目的在于提供一种加快产氢藻产生氢气速率或增加产氢藻产氢量的方法。

本发明还有另一目的在于提供一种鉴定LEAT蛋白的方法。

本发明还有另一目的在于提供一种改造野生型荧光蛋白增强其传递光能活性的方法。

本发明还有另一目的在于提供数种LEAT蛋白及编码其序列的多核苷酸。

本发明还有另一目的在于提供一种将光能转化为化学能的方法。

本发明还有另一目的在于提供LEAT蛋白在将光能转化为化学能中的用途。

本发明还有另一目的在于提供一种包含LEAT蛋白与醌的组合物。

本发明还有另一目的在于提供一种在光下裂解水的装置。

本发明还有另一目的在于提供一种产生氢气的装置。

在第一方面，本发明提供一种利用光裂解水的方法，所述裂解水的方法包括利用下列物质：

(a)光能吸收和传递蛋白(LEAT蛋白)，

(b)醌；

在光下使得水裂解。

在优选的实施方式中，所述方法包括以下步骤：

利用LEAT蛋白与醌，在光下使得水裂解，放出氧。

在优选的实施方式中，所述光的波长为300-1000nm，优选320-760nm之间的可见光，更优选380-760nm之间的可见光。

在优选的实施方式中，所述光的强度是>0.1μmol m^-2s^-1，优选1-2μmol m^-2s^-1。

在优选的实施方式中，所述方法在pH为5-8.5，优选5.5-7.5，最优选6.5下进行。

在另一优选的实施方式中，所述的(a)组物质是一种LEAT蛋白分子，或两种或两种以上LEAT蛋白的混合物；所述的醌是一种醌分子，或两种或两种以上醌分子的混合物。

在另一优选的实施方式中，所述的LEAT蛋白选自荧光蛋白、非荧光生色蛋白或它们的突变体蛋白；

其中所述突变体蛋白是经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后其吸收光谱、荧光光谱或荧光强度发生或不发生改变，但依然能够利用光能裂解水的突变体蛋白。

在另一优选的实施方式中，所述的LEAT蛋白选自下组：

(a)蓝色荧光蛋白(Blue Fluorescent Protein，BFP)或其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后其吸收光谱、荧光光谱或荧光强度发生或不发生改变，但依然能够利用光能裂解水的突变体蛋白；

(b)青色荧光蛋白(Cyan Fluorescent Protein，CFP)或其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后其吸收光谱、荧光光谱或荧光强度发生或不发生改变，但依然能够利用光能裂解水的突变体蛋白；

(c)绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)或其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后其吸收光谱、荧光光谱或荧光强度发生或不发生改变，但依然能够利用光能裂解水的突变体蛋白；

(d)黄色荧光蛋白(Yellow Fluorescent Protein，YFP)或其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后其吸收光谱、荧光光谱或荧光强度发生或不发生改变，但依然能够利用光能裂解水的突变体蛋白；

(e)红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein，RFP)或其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后其吸收光谱、荧光光谱或荧光强度发生或不发生改变，但依然能够利用光能裂解水的突变体蛋白；

(f)远红光荧光蛋白(Far-red Fluorescent Protein)或其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后其吸收光谱、荧光光谱或荧光强度发生或不发生改变，但依然能够利用光能裂解水的突变体蛋白；

(g)近红外荧光蛋白(Near Infra-red Fluorescent Protein)或其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后其吸收光谱、荧光光谱或荧光强度发生或不发生改变，但依然能够利用光能裂解水的突变体蛋白；

(h)非荧光生色蛋白(non-fluorescent chromoprotein)或其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后其吸收光谱、荧光光谱或荧光强度发生或不发生改变，但依然能够利用光能裂解水的突变体蛋白；

(i)氨基酸序列如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52或54所示的蛋白；

(j)氨基酸序列在(i)的基础上经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后其吸收光谱、荧光光谱或荧光强度发生或不发生改变，但依然能够利用光能裂解水的突变体蛋白；

在另一优选的实施方式中，所述醌是苯醌或萘醌及其衍生物。

在优选的实施方式中，所述醌具有以下结构：

其中，R1、R2、R3和R4为为氢或取代基，并且上述结构式中至少要有一个取代基。

在优选的实施方式中，所述取代基之间不完全相同。

在优选的实施方式中，所述取代基之间在取代位置不对称，或相同的取代基团在取代位置上不完全对称。

在优选的实施方式中，所述取代基优选给电子基团。

在优选的实施方式中，所述取代基是C1-10的烷基或C2-10烯基，优选C1-6的烷基或C2-6烯基，更优选甲基。

在优选的实施方式中，所述醌选自2,3,5-三甲基对苯醌、2,6-二甲基对苯醌或甲基对苯醌，最优选2,3,5-三甲基对苯醌。

在优选的实施方式中，所述萘醌是甲基萘醌。

在优选的实施方式中，所述甲基萘醌是Vitamin K3。

在第二方面，本发明提供一种产生氢的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)利用本发明第一方面所述的方法裂解水；

(b)与步骤(a)耦联的产氢步骤；

从而产生氢。

在优选的实施方式中，所述(b)步骤与(a)步骤在同一体系或同一反应装置中进行。

在另一优选的实施方式中，所述(b)步骤与(a)步骤在不同体系或反应装置中进行，进行(b)步骤的体系或装置处于进行(a)步骤的体系或装置的下游并且与(a)步骤的反应相耦联。

在另一优选的权利要求中，步骤(a)包括：将LEAT蛋白与醌置于同一水性体系中；

步骤(b)包括以下步骤：

(c)加入一种或多种能够利用还原型的醌分子进行氧化还原反应或进行电子传递的物质；和

(d)加入产氢酶，并且所述的产氢酶能够利用步骤(c)的产物来产生氢气。

在优选的实施方式中，所述的能够利用还原型的醌进行氧化还原反应或电子传递的物质包括但不限于：细胞色素c，细胞色素f，卟啉（细胞色素的辅基）或质蓝素。

在优选的实施方式中，所述产氢酶包括但不限于：细胞色素c3依赖的氢酶、铁氧还蛋白依赖的氢酶。

在优选的实施方式中，所述还原型细胞色素c，细胞色素f与电池耦联用于生产光生物电池。

在另一优选的实施方式中，步骤(a)包括：将LEAT蛋白与甲基萘醌置于同一水性体系中；步骤(b)包括：加入甲基萘醌依赖的产氢酶。

在优选的实施方式中，所述甲基萘醌是VitaminK3。

在优选的实施方式中，所述还原型甲基萘醌与电池耦联用于生产光生物电池。

在第三方面，本发明提供一种加快产氢藻产生氢气速率或增加产氢藻产氢量的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将LEAT蛋白转入产氢藻中；

从而加快该产氢藻的产氢速率或增加该产氢藻的产氢量。

在第四方面，本发明提供一种鉴定LEAT蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将待测蛋白与醌置于水性体系中；

(b)在光照条件下检测是否有氧或还原型的醌产生；

如果步骤(b)中检测到有氧或还原型的醌产生，则所述待测蛋白是LEAT蛋白。

在优选的实施方式中，所述鉴定LEAT蛋白的方法在步骤(a)之前还可包括以下步骤：

(a1)测定待测蛋白的吸收光谱，

如果所述待测蛋白的吸收峰不仅仅在280nm处，则进行步骤(a)、(b)。

在优选的实施方式中，所述待测蛋白在380nm、395nm、425nm、487nm、512nm、487nm、587nm中的一处或几处有吸收峰。

在第五方面，本发明提供一种改造野生型荧光蛋白增强其传递光能活性的方法，所述方法包括：

(a)获得野生型荧光蛋白的突变体；

(b)采用本发明第四方面所述的方法检测突变体光裂解水放出氧的能力，或检测突变体还原醌的能力；

如果突变体利用光裂解水放出氧的能力或还原醌的能力比野生型提高，则该突变体传递光能的活性增强。

在优选的实施方式中，改造所述野生型荧光蛋白的编码序列使得生色团周围相关残基改变。

在优选的实施方式中，改造所述野生型荧光蛋白的编码序列，从而除去编码的氨基酸序列中对应于野生型GFP所示氨基酸序列C末端的8个氨基酸残基残基。

在第六方面，本发明提供数种LEAT蛋白，所述LEAT蛋白包括：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:12、14、16、18、20、22、24、26、28或30所示的蛋白；或

(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且具有光解水功能的由(a)衍生的蛋白。

在第七方面，本发明提供数种多核苷酸，所述的多核苷酸为选自下组的序列：

(a)编码本发明第六方面所述蛋白的核苷酸序列；

(b)序列如SEQ ID NO:11、13、15、17、19、21、23、25、27或29所示的核苷酸序列；

(c)与(b)所示的序列同源性≥95%（较佳地≥98%）的核苷酸序列；

(d)与(a)-(e)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在第八方面，本发明提供一种将光能转化为化学能的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)利用LEAT蛋白与醌，在光照条件下使得水分解，从而将化学能储存在醌中。

在优选的实施方式中，所述储存在醌中的化学能是指还原型的醌分子所具有的还原其他分子的还原力。

在优选的实施方式中，利用储存在醌中的化学能产生其它化学产品。

在优选的实施方式中，所述化学产品是光生物电池、H₂、还原型的细胞色素c、还原型的细胞色素f和还原型的质蓝素等氧还电位高于醌的化学物质。

在第九方面，本发明提供LEAT蛋白在将光能转化为化学能中的用途。

在优选的实施方式中，所述光能转化为化学能是利用光能裂解水，从而将还原能储存在醌中。

在优选的实施方式中，所述应用还包括产生其它化学产品，优选H₂。

在第十方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包含以下组分：

(a)LEAT蛋白；和

(b)醌。

在优选的实施方式中，所述组合物是水溶液。

在第十一方面，本发明提供一种在光下裂解水的装置，所述装置包括一个或多个容器，所述容器中装有光能吸收和传递蛋白(LEAT蛋白)、醌与水，其中所述光能吸收和传递蛋白(LEAT蛋白)、醌与水可以处于同一或不同的所述容器中，从而能实施本发明第一方面所述的方法。

在优选的实施方式中，所述装置还包括能发出适合实施本发明第一方面所述方法的光的光源以及将产生的光引入所述容器以实施本发明第一方面所述方法的器件。

在第十二方面，本发明提供一种产生氢气的装置，所述装置包括一个或多个容器，所述容器中装有光能吸收和传递蛋白(LEAT蛋白)、醌与水，其中所述光能吸收和传递蛋白(LEAT蛋白)、醌与水可以处于同一或不同的所述容器中，从而能实施本第二方面所述的方法。

在优选的实施方式中，所述装置还包括适合发出实施本发明第二方面所述方法的光的光源以及将产生的光引入所述容器以实施本发明第二方面所述方法的器件。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.预照光的YFP对NADP⁺和NAD⁺的还原；其中图A和B为吸收光谱；C和D为不同YFP浓度下的差示光谱。图C和D中数字为反应体系中YFP的nM浓度。根据NADH和NADPH在340nm处的摩尔消光系数进行计算，基本上2个YFP分子还原1个NAD⁺或NADP⁺分子。

图2.预照光的mCherry对NADP⁺和NAD⁺的还原；其中A和B为吸收光谱；C和D为不同mCherry浓度下的差示光谱；E和F为GST蛋白存在情况下的吸收光谱。图C和D中数字为反应体系中GST-mCherry的nM浓度。mCherry：GST-mCherry融合蛋白，GST：大肠杆菌表达的谷胱甘肽转巯基酶。根据NADH和NADPH在340nm的摩尔消光系数进行计算，基本上2个mCherry分子还原1个NAD⁺或NADP⁺分子。

图3.光照对YFP存在时NAD⁺或NADP⁺还原的影响；图中所示为开光前后340nM处吸收值的变化。结果说明YFP在光下不能持续还原NAD和NADP。

图4.YFP和TMBQ依赖的光下裂解水放氧；其中A为不同条件下开光前后氧浓度变化示意图；B为开光后两种同位素氧18和氧16的释放速率；C为TMBQ存在下，YFP和GFP光下裂解水放氧的光强响应曲线；D为TMBQ存在时，光下裂解水放氧的YFP浓度响应曲线；E为不同pH条件下，YFP和TMBQ光下裂解水放氧活力的比较。TMBQ：2,3,5-三甲基对苯醌；GL：绿光；RL：红光；反应速率以每分钟转换的分子数表示。除图中特别标示外，反应体系为：YFP，10nM；GFP，1μM；TMBQ，400μM，pH6.5；光强：0.6-1μmol m^-2s^-1。

图5.mCherry和TMBQ依赖的光下裂解水放氧；其中A为不同条件下开光前后氧浓度变化示意图；B为TMBQ存在下，mCherry和GFP光下裂解水放氧的光强响应曲线；C为mCherry和GFP光下裂解水放氧的TMBQ浓度响应曲线；D为不同pH条件下，mCherry和TMBQ光下裂解水放氧活力的比较。TMBQ：2,3,5-三甲基对苯醌；GL：绿光；RL：红光。除图中特别标示外，反应体系为：YFP，10nM；GFP，100nM；TMBQ，400μM；pH6.5；光强：0.6-1μmol m^-2s^-1。

图6.YFP和TMBQ依赖的光下裂解水放氧的同位素示踪实验；其中A为反应体系溶解氧中¹⁸O含量的实时变化；B为反应体系溶解氧中¹⁶O含量的实时变化。TMBQ：2,3,5-三甲基对苯醌；反应体系为：YFP，10nM；TMBQ，400μM，pH6.5；光强：1-2μmol m^-2s^-1。氧¹⁸水的含量为5mM。反应池体积为15ml。反应体系溶解氧中¹⁶O和¹⁸O含量用毛细管连接的HPR40型薄膜进样质谱仪(HIDEN分析仪器公司，英国)进行实时分析。CK为不加YFP和TMBQ的空白对照，绿色箭头标示开光时间点。

图7.2,3,5-三甲基对苯醌(TMBQ)浓度对YFP荧光强度的影响；其中A为0.25μM YFP；B为0.05μM YFP；图中数字为测定体系中TMBQ浓度。以不加TMBQ的YFP的荧光强度为100。

图8.YFP_1-231在5mM TMBQ存在的情况下，其光吸收峰高低随着处理时间的增加其吸收光的能力逐渐加强。以不加TMBQ的YFP_1-231为对照，用514nm吸收峰值进行归一化处理。图中数字为测定体系中TMBQ处理时间。以不加TMBQ的YFP的吸收峰为1。

图9.不同醌存在条件下的mCherry和YFP的光下裂解水放氧能力的比较；其中A和B为不同醌存在下，YFP(A)和mCherry(B)光下裂解水放氧能力的比较；C和D为TMBQ(C)和MBQ(D)存在下，光下裂解水放氧活力的mCherry和YFP浓度响应曲线；C中mCherry最大浓度为15nM，YFP为60nM。BQ：对苯醌；MBQ：甲基对苯醌；DMBQ1：2,5-二甲基对苯醌；DMBQ2：2,6-二甲基对苯醌；TMBQ：2,3,5-三甲基对苯醌；DQ：杜醌或四甲基对苯醌；UQ：2,3-甲氧基-5-甲基对苯醌；VK₃：Vitmin K₃。除图中特别标示外，反应体系为：50mM磷酸缓冲液，pH6.5；YFP，10nM；mCherry，5nM；光强：0.6-1μmol m^-2s^-1。

图10.苯醌和萘醌的分子结构式。其中，R1、R2、R3和R4为氢或取代基团，该分子结构式中至少要有一个取代基；取代基团可以是取代基是C1-10烷基或C2-10烯基，优选C1-6烷基或或C2-6烯基，更优选甲基。

图11.不同LEAT蛋白光下裂解水放氧的能力比较。其中A为荧光蛋白的吸收光谱；B为不同荧光蛋白的荧光光谱；C为不同荧光蛋白光下裂解水放氧活力的TMBQ浓度响应曲线。

图12.mCherry和YFP与其突变体的荧光强度及其光下裂解水放氧活力比较。其中，A和D为YFP(A)和mCherry(D)及其突变体的吸收光谱；B和E为YFP(B)和mCherry(E)及其突变体的荧光光谱；C和F为YFP(C)和mCherry(F)与其突变体的光下裂解水放氧活力。A、B、D、E：光吸收和荧光强度在相同蛋白浓度下进行比较，分别以突变前的YFP或mCherry为1(吸收)和100(荧光强度)。(G)：A图中YFPmu4和YFPmu7部分的放大；（H）：B图中mcherrymu4和mCherrymu7部分的放大。

图13.LEAT蛋白催化2,3,5-三甲基对苯醌(TMBQ)还原活力的比较。A为YFP与GFP对2,3,5-三甲基对苯醌还原示意图；B为不同LEAT蛋白催化2,3,5-三甲基对苯醌还原的活力；LEAT蛋白浓度为25nM。在1-2μmolm^-2s^-1各自激发光下测定。A中纵轴代表的是氧化型TMBQ的OD₄₃₆吸收的变化，箭头长度代表是OD₄₃₆变化刻度0.0015，横轴箭头代表的是时间，箭头长度代表时间刻度。

图14.YFP和mCherry及其点突变催化2,3,5-三甲基对苯醌还原活力比较。其中，A为YFP及其点突变；B为mCherry及其点突变。其中YFP的TMBQ光下还原活力约为3200min^-1，mCherry的TMBQ光下还原活力为2000min^-1。

图15.TMBQ依赖的YFP(A)和mCherry(B)催化的细胞色素c的光下还原，以及TMBQ依赖的不同LEAT蛋白(C)催化的细胞色素f的光下还原。YFP和mCherry浓度分别为：0.25μM和0.75μM；CytC和f浓度为5uM；TMBQ浓度为400μM，在1-2μmol m^-2s^-1各自激发光下测定。

图16、(A)细胞色素f(Cytf)和质蓝素(PC)浓度依赖的、质醌类似物2,3,5-三甲基醌(PQ)介导的YFP对Cytf和PC的光下还原。在没有添加PQ的条件下，YFP在光下不能催化无论是细胞色素f还是质蓝素的还原；(B)YFP光下催化PQ介导的细胞色素f和质蓝素还原的光强响应曲线,YFP浓度为1μM，最大光强为2μmol m^-2s^-1。

图17、CFP、GFP、mCherry、YFP及YFP点突变体光下催化PQ介导的细胞色素f(A和C)和质蓝素(B和D)还原活性的比较。

图18.不同LEAT蛋白和还原剂对Vitamin K₃的还原能力比较。其中，A为不同LEAT蛋白对Vitamin K₃还原速率；B为DTT、GSH、Vitamin C和mCherry对Vitamin K₃还原速率；荧光蛋白浓度为1μM，GFP浓度为10μM，在1-2μmolm^-2s^-1各自激发光下测定。DTT：2mM；GSH：0.3mM；抗坏血酸：5mM；VitaminK₃：25μM。

图19.mCherry(A)和YFP(B)催化Vitamin K₃的光下还原。其中，mCherry和YFP蛋白浓度为1μM。在1-2μmolm^-2s^-1各自激发光下测定。

图20.EGFP、EYFP、BFP和ECFP蛋白序列比较。图中*所示是GFP与其他LEAT蛋白有差异而在其他LEAT蛋白高度保守的氨基酸残基位点。

图21.YFP蛋白232位氨基酸点突变以及232位后C末端去除后的吸收光谱(A)、荧光光谱(B)和光下裂解水放氧活力(C)的比较。其中，A和B为光吸收和荧光强度在相同蛋白浓度下进行比较，分别以突变前的YFP为1(吸收)和100(荧光强度)。C中，LEAT蛋白浓度为10nM，L232H蛋白浓度为100nm，TMBQ浓度为400μM，在1-2μmolm^-2s^-1各自激发光下测定。

图22.GFP蛋白232位后C末端去除后的吸收光谱(A)、荧光光谱(B)和光下裂解水放氧活力(C)的比较。其中，A和B为光吸收和荧光强度在相同蛋白浓度下进行比较，分别以突变前的GFP为1(吸收)和100(荧光强度)。C中，GFP_1-231蛋白浓度为10nM，GFP浓度为100nm，TMBQ浓度为400μM，在1-2μmol m^-2s^-1各自激发光下测定。

图23：（A）110种刺胞动物（Cnidarian）和节足动物（Arthropoda）来源荧光蛋白和非荧光生色蛋白进化树（摘自Alieva et al.,2008,Diversity andevolution of coarl fluorescent proteins.PLoS One3(7):e2680.doi:10.1371/journal.pone.0002680）。图中圆点表示在本专利中所选用的荧光蛋白及名称。这些荧光蛋白在进化树上分别属于A,B,C,D等不同的分支。（B）本专利所用的所有LEAT蛋白的系统进化树（B）和序列同源性比较（C）。

图24.LEAT蛋白光下催化水裂解反应的模式图。LEAT蛋白受光激发后，催化水的裂解，将能量释放并重新回到基态，在此过程中将裂解产生的电子和质子传递给相关醌分子，特别是质体醌，在此过程中完成醌的还原和放氧。LEAT：基态LEAT蛋白，Q：醌，QH₂：氢醌；LEAT^*：激发态的LEAT蛋白。

图25.不同浓度TMBQ对280nm和295nm激发的YFP内源荧光的影响。YFP终浓度为3μM。280nm激发的是YFP蛋白的酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）荧光，295nm激发的是YFP蛋白的色氨酸残基的荧光；它们的光谱变化与蛋白结构内部酪氨酸和色氨酸残基微环境相关，体现的是蛋白构像上的变化和异同。结果显示280nm激发的YFP内源荧光随着TMBQ浓度增加而逐渐降低，而且其最大荧光峰值的波长从333.4nm蓝移到325nm。295nm激发的YFP内源荧光也随着TMBQ浓度的增加逐渐降低，最大荧光峰值的波长从333.2nm蓝移到331.4nm。结果表明TMBQ的存在导致了YFP的构像发生了变化，说明TMBQ与YFP之间发生了相互作用。

图26.(A)YFP和GFP及其突变体280nm激发是内源荧光光谱;(B)TMBQ存在时，YFP和GFP及其突变体280nm激发的内源荧光光谱比，以各自不加TMBQ的荧光峰值为100％。FPs终浓度为1.5μM;TMBQ终浓度为0.5mM。结果显示放氧活力高的突变体，其280nm激发的内源荧光就高，而加入TMBQ后其内源荧光下降的比例就大。这说明荧光蛋白放氧活力的高低与其蛋白结构相关

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现一系列光能吸收和传递蛋白(简称为LEAT蛋白：light energy absorbance and transduction protein)及其不发荧光的突变体在醌存在下能够利用光能，在光下高效地催化水的裂解，并放出氧气，水裂解产生的电子和质子传递给各种合适的醌分子从而得到还原型的醌，而还原型的醌能作为电子供体驱动多种氧化还原反应，实现光能向化学能的转化。在此基础上完成了本发明。

术语

本文中所述的“水裂解”，是指如下所示将水分子裂解成为氧、1个电子和1个质子：

H₂O=H⁺+e^-+1/2O₂

本文中所述的“光”，除了指波长范围从380-760nm的可见光范围内的电磁波外，还包括波长范围是300-380nm的紫外线和760nm-1000nm的近红外线的电磁波。所述“光能”，指上述范围，即300-1000nm的电磁波的能量。

本发明方法利用光照本发明的LEAT蛋白以及各种类型的醌来裂解水。本领域普通技术人员知道，光强越强，单位面积的光量子越多，光强越高，单位时间捕获的光能越多，利用光强较高的光可以缩短反应时间，但本发明方法依然可以利用较弱的光。只要所述光子能量大于将水分子裂解所需的约1.23±0.100电子伏特的能量。

在具体的实施方式中，所述光的强度是>0.1μmol m^-2s^-1。在优选的实施方式中，所述光的强度是1-2μmol m^-2s^-1。

此外，实施例未应用红光、红外线仅仅是因为所用蛋白不吸收红光和红外线，但本领域普通技术人员知晓，通过对本发明公开的蛋白作进一步改造就能使之吸收并利用红光或红外光。

本文所用的术语“LEAT”蛋白表示一类由其自身组成蛋白质序列的氨基酸残基构成的生色基团吸收300-1000nm的电磁波，并将其吸收的电磁波的能量（如上述用法所述，以下简称为“光能”）转化为化学能的蛋白(Light EnergyAbsorption and Transduction protein，简称LEAT蛋白)。

LEAT所吸收的电磁波的波长下限是300nm，较佳的，320nm、340nm，更佳的，350nm、360nm、370nm、380nm、390nm或400nm；上限是1000nm，较佳的，950nm、900nm，850nm、800nm，更佳的，750nm、700nm、680nm、660nm、650nm、640nm、630nm或620nm。

所述LEAT蛋白优选自：

荧光蛋白或其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后荧光光谱和荧光发射能力发生改变的，但依然能够利用光能裂解水同时还原醌或其类似物的突变体蛋白；或

非荧光生色蛋白其经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后依然能够利用光能裂解水同时还原醌或其类似物的突变体蛋白。

所述荧光蛋白是指天然存在的或合成的蛋白，无需外加辅助因子，可受一定波长的光的激发并发射光。

所述非荧光生色蛋白是指天然存在的或合成的蛋白，无需外加辅助因子，可吸收一定波长的光，并且具有吸收光能后，可通过夺取水分子中的电子而还原醌或其类似物能力的蛋白。带有任何辅基或辅助因子或通过任何辅基或辅助因子吸收光能的生色蛋白，如：血红蛋白、黄素蛋白、细胞色素蛋白等，均不在本发明所述的非荧光生色蛋白范围内。

上述荧光蛋白和非荧光生色蛋白都具有相似的三维圆柱形结构，其多肽骨架大部分折叠成11条氢键链接的β-片层，中央为包含生色基团的α螺旋，其均都可依靠其自身的氨基酸序列就能够形成生色团结构来吸收及发射光能。

本发明中所述的荧光蛋白优选自：蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、远红光荧光蛋白、近红外荧光蛋白。

所述的“蓝色荧光蛋白”(Blue Fluorescent Protein，BFP)是发射峰位于440-470nm的荧光蛋白；如SEQ ID NO:4所示的蓝色荧光蛋白。

所述的“青色荧光蛋白”(Cyan Fluorescent Protein，CFP)是发射峰位于470-500nm的荧光蛋白；如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:54所示的青色荧光蛋白。

所述的“绿色荧光蛋白”(Green Fluorescent Protein，GFP)是发射峰位于500-525nm的荧光蛋白；如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:44所示的绿色荧光蛋白。

所述的“黄色荧光蛋白”(Yellow Fluorescent Protein，YFP)是发射峰位于525-570nm的荧光蛋白；如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:50所示的黄色荧光蛋白。

所述的“红色荧光蛋白”(Red Fluorescent Protein，RFP)是发射峰位于570-630nm的荧光蛋白；如SEQ ID NO:2所示的红色荧光蛋白；如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:46所示的红色荧光蛋白。

所述的“远红光荧光蛋白”(Far-red Fluorescent Protein)是发射峰位于630-760nm的荧光蛋白。

所述的“近红外荧光蛋白”(Near Infra-red Fluorescent Protein)是发射峰位于760-900nm的荧光蛋白；如SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:48所示的近红外荧光蛋白。

所述的“非荧光生色蛋白”(non-fluorescent chromoprotein)如SEQ ID NO:38所示的非荧光生色蛋白。

多种光能吸收和传递蛋白(LEAT)蛋白可应用于本发明，只要其是吸收光子的能量超过裂解水能量的蛋白，或能够吸收300-1000nm波长的蛋白。本领域公知，在标准条件下，1分子水分解成氧和2个电子和2个质子需要1.23电子伏特光能，因此LEAT蛋白吸收光子的能量只要超过裂解水的能量，也就是1.23电子伏特就能驱动这一反应，在醌分子存在的条件下裂解水放出氧气并将还原力储存在醌分子中，并最终通过进一步利用储存在醌分子中的还原力进行氧化还原反应，从而产生氢气。因此，本发明涉及一系列具有光能吸收和传递功能的蛋白，包括吸收光波辐射的发射和不发射荧光的蛋白基因，如绿色、黄色、红色荧光蛋白及其突变体。

作为本发明的优选方式，所述的LEAT蛋白包括：蓝色荧光蛋白，青色荧光蛋白，绿色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，橙色荧光蛋白，红色荧光蛋白或远红光荧光蛋白或非荧光生色蛋白，和它们的不发荧光突变体以及表2所示各种来源的荧光或生色蛋白。

荧光蛋白是一类在适当条件下能发光的蛋白，其生色基团是由组成其蛋白序列的氨基酸残基构成。在现有技术中其主要被用于标记细胞结构和监测胞内过程，它还用于细胞群体的体内示踪，如肿瘤细胞。最早出现的绿色荧光蛋白(GFP)是于1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现，之后又在海洋珊瑚虫中分离得到了GFP。随后的研究又在腔肠动物门中的珊瑚虫纲(Actinozoa)中，如珊瑚和海葵中发现了一系列不同光谱特性的荧光蛋白。所有的荧光蛋白都具有相似的三维圆柱形结构，其多肽骨架大部分折叠成11条氢键链接的β-片层，中央为包含生色基团的α螺旋。迄今为止，荧光蛋白经过基因工程手段的改造已发展出一系列的衍生物，它们的发射光谱基本已覆盖了整个的可见光区(400-760nm)和近红外线区(760-900nm)。因此，较佳地，荧光蛋白是三级结构为11股β-折叠组成的β-桶状结构环绕着包含生色基团的α-螺旋。

所述荧光蛋白是指天然存在的或合成的蛋白，无需外加辅助因子，其本身氨基酸构成的生色基团即可受一定波长范围的电磁波激发并发射出可见光。另一方面，所述荧光蛋白可以是从腔肠动物，如水母，珊瑚虫或海葵，中分离的荧光蛋白及其衍生物；另一方面，所述荧光蛋白是来自Aequorea的绿色荧光蛋白(Swiss-Prot:P42212)及其衍生物，如SEQ ID NO:4所示的BFP；或所述荧光蛋白也可来自Discosoma sp.的红色荧光蛋白(DsRed)(Swiss-Prot:Q9U6Y8)或其衍生物，如mCherry。

本发明中所述的非荧光生色蛋白与上述荧光蛋白具有类似的结构，能够吸收一定波长的光能，但其野生型蛋白发射荧光的能力极弱。

作为本发明的优选方式，所述的LEAT蛋白是：蓝色荧光蛋白(BlueFluorescent Protein，BFP)，青色荧光蛋白(Cyan Fluorescent Protein，CFP)，绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)，黄色荧光蛋白，红色荧光蛋白(RedFluorescent Protein，RFP)，或远红色荧光蛋白或非荧光生色蛋白。上述荧光蛋白的变异体也可应用于本发明中。上述荧光蛋白的变异体尽管其中一些的荧光强度发生较大的改变，例如荧光强度减弱或消失，甚至其吸收光谱和荧光光谱发生改变，但仍然能够在醌存在的条件下利用光能催化水的裂解反应，释放氧气，持续的产生还原能并储存在醌中，因此它们也能够应用于本发明。同样的可以理解，对本发明中提到的荧光蛋白进行突变，如果突变体的荧光强度增强或保持不变，只要能够在醌存在的条件下利用光能催化水的裂解反应，释放氧气，持续的产生还原能并储存在醌中，它们也同样能够应用在本发明中，落在本发明的表述范围之内。

作为本发明的另一优选方式，所述的荧光蛋白选自但不限于：黄色荧光蛋白(Yellow Fluorescent Protein)，红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein，RFP)，或远红光荧光蛋白(Far-red Fluorescent Protein)。

所述的“绿色荧光蛋白”、“青色荧光蛋白”、“蓝色荧光蛋白”还包括“增效的绿色荧光蛋白”、“增效的青色荧光蛋白”、“增效的蓝色荧光蛋白”。

所述的“青色荧光蛋白”例如可以具有GenBank登录号AAQ96626所示的氨基酸序列或与其基本上相同；或将该氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有该序列的蛋白相同功能的蛋白；或与GenBank登录号AAQ96626所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且具有光下裂解水能力的蛋白。

所述的“黄色荧光蛋白”例如可以具有GenBank登录号ADR00308所示的氨基酸序列或与其基本上相同；或将该氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有该序列的蛋白相同功能的蛋白；或与GenBank登录号ADR00308所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且具有光下裂解水能力的蛋白。

所述的“远红光荧光蛋白”例如可以具有GenBank登录号ACH06541所示的氨基酸序列或与其基本上相同；或将该氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有该序列的蛋白相同功能的蛋白；或与GenBank登录号ACH06541所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且具有该序列的蛋白相同功能的蛋白。

所述的“非荧光生色蛋白”例如可以具有GenBank登录号DQ206394(gfasCP)，AF363776(hcriCP)，AY485336(anm2CP)等。

在本发明中，所用的LEAT蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自低等生物，如腔肠动物门。此外，所述的LEAT蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产的LEAT蛋白。优选的，本发明可采用重组的LEAT蛋白。任何适合的LEAT蛋白均可用于本发明。所述的LEAT蛋白包括全长的LEAT蛋白或其生物活性片段。将野生型LEAT蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有该序列的蛋白相同功能的蛋白；或与野生型氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且具有野生型蛋白相同功能的蛋白。LEAT蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其光能吸收和传递特性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性；见Watson等Molecular Biology ofThe Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。任何一种LEAT蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，LEAT蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的LEAT蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长LEAT蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长LEAT蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。本发明也可采用经修饰或改良的LEAT蛋白，任何不影响LEAT蛋白的光能吸收和传递的变化形式都可用于本发明中。

此外，在本文中，发明人业已证明将YFP和GFP的232位后的C末端8个氨基酸残基去除得到的突变体，YFP_1-231和GFP_1-231的光吸收和荧光强度都大幅度降低，但其光下裂解水放氧活力却明显增加，特别是GFP_1-231的放氧活力已经回复到与YFP同一数量级范围(结果如图22所示)。从而进一步证明本领域技术人员鉴于本发明的教导和现有技术可在本发明公开的蛋白的基础上，作出较大改变而仍能得到基本具备，甚至具备更好的光下裂解水能力的突变体。

综上所述，本发明的蛋白包括在本发明公开的LEAT蛋白，例如，SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52或54所示所示蛋白的基础上作进一步突变而仍具有吸收和传递光能活性的多肽。例如，本发明的LEAT蛋白(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52或54所示；或(b)：包含(a)所限定的序列经过一个或多个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有光下裂解水功能的由(a)衍生的多肽。

在本发明中，本发明的LEAT蛋白包括与氨基酸序列SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52或54所示的LEAT蛋白相比，有至多20个、较佳地至多10个，再佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的突变体。这些保守性变异的突变体可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生。

初始残基	代表性的取代残基	优选的取代残基
			Ala(A)	Val;Leu;Ile	Val
Arg(R)	Lys;Gln;Asn	Lys
			Asn(N)	Gln;His;Lys;Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro;Ala	Ala
			His(H)	Asn;Gln;Lys;Arg	Arg
Ile(I)	Leu;Val;Met;Ala;Phe	Leu
			Leu(L)	Ile;Val;Met;Ala;Phe	Ile
Lys(K)	Arg;Gln;Asn	Arg
			Met(M)	Leu;Phe;Ile	Leu
Phe(F)	Leu;Val;Ile;Ala;Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr;Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp;Phe;Thr;Ser	Phe
Val(V)	Ile;Leu;Met;Phe;Ala	Leu

因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

LEAT蛋白的应用

本发明的LEAT蛋白可应用于光下催化水的裂解，从而产生氧。但本领域普通技术人员根据现有技术和本发明的教导也显然能够理解，将还原力储存在醌分子中后，不难通过与其它步骤相耦联获得其它化学产品，例如，还原各种细胞色素、卟啉、制备醌电极。例如，通过与产氢步骤相耦联从而产生氢，产生氢的方法可以是在与裂解水相同的体系或装置中加入和产氢相关的后续物质，例如氢酶；也可以是在上述裂解水的体系或装置的下游额外建立一个新的体系或装置，其中放置有能够利用上一步产生的还原型的醌分子来产生氢气的物质，例如氢酶和一些其他反应所必须的物质，例如包括用于辅助电子传递的物质或催化反应进行的催化剂。获得其他化学品的方法也包括可以与光合生物中的醌(例如质体醌，一种TMBQ类似物)耦联，额外建立一个新的人工光反应中心，以期拓展对太阳光利用的光谱范围，因为植物对一些波长的太阳光不能有效利用，从而提高光合生物的光能利用率以提高生物量和经济产量。

国际上有利用甲基紫精吸收光能，然后利用细胞色素c依赖的氢酶和卟啉进行光诱导产氢的报道（Amao Y．，Tomonou Y．，0hlr．a I．Highly efficientphotochemical hydrogen production system using zinc porphyrin and hydrogenasein CTAB micellar system.Solar energy Mater.Solar Cells.2003，79，103—11）(QiaD．J．，WenK S．O．，Nakamura C．，Wakayanla T．，Zorin，N．，MiyakeJ．Photoinduced hydrogen evolution by use of porphyrin，EDTA，viologens andhydrogenase in solutions and Langmuir Blodgett films(J)Inter.J.Hydrogen Energy2002，27，1481一1487．)。同理可知，本发明将水裂解成氧气并把还原能储存在醌中，并进一步利用所产生的还原型的醌将包括细胞色素c在内的物质，例如细胞色素c、细胞色素f和质蓝素还原。因此，结合上述文献报道可知，在本发明的基础上可进一步将细胞色素c依赖的氢酶用于本发明，从而利用本发明产生氢气。细胞色素c依赖的氢酶可直接加入至还原醌的反应体系中，也可在还原醌的反应体系下游另外建立反应体系或装置，在其中加入氢酶，利用前述步骤产生的还原力，例如还原型的细胞色素c，来得到氢气。此外应理解，本发明不限于利用细胞色素c依赖的氢酶，任何使用可利用还原力来产生氢气的氢酶，并且所述的还原力是可以通过本发明的反应直接或间接得到的，都在本发明所述的范围之内。

此外，本领域技术人员也能理解本发明的LEAT蛋白可用于光伏电池的生产。

此外应理解，发明内容中用到的LEAT蛋白，不仅可以使用各种单独来源的LEAT蛋白分子，也同样可以使用不同来源的LEAT蛋白分子的混合物，本领域内工作人员可根据实际需要，随意使用一种或几种LEAT蛋白的混合物用于本发明。例如，为了有效而充分的利用光中各个波长段的不同光，可以使用多种LEAT蛋白的混合物，混合物中的每种LEAT蛋白的光吸收峰不同，但都具有本发明所述的吸收和传递光能的作用，由此可以提高吸收光能的效率，提高对光的利用率。这些内容都在本发明所保护的范围之内。

同样的，发明内容中用到的醌，不仅可以使用各种单独来源的可用于本发明的（即可以与LEAT蛋白在光下裂解水的）醌分子，也同样可以使用不同醌分子的混合物，本领域内工作人员可根据实际需要，随意使用一种或几种醌的混合物用于本发明，这些内容同样都在本发明所保护的范围之内。

本发明的方法

本发明提供光下裂解水的方法，所述方法包括利用LEAT蛋白与醌，在光照条件下使得水分解，放出氧。

在优选的实施方式中，以上方法在pH为5-8.5，优选5.5-7.5，最优选6.5下进行。

在具体的实施方式中，所述LEAT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52或54所示。

本领域技术人员不难理解，所述方法还包括在光下裂解水放出氧后进一步产生H₂的步骤。

在具体的实施方式中，所述产生H₂的步骤为利用本发明的体系，将还原能传递给细胞色素c或卟啉（细胞色素的辅基）或VitaminK₃，然后利用它们耦联产氢酶来产生H₂。

在具体的实施方式中，所述产生H₂包括以下步骤：

(a)将LEAT蛋白与醌置于水性体系中，加入细胞色素c或将LEAT蛋白与甲基萘醌置于水性体系中；

(b)在光照条件下检测细胞色素c或甲基萘醌的还原；

(c)将还原型细胞色素c或甲基萘醌作为产氢酶的底物，与产氢酶耦联以便产生H2。

在优选的实施方式中，所述醌是甲基醌，所述甲基萘醌是Vitamin K3。

在优选的实施方式中，产生的还原型细胞色素c或甲基萘醌与电池耦联用于光生物电池。

在一优选例中，所述产氢酶包括但不限于：细胞色素c3依赖的氢酶、甲基萘醌依赖的氢酶、铁氧还蛋白依赖的氢酶。

本发明还提供鉴定LEAT蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将待测蛋白与醌置于反应体系中；

(b)光照条件下检测是否有氧产生；

如果步骤(b)中检测到有氧产生，则所述待测蛋白是LEAT蛋白。

(a1)测定待测蛋白的吸收光谱，

本发明还提供改造野生型荧光蛋白增强传递光能活性的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)获得野生型荧光蛋白的突变体；

(b)采用本发明方法测定所述的突变体在光下裂解水放出氧的能力，或检测突变体还原醌的能力；

醌

本发明方法中利用醌与LEAT光下裂解水，从而将光能转化为化学能。本发明方法可以利用苯醌及其衍生物。鉴于本发明的教导和现有技术的知识，本领域普通技术人员应理解，本发明不限于具体使用的醌。在本发明的LEAT蛋白作进一步修饰后，其它醌类也适用。

例如，在本发明实施例中具体使用醌中，TMBQ是一种植物体内质体醌的类似物，那本领域技术人员就可以合理预计，与植物体内质体醌类似的其它类似物也可能应用于本发明，特别是在LEAT蛋白作进一步修饰后。

在具体的实施方式中，本发明所用的醌具有以下结构：

其中，R1、R2、R3和R4为氢或取代基，上述结构式中至少要有一个取代基；

在一优选例中，上述醌结构所述的取代基不完全相同；

在一优选例中，上述醌结构中至少有一个取代基且取代基之间在取代位置不对称，或相同的取代基团在取代位置上不完全对称，且取代基必须是给电子基团。

在一优选例中，所述取代基是C1-10的烷基或C2-10烯基，优选C1-6的烷基或C2-6烯基，更优选甲基。

在一优选例中，所述醌选自2,3,5-三甲基对苯醌、2,6-二甲基对苯醌或甲基对苯醌，最优选2,3,5-三甲基对苯醌。

本发明优点：

1.本发明能持续地实现光能转化为化学能的过程，具备极高的产业价值；

2.本发明方法操作简便、条件温和、能耗低、转化效率高；

3.本发明方法不使用任何污染性的贵金属或稀土元素，对环境友好；和

4.本发明方法的原料简单易得，因此成本低。

以下结合具体实施案例对本发明的技术方案进一步描述，但以下实施案例不构成对本发明的限制，所有依据本发明的原理和技术手段采用的各种施用方法，均属于本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

本发明的实验材料与方法

1.荧光蛋白序列

mCherry基因序列(SEQ ID NO:1)

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta g 711

mCherry蛋白序列(SEQ ID NO:2)

MVSKGEEDNM AIIKEFMRFK VHMEGSVNGH EFEIEGEGEG RPYEGTQTAK LKVTKGGPLP 60

FAWDILSPQF MYGSKAYVKH PADIPDYLKL SFPEGFKWER VMNFEDGGVV TVTQDSSLQD 120

GEFIYKVKLR GTNFPSDGPV MQKKTMGWEA SSERMYPEDG ALKGEIKQRL KLKDGGHYDA 180

EVKTTYKAKK PVQLPGAYNV NIKLDITSHN EDYTIVEQYE RAEGRHSTGG MDELYK 236

BFP基因序列(SEQ ID NO:3)

ATGGTGAGCA AGGGCGAGGA GCTGTTCACC GGGGTGGTGC CCATCCTGGT CGAGCTGGAC 60

GGCGACGTAA ACGGCCACAA GTTCAGCGTG TCCGGCGAGG GCGAGGGCGA TGCCACCTAC 120

GGCAAGCTGA CCCTGAAGTT CATCTGCACC ACCGGCAAGC TGCCCGTGCC CTGGCCCACC 180

CTCGTGACCA CCCTGAGCCA CGGCGTCCAG TGCTTCAGCC GCTACCCCGA CCACATGAAG 240

CAGCACGACT TCTTCAAGTC CGCCATGCCC GAAGGCTACG TCCAGGAGCG CACCATCTTC 300

TTCAAGGACG ACGGCAACTA CAAGACCCGC GCCGAGGTGA AGTTCGAGGG CGACACCCTG 360

GTGAACCGCA TCGAGCTGAA GGGCATCGAC TTCAAGGAGG ACGGCAACAT CCTGGGGCAC 420

AAGCTGGAGT ACAACTTCAA CAGCCACAAC GTCTATATCA TGGCCGACAA GCAGAAGAAC 480

GGCATCAAGG CGAACTTCAA GATCCGCCAC AACATCGAGG ACGGCAGCGT GCAGCTCGCC 540

GACCACTACC AGCAGAACAC CCCCATCGGC GACGGCCCCG TGCTGCTGCC CGACAGCCAC 600

TACCTGAGCA CCCAGTCCGC CCTGAGCAAA GACCCCAACG AGAAGCGCGA TCACATGGTC 660

CTGCTGGAGT TCGTGACCGC CGCCGGGATC ACTCTCGGCA TGGACGAGCT GTACAAGTAA 720

BFP蛋白序列(SEQ ID NO:4)

MVSKGEELFT GVVPILVELD GDVNGHKFSV SGEGEGDATY GKLTLKFICT TGKLPVPWPT 60

LVTTLSHGVQ CFSRYPDHMK QHDFFKSAMP EGYVQERTIF FKDDGNYKTR AEVKFEGDTL 120

VNRIELKGID FKEDGNILGH KLEYNFNSHN VYIMADKQKN GIKANFKIRH NIEDGSVQLA 180

DHYQQNTPIG DGPVLLPDSH YLSTQSALSK DPNEKRDHMV LLEFVTAAGI TLGMDELYK 239

GFP基因序列(SEQ ID NO:5)

ATGGTGAGCA AGGGCGAGGA GCTGTTCACC GGGGTGGTGC CCATCCTGGT CGAGCTGGAC 60

GGCGACGTAA ACGGCCACAA GTTCAGCGTG TCCGGCGAGG GCGAGGGCGA TGCCACCTAC 120

GGCAAGCTGA CCCTGAAGTT CATCTGCACC ACCGGCAAGC TGCCCGTGCC CTGGCCCACC 180

CTCGTGACCA CCTTCACCTA CGGCGTGCAG TGCTTCAGCC GCTACCCCGA CCACATGAAG 240

CAGCACGACT TCTTCAAGTC CGCCATGCCC GAAGGCTACG TCCAGGAGCG CACCATCTTC 300

TTCAAGGACG ACGGCAACTA CAAGACCCGC GCCGAGGTGA AGTTCGAGGG CGACACCCTG 360

GTGAACCGCA TCGAGCTGAA GGGCATCGAC TTCAAGGAGG ACGGCAACAT CCTGGGGCAC 420

AAGCTGGAGT ACAACTACAA CAGCCACAAC GTCTATATCA TGGCCGACAA GCAGAAGAAC 480

GGCATCAAGG TGAACTTCAA GATCCGCCAC AACATCGAGG ACGGCAGCGT GCAGCTCGCC 540

GACCACTACC AGCAGAACAC CCCCATCGGC GACGGCCCCG TGCTGCTGCC CGACAACCAC 600

TACCTGAGCA CCCAGTCCGC CCTGAGCAAA GACCCCAACG AGAAGCGCGA TCACATGGTC 660

CTGCTGGAGT TCGTGACCGC CGCCGGGATC ACTCACGGCA TGGACGAGCT GTACAAGTAA 720

GFP蛋白序列(SEQ ID NO:6)

MVSKGEELFT GVVPILVELD GDVNGHKFSV SGEGEGDATY GKLTLKFICT TGKLPVPWPT 60

LVTTFTYGVQ CFSRYPDHMK QHDFFKSAMP EGYVQERTIF FKDDGNYKTR AEVKFEGDTL 120

VNRIELKGID FKEDGNILGH KLEYNYNSHN VYIMADKQKN GIKVNFKIRH NIEDGSVQLA 180

DHYQQNTPIG DGPVLLPDNH YLSTQSALSK DPNEKRDHMV LLEFVTAAGI THGMDELYK 239

YFP基因序列(SEQ ID NO:7)

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagct accagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

YFP蛋白序列(SEQ ID NO:8)

MVSKGEELFT GVVPILVELD GDVNGHKFSV SGEGEGDATY GKLTLKFICT TGKLPVPWPT 60

LVTTFGYGLQ CFARYPDHMK QHDFFKSAMP EGYVQERTIF FKDDGNYKTR AEVKFEGDTL 120

VNRIELKGID FKEDGNILGH KLEYNYNSHN VYIMADKQKN GIKVNFKIRH NIEDGSVQLA 180

DHYQQNTPIG DGPVLLPDNH YLSYQSALSK DPNEKRDHMV LLEFVTAAGI TLGMDELYK 239

CFP基因序列(SEQ ID NO:9)

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgacctg gggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacat cagccacaac gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg ccaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

CFP蛋白序列(SEQ ID NO:10)

MVSKGEELFT GVVPILVELD GDVNGHKFSV SGEGEGDATY GKLTLKFICT TGKLPVPWPT 60

LVTTLTWGVQ CFSRYPDHMK QHDFFKSAMP EGYVQERTIF FKDDGNYKTR AEVKFEGDTL 120

VNRIELKGID FKEDGNILGH KLEYNYISHN VYITADKQKN GIKANFKIRH NIEDGSVQLA 180

DHYQQNTPIG DGPVLLPDNH YLSTQSALSK DPNEKRDHMV LLEFVTAAGI TLGMDELYK 239

YFP点突变后的基因和蛋白序列：

YFPmu2(YFP^H149CY204A)基因序列(SEQ ID NO:11)

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagctgtaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagcg cacagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

YFPmu2(YFP^H149CY204A)蛋白序列(SEQ ID NO:12)

MVSKGEELFT GVVPILVELD GDVNGHKFSV SGEGEGDATY GKLTLKFICT TGKLPVPWPT 60

LVTTFGYGLQ CFARYPDHMK QHDFFKSAMP EGYVQERTIF FKDDGNYKTR AEVKFEGDTL 120

VNRIELKGID FKEDGNILGH KLEYNYNSCN VYIMADKQKN GIKVNFKIRH NIEDGSVQLA 180

DHYQQNTPIG DGPVLLPDNH YLSAQSALSK DPNEKRDHMV LLEFVTAAGI TLGMDELYK 239

YFPmu4(YFP^{H149CF166NI168MY204A})基因序列(SEQ ID NO:13)

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagctgtaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacaacaa gatgcgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagcg cacagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

YFPmu4(YFP^{H149CF166NI168MY204A})蛋白序列(SEQ ID NO:14)

MVSKGEELFT GVVPILVELD GDVNGHKFSV SGEGEGDATY GKLTLKFICT TGKLPVPWPT 60

LVTTFGYGLQ CFARYPDHMK QHDFFKSAMP EGYVQERTIF FKDDGNYKTR AEVKFEGDTL 120

VNRIELKGID FKEDGNILGH KLEYNYNSCN VYIMADKQKN GIKVNNKMRH NIEDGSVQLA 180

DHYQQNTPIG DGPVLLPDNH YLSAQSALSK DPNEKRDHMV LLEFVTAAGI TLGMDELYK 239

YFPmu7(YFP^{S148CH149CF166NK167MI168MS203AY204A})基因序列(SEQ ID NO:15)

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa ctgctgtaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacaacat gatgcgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctggctg cacagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

YFPmu7(YFP^{S148CH149CF166NK167MI168MS203AY204A})蛋白序列(SEQ ID NO:16)

MVSKGEELFT GVVPILVELD GDVNGHKFSV SGEGEGDATY GKLTLKFICT TGKLPVPWPT 60

LVTTFGYGLQ CFARYPDHMK QHDFFKSAMP EGYVQERTIF FKDDGNYKTR AEVKFEGDTL 120

VNRIELKGID FKEDGNILGH KLEYNYNCCN VYIMADKQKN GIKVNNMMRH NIEDGSVQLA 180

DHYQQNTPIG DGPVLLPDNH YLAAQSALSK DPNEKRDHMV LLEFVTAAGI TLGMDELYK 239

YFP^L232H基因序列(SEQ ID NO:17)

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagct accagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actcacggca tggacgagct gtacaagtaa 720

YFP^L232H蛋白序列(SEQ ID NO:18)

MVSKGEELFT GVVPILVELD GDVNGHKFSV SGEGEGDATY GKLTLKFICT TGKLPVPWPT 60

LVTTFGYGLQ CFARYPDHMK QHDFFKSAMP EGYVQERTIF FKDDGNYKTR AEVKFEGDTL 120

VNRIELKGID FKEDGNILGH KLEYNYNSHN VYIMADKQKN GIKVNFKIRH NIEDGSVQLA 180

DHYQQNTPIG DGPVLLPDNH YLSYQSALSK DPNEKRDHMV LLEFVTAAGI THGMDELYK 239

YFP^L232Q基因序列(SEQ ID NO:19)

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagct accagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actcagggca tggacgagct gtacaagtaa 720

YFP^L232Q蛋白序列(SEQ ID NO:20)

MVSKGEELFT GVVPILVELD GDVNGHKFSV SGEGEGDATY GKLTLKFICT TGKLPVPWPT 60

LVTTFGYGLQ CFARYPDHMK QHDFFKSAMP EGYVQERTIF FKDDGNYKTR AEVKFEGDTL 120

VNRIELKGID FKEDGNILGH KLEYNYNSHN VYIMADKQKN GIKVNFKIRH NIEDGSVQLA 180

DHYQQNTPIG DGPVLLPDNH YLSYQSALSK DPNEKRDHMV LLEFVTAAGI TQGMDELYK 239

YFP1-231基因序列(SEQ ID NO:21)

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagct accagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc acttaa 696

YFP1-231蛋白序列(SEQ ID NO:22)

MVSKGEELFT GVVPILVELD GDVNGHKFSV SGEGEGDATY GKLTLKFICT TGKLPVPWPT 60

LVTTFGYGLQ CFARYPDHMK QHDFFKSAMP EGYVQERTIF FKDDGNYKTR AEVKFEGDTL 120

VNRIELKGID FKEDGNILGH KLEYNYNSHN VYIMADKQKN GIKVNFKIRH NIEDGSVQLA 180

DHYQQNTPIG DGPVLLPDNH YLSYQSALSK DPNEKRDHMV LLEFVTAAGI T 231

GFP突变后的基因和蛋白序列如下：

GFP1-231基因序列(SEQ ID NO:23)

ATGGTGAGCA AGGGCGAGGA GCTGTTCACC GGGGTGGTGC CCATCCTGGT CGAGCTGGAC 60

GGCGACGTAA ACGGCCACAA GTTCAGCGTG TCCGGCGAGG GCGAGGGCGA TGCCACCTAC 120

GGCAAGCTGA CCCTGAAGTT CATCTGCACC ACCGGCAAGC TGCCCGTGCC CTGGCCCACC 180

CTCGTGACCA CCTTCACCTA CGGCGTGCAG TGCTTCAGCC GCTACCCCGA CCACATGAAG 240

CAGCACGACT TCTTCAAGTC CGCCATGCCC GAAGGCTACG TCCAGGAGCG CACCATCTTC 300

TTCAAGGACG ACGGCAACTA CAAGACCCGC GCCGAGGTGA AGTTCGAGGG CGACACCCTG 360

GTGAACCGCA TCGAGCTGAA GGGCATCGAC TTCAAGGAGG ACGGCAACAT CCTGGGGCAC 420

AAGCTGGAGT ACAACTACAA CAGCCACAAC GTCTATATCA TGGCCGACAA GCAGAAGAAC 480

GGCATCAAGG TGAACTTCAA GATCCGCCAC AACATCGAGG ACGGCAGCGT GCAGCTCGCC 540

GACCACTACC AGCAGAACAC CCCCATCGGC GACGGCCCCG TGCTGCTGCC CGACAACCAC 600

TACCTGAGCA CCCAGTCCGC CCTGAGCAAA GACCCCAACG AGAAGCGCGA TCACATGGTC 660

CTGCTGGAGT TCGTGACCGC CGCCGGGATC ACTTAA 720

GFP1-231蛋白序列(SEQ ID NO:24)

MVSKGEELFT GVVPILVELD GDVNGHKFSV SGEGEGDATY GKLTLKFICT TGKLPVPWPT 60

LVTTFTYGVQ CFSRYPDHMK QHDFFKSAMP EGYVQERTIF FKDDGNYKTR AEVKFEGDTL 120

VNRIELKGID FKEDGNILGH KLEYNYNSHN VYIMADKQKN GIKVNFKIRH NIEDGSVQLA 180

DHYQQNTPIG DGPVLLPDNH YLSTQSALSK DPNEKRDHMV LLEFVTAAGI T 239

mCherry点突变后的基因和蛋白序列：

mCherrymu3(mCherry^{S151CS152CK167M})基因序列(SEQ ID NO:25)

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tgctgtgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcat gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta g 711

mCherrymu3(mCherry^{S151CS152CK167M})蛋白序列(SEQ ID NO:26)

MVSKGEEDNM AIIKEFMRFK VHMEGSVNGH EFEIEGEGEG RPYEGTQTAK LKVTKGGPLP 60

FAWDILSPQF MYGSKAYVKH PADIPDYLKL SFPEGFKWER VMNFEDGGVV TVTQDSSLQD 120

GEFIYKVKLR GTNFPSDGPV MQKKTMGWEA CCERMYPEDG ALKGEIMQRL KLKDGGHYDA 180

EVKTTYKAKK PVQLPGAYNV NIKLDITSHN EDYTIVEQYE RAEGRHSTGG MDELYK 236

mCherrymu4(mCherry^{S151CS152CK167MI202A})基因序列(SEQ ID NO:27)

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tgctgtgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcat gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacgcaaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta g 711

mCherrymu4(mCherry^{S151CS152CK167MI202A})蛋白序列(SEQ ID NO:28)

MVSKGEEDNM AIIKEFMRFK VHMEGSVNGH EFEIEGEGEG RPYEGTQTAK LKVTKGGPLP 60

FAWDILSPQF MYGSKAYVKH PADIPDYLKL SFPEGFKWER VMNFEDGGVV TVTQDSSLQD 120

GEFIYKVKLR GTNFPSDGPV MQKKTMGWEA CCERMYPEDG ALKGEIMQRL KLKDGGHYDA 180

EVKTTYKAKK PVQLPGAYNV NAKLDITSHN EDYTIVEQYE RAEGRHSTGG MDELYK 236

mCherrymu5(mCherry^{S151CS152CI166NK167MI202A})基因序列(SEQ ID NO:29)

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tgctgtgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagaatat gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacgcaaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta g 711

mCherrymu5(mCherry^{S151CS152CI166N K167MI202A})蛋白(SEQ ID NO:30)

MVSKGEEDNM AIIKEFMRFK VHMEGSVNGH EFEIEGEGEG RPYEGTQTAK LKVTKGGPLP 60

FAWDILSPQF MYGSKAYVKH PADIPDYLKL SFPEGFKWER VMNFEDGGVV TVTQDSSLQD 120

GEFIYKVKLR GTNFPSDGPV MQKKTMGWEA CCERMYPEDG ALKGENMQRL KLKDGGHYDA 180

EVKTTYKAKK PVQLPGAYNV NAKLDITSHN EDYTIVEQYE RAEGRHSTGG MDELYK 236

eqFP611(AY130757)基因序列(SEQ ID NO:31)

atgaattcactgatcaaggaaaatatgcgtatgatggtggtcatggaaggttcggtcaacggctaccaattcaaatgcacaggtgaaggagatggcaatccatacatgggaactcaaaccatgaggatcaaagtcgtcgagggaggacctctgccatttgcctttgacattcttgccacaagcttcatgtatggcagcaagacttttatcaagcacactaaaggcattcctgatttctttaaacagtcctttcctgagggttttacttgggaaagagttacaagatacgaagatggtggagtctttaccgttatgcaggacaccagccttgaagatggctgtctcgtttaccacgccaaagtcactggggtaaactttccctccaatggtgccgtgatgcagaagaagaccaagggttgggagccaaatacagagatgctgtatccagcagatggtggtctgaggggatactctcaaatggcactgaatgttgatggtggtggctatctgtcttgctctttcgaaacaacttacaggtcaaaaaagaccgtcgagaacttcaagatgcccggtttccattttgttgatcaccgcctggaaaggttagaggaaagtgacaaggaaatgttcgtagtacaacacgaacacgcagttgccaagttctgtgaccttccatccaaactgggacgtctttga

eqFP611蛋白序列(SEQ ID NO:32)

MNSLIKENMRMMVVMEGSVNGYQFKCTGEGDGNPYMGTQTMRIKVVEGGPLPFAFDILATSFMYGSKTFIKHTKGIPDFFKQSFPEGFTWERVTRYEDGGVFTVMQDTSLEDGCLVYHAKVTGVNFPSNGAVMQKKTKGWEPNTEMLYPADGGLRGYSQMALNVDGGGYLSCSFETTYRSKKTVENFKMPGFHFVDHRLERLEESDKEMFVVQHEHAVAKFCDLPSKLGRL

hcriCP(AF363776)基因序列(SEQ ID NO:33)

atggctggtttgttgaaagaaagtatgcgcatcaagatgtacatggaaggcacggttaatggccattatttcaagtgtgaaggagagggagacggcaacccatttacaggtacgcagagcatgaggattcatgtcaccgaaggggctccattaccatttgccttcgacattttggcaccgtgttgtgagtacggcagcaggacctttgtccaccatacggcagagattcccgatttcttcaagcagtctttccctgaaggctttacttgggaaagaaccacaacctatgaagatggaggcattcttactgctcatcaggacacaagcctggaggggaactgccttatatacaaggtgaaagtccttggtaccaattttcctgctgatggccccgtgatgaagaacaaatcaggaggatgggagccatgcactgaggtggtttatccagagaatggtgtcctgtgtggacgtaatgtgatggcccttaaagtcggtgatcgtcgtttgatctgccatctctatacttcttacaggtccaagaaagcagtccgtgccttgacaatgccaggatttcattttacagacatccgccttcagatgccgaggaaaaagaaagacgagtactttgaactgtacgaagcatctgtggctaggtacagtgatcttcctgaaaaagcaaattga

hcriCP蛋白序列(SEQ ID NO:34)

MAGLLKESMRIKMYMEGTVNGHYFKCEGEGDGNPFTGTQSMRIHVTEGAPLPFAFDILAPCCEYGSRTFVHHTAEIPDFFKQSFPEGFTWERTTTYEDGGILTAHQDTSLEGNCLIYKVKVLGTNFPADGPVMKNKSGGWEPCTEVVYPENGVLCGRNVMALKVGDRRLICHLYTSYRSKKAVRALTMPGFHFTDIRLQMPRKKKDEYFELYEASVARYSDLPEKAN

eforCP(EU498726)基因序列(SEQ ID NO:35)

atgagtgtgattaaacaagtaatgaagaccaagttgcacttggagggaactgttaacggacatgactttactattgagggtaaaggagaaggcaaaccttacgaaggattgcagcatatgaaaatgacggtcaccaaaggtgcgcctctgccgttttccgttcacattctgacacctagccatatgtacggaagcaaaccgtttaacaagtatcccgcggacatccctgactaccacaagcagtctttccccgaaggcatgtcttgggagaggagtatgatttttgaagatggaggcgtatgcactgccagcaatcattccagcataaacttgcaagaaaactgtttcatctatgatgtgaaatttcacggcgtgaaccttcctcctgatggtcctgttatgcaaaagaccattgcgggatgggagccgtctgtggagacactgtacgtgcgagacgggatgctgaaaagtgacactgcaatggtttttaagctgaagggaggcggtcatcaccgagttgatttcaagactacttacaaggcaaagaaacctgtcaagttgccagagttccactttgtggagcatcgcctggaactgacaaaacacgacaaggatttcacaacttgggaccagcaggaggcagccgagggtcatttttctccgctgcctaaagctttgccataa

eforCP蛋白序列(SEQ ID NO:36)

MSVIKQVMKTKLHLEGTVNGHDFTIEGKGEGKPYEGLQHMKMTVTKGAPLPFSVHILTPSHMYGSKPFNKYPADIPDYHKQSFPEGMSWERSMIFEDGGVCTASNHSSINLQENCFIYDVKFHGVNLPPDGPVMQKTIAGWEPSVETLYVRDGMLKSDTAMVFKLKGGGHHRVDFKTTYKAKKPVKLPEFHFVEHRLELTKHDKDFTTWDQQEAAEGHFSPLPKALP

spisCP(DQ206398)基因序列(SEQ ID NO:37)

atgtctcattcaaagcaagctctagccgataccatgaagatgacctggcttatggaaggcagcgtcaatggtcatgcatttaccattgagggagaaggcactggaaaaccttacgagggcaagcaatcagggacattccgtgttacaaagggcggaccccttccatttgcctttgacatagtggcaccgaccttgaagtatggattcaaatgttttatgaagtaccctgctgatatacctgactattttaagctggcatttcccgaaggtcttacatacgacaggaaaatagcatttgaagatggagggtgtgccacggccactgtggaaatgagcctcaaaggcaacactcttgtgcacaagaccaattttcaaggaggcaactttcccattgacgggcctgtcatgcagaaaaggactcttggctgggaaccaacctcagagaaaatgactccttgtgatggaataatcaagggtgacactatcatgtacctgatggttgaaggaggcaaaactctgaaatgccgatatgaaaacaattacagggccaacaagccagttctgatgccaccgagccattttgtggatcttcgccttaccagaaccaaccttgataaggaaggccttgcgtttaaactggaggaatacgctgtggcaagagtcctcgaagtttga

spisCP蛋白序列(SEQ ID NO:38)

MSHSKQALADTMKMTWLMEGSVNGHAFTIEGEGTGKPYEGKQSGTFRVTKGGPLPFAFDIVAPTLKYGFKCFMKYPADIPDYFKLAFPEGLTYDRKIAFEDGGCATATVEMSLKGNTLVHKTNFQGGNFPIDGPVMQKRTLGWEPTSEKMTPCDGIIKGDTIMYLMVEGGKTLKCRYENNYRANKPVLMPPSHFVDLRLTRTNLDKEGLAFKLEEYAVARVLEV

scubGFP(AY037767)基因序列(SEQ ID NO:39)

ATGCAGCGTGCTGGGATGAAGGTTAAGGAACATATGAAGATCAAACTGCGTATGGGAGGTACTGTAAACGGAAAGCATTTCGCGGTTAATGGGACAGGAGACGGCTACCCTTATCAGGGAAAACAGATTTTGAAACTTATCGTCGAAGGCAGCGAACCTCTGCCTTTCGCTTTTGATATCTTGTCAGCAGCATTCCAGTATGGCAACAGGGCATTCACCGAATACCCAACAGAGATAGCAGACTATTTCAAGCAGTCGTTTGAGTTTGGCGAGGGGTTCTCCTGGGAACGAAGTTTCACTTTCGAAGATGGGGCCATTTGCGTCGCCACCAACGATATAACGATGGTTGGTGGTGAGTTTCAGTATGATATTCGATTTGATGGTCTGAACTTCCCCGAAGATGGTCCAGTGATGCAAAAGAAAACCGTAAAATGGGAGCCATCCACTGAGATAATGTATATGCAAAATGGAGTGCTGAAGGGTGAGGTTAACATGGCTCTGTTGCTTCAAGACAAAAGCCATTACCGTTGCGACCTCAAAACTACTTACAAAGCTAAGAATAATGTGCCGCATCCTCCAGGCTACCACTATGTGGATCACTGCATTGAAATACTCGAAGAACGTAAGGATCACGTTAAGCTGCGGGAGCATGCTAAAGCTCGTTCTAGCCTGTCACCTACCAGTGCAAAAGAACGAAAGGCTTAG

scubGFP蛋白序列(SEQ ID NO:40)

MQRAGMKVKEHMKIKLRMGGTVNGKHFAVNGTGDGYPYQGKQILKLIVEGSEPLPFAFDILSAAFQYGNRAFTEYPTEIADYFKQSFEFGEGFSWERSFTFEDGAICVATNDITMVGGEFQYDIRFDGLNFPEDGPVMQKKTVKWEPSTEIMYMQNGVLKGEVNMALLLQDKSHYRCDLKTTYKAKNNVPHPPGYHYVDHCIEILEERKDHVKLREHAKARSSLSPTSAKERKA

rfloRFP(AY037773)基因序列(SEQ ID NO:41)

ATGAGTGCACTCAAAGAGGAAATGAAAATCAAGCTTACATTGGTGGGCGTTGTTAACGGGCACCCATTCAAGATCATTGGGGACGGAAAAGGCAAACCCTATGAGGGATCGCAGGAATTAACCCTTGCCGTGGTGGAAGGAGGGCCTCTGCCTTTCTCTTATGATATCCTGACAACGATAGTTCACTATGGCAACAGGGCATTTGTGAACTACCCAAAGGACATACCAGATATTTTCAAGCAGACCTGCTCTGGTCCTGGTGCTGGATATTCCTGGCAAAGGACCATGAGTTTTGAAGACGGAGGCGTTTGCACTGCTACGAGCCATATCAGGGTGGATGGCGACACTTTCAATTATGACATTCACTTCATGGGAGCGGATTTCCCTCTTAATGGTCCAGTGATGCAGAAAAGAACAGTGAAATGGGAGCCATCCACTGAGATAATGTTTCAATGTGATGGATTGCTGAGGGGTGATGTTGCCATGTCTCTGTTGCTGAAAGGAGGCGGCCATTACCGATGTGACTTTAAAACTATTTATAAACCCAAGAAGAATGTCAAGATGCCAGGTTACCATTTTGTGGACCACTGCATTGAGATAACGAGTCAACAGGACGATTACAACGTGGTTGAGCTGTACGAGGGTGCTGTAGCCCACTACTCTCCTCTGCAGAAACCATGCCAAGCAAAGGCATAA

rfloRFP蛋白序列(SEQ ID NO:42)

MSALKEEMKIKLTLVGVVNGHPFKIIGDGKGKPYEGSQELTLAVVEGGPLPFSYDILTTIVHYGNRAFVNYPKDIPDIFKQTCSGPGAGYSWQRTMSFEDGGVCTATSHIRVDGDTFNYDIHFMGADFPLNGPVMQKRTVKWEPSTEIMFQCDGLLRGDVAMSLLLKGGGHYRCDFKTIYKPKKNVKMPGYHFVDHCIEITSQQDDYNVVELYEGAVAHYSPLQKPCQAKA

rmueGFP(AY015996)基因序列(SEQ ID NO:43)

atgagtaaacaaatattgaagaacacttgtttacaagaagtaatgtcgtataaagtaaatctggaaggaattgtaaacaaccatgtttttacaatggagggttgcggcaaagggaatattttattcggcaatcaactggttcagattcgtgtcacgaaaggggccccactgccttttgcatttgatattgtgtcaccagcttttcaatatggcaaccgtactttcacgaaatatccgaatgatatatcagattattttatacaatcatttccagcaggatttatgtatgaacgaacattacgttacgaagatggcggacttgttgaaattcgttcagatataaatttaatagaagacaagttcgtctacagagtggaatacaaaggtagtaacttcccagatgatggtcccgtcatgcagaagactatcttaggaatagagccttcatttgaagccatgtacatgaataatggcgtcttggtcggcgaagtaattcttgtctataaactaaactctgggaaatattattcatgtcacatgaaaacattaatgaagtcgaaaggtgtagtaaaggagtttccttcgtatcattttattcaacatcgtttggaaaagacttacgtagaagacggggggttcgttgaacagcatgagactgctattgctcaaatgacatctataggaaaaccactaggatccttacacgaatgggtttaa

rmueGFP蛋白序列(SEQ ID NO:44)

MSKQILKNTCLQEVMSYKVNLEGIVNNHVFTMEGCGKGNILFGNQLVQIRVTKGAPLPFAFDIVSPAFQYGNRTFTKYPNDISDYFIQSFPAGFMYERTLRYEDGGLVEIRSDINLIEDKFVYRVEYKGSNFPDDGPVMQKTILGIEPSFEAMYMNNGVLVGEVILVYKLNSGKYYSCHMKTLMKSKGVVKEFPSYHFIQHRLEKTYVEDGGFVEQHETAIAQMTSIGKPLGSLHEWV

ceriantRFP(AY296063)基因序列(SEQ ID NO:45)

atgaacctgagcaaaaacgtgagcgtgagcgtgtatatgaaggggaacgtcaacaatcatgagtttgagtacgacggggaaggtggtggtgatccttatacaggtaaatattccatgaagatgacgctacgtggtcaaaattgcctacccttttcctatgatatcattaccacggcatttcagtatggtttccgcgtatttacaaaataccctgagggaattgttgactattttaaggattcgcttcccgacgcattccagtggaacagacgaattgtgtttgaagatggtggagtactaaacatgagcagtgatatcacatataaagataatgttctgcatggtgacgtctgggctgtcggagtgaacttcccgccgaatgggccagtgatgaagaatgaaattgtgatggaggaaccgactgaagaaacatttactccaaaaaacggggttcttgttggcttttgtcccaaagcgtacttacttaaagatggttcctattactatggaaatatgacaacattttacagatccaagaaatctggccaggcacctcctgggtatcactttgttaagcatcgtctcgtcaagaccaatgtgggacatggatttaagacggttgagcagactgaatatgccactgctcatgtcagtgatcttcccaagtaa

ceriantRFP蛋白序列(SEQ ID NO:46)

MNLSKNVSVSVYMKGNVNNHEFEYDGEGGGDPYTGKYSMKMTLRGQNCLPFSYDIITTAFQYGFRVFTKYPEGIVDYFKDSLPDAFQWNRRIVFEDGGVLNMSSDITYKDNVLHGDVWAVGVNFPPNGPVMKNEIVMEEPTEETFTPKNGVLVGFCPKAYLLKDGSYYYGNMTTFYRSKKSGQAPPGYHFVKHRLVKTNVGHGFKTVEQTEYATAHVSDLPK

anm2CP(AY485336)基因序列(SEQ ID NO:47)

atggaaggtggtccagcattatttcaatccgatatgacattcaagatcttcatcgatggagtggtgaatgatcagaaattcacgataatcgcagatggatcgtccaaattcccccatggtgacttcaacgtgcatgctgtgtgcgaaaccgggaaactcccaatgtcatggaaacctatttgtcaccttatccaatacggggagccattctttgcaaaatatcccaatggcatcagccattttgcacaggagtgctttccagaaggattaacaattgatcgaacagtcagattcgaaaatgacggcactatgacgtctcaccacacctatgagttggacggcacctgtgtcatttccaggataaccgttaattgtgacggatttcaacctgatggaccaatcatgaaagaccagcttgttgatatcctgccaactgagacacatatgttccctcatgggtccaatgctgtcagacaattgtgctacattggcttcacgacagctgatggtggtctcatgatgtcacattttgattcgaaattgacattcaatggttcgagagcaatcaagattcctggacctcatttcgttactgtgataatcaaacagatgaaagatacaagcgacaagcgtgatcatgtgtgtcaacgtgaagtcacctacgctcactcagttccacgcatcacttctgctatctaa

anm2CP蛋白序列(SEQ ID NO:48)

MEGGPALFQSDMTFKIFIDGVVNDQKFTIIADGSSKFPHGDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQYGEPFFAKYPNGISHFAQECFPEGLTIDRTVRFENDGTMTSHHTYELDGTCVISRITVNCDGFQPDGPIMKDQLVDILPTETHMFPHGSNAVRQLCYIGFTTADGGLMMSHFDSKLTFNGSRAIKIPGPHFVTVIIKQMKDTSDKRDHVCQREVTYAHSVPRITSAI

phiYFP(AY485333)基因序列(SEQ ID NO:49)

atgtctagtggagcactgttgttccacggaaagatcccatatgttgttgagatggagggaaatgttgatggacacacattctccattagaggtaaaggttatggagatgcaagtgttggtaaagttgatgcccaattcatctgcacaactggagatgtaccagttccatggtcaactttagtaacaacacttacttatggtgcacaatgcttcgccaaatatggtccagaattaaaggatttctacaagagttgcatgcctgaaggctatgtgcaggagcgtacaatcacatttgaaggggacggagtatttaaaactcgcgctgaagttacatttgaaaacggatctgtttataaccgagtcaaacttaatggacaaggatttaagaaagacggacatgtgcttggaaagaatcttgaattcaatttcacacctcattgtctttacatttggggagatcaggctaatcatggtttgaagtctgctttcaaaattatgcatgagattactggatcaaaagaagacttcattgttgcagaccacacccaaatgaacacacccattggtggtggaccagtccatgtccctgaataccatcatataacataccatgtcactctcagcaaagatgttactgatcacagggataacatgagcttggttgaaaccgtacgggctgtggattgcagaaaaacatatctttaa

phiYFP蛋白序列(SEQ ID NO:50)

MSSGALLFHGKIPYVVEMEGNVDGHTFSIRGKGYGDASVGKVDAQFICTTGDVPVPWSTLVTTLTYGAQCFAKYGPELKDFYKSCMPEGYVQERTITFEGDGVFKTRAEVTFENGSVYNRVKLNGQGFKKDGHVLGKNLEFNFTPHCLYIWGDQANHGLKSAFKIMHEITGSKEDFIVADHTQMNTPIGGGPVHVPEYHHITYHVTLSKDVTDHRDNMSLVETVRAVDCRKTYL

cpGFP(AB185173)基因序列(SEQ ID NO:51)

atgacaaccttcaaaatcgagtcccggatccatggcaacctcaacggggagaagttcgagttggttggaggtggagtaggtgaggagggtcgcctcgagattgagatgaagactaaagataaaccactggcattctctcccttcctgctgtcccactgcatgggttacgggttctaccacttcgccagcttcccaaaggggactaagaacatctatcttcatgctgcaacaaacggaggttacaccaacaccaggaaggagatctatgaagacggcggcatcttggaggtcaacttccgttacacttacgagttcaacaagatcatcggtgacgtcgagtgcattggacatggattcccaagtcagagtccgatcttcaaggacacgatcgtgaagtcgtgtcccacggtggacctgatgttgccgatgtccgggaacatcatcgccagctcctacgctagagccttccaactgaaggacggctctttctacacggcagaagtcaagaacaacatagacttcaagaatccaatccacgagtccttctcgaagtcggggcccatgttcacccacagacgtgtcgaggagactcacaccaaggagaaccttgccatggtggagtaccagcaggttttcaacagcgccccaagagacatgtag

cpGFP蛋白序列(SEQ ID NO:52)

MTTFKIESRIHGNLNGEKFELVGGGVGEEGRLEIEMKTKDKPLAFSPFLLSHCMGYGFYHFASFPKGTKNIYLHAATNGGYTNTRKEIYEDGGILEVNFRYTYEFNKIIGDVECIGHGFPSQSPIFKDTIVKSCPTVDLMLPMSGNIIASSYARAFQLKDGSFYTAEVKNNIDFKNPIHESFSKSGPMFTHRRVEETHTKENLAMVEYQQVFNSAPRDM

efasCFP(DQ206397)基因序列(SEQ ID NO:53)

atgtctttttcaaagcaggttttaaacgacgtgacgatgacctattttatggaaggcagtgtcaacgggcacgactttactattgaaggcgaaggcactggcaaaccatacgaaggacatcaacgttttaatctacgcgtcaccaagggcgcgcctctgcctttcgcagttgacatcctgtcagcagcgtttgcttatggcaaccgatgctttactaagtatcctaaagagataccagactttttcaaacaatcactccccgaagacatgtcatgggagaggacgatgacgttcgaagatggcggtattgttgctatcagtgcgcacatacgccttattggaaaccgcttcgagcacaaatccaagtttgtcggcgtgaacttccccgccgacggacctgtgatgcaaaggaagacgctaggttgggagccttccagcgagaaaatgactccccgcgacggaatactaaagggctatgttccgagtttcctcgtgctgcagggaggtggcaattacagatgcgactacgatactagctacagagccatgaagcctgtggagatgccagggggtcatttcatccagcatcgcattgtcaggagagacatcaagaaagattccaatggcaacacctggcaaattcaagaagacgcgtttgctcataacagcgaggtccctgatagtgcatga

efasCFP蛋白序列(SEQ ID NO:54)

MSFSKQVLNDVTMTYFMEGSVNGHDFTIEGEGTGKPYEGHQRFNLRVTKGAPLPFAVDILSAAFAYGNRCFTKYPKEIPDFFKQSLPEDMSWERTMTFEDGGIVAISAHIRLIGNRFEHKSKFVGVNFPADGPVMQRKTLGWEPSSEKMTPRDGILKGYVPSFLVLQGGGNYRCDYDTSYRAMKPVEMPGGHFIQHRIVRRDIKKDSNGNTWQIQEDAFAHNSEVPDSA

2.LEAT蛋白的原核表达及其纯化

PCR扩增mCherry全长基因，PCR产物用Bam HI和SalI酶切后接入pGEX-4T-1(GE healthcare，Uppsala，Sweden)载体中，使得GST融合在mCherry基因的N端，然后质粒转化E.coli BL21(DE3)(Promega，Madison，WI)。PCR扩增正向引物为:5’-CCCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’(SEQID NO:55)，反向引物为：

5’-CCGGTCGACCTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’(SEQ ID NO:56)。正向和反向引物序列下划线部分分别为BamHI和SalI酶切位点。

pRSET-BFP经EcoRI/XhoI酶切将BFP全长基因片段连接到pGEX-4T-1EcoRI/XhoI位点中，使得GST融合在BFP基因的N端，然后质粒转化E.coli BL21(DE3)。

mCherry点突变体基因(mCherrymu3,mCherrymu4和mCherrymu5)通过合成获得(金斯瑞生物科技，南京，中国)，合成序列时分别两端带有BamHI和SacI，合成后mCherrymu3,mCherrymu4和mCherrymu5片段连接到pUC57载体BamHI/SacI酶切位点。pUC57-mCherrymu3,pUC57-mCherrymu4和pUC57-mCherrymu5用BamHI和SacI酶切后，片段接入pET30a(Novagen)载体,使得6XHis标签融合在mCherry各突变基因的N端。将质粒转化E.coliBL21(DE3)菌株中，诱导表达融合蛋白。

分别以pEYFP，pECFP(Clonetech)和p1301-GFP（Li N,Zhang D-S,Liu H-Set al.The rice tapetum degeneration retardation gene is required for tapetumdegradation and anther development.The Plant Cell2006;18:2999-3014.）为模板，利用iProof High-Fidelity DNA聚合酶(Bio-rad)，通过PCR扩增YFP，CFP，GFP基因，将PCR产物用KpnI和SacI酶切后连接到pET51b载体(Novagen)中，YFPmu2、YFPmu4等的点突变通过引物扩增引入。以上的基因的N末端融合有strepII，将测序正确的质粒转化到BL21-CodonPlus菌株(Promega，Madison，WI)中，以20℃，0.1ml IPTG诱导过夜。

12个LEAT蛋白基因通过合成获得(金斯瑞生物科技，南京，中国)，合成序列时分别两端带有BamHI和SacI或EcoRI和SacI酶切位点，用BamHI和SacI或EcoRI和SacI酶切后接入pET30a(Novagen)，N末端与6XHis标签融合。将质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株中，诱导表达融合蛋白。

上述融合蛋白的诱导表达参照生产厂商的产品说明书。纯化的蛋白经脱盐后，-80C保存在含10%甘油的50mM的PBS缓冲液中。

3.LEAT蛋白光下裂解水放氧速率的测定

将1.85ml50mM磷酸缓冲液(pH6.5)加入Clark型氧电极的反应池中。然后避光先后加入终浓度为0.02-1μg/ml的LEAT蛋白(GFP和YFP L232H蛋白含量约为10μg/ml)和终浓度为400μM的各种类型对苯醌。然后在其被激发波长的光下(光强约为1-2μmolm^-2s^-1)测定其放氧速率。氧电极反应池的纵截面面积为2.4cm²。

4.LEAT蛋白光下裂解水放氧的同位素示踪鉴定

将终浓度为10nM的YFP；400μM的TMBQ加入15ml含浓度为50mMH₂ ¹⁸O的磷酸缓冲液(pH6.5)反应池中。在1-2μmol m^-2s^-1光强下反应。用毛细管连接的HPR40型薄膜进样质谱仪(HIDEN分析仪器公司，英国)实时分析反应体系溶解氧中¹⁶O和¹⁸O释放图谱。以不加YFP和TMBQ的空白为对照。

5.LEAT蛋白光还原2,3,5-三甲基对苯醌和Vitamin K₃速率的测定

将2ml50mM PBS(pH6.5)加入3ml四面透光的石英比色杯中。然后避光加入终浓度为0.02-1μg/ml的LEAT蛋白(GFP蛋白含量约为20μg/ml)，再加入终浓度为400μM2,3,5-三甲基对苯醌(TMBQ)或60μM Vitamin K₃。然后在各自适合波长的光(光强约为1-2μmol m^-2s^-1)下用UV-3000(日本岛津公司Shimadzu)分别测定其OD₄₃₆吸光减少速率或OD₃₆₀增加速率，TMBQ还原速率按照其在436nm处的消光系数(41.4M^-1cm^-1)进行计算，Vitamin K₃还原速率以OD₃₆₀增加速率表示。

6.吸收和荧光光谱测定

用UV-2450(日本岛津公司，Shimadzu)测定吸收光谱，用FL-4600荧光分光光度计(日本日立公司，Hitachi)测定荧光光谱。

实验所用的醌中，TMBQ购自德国CHEMOS GmbH公司；对苯醌购自TCI公司；其他醌购自Sigma公司。

实施例

实施例1YFP和mCherry对NAD和NADP等电子受体的还原在光下并不能持续还原

已有报道表明，GFP蛋白能够作为电子供体还原一些氧化态的小分子化合物如NAD^＋、铁氰化钾以及一些蛋白如细胞色素c、以FAD为辅基的蛋白，这暗示着这类蛋白有可能作为光合电子传递链的供体。发明人利用纯化的大肠杆菌表达重组蛋白对一些电子受体进行实验。结果表明不仅仅YFP(GFP系列)蛋白能将NAD⁺和NADP⁺还原(图1)，而且mCherry蛋白(dsRed系列)也能还原NAD⁺和NADP⁺(图2)。

但YFP和mCherry却不能在光下持续还原NAD⁺和NADP⁺，根据NAD(P)H在340nm处摩尔消光系数(6.220mM cm^-1)算出，反应产生的NAD(P)H是反应体系中YFP或mCherry的分子摩尔数的1/2，即反应产生的NAD(P)H的量只与反应初始加入的YFP或mCherry的量有关，而与反应时间无关，与是否继续照光无关(图3)，说明预照光的YFP和mCherry虽然可以作为电子供体，但其反应不可持续。经过很多次的尝试，发现很多生物体内常见的电子受体，虽然能被预照光的荧光蛋白还原(Bogdanov等2010，Green fluorescent proteins are light-inducedelectron donors，Nature Biological Chemistry)，但这个反应在光下并不能持续，电子受体的还原量与反应时间无关(表1)。

表1.mCherry和YFP对各种电子传递受体光下持续还原能力

标准氧化还原电位(pH7，25℃)

实施例2.醌介导的LEAT蛋白光下裂解水放氧

虽然单纯的YFP/mCherry蛋白和2,3,5-三甲基对苯醌(TMBQ，一种植物体内质体醌的类似物)分子本身不能通过吸收光能使得水裂解，放出氧气，但当它们组合起来后，就能通过利用光的能量，催化水的裂解放出氧气。这个反应是和蛋白本身的吸光特性相关，当照射的光为红光时，由于红光不能被YFP/mCherry蛋白吸收，反应并不能发生，而GFP的光下裂解水能力相对较弱(图4A和5A)。进一步的证据表明，这个反应是光强、YFP/mCherry蛋白浓度和TMBQ醌依赖的(图4和5)。同时这个反应与体系的pH相关。这些结果证明水光下裂解放出氧气是由YFP/mCherry吸收光能后与TMBQ相互作用产生的。这种光下裂解水放氧反应在很微弱的光下(>0.1μmol m^-2s^-1)就能发生。

不同TMBQ浓度下YFP荧光强度的比较实验表明，TMBQ的存在会使YFP的荧光强度明显减弱，并随TMBQ浓度的增加而下降(图7B)；而当YFP浓度比较高时，这种减弱趋势相对不明显(图7A)。这进一步说明YFP将部分吸收的光能用于裂解水，从而导致了其荧光强度的降低。

5mM醌浓度在暗中处理YFP_1-231不同时间的实验表明，TMBQ的存在使得YFP吸收对光的吸收明显增强，并随着处理时间的延长而增加(图8)，这说明当处于激发态的YFP将能量传递给醌分子后其构像发生显著了变化，使得更多的YFP蛋白分子处于基态，可以再次被激发。有些LEAT蛋白吸光值很低，那是因为它吸收的光能通过荧光的形式释放能量很少，绝大部分蛋白分子处于激发态，不能再被激发。但一旦其能量被释放就能吸收光能，所以它催化光下水裂解放氧能力很强的原因。TMBQ存在时，280nm和295nm激发的蛋白内源荧光强度及其最大荧光峰值的蓝移进一步证明了TMBQ与荧光蛋白发生相互作用使得蛋白构像发生变化（图25）。

实验结果表明，在TMBQ存在下，YFP和mCherry蛋白分子的光下催化水裂解放氧活力最高，其中TMBQ>DMBQ2（2,6-二甲基-对苯醌）>MBQ（甲基-对苯醌）>DMBQ1（2,5-二甲基-对苯醌），而用杜醌(duroquinone，DQ，四甲基醌)和泛醌类似物(2,3-二甲氧基-5-甲基对苯醌,UQ)取代TMBQ时，YFP和mCherry蛋白分子则不能在光下催化水裂解放氧，VitaminK₃(一种甲基萘醌)在表观上反而则体现出吸氧的能力(图9)，这可能与光下水裂解后被还原VitaminK₃具有较高的还原能力有关，还原型的VitaminK₃可以还原O₂分子，产生超氧阴离子。同时实验结果还显示，在不同醌存在的情况下，YFP和mCherry最佳浓度不一样(图9C、D)。另外，当蛋白浓度比较高时，TMBQ被还原的速度比较快，局部TMBQ浓度过高，也与VitaminK3一样与氧气分子产生氧自由基，(GongX,Gutala R,JaiswalAK.Quinone oxidoreductases and vitamin K metabolism.Vitam.Horm.N.Y.)2008;78:85-101..KoikeH,NakazonoH,KashinoY,SatohK.Quinones as electron acceptors in intact cells of a cyanobacterium.Photosynthesis:Mechanisms and Effects 1998 ;2:1149-1152.)也会产生一定程度的耗氧，所以导致表现放氧速率的下降。因此醌的结构对于光下裂解水放氧活力至关重要。本领域技术人员知道，即使现在不能用于光下裂解水放氧反应的醌，通过对荧光蛋白的突变后，也可能发生反应。图10显示了参与光下裂解水反应的醌构像的可能性。由于LEAT蛋白在受光激发前后，会形成类似苯和醌的结构，而这一结构与反应还原性的醌自发形成醌氢醌结构，根据其结构的相似性可以合理预计认为能与一般性的醌是能这一结构的发生相互作用，进行氧化还原能的传递，现在不能发生反应的醌可能是与蛋白立体结构契合程度有关(Jung,G.;Wiehler,J.;Zumbusch,A.Biophys.J.2005,88,1932)。因此，本领域技术人员可以合理预知在对LEAT蛋白作进一步结构修饰之后，其它醌也可应用于本发明。

发明人进一步尝试了除YFP和mCherry外的其他LEAT蛋白的光下催化水裂解放氧反应，发现光下催化水裂解放氧，并不是YFP和mCherry的一个特殊现象，在LEAT蛋白中普遍存在的，而且放氧的能力与LEAT蛋白的激发和发射波长及其荧光强度不呈正相关(图11)。GFP的催化活力较弱。

实施例3.醌介导的LEAT蛋白不发光突变体催化的光下水裂解放氧

自然界中存在许多不发光但能吸收光的生色蛋白。为了进一步探讨LEAT蛋白的荧光特性与光下催化水裂解放氧能力关系，发明人将YFP和mCherry生色团周围相关残基进行突变，各得到了3个荧光大幅度减弱的点突变：YFP mu2(H149C、Y204A)、YFP mu4(H149C、F165N、I167M、Y204A)、YFP mu7(S148C、H149C、F165N、K166M、I167M、S203A、Y204A)、mCherry mu3(S148C、S149C、K166M)、mCherry mu4(S148C、S149C、K166M、I203A)、mCherry mu5(S148C、S149C、I165N、K166M、I203A)。

吸收和激发光谱扫描实验结果发现，这6个突变体只能发很弱的荧光或基本不发荧光。其中YFP mu2和mCherry mu3的吸收光的能力分别减少到原来的30%和40%(图12A和D)，但其荧光强度分别只有原来的～1和4%(图12B和E)。其它4个突变体不仅荧光强度减弱得更多，其吸收光的能力也大幅度降低。其中YFP mu4和YFP mu7的荧光强度分别只有野生型的0.04%和0.07%，而mCherrymu4和mCherry mu5的荧光强度分别只有野生型的3%和5%(图12)。

进一步的光下催化水裂解放氧活力测定表明，它们醌介导的光下裂解水放氧能力与他们的荧光强度没有相关性。放氧活力不仅没有随着荧光强度的降低，反而有大幅度的提高。其中YFP mu2和YFP mu7分别是野生型的6倍和30倍，mCherry mu3是野生型的6倍(图12C和F)。这些结果表明醌介导的LEAT蛋白放氧活性与其是否发射荧光无关，而与蛋白吸收光能并传递光能(Light EnergyAbsorption and Transduction)的能力有关。由于其没有荧光来耗散吸收的光能，它们的光下裂解水放氧的活力反而更高。另外由于没有荧光耗散其激发能，处于激发态的LEAT蛋白分子回到基态需要更长时间，可能导致处于基态的LEAT蛋白分子较少其吸收光能力的大幅度下降。比如YFP1-231突变体的光吸收能力较弱，但其在TMBQ存在的情况下，吸收光的能力就会恢复到原来1倍左右。另外280nm激发的LEAT蛋白内源荧光的实验表明，活力高的内源荧光高，其内源荧光在TMBQ存在的情况下，下降的比例也高（图26），这为今后选择活力较高的突变体，提供了一个较为简便的方法。

实施例4.LEAT蛋白在光下通过醌介导催化水裂解放氧将还原能储存在醌分子中

通过监测醌分子的在436nm吸收减少的变化，来测定醌分子在光下裂解水放氧过程中的还原速率。实验结果显示：在水裂解放氧过程中，醌被迅速还原，不同LEAT蛋白的醌还原速率(图13)与放氧速率变化趋势一致（图11）。YFP和mCherry发弱荧光或不发光突变体的TMBQ还原速率也大幅度提高，其中YFPmu7比野生型提高了200倍。由于较高浓度TMBQ能还原O₂产生氧自由基，1个电子能还原1分子氧，而水裂解反应放出1分子氧则需要4个电子；因此在醌还原和放氧测定中的LEAT蛋白含量高或LEAT活力高时，其反应速度就快，单位时间产生的还原醌就多，容易造成醌还原速率远大于放氧速率。由于YFPmu7活力比野生型高很多，因此其表观放氧速率只增加了30倍（图12），而还原醌的速率增加了200倍。(图14)，说明这两个反应是耦合的，LEAT蛋白吸收光能，分解水放出氧气后将光能以还原能的形式储存在TMBQ分子中。

以质体醌为例，根据反应自由能公式可以计算出整个反应光能转化为化学能的量。ΔG₀=-nFΔE₀，其中F为法拉第常数，n为电子传递数。在标准条件下，1分子水分解成氧和2个电子和2个质子氧化还原电电位变化约为-1.23电子伏特，而质子与电子传递给醌形成氢醌的氧化还原电位大约±0.100电子伏特，标准条件下整个光下裂解水放氧及醌的还原反应的ΔE₀是-1.23±0.100电子伏特，也就是说，在标准条件下上述光下裂解水过程中有1.23±0.100电子伏特的光能转化成了为化学能。同时，这固定在醌中的还原能是可以往下传递的。比如在原有的反应体系中加入细胞色素c和细胞色素f后可以明确观测到细胞色素c和f被还原(图15)。

发明人还通过检测醌氢醌含量增加(360nm吸收的上升)比较了不同LEAT蛋白对Vitamin K₃(一种甲基萘醌)还原。结果发现LEAT蛋白不仅能在光下持续还原TMBQ，而且还能在光下持续还原VitaminK₃。各种LEAT蛋白还原VitaminK₃的能力mCherry>YFP>CFP，BFP和GFP的还原能力很弱(图18A)，而且即使mCherry（图中最高浓度为1μM，下同）浓度远远低于DTT（2mM）和还原性谷胱甘肽（0.3mM），还原VitaminK₃的速率并不亚于低浓度的DTT和还原型谷胱甘肽，而优于抗坏血酸（5mM）(图18B)。这种还原能力随着VitaminK₃浓度增加而增加(图19)。

上述的实验说明醌介导的LEAT蛋白光下催化水裂解放氧活力与其吸收和荧光的波长，以及荧光强度没有必然的联系。为了找出光下催化水裂解放氧的催化相关位点，发明人将实验中的GFP系列的几个LEAT蛋白的一级结构进行了比对，发现GFP与其他几个蛋白除了生色团附近结构存在差异外，在232位存在显著差异：GFP在232位的氨基酸残基为组氨酸(H)，而在其他蛋白中为亮氨酸(L)(图20)。对YFP的这个氨基酸残基进行点突变后的实验结果表明，这个位点的突变对YFP的光吸收和荧光特性没有太大的影响(图21A和B)。YFP的L232Q突变并没有显著影响YFP光下催化水裂解放氧活力。但YFP的L232H突变则显著降低了YFP的光下裂解水放氧活力(图21C)，而与GFP放氧活力接近(图5)。

进一步实验结果表明，当232位（包括232）后的C末端8个氨基酸残基被去除后，YFP_1-231和GFP_1-231的光吸收和荧光强度都有大幅度的下降，但其光下裂解水放氧活力明显增加，特别是GFP_1-231的放氧活力已经回复到与YFP同一数量级范围(结果如图22所示)。在图22中，比较了GFP蛋白232位后C末端去除后的吸收光谱(A)、荧光光谱(B)和放氧活力(C)；其中，A和B为光吸收和荧光强度在相同蛋白浓度下进行比较，分别以突变前的GFP为1(吸收)和100(荧光强度)。C中，GFP_1-231蛋白浓度为10nM，GFP浓度为100nM，TMBQ浓度为400μM，在光强度为1-2μmol m^-2s^-1的各自激发光下测定。

以上结果说明GFP系列蛋白C末端序列对于LEAT蛋白的催化水裂解活力有较大的抑制作用。这为今后降低LEAT蛋白能量的荧光损耗，增强光下催化水裂解放氧能力的改造提供新的途径。

实施例5.YFP的光下催化水裂解放氧的同位素示踪实验

根据“材料与方法”中“4.LEAT蛋白光下催化水裂解放氧的同位素示踪鉴定”所述进行本实施例的实验

将终浓度为10nM的YFP，400μM的TMBQ加入15ml含50mMH₂ ¹⁸O的磷酸缓冲液(pH6.5)反应池中。在1-2μmolm^-2s^-1光强下反应。用毛细管连接的HPR40型薄膜进样质谱仪(HIDEN分析仪器公司，英国)实时分析反应体系溶解氧中¹⁶O和¹⁸O释放图谱。结果如图6所示：其中A为反应体系溶解氧中¹⁸O含量的实时变化；B为反应体系溶解氧中¹⁶O含量的实时变化；CK为不加YFP和TMBQ的空白对照。

本实施例的结果从另外一个角度证明放出的氧分子确实来源于水分子，从而进一步证明水裂解反应的发生。

实施例6.醌对于LEAT蛋白吸收光的能力的影响

发明人检测了醌的存在对于LEAT蛋白吸收光的能力的影响。结果如图8所示，YFP_1-231在5mM TMBQ存在下，其光吸收强度随着处理时间的增加其吸收光的能力逐渐加强。其中以不加TMBQ的YFP_1-231为对照，用514nm吸收峰进行归一化处理。图中数字为测定体系中TMBQ处理时间。以不加TMBQ的YFP的荧光强度为100。

该实施例的结果说明LEAT蛋白的激发态和基态吸收光的能力不一样。由于LEAT蛋白吸收光后，蛋白处于激发态，其吸收光再被激发的能力大幅下降，而当存在TMBQ时，其激发态的能量通过裂解水并还原TMBQ逐渐释放，因此其吸收光的能力也就逐渐恢复。这可能是有些LEAT蛋白虽然它的吸光能力很弱，但它仍然保持很高的光下裂解水活力的原因。

实施例7来源于不同进化分支物种的LEAT蛋白尽管其同源性、荧光光谱、强弱有很大的差异，但都有催化水裂解放氧活力。

发明人从110种刺胞动物（Cnidarian）和节足动物（Arthropoda）来源的荧光蛋白和非荧光生色蛋白（表2）中选择了9个荧光蛋白和3个非荧光生色蛋白（图23A)。这12个蛋白在进化树上分别属于A、B、C、D等不同的分支（图23A)。这12个荧光蛋白和非荧光生色蛋白加上GFP系列和dsRED系列荧光蛋白覆盖了目前已报道的大部分的LEAT蛋白（Alieva等,2008,Diversity and evolution ofcoarl fluorescent proteins.PLoS One3(7):e2680.doi:10.1371/journal.pone.0002680），它们分子进化途径以及氨基酸的同源性与GFP系列和dsRED系列的LEAT同源性有很大的差别（图23B和23C）。利用大肠杆菌表达这些蛋白，发现这些蛋白都有不同程度的利用光裂解水放氧的活力(结果见下表3)，其中荧光蛋白浓度为25nM，TMBQ浓度为400μM，（终浓度）在光强度为1-2μmolm^-2s^-1的各自激发光下测定。

表2、110种刺胞动物（Cnidarian）和节足动物（Arthropoda）来源荧光蛋白和非荧光生色蛋白名称及基因序列号（来自Alieva et al.,2008）。划线的蛋白为本专利所选择的在大肠杆菌中表达、纯化并检测光下裂解水放氧活性的蛋白。

表3.不同来源的LEAT蛋白荧光和光下裂解水放氧活力的强弱(光下裂解水)

注：放氧活力测定中，“+”表示放氧活力与YFP在一个数量级，在2000±1000min^-1左右，“++”表示放氧活力高于YFP至少一个数量级，“弱”表示放氧活力低于YFP的1/10。

实施例8.LEAT蛋白在光下通过催化水裂解放氧储存在醌分子中的能量可以继续传递给下游的电子载体。

发明人还检测了在LEAT蛋白催化水裂解体系中，加入电子受体，如细胞色素f(Cytf)、细胞色素(Cytc)，和质蓝素（PC），检测其是否被还原。结果显示在没有添加TMBQ的条件下，无论是YFP还是mCherry都不能催化细胞色素c的还原（图15），在没有TMBQ存在的情况下YFP也不能催化Cytf的和的光下还原，但一旦加入TMBQ后就能通过TMBQ的介导还原细胞色素f、细胞色素c和质蓝素（图15、16和17）。而且细胞色素f和质蓝素还原的是光强依赖的（图16B）。同时发明人还发现，LEAT蛋白依赖TMBQ光下催化细胞色素f和质蓝素光还原活性，与催化水裂解放氧类似，除了GFP活性较低之外，其余的LEAT蛋白都具有很高的活性(图17A，B)，尤其是荧光减弱或不发荧光的突变体(图11C，D)。

由于Cytc，Cytf和PC是重要的电子传递介质，LEAT蛋白在醌介导下具有催化它们还原的活力，意味着通过LEAT蛋白将光能转换成化学能固定在醌中后，还可以通过各种电子载体传递，方便人们的利用。比如不仅可以转到细胞质中提高整体光合效率，而且还可以整合到光合机构的类囊体膜上后，作为人工天线来提高植物的捕光效率。特别是细胞色素c，还原型的细胞色素c是一类产氢酶用于产氢反应的底物

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种利用光裂解水的方法，其特征在于，所述裂解水的方法包括利用下列物质：

(a)光能吸收和传递蛋白(LEAT蛋白)，

(b)醌；

在光下使得水裂解。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的(a)组物质是一种LEAT蛋白分子，或两种或两种以上LEAT蛋白的混合物；所述的醌是一种醌分子，或两种或两种以上醌分子的混合物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的LEAT蛋白选自荧光蛋白、非荧光生色蛋白或它们的突变体蛋白；

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的LEAT蛋白选自下组：

(d)黄色荧光蛋白(Yellow Fluorescent Protein，YFP)或其经一个或多个(如 1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后其吸收光谱、荧光光谱或荧光强度发生或不发生改变，但依然能够利用光能裂解水的突变体蛋白；

(j)氨基酸序列在(i)的基础上经一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸位点突变后其吸收光谱、荧光光谱或荧光强度发生或不发生改变，但依然能够利用光能裂解水的突变体蛋白。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醌是苯醌或萘醌及其衍生物。

6.一种产生氢的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)利用如权利要求1-5中任一项所述的方法裂解水；

(b)与步骤(a)耦联的产氢步骤；

从而产生氢。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述(b)步骤与(a)步骤在同一体系或同一反应装置中进行。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述(b)步骤与(a)步骤在不同体系或反应装置中进行，进行(b)步骤的体系或装置处于进行(a)步骤的体系或装置的下游并且与(a)步骤的反应相耦联。

9.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(a)包括：将LEAT蛋白与醌置于同一水性体系中；

步骤(b)包括以下步骤：

10.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(a)包括：将LEAT蛋白与甲基萘醌置于同一水性体系中；步骤(b)包括：加入甲基萘醌依赖的产氢酶。

11.一种加快产氢藻产生氢气速率或增加产氢藻产氢量的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将LEAT蛋白转入产氢藻中；

从而加快该产氢藻的产氢速率或增加该产氢藻的产氢量。

12.一种鉴定LEAT蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)将待测蛋白与醌置于水性体系中；

(b)在光照条件下检测是否有氧或还原型的醌产生；

13.一种改造野生型荧光蛋白增强其传递光能活性的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)获得野生型荧光蛋白的突变体；

(b)采用如权利要求12所述的方法检测突变体光裂解水放出氧的能力，或检测突变体还原醌的能力；

14.一种LEAT蛋白，其特征在于，所述LEAT蛋白包括：

15.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸为选自下组的序列：

(a)编码如权利要求13所述蛋白的核苷酸序列；

(d)与(a)-(e)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

16.一种将光能转化为化学能的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

17.LEAT蛋白在将光能转化为化学能中的用途。

18.一种组合物，所述组合物包含以下组分：

(a)LEAT蛋白；和

(b)醌。

19.一种在光下裂解水的装置，其特征在于，所述装置包括一个或多个容器，所述容器中装有光能吸收和传递蛋白(LEAT蛋白)、醌与水，其中所述光能吸收和传递蛋白(LEAT蛋白)、醌与水可以处于同一或不同的所述容器中，从而能实施权利要求1-5中任一项所述的方法。

20.一种产生氢气的装置，其特征在于，所述装置包括一个或多个容器，所述容器中装有光能吸收和传递蛋白(LEAT蛋白)、醌与水，其中所述光能吸收和传递蛋白(LEAT蛋白)、醌与水可以处于同一或不同的所述容器中，从而能实施权利要求6-10中任一项所述的方法。