WO2023191038A1 - 環境記憶型種子及びその利用 - Google Patents

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WO2023191038A1
WO2023191038A1 PCT/JP2023/013510 JP2023013510W WO2023191038A1 WO 2023191038 A1 WO2023191038 A1 WO 2023191038A1 JP 2023013510 W JP2023013510 W JP 2023013510W WO 2023191038 A1 WO2023191038 A1 WO 2023191038A1
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WO
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gene
plant
stress
plants
seeds
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PCT/JP2023/013510
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English (en)
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Inventor
勇志 石橋
チェットピリン スリヤサック
範光 濱岡
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国立大学法人九州大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G7/00—Botany in general
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H3/00—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to environmental memory type seeds and their use. INDUSTRIAL APPLICABILITY
  • the present invention is useful in fields such as plant improvement, crop production, and industrial crop production.
  • Patent Document 1 proposes a method for treating seeds comprising the step of treating seeds for sowing with UV-B irradiation, which method is for improving the yield of harvestable crop material.
  • lettuce and kale obtained from UV-B irradiated seeds for sowing are analyzed for flavonoid content, drought stress tolerance, seedling size, etc. It has also been described that effects related to UV-B treatment of seeds are associated with mutations associated with the UVR8 locus and UVR8 activity.
  • Patent Document 2 proposes a method for improving the germination rate of buried seeds contained in topsoil, which includes a stress imparting step.
  • Patent Document 3 proposes a method for causing early flowering of plants belonging to a group called stone fruits among Rosaceae plants by seed propagation, which includes a step of applying stress treatment to seedlings to promote flower bud differentiation.
  • Patent Document 4 describes a method for enhancing the characteristics of a plant, which includes a freezing step of freezing a plant tissue, a thawing step of thawing the frozen plant tissue, and a development step of developing a plant from the thawed plant tissue. has been done.
  • these documents do not describe the effects of stress treatment on plants on the next generation.
  • Patent Document 5 proposes a method for enhancing stress resistance in the next generation of plants, which is characterized by including a step of applying stress treatment at least during the vegetative growth period of the present plants.
  • seeds were obtained by applying salt stress or low light stress during the vegetative growth period of the rice varieties Hitomebore and Sasanishiki, and for this purpose, the cold tolerance of the next generation rice cultivated was enhanced during the earing stage. It is stated that it was done.
  • Patent Document 6 proposes a method for controlling the flowering time of the next generation of plants, which includes a step of applying stress treatment during the vegetative growth period of the current plants.
  • Non-Patent Document 1 The mechanism of delayed seed germination due to high temperatures during ripening in rice (Oryza sativa L.) has been studied. It has been reported that DNA methylation occurs (Non-Patent Document 2).
  • the present inventors have been promoting research focusing on grains (seeds), which are important traits in crop yield and quality.
  • environmental factors during the ripening period have a strong influence on factors that reduce seed quality, such as high-temperature damage in paddy rice, so we have investigated the relationship between seed quality and the ripening environment. If the relationship between traits related to modification of seed weight, ripening environment, and seed quality is clarified, new methods can be used to improve the yield and quality of crop seeds in place of conventional genetic engineering methods. It becomes possible.
  • the present inventors demonstrated that when seeds obtained from rice plants grown under high temperature stress during the ripening stage are cultivated, germination is delayed, biomass is increased, flowering is accelerated, grain yield is increased, and high temperature tolerance is imparted. I discovered that. Furthermore, the inventors have discovered that such environmental stress is stored in the seeds and that it is possible to produce seeds for agricultural crop production that have increased tolerance to environmental stress, and have completed the present invention.
  • This application provides the following: [1] Having a promoter in which the methylation level of any gene selected from the group consisting of the SLB1 gene, Hd1 gene, AGPS2b gene, GBSSI gene, SuSy2 gene, AMy1A gene, and Amy3D gene is effectively controlled; Plant seeds, their products, harvests obtained from them, or processed products thereof. [2] The seed according to 1, or a product thereof, or a product thereof, wherein the promoter is a hypermethylated promoter of any gene selected from the group consisting of the SLB1 gene, AGPS2b gene, GBSSI gene, and SuSy2 gene. Harvested products or processed products thereof.
  • a method for producing plant seeds having useful characteristics comprising: Cultivating first generation plants under environmental stress; A production method comprising the step of obtaining seeds with stored environmental stress from cultivated plants or their progeny.
  • the plant is a grass family, and the useful characteristics are selected from the group consisting of increased biomass, accelerated flowering, increased grain yield, high temperature ripening tolerance, low nitrogen tolerance, and early maturation. 9. The production method according to any one of 6 to 8.
  • the plant is a member of the Poaceae family, and the useful characteristic is selected from the group consisting of increased number of tillers, increased yield per unit area, earlier heading period, and incidence of white immature grains. 10.
  • the plant is rice, the environmental stress is high temperature stress during the period of seed development, and the high temperature stress is cultivated at an environmental temperature that is 5°C or more higher than the average temperature at that time for 6 weeks or more after heading.
  • the production method according to any one of 6 to 12 wherein
  • This application also provides: [1] Having a promoter in which the methylation level of any gene selected from the group consisting of the SLB1 gene, Hd1 gene, AGPS2b gene, GBSSI gene, SuSy2 gene, AMy1A gene, and Amy3D gene is effectively controlled; Plant seeds, their products, harvests obtained from them, or processed products thereof. [2] The seed according to 1, or a product thereof, or a product thereof, wherein the promoter is a hypermethylated promoter of any gene selected from the group consisting of the SLB1 gene, AGPS2b gene, GBSSI gene, and SuSy2 gene. Harvested products or processed products thereof.
  • a method for producing plant seeds having useful characteristics comprising: Cultivating first generation plants under environmental stress; A production method comprising the step of obtaining seeds with stored environmental stress from cultivated plants or their progeny.
  • the plant is a member of the Poaceae family, and the useful characteristic is selected from the group consisting of increased number of tillers, increased yield per unit area, earlier heading period, and incidence of white immature grains.
  • the plant is a grass family, the environmental stress is high temperature stress during the period of seed development, and the high temperature stress is cultivated at an environmental temperature that is 5°C or more higher than the average temperature at that time for 6 weeks or more after heading.
  • the production method according to any one of 6 to 10 which comprises:
  • Seeds for producing high-yielding, early-maturing crops can be obtained by using existing superior varieties without genetic manipulation or breeding through breeding or fixation. By allowing seeds to remember environmental stress, it can contribute to stable production of crops under global environmental changes such as global warming.
  • the present invention can be expected to be used for the production of high-yield and early maturing agricultural crops, the production of seeds for factory production, the production of agricultural crops in factories, and the construction of agricultural crop/seed production systems.
  • Heat stress during ripening induces transcriptional changes during subsequent plant development stages.
  • DEGs Total differentially expressed genes obtained by RNA sequencing of developing leaves of 55 DAS
  • b GO analysis of total DEGs. Transcription levels of OsSLB1 (relative to the expression of OsActin and OsUBQ, respectively) in c, roots; d, leaves (CS, control seeds; HDS, thermogenic seeds).
  • e Heat map showing the expression levels of heading-related genes in rice.
  • f, g Relative expression of OsHd1 and OsHd3a before flowering normalized with OsUBQ. Error bars represent standard deviation of 3 biological replicates.
  • a Promoter region
  • b OsSLB1, c, OsHd1, d, OsHd3a promoter methylation levels in seeds.
  • e OsSLB1 promoter methylation level in roots at maximum tillering stage.
  • a Gene expression of starch synthesis (OsAGPS2b, OsGBSSI, OsSuSy2) and starch degrading ⁇ -amylase (OsAmy1A, OsAmy3D) in ripening seeds.
  • b SPAD value of the flag leaf every 5 days after flowering and
  • c photosynthesis rate of the flag leaf at 26 DAF (Days after flowering).
  • d Incidence of white immature grains and percentage of white immature grain type in harvested brown rice.
  • the present invention provides seeds of environmental memory plants, products thereof, harvests obtained therefrom, or processed products thereof.
  • seeds may be explained among seeds, their products, crops obtained from them, or processed products thereof, but those skilled in the art will be able to explain the seeds as appropriate. It can also be applied and understood to the harvested products obtained from these or processed products thereof.
  • an environmental memory seed is a seed that has polynucleotides with effectively controlled methylation levels.
  • An example of the polynucleotide is a promoter of any gene selected from the group consisting of SLB1 gene, Hd1 gene, AGPS2b gene, GBSSI gene, SuSy2 gene, AMy1A gene, and Amy3D gene.
  • the promoter is the promoter of any gene selected from the group consisting of the SLB1 gene, the AGPS2b gene, the GBSSI gene, and the SuSy2 gene, wherein the promoter has an effectively controlled methylation level. is a methylation level that is different (higher or lower) than that of the reference seed, and is sufficiently high or low to alter the expression of downstream genes from that of the reference seed. be able to.
  • the promoter is the promoter of any gene selected from the group consisting of the Hd1 gene, the AMy1A gene, and the Amy3D gene, in which the methylation level of the promoter affects the expression of the downstream gene. It is preferable that it be as low as possible to promote.
  • the promoter whose methylation level is controlled is the SLB1 gene P2 promoter.
  • the relative methylation level is preferably 1.6% input or higher.
  • Promoters related to the present invention are shown below using Oryza sativa L. cv. Nipponbare as an example.
  • the P1 promoter of the SLB1 gene refers to any of the following.
  • A A polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
  • B A polynucleotide consisting of a sequence having high sequence identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and having the activity of regulating the expression of the SLB1 gene.
  • the P2 promoter of the SLB1 gene refers to any of the following.
  • A Polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
  • B A polynucleotide consisting of a sequence having high sequence identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and having the activity of regulating the expression of the SLB1 gene.
  • the P3 promoter of the SLB1 gene refers to any of the following.
  • A Polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
  • B A polynucleotide consisting of a sequence having high sequence identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and having the activity of regulating the expression of the SLB1 gene.
  • the P1 promoter of the Hd1 gene refers to any of the following.
  • A Polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 4;
  • B A polynucleotide consisting of a sequence having high sequence identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and having the activity of regulating the expression of the Hd1 gene.
  • the P2 promoter of the Hd1 gene refers to any of the following.
  • A A polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 5;
  • B A polynucleotide consisting of a sequence having high sequence identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and having the activity of regulating the expression of the Hd1 gene.
  • the P3 promoter of the Hd1 gene refers to any of the following.
  • A Polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 6;
  • B A polynucleotide consisting of a sequence having high sequence identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 6 and having the activity of regulating the expression of the Hd1 gene.
  • the P1 promoter of the Hd3a gene refers to any of the following.
  • A Polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 7;
  • B A polynucleotide consisting of a sequence having high sequence identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and having the activity of regulating expression of the Hd3a gene.
  • the P2 promoter of the Hd3a gene refers to any of the following.
  • the promoter of the AGPS2b gene refers to any of the following.
  • A Polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 9;
  • B A polynucleotide consisting of a sequence having high sequence identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 9 and having the activity of regulating expression of the AGPS2b gene.
  • the promoter of the GBSSI gene refers to any of the following.
  • A Polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 10;
  • B A polynucleotide consisting of a sequence having high sequence identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 10 and having the activity of regulating the expression of the GBSSI gene.
  • the promoter of the SuSy2 gene refers to any of the following.
  • A Polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 11;
  • B A polynucleotide consisting of a sequence having high sequence identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 11 and having the activity of regulating the expression of the SuSy2 gene.
  • Amy1A gene promoter refers to any of the following.
  • A Polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 12;
  • B A polynucleotide consisting of a sequence having high sequence identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 12 and having the activity of regulating the expression of the Amy1A gene.
  • the promoter of the AGPS2b gene refers to any of the following.
  • A Polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 13;
  • B A polynucleotide consisting of a sequence having high sequence identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 13 and having the activity of regulating expression of the AGPS2b gene.
  • Sequences of SEQ ID NOs: 1-13 in the sequence listing, which is part of this specification, are derived from rice (Oryza sativa L).
  • Calculation of nucleotide sequence identity can be performed by programs well known to those skilled in the art (eg, BLASTN, BLASTP, BLASTX, ClustalW). Parameters when using a program can be appropriately set by those skilled in the art, and default parameters for each program may be used. Specific techniques for these analysis methods are also well known to those skilled in the art.
  • sequences as having high identity when referring to sequences as having high identity, unless otherwise specified, in any case, 64% or more, 65% or more, 69% or more, 70% or more, 72% or more, 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% or more, preferably 80% or more, 81% or more, 83% or more, 84% or more, more preferably 85% or more, 86% or more, 89% or more, and It refers to sequence identity of preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97.5% or more, and even more preferably 99% or more.
  • sequence identity between the promoter region of each rice gene (the region of 3000 bases upstream of the gene) and its corresponding counterpart derived from other plants is as follows.
  • GBSSI gene 5.1 wheat Gene ID: Traes_4AL_4B9D56131.1 (NDP-glucose--starch glucosyltransferase / Waxy protein) Sequence identity: 78% 5.2 maize: Gene ID: Zm00001d045462_T001 (NDP-glucose--starch glucosyltransferase / Waxy protein) Sequence identity: 90% 5.3 lettuces: Gene ID: Lsat_1_v5_gn_2_73301.1 (NDP-glucose--starch glucosyltransferase / Waxy protein) Sequence identity: 76% 5.4 Brassica rapa: Gene ID: Brara.E01764.1 (NDP-glucose--starch glucosyltransferase / Waxy protein) Sequence identity: 72%
  • the methylation level can be determined by measuring the degree of methylation of DNA extracted from the target seed using an appropriate method.
  • the measurement method is not particularly limited, and includes (A) a method of fragmenting and concentrating methylated DNA to analyze the methylated DNA, (B) an analysis method of bisulfite treatment and sequencing, and (C) an analysis method of methylation sensitivity.
  • analysis methods using restriction enzymes analysis methods using (D) methylation-specific PCR method, etc., and any of them may be used.
  • a suitable example is to use an antibody against 5-methylcytosine (5-mC) to detect 5-mC on single-stranded DNA (ssDNA) fragments that have been fragmented by sonication or enzymes.
  • This method involves immunoprecipitation and concentration.
  • commercially available kits can be used, such as the MeDIP Kit.
  • the methylation level can be expressed in % input as the ratio of methylated DNA to the DNA used for analysis (input) (https://www.diagenode.com/files/products/kits/magmedip-qpcr- kit-manual.pdf).
  • P1 promoter relative methylation level of SLB1 gene 0.028% input or more, preferably 0.046% input or more, more preferably 0.049% input or more, and still more preferably 0.062% input or more.
  • P2 promoter relative methylation level of SLB1 gene 0.116% input or more, preferably 0.148% input or more, more preferably 0.195% input or more, even more preferably 0.198% input or more.
  • P3 promoter relative methylation level of SLB1 gene 0.144% input or more, preferably 0.163% input or more, more preferably 0.169% input or more, and still more preferably 0.171% input or more.
  • P1 promoter relative methylation level of Hd1 gene 0.222% input or more, preferably 0.308% input or more, more preferably 0.558% input or more, even more preferably 0.761% input or more.
  • Relative methylation level of P2 promoter of Hd1 gene 0.019% input or more, preferably 0.032% input or more, more preferably 0.040% input or more, even more preferably 0.049% input or more.
  • Relative methylation level of P3 promoter of Hd1 gene 0.002% input or more, preferably 0.004% input or more, more preferably 0.008% input or more, even more preferably 0.012% input or more.
  • Relative methylation level of P1 promoter of Hd3 gene 0.009% input or more, preferably 0.011% input or more, more preferably 0.012% input or more, even more preferably 0.015% input or more.
  • Relative methylation level of P2 promoter of Hd3 gene 0.002% input or more, preferably 0.005% input or more, more preferably 0.006% input or more, even more preferably 0.012% input or more.
  • Promoter relative methylation level of AGPS2b gene 0.003% input or more, preferably 0.010% input or more, more preferably 0.018% input or more, even more preferably 0.022% input or more.
  • Promoter relative methylation level of GBSSI gene 0.019% input or more, preferably 0.027% input or more, more preferably 0.036% input or more, even more preferably 0.040% input or more.
  • Promoter relative methylation level of SuSy2 gene 0.005% input or more, preferably 0.010% input or more, more preferably 0.014% input or more, and still more preferably 0.019% input or more.
  • Promoter relative methylation level of AMy1A gene 0.027% input or more, preferably 0.033% input or more, more preferably 0.039% input or more, even more preferably 0.065% input or more.
  • Relative methylation level P3 promoter of Amy3D gene It is 0.005% input or more, preferably 0.006% input or more, more preferably 0.007% input or more, and still more preferably 0.009% input or more.
  • plants The present invention can be applied to various plants. Examples of plants include plants belonging to any family selected from Poaceae, Asteraceae, Lamiaceae, Brassicaceae, Apiaceae, and Amaraceae.
  • Plants to which the present invention is applied are not particularly limited, but examples of plants to which the present invention can be preferably applied are plants belonging to the monocot family, more preferably plants belonging to the Asiatic subfamily, and even more preferably plants belonging to the Poaceae family (Poaceae).
  • Poaceae for example, plants belonging to any of the genera of rice (Oryza), barley, rye, bread wheat, barley, adlay, sugarcane, corn, sorghum, millet, millet, and barnyard grass.
  • plants belonging to the Poaceae family plants belonging to the genus Poaceae are preferred, and rice (Oryza sativa L.) is more preferred.
  • Plants to which the present invention is applied include rice, wheat, rye, oat, barley, soybean, corn, sorghum, pumpkin, and Arabidopsis thaliana. is suitable.
  • plants to which the present invention can be preferably applied are plants belonging to the dicot family, specifically plants belonging to any of the Asteraceae, Lamiaceae, Brassicaceae, Apiaceae, and Fabaceae.
  • More specific plant examples are: Poaceae: rice, wheat, rye, oats, barley, corn Asteraceae: lettuce, cornstarch, chisha Lamiaceae: basil Cruciferae: Komatsuna, Mizuna, Japanese radish, Brassica rapa (Brassica rapa, native rapeseed, Chinese cabbage, turnip, yellow monkey) son, kosai tai, tai choy, bok choy, rapeseed (oleifera subsp.), rapeseed (campestris subsp.))
  • the term "plant” is used to mean an individual plant or a part thereof, and the term “part” refers to seeds (germinated seeds, immature seeds), unless otherwise specified. (including seeds), organs or parts thereof (including leaves, roots, stems, flowers, stamens, pistils, and pieces thereof), cultured plant cells, callus, and protoplasts. Plants include genetically engineered plants and transformed plants. Plants include harvested products and propagation material. In the context of the present invention, unless otherwise specified, propagation material refers to all or part of a plant that is used for propagation (sometimes referred to as seedlings), such as seeds, seedlings, and cells. , callus, and young buds.
  • harvested product is used in the usual sense unless otherwise specified, and refers to all or part of a plant that is not used for propagation, for example, when the plant is rice, harvested Materials include harvested rice and fir. Harvested products are sometimes referred to as crops or agricultural products.
  • processed product refers to a processed product produced directly or indirectly from harvested products, unless otherwise specified.
  • the scope of the present invention includes at least processed products that reflect the characteristics of the harvested products of the present invention. For example, if the plant is rice, polished rice, boiled rice, rice flour, breads using rice flour, sweets, manjus, pizza, and alcohol are included in the scope of processed products.
  • the term "progeny” refers to a plant that has at least one of its genetic parents and/or ancestors, unless otherwise specified. As long as the desired traits are inherited by the offspring, the progeny obtained from the parent transformed plant (T1, etc.) or its progeny, the progeny of crosses with T0 or T1 as one parent (e.g. F1), and their progeny. Includes descendants.
  • seed products are bags containing multiple seeds, such as 100 or more seeds, 1,000 or more seeds, or 10,000 or more seeds.
  • the product may be for crop production.
  • the product and the seeds for production may be referred to as raw paddy or seed paddy.
  • the seed product in this case may be of above standard quality. Examples of standards are shown below.
  • Moisture Paddy moisture is 14.0-16.0%
  • Floating rice ratio Within 5% of purified water (5 out of 100 grains)
  • Ratio on sieve 2.2 mm 98% or more on streaks
  • Germination Germination rate 90% or more
  • No shelled grains, split rice, foreign grains, or foreign matter mixed in Uruchi mixture Contamination limit is 0.04% (4 grains out of 10,000 grains)
  • Plants with useful characteristics can be grown from the environmental memory type seeds provided by the present invention.
  • examples of useful characteristics are increased biomass, accelerated flowering, increased grain yield, and imparting high temperature ripening tolerance.
  • the useful characteristics of the plant obtained from environmental memory seeds are increased number of tillers, increased yield per cultivated area, earlier heading period, and white immature grain type. It is one selected from the group consisting of a low proportion of The incidence (%) of white immature grains can be calculated by dividing the threshed grains into 5 groups according to the classification in the Examples section of this specification, and calculating (opaque number)/(total number) x 100.
  • the useful feature of plants obtained from memory wheat seeds is increased yield.
  • environmental memory wheat seeds obtained from wheat subjected to temperature stress (e.g., 15°C) during the ripening stage have higher yields than those grown using normal seeds under the same conditions. It can be increased by 50% or more, preferably 100% or more, more preferably 200% or more, even more preferably 300% or more, for example about 340%. The same thing can be expected with grasses other than wheat or plants other than grasses.
  • the useful characteristic of plants obtained from memory barley seeds is increased yield.
  • environmental memory barley seeds obtained from barley plants that have been subjected to high temperature stress (e.g. 25°C) during the ripening stage have higher yields than normal seeds grown under the same conditions.
  • the same thing can be expected with grasses other than barley or plants other than grasses.
  • one of the useful characteristics of plants obtained from environmental memory rice seeds is increased biomass under low nitrogen conditions.
  • the degree of increase in biomass can be determined by any one selected from the group consisting of above-ground length, underground length, and dry weight.
  • environmental memory rice seeds have a dry weight of 30% or more, preferably 21 days after germination, than plants grown using regular seeds under similar low nitrogen conditions. can be increased by 40% or more, more preferably 50% or more, even more preferably 60% or more, for example about 70%. The same thing can be expected with grasses other than rice or plants other than grasses.
  • one of the useful characteristics of plants obtained from memory lettuce seeds is increased biomass.
  • environmental memory type lettuce seeds have an above-ground weight of 30% or more, preferably 40% or more, more preferably 50% or more, and even more preferably 60% or more of the weight of the above-ground part than normal seeds grown for the same number of days. % or more, for example, about 70%. The same thing can be expected with Asteraceae plants other than lettuce or plants other than Asteraceae plants.
  • one of the useful characteristics of plants obtained from environmental memory lettuce seeds is a rapid increase in biomass. Specifically, it takes 5 days or more, preferably 10 days or more, and more preferably 20 days to obtain the desired amount of biomass from environmentally memorized lettuce seeds than from conventional seeds. More preferably, it is as early as 30 days or more, for example, about 35 days. The same thing can be expected with Asteraceae plants other than lettuce or plants other than Asteraceae plants.
  • one of the useful characteristics of plants obtained from environmental memory cowpea seeds is a large number of seeds.
  • environmental memory type cowpea seeds produce 3% or more, preferably 5% or more, more preferably 7% or more, still more preferably 10% or more, than normal seeds grown under the same conditions. For example, about 15%, which is a lot. Similar effects can be expected with legumes other than cowpeas, or with plants other than legumes.
  • the invention also relates to a method for producing plant seeds having useful characteristics.
  • the production method of the present invention includes the following steps: Cultivating first generation plants under environmental stress; A process of obtaining seeds with stored environmental stress from cultivated plants or their progeny.
  • environmental stress examples include temperature stress (high temperature stress or low temperature stress), low nitrogen stress, salt stress, low light stress, strong light stress, drought stress, overhumidity stress, high temperature stress, low temperature stress, nutritional stress, heavy metal stress, These include disease stress, oxygen deprivation stress, ozone stress, Co2 stress, and strong wind stress.
  • the environmental stress is preferably temperature stress (high temperature stress or low temperature stress) or low nitrogen stress during the period of seed development. The period when seeds develop is sometimes called the ripening period.
  • high temperature stress When the plant is a grass species, one preferable example of environmental stress is high temperature stress during the period of seed development, and high temperature stress is an environment where the temperature is 5°C or more higher than the average temperature at that time for 6 weeks or more after heading. It is cultivated by temperature.
  • environmental stress In the case of wheat, one preferable example of environmental stress is temperature stress (for example, 10 to 20°C, for example, 15°C) during the period of seed development. In the case of barley, one preferable example of environmental stress is high temperature stress (eg, 20 to 30°C, eg, 25°C) during seed development. In the case of lettuce, one preferred example of environmental stress is high temperature stress (eg, 20 to 32°C, eg, 25°C, or 30°C) during seed development. In the case of cowpea, one preferable example of environmental stress is high temperature stress (eg, 20 to 30°C, eg, 25°C) during the period of seed development. In the case of soybean, one preferable example of environmental stress is temperature stress (eg, 15 to 25°C, eg, 20°C) during seed development.
  • the memory of environmental stress is a change in the DNA methylation level in the promoter of the Heading date 1 (Hd1) gene. Change refers to increasing or decreasing.
  • the central part of the flag leaf was collected and stored in FAA (formalin-acetic acid-ethyl alcohol) solution until analysis. After that, 15 ⁇ m thick sections were prepared from the leaf samples using a frozen sectioning method using OCT compound (Leica CM1950, Leica Microsystems K.K.), and visualized with a microscope (BZ-X710, Keyence). Thickness, width, and cell layers were measured with ImageJ.
  • FAA formalin-acetic acid-ethyl alcohol
  • the difference in methylation level was more than 1.25 times (the difference in methylation between the control group and the treatment group was ⁇ 25%) (with a P value of less than 0.05), and the methylation change site (DMP) and It was extracted as a methylated region (DMR), and the extracted DMR was screened in 100 bp increments using a sliding window method.
  • DMRs located within a range of 3000 bp upstream and downstream of the translated region are regarded as the TSS (transcription start site) of the promoter.
  • RNA sequence analysis and quantitative real-time PCR Analysis was performed for each growth stage. Roots and leaves at the highest tillering stage (OsSLB1) or the newest, fully expanded leaves were harvested at 10:00 a.m. (OsHd3a) and 8:00 p.m. (OsHd1) in accordance with the circadian expression of the respective genes. did. In addition, growing roots were collected at the peak tillering stage, 55 days after sowing (DAS), and grains that were in the process of maturing were collected at 15 days after flowering (DAF). Total RNA was extracted from cryopreserved leaves, roots, or partially mature grains by the SDS/phenol/lithium chloride method (Chirgwin et al.
  • RNA sequence analysis was performed using scientific replicates. All differentially expressed genes (DEGs, P ⁇ 0.05) were analyzed and a heat map of RNA reads was generated using OriginPro. GO analysis on DEGs was performed in the same manner as described above for DMR.
  • qRT-PCR quantitative real-time PCR
  • cDNA was synthesized from the extracted RNA using ReverTra Ace reverse transcriptase (Toyobo) according to the manufacturer's instructions.
  • Quantitative real-time PCR was performed using the CFX Connect optical module real-time PCR detection system (Bio-Rad) with SYBR Green (Toyobo) according to the manufacturer's instructions.
  • Primers used for qRT-PCR are listed in Supplementary Table S5.
  • the PCR conditions were as follows. After initial denaturation at 94°C for 2 minutes, denaturation at 94°C for 20 seconds, annealing at the temperature set for each primer for 20 seconds, and extension at 72°C for 20 seconds were repeated for 40 cycles, followed by thawing and the plate. I deciphered it. Results were normalized based on the expression levels of OsUBQ (leaf samples) or OsActin (root and developing fruit samples).
  • DNA methylation analysis using MeDIP-qPCR Genomic DNA was extracted from dried seeds, growing leaves, and grains in the middle of maturation using a DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen), and then subjected to ultrasonication. The treatment resulted in shearing into approximately 500 bp fragments.
  • immunoprecipitation using 1000 ng of sheared DNA was performed using an immunoprecipitation kit (Active Motif) as described in the manufacturer's protocol. The immunoprecipitated DNA was subjected to qRT-PCR to detect positions where DNA methylation levels changed.
  • % input was calculated as described in the manufacturer's protocol (https://www.diagenode.com/files/products/kits/magmedip-qpcr-kit-manual.pdf). Specifically, % input is the ratio of DNA precipitated by the methylated antibody to the DNA (input) used for analysis.
  • the specific primers used for MeDIP-qPCR are listed in the table below.
  • control and high temperature treated plants were evaluated from the control to the control (25°C), from the control to the high temperature treatment (30°C), and from the high temperature treatment to the high temperature treatment, respectively. They were divided into three groups with high temperature treatment (30°C) and used in high temperature resistance experiments. SPAD measurements were performed every 5 days. Three flag leaves were selected from each pot and measurements were taken at three locations on the leaf: the top, middle, and bottom to generate an average SPAD value, and the same location on the same flag leaf was then measured each time. At 26 days after anthesis (DAF), the photosynthetic rate of the central part of the flag leaf (3–4 replicates) was measured.
  • DAF the photosynthetic rate of the central part of the flag leaf (3–4 replicates) was measured.
  • the measurements were performed using an LCi portable photosynthesis system (Li-COR Biosciences, Lincoln, California, USA) between 8:00 and 14:00 on a sunny day.
  • the measurement conditions were a chamber temperature of 25°C, photosynthetically active radiation (PAR) of 1,500 photon flux density ( ⁇ mol m-2s-1), and natural atmospheric CO 2 as a reference background.
  • PAR photosynthetically active radiation
  • Gene expression in the mid-maturing grains for each treatment was analyzed as described above, and white immature grains were classified as described in previous studies. Specifically, we visually observed the grains from below under transmitted illumination, and found that normal rice grains are translucent and transmit light, while immature rice grains have opaque or chalky parts that do not allow light to pass through. The evaluation was based on the fact that dark areas are formed due to interference. According to the criteria of Ishimaru et al. (2009), they were classified into five groups: opaque, white-belly, white-based, white-backed, and immature.
  • RNA sequence analysis was performed using RNA from leaves during vegetative growth.
  • DEGs differentially expressed genes
  • strigolactone biosynthesis gene 1 (OsSLB1) is an ortholog of MAX1, which is involved in branching of the aerial part of Arabidopsis, and therefore may be involved in suppressing tillering in rice. It was speculated that there may be.
  • SLs strigolactones
  • SLs are mainly synthesized in the roots and move atopically to the above-ground parts (Wang and Li et al. 2011), suppressing tillering in rice. It has been suggested that it increases plant height (Liu et al. 2020).
  • the heading date gene 1 (Heading date1) (OsHd1), which is an ortholog of CONSTAN in Arabidopsis and plays an important role in controlling heading time in rice, was found. It was.
  • Heading date1 (OsHd1)
  • Fig. 3e an expression heat map of genes involved in the regulation of heading in rice
  • OsHd1 OsHd1 and its downstream ⁇ heading date3a'' (OsHd3a), an ortholog of Arabidopsis FT, before heading. It was revealed that the expression of both OsHd3a was increased (Fig. 3f-g) and induced early heading.
  • the promoter region of OsSLB1 was significantly hypermethylated, and the promoter region of OsHd1 was shown to be significantly hypomethylated (Fig. 4b, c).
  • significant hypermethylation was observed in the OsSLB1 promoter region in the growing roots at the highest tillering stage of plants ripened at high temperature (Fig. 4e), and at the same time, significant hypermethylation in the OsHd1 promoter region was observed in leaves. Hypomethylation was observed (Fig. 4f).
  • the methylation level of OsSLB1 promoter did not differ between control and high temperature stress treatments in leaves.
  • Progeny of plants subjected to high temperature stress exhibit high temperature tolerance during the ripening stage. Many DMRs and DEGs have been found to be involved in response to abiotic stress and detoxification. We hypothesized that when plants are exposed to high temperature stress during the ripening stage, the memory of stress may be passed down from generation to generation in order to cope with such repeated stress. Therefore, in order to observe whether the progeny of plants subjected to high-temperature stress exhibit high-temperature tolerance during the ripening stage, after flowering, plants were tested for control-control (25°C), control-high-temperature treatment (30°C), and high-temperature treatment (30°C). Treatment - divided into 3 groups: high temperature treatment (30°C). The former and latter temperatures refer to the growth temperature during the ripening period of the parent plant and the next generation plant, respectively.
  • the starch biosynthetic genes OsAGPS2b (ADP-glucose pyrophosphorylase subunit 2b), OsGBSSI (granule-bound starch synthase), OsSuSy2 (sucrose synthase 2), and the starch decomposition gene OSAmy1A ( ⁇ - When the expression levels of amylase 1A) and OSAmy3D ( ⁇ -amylase 3D) were investigated, the expression of starch biosynthetic genes was significantly decreased and the expression of starch degrading genes was significantly decreased in the control and high-temperature treated plants compared to the control. It was significantly elevated (Fig. 5a).
  • Hd3a protein produced in the leaf blade is transported through the leaf phloem to the apical meristem and is involved in axillary bud elongation (Tsuji et al. 2015). This suggests that the expression of heading-related genes that influence the promotion of tillering may be increased in plants subjected to high-temperature stress. In grasses, tillering is known to be an important agronomic trait that influences grain production (Hussien et al. 2014).
  • plants exposed to high temperature stress showed phenotypic changes such as flag leaves becoming shorter and thicker. Such changes in leaf morphology may have resulted in delayed leaf senescence and enhanced photosynthetic rate under high temperature stress compared to control-high temperature treated plants.
  • Significant negative correlations between leaf thickness and leaf H 2 O 2 content and positive correlations between thickness and photosynthetic parameters have been observed in Helicoptera sativa under high temperature stress (Soliman et al. 2015) .
  • the amount of chlorophyll and the photosynthetic rate during the ripening stage are important factors that affect the yield and quality of rice (Yang et al. 2015).
  • Hd1 is known to have both inducing and suppressing effects on heading under short-day conditions (SD) and long-day conditions (LD) (Liu et al. 2014). Therefore, when we cultivated high-temperature-stressed plants under SD and LD conditions, we also observed that, due to high Hd1 expression, heading occurred earlier in SD and later in LD. These results suggest that OsHd1 may play an important role in controlling photoperiod-dependent heading date in rice through changes in DNA methylation due to high temperature stress during the ripening stage.
  • OsAmy3D is known to be expressed ventrally under high-temperature stress (Nakata et al. 2017), and significant expression suppression due to hypermethylation of its promoter is associated with swollen white immature grains in high-temperature-treated plants. As a result, it was expected to play an important role in improving overall quality.
  • Germinated rice (Oryza sativa L. cv. Nipponbare, the same variety was used in the following experiments, unless otherwise specified) seeds were sown in sand, and dry matter was measured at the 3-leaf stage. Fertilizer conditions were as follows: No nitrogen was added, and at the time of sowing, potassium chloride (potassium 60%) was adjusted to 2.27 g/L and superphosphate lime (phosphorus 17.5%) was adjusted with water to 7.77 g/L. 1 mL was added to each sample. Normally, 6.48 g/L of ammonium sulfate (nitrogen 21%) is added to this condition, and 1 mL per individual plant.
  • IT98K-205-8 was set to 25°C (Control) and 30°C (Heat(D), Heat(I)), Cultivated under infinite growth (Heat(I)).
  • the treatment temperature was set at 25°C and 30°C.
  • PGL encoding chlorophyllide a oxygenase 1
  • Du, A. et al. The DTH8-Hd1 module mediates day-length-dependent regulation of rice flowering. Mol. Plant 10, 948-961 (2017). Koumoto, T. et al. Transgenerational effect of maternal growth environment on flowering date in rice (Oryza sativa L.). Environ. Exp. Bot.
  • the present invention it is possible to produce seeds for agricultural crop production that have increased resistance to environmental stress, and are useful in fields such as agriculture and industrial production of agricultural crops.
  • the present invention can be expected to be used for the production of high-yield and early maturing agricultural crops, the production of seeds for factory production, the production of agricultural crops in factories, and the construction of agricultural crop/seed production systems.

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Abstract

環境ストレスと種子品質との関係を明確にし、従来の遺伝子工学的な手法とは異なる新たな手法により、作物種子の収量及び品質向上を行うことを課題とする。SLB1遺伝子、Hd1遺伝子、AGPS2b遺伝子、GBSSI遺伝子、SuSy2遺伝子、AMy1A遺伝子、及びAmy3D遺伝子からなる群より選択されるいずれかの遺伝子の、メチル化レベルが有効に制御されたプロモーターを有する、植物の種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品を提供する。また、有用な特徴を有する植物の種子の生産方法であって：第１世代の植物を環境ストレス下で栽培する工程；栽培された植物又はその子孫から、環境ストレスが記憶された種子を得る工程を含む、生産方法を提供する。

Description

環境記憶型種子及びその利用
　本発明は、環境記憶型種子及びその利用に関する。本発明は、植物の改良、農作物の生産、農作物の工業的生産等の分野で有用である。
　昨今の地球環境変動や人口増加傾向による食糧問題は，作物収量の改善が世界的な重要課題であることを再認識させている。高温、干ばつ、塩分などの環境ストレスは、作物生産に損失をもたらすことがある。特に農作物が栽培される周囲の温度は、生育期と生殖期の両方において、成長と発達に強く影響する。環境ストレスが作物に及ぼす影響や小物の環境ストレス抵抗性を向上させる方法に関する様々な研究がなされている。
　例えば特許文献１は、ＵＶ－Ｂ照射により播種用種子を処理する工程を含む、種子を処理する方法を提案しており、この方法が、収穫可能な作物材料の収量の向上のためのものであることが記載されている。実施例の項では、ＵＶ－Ｂ照射された播種用種子より得られたレタス、ケールについて、フラボノイド含量、乾燥ストレス耐性、苗の大きさ等が分析されている。またＵＶ－Ｂによる種子の処理に関する作用が、ＵＶＲ８座及びＵＶＲ８活性に関連する突然変異に関連する旨が記載されている。特許文献２は、ストレス付与工程を含む、表土に含まれる埋土種子の発芽率を向上させる方法を提案する。また特許文献３は、実生苗にストレス処理を行って花芽分化を促進する工程を含む、バラ科植物の中で核果類と称する群に属するものを種子繁殖により早期に開花させる方法を提案する。さらに特許文献４は、植物組織を凍結する凍結工程と、凍結された植物組織を解凍する解凍工程と、解凍された植物組織から植物を発生させる発生工程と、を含む植物の特性増強方法が記載されている。しかし、これらの文献には、植物に対するストレス処理が次世代に及ぼす影響については記載されていない。
　また特許文献５は、少なくとも当代の植物の栄養成長期においてストレス処理をかける工程を含むことを特徴とする植物の次世代におけるストレス抵抗性強化法を提案する。この文献の実施例の項では、イネ品種ひとめぼれ、ササニシキの栄養成長期に塩類ストレス又は寡照ストレスを与えて種子を得て、その趣旨から栽培した次世代のイネの穂ばらみ期耐冷性が強化されたことが記載されている。また特許文献６は、当代の植物の栄養成長期においてストレス処理をかける工程を含む、植物の次世代における開花時期の制御法を提案する。この文献の実施例の項では、イネ品種ひとめぼれ、ササニシキに関し、低温環境で栽培し、採種した種子から栽培した次世代が、高温環境で栽培・採種した種子からの次世代より出穂が早まることが確認されている。そして、その要因の一つとして、栄養成長期の水温が次世代の出穂制御に関わる可能性を示唆する、履歴時期の温度の差異を次世代まで記憶していることを示唆していると述べられている。
　最近では、植物が過去の環境事象を記憶し、その記憶を利用して環境事象が再発したときの対応に役立てていることが明らかになってきた。さまざまな環境ストレス下で植物が利用するエピジェネティックなメカニズムの解明が行われており、低分子RNA、ヒストン修飾、DNAメチル化などを介して、遺伝子発現の制御に重要な役割を果たしていることが知られている（非特許文献１）。イネ(Oryza sativa L.)の登熟期の高温による種子発芽遅延のメカニズムが研究されており、登熟時の高温によってアブシジン酸（ABA）異化作用関連遺伝子のプロモーター及びα-アミラーゼ遺伝子のプロモーターにおいてDNAのメチル化が起こることが報告されている（非特許文献２）。
特表２０１７－５２９０７６号公報 特開２００９－８２０２２号公報 特開２００８－４８６６４号公報 特開２０１８－１８３１１２号公報 特開２０１５－１８１３７０号公報 特開２０１６－１８２０９４号公報
Kinoshita, T. et al., Epigenetic Memory for Stress Response and Adaptation in Plants. Plant Cell Physiol., 55(11): 1859-1863 (2014) Suriyasak, C. et al., Mechanism of delayed seedgermination caused by high temperature during grain filling in rice (Oryza sativa L.). Scientific Reports, 10: 17378 (2020)
　本発明者らは、作物収量及び品質において重要形質である子実（種子）に着目した研究を推進してきた。特に水稲の高温障害など、種子品質の低下要因には登熟期間の環境要因が強く影響していることから、種子品質と登熟環境との関連性について検討してきた。種子重の改変に関わる形質や登熟環境と種子品質との関係が明らかになれば、従来の遺伝子工学的な手法に代えて、新たな手法により、作物種子の収量及び品質向上を行うことが可能となる。
　本発明者らは、登熟期に高温ストレス下で栽培したイネ植物より得た種子を栽培すると、発芽遅延、バイオマスの増加、開花促進、子実収量増加、及び高温登熟耐性が付与されることを見出した。また、このような環境ストレスは、種子に記憶され、環境ストレス耐性を高めた農作物生産用種子が生産できることを見出し、本発明を完成した。
　本願は、以下を提供する。
［１］　SLB1遺伝子、Hd1遺伝子、AGPS2b遺伝子、GBSSI遺伝子、SuSy2遺伝子、AMy1A遺伝子、及びAmy3D遺伝子からなる群より選択されるいずれかの遺伝子の、メチル化レベルが有効に制御されたプロモーターを有する、植物の種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品。
［２］　プロモーターが、SLB1遺伝子、AGPS2b遺伝子、GBSSI遺伝子、及びSuSy2遺伝子からなる群より選択されるいずれかの遺伝子の、高メチル化プロモーターである、１に記載の種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品。
［３］　プロモーターが、Hd1遺伝子、AMy1A遺伝子、及びAmy3D遺伝子からなる群より選択されるいずれかの遺伝子の、低メチル化プロモーターである、１又は２に記載の種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品。
［４］　プロモーターが、SLB1遺伝子P2プロモーターである、１から３のいずれか１項に記載の種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品。
［５］　植物がイネ科植物であり、相対メチル化レベルが1.6 % input以上である、１から４のいずれか１項に記載の種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品。
［６］　有用な特徴を有する植物の種子の生産方法であって：
第１世代の植物を環境ストレス下で栽培する工程；
栽培された植物又はその子孫から、環境ストレスが記憶された種子を得る工程
を含む、生産方法。
［７］　環境ストレスの記憶が、Heading date 1(Hd1)遺伝子のプロモーター領域におけるDNAのメチル化レベルの変化である、６に記載の生産方法。
［８］　環境ストレスが、種子が発育する時期の温度ストレス、又は低窒素ストレスである、６又は７に記載の生産方法。
［９］　植物がイネ科植物であり、有用な特徴が、バイオマスの増加、開花促進、子実収量増加、高温登熟耐性の付与、低窒素耐性の付与、早生性からなる群より選択されるいずれかである、６から８のいずれか１項に記載の生産方法。
［１０］　植物がイネ科植物であり、有用な特徴が、分げつ数の増加、単位面積当たりの収量の増加、出穂期の早化、白未熟粒の発生率からなる群より選択されるいずれかである、６から１０のいずれか１項に記載の生産方法。
［１１］　植物がイネ科、マメ科、又はキク科に属する植物であり、環境ストレスが、種子が発育する時期の温度ストレスである、６から８のいずれか１項に記載の生産方法。
［１２］　植物がイネであり、環境ストレスが、種子が発育する時期の高温ストレスであり、高温ストレスが、出穂後６週間以上、その時期の平均気温より５℃以上高い環境温度で栽培することである、６から１２のいずれか１項に記載の生産方法。
　本願はまた、以下を提供する。
［１］　SLB1遺伝子、Hd1遺伝子、AGPS2b遺伝子、GBSSI遺伝子、SuSy2遺伝子、AMy1A遺伝子、及びAmy3D遺伝子からなる群より選択されるいずれかの遺伝子の、メチル化レベルが有効に制御されたプロモーターを有する、植物の種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品。
［２］　プロモーターが、SLB1遺伝子、AGPS2b遺伝子、GBSSI遺伝子、及びSuSy2遺伝子からなる群より選択されるいずれかの遺伝子の、高メチル化プロモーターである、１に記載の種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品。
［３］　プロモーターが、Hd1遺伝子、AMy1A遺伝子、及びAmy3D遺伝子からなる群より選択されるいずれかの遺伝子の、低メチル化プロモーターである、１に記載の種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品。
［４］　プロモーターが、SLB1遺伝子P2プロモーターである、２に記載の種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品。
［５］　植物がイネ科植物であり、相対メチル化レベルが1.6 % input以上である、４に記載の種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品。
［６］　有用な特徴を有する植物の種子の生産方法であって：
第１世代の植物を環境ストレス下で栽培する工程；
栽培された植物又はその子孫から、環境ストレスが記憶された種子を得る工程を含む、生産方法。
［７］　環境ストレスの記憶が、Heading date 1(Hd1)遺伝子のプロモーター領域におけるDNAのメチル化レベルの変化である、６に記載の生産方法。
［８］　環境ストレスが、種子が発育する時期の高温ストレス、又は低窒素ストレスである、６又は７に記載の生産方法。
［９］　植物がイネ科植物であり、有用な特徴が、バイオマスの増大、開花促進、子実収量増加、高温登熟耐性の付与からなる群より選択されるいずれかである、６から８のいずれか１項に記載の生産方法。
［１０］　植物がイネ科植物であり、有用な特徴が、分げつ数の増加、単位面積当たりの収量の増加、出穂期の早化、白未熟粒の発生率からなる群より選択されるいずれかである、６から９のいずれか１項に記載の生産方法。
［１１］　植物がイネ科植物であり、環境ストレスが、種子が発育する時期の高温ストレスであり、高温ストレスが、出穂後６週間以上、その時期の平均気温より５℃以上高い環境温度で栽培することである、６から１０のいずれか１項に記載の生産方法。
　遺伝子操作を行うことなく、また交配・固定による品種改良を行うことなく、既存の優良品種を利用して高収量性・早生性の農作物生産のための種子を得ることができる。種子に環境ストレスを記憶させることにより、温暖化などの地球環境変動下での農作物の安定生産に寄与しうる。
　環境ストレス耐性を高めた農作物生産用種子の生産を行うことができる。
　本発明は、高収量性・早生性農作物の生産、工場生産用の種子の生産、工場での農作物の生産、農作物・種子の生産システムの構築のための利用が期待できる。
登熟期の高温ストレスの次世代への影響。a, 自然環境下の対照区と高温ストレスを受けた植物の表現型。b, c, 最高分げつ期（55 DAS; Days after sowing; 播種後）の分げつ数と草丈(n=8)。d, 止葉の全体と0.2% Toluidine blueで染色した葉の横断面の形態。e, f, 止葉の長さ(n=50) と厚さ (n=10)。g, 自然環境下での高温ストレスを受けた植物の出穂促進 (82 DAS)。h, 対照区と高温ストレス区のそれぞれ200個体の出穂率の分布と平均出穂日 (n=20)。i, 植物-個体あたりの玄米の収量(15%含水率計算, n=8)。Student’s t-testにおけるP<0.01**, P<0.001***の有意差を表す。 対照種子とheat-developed種子（登熟期に高温ストレスを受けた種子）の全ゲノムビスルファイトシーケンスで解析した全ゲノムワイドメチル化レベル。a, 1Mbpのウィンドウサイズにおける各メチル化コンテキスト（CG、CHG、CHH）の平均メチル化レベルのクロモソームマップ（CS、対照種子；HDS、熱現像種子）。b, 異なるゲノム領域における各コンテキストのハイパーメチル化およびハイポメチル化DMRの分布。c, 総DMRのジーンオントロジー解析。 登熟期の熱ストレスは、その後の植物の発育段階での転写変化を誘導する。(a)55DASの発育葉のRNA配列決定により得られた総差異発現遺伝子(DEGs)、 b, 総DEGsのGO解析。c, 根、d, 葉におけるOsSLB1の転写レベル（それぞれOsActin及びOsUBQの発現に対する相対値）（CS、対照種子；HDS、熱発生種子）。e, イネにおける見出し関連遺伝子の発現量を示すヒートマップ。f, g, OsUBQでノーマライズした開花前のOsHd1及びOsHd3aの相対発現。エラーバーは3生物学的複製の標準偏差を表す。有意差はStudent's t-testによりP < 0.05*およびP < 0.01**で示される。 対照区と高温ストレスを受けた種子及び生育途中組織のMeDIP-qPCRによるOsSLB1, OsHd1及びOsHd3aのプロモーターのメチル化レベル。a, プロモーター領域、種子内の b, OsSLB1, c, OsHd1, d, OsHd3a プロモーターのメチル化レベル。e, 最高分げつ期の根におけるOsSLB1プロモーターのメチル化レベル。55 DASの葉における f, OsHd1 と g, OsHd3aプロモーターのメチル化レベル。Student’s t-testにおけるP<0.05*, P<0.01**の有意差を表す(n=4)。 登熟期の高温ストレスを受けた次世代植物の高温耐性を獲得する。a, 登熟中種子におけるデンプン合成（OsAGPS2b, OsGBSSI, OsSuSy2）及びデンプン分解α-アミラーゼ（OsAmy1A, OsAmy3D）の遺伝子発現。b, 開花後の５日おきの止葉のSPAD値及び c, 26 DAF (Days after flowering；開花後)における止葉の光合成速度。d , 収穫玄米の白未熟粒の発生率と白未熟粒型の割合。相対発現量はOsActinと比べた。異なったアルファベットはTukey検定による５％水準の有意差を表す (SPADと光合成速度, n=4; 遺伝子発現, n=3)。 対照区と高温ストレスを受けた種子及び生育途中組織のMeDIP-qPCRによるデンプン合成及びデンプン分解のプロモーターのメチル化レベル。a, 種子内と b, 15 DAFの登熟中の種子のデンプン合成とデンプン分解遺伝子プロモーターのメチル化レベル。Student’s t-testにおけるP<0.05*, P<0.01**、又は異なったアルファベットはTukey検定による５％水準の有意差を表す (n=4)。 コムギの登熟期の熱ストレス（発芽とバイオマス） コムギの登熟期の熱ストレス（出穂期と収量） 低窒素条件下における高温記憶イネのバイオマス増加 高温記憶イネの高温ストレス耐性 オオムギ（Hordeum vulgare (Barley) cv. Ichibanboshi）における温度記憶種子のバイオマスへの影響 レタス（Lactusa sativa）における温度記憶種子のバイオマスへの影響 ササゲ（Vigna unguiculata (Cowpea) cv. IT98K-205-8）における温度記憶種子のバイオマスへの影響 ダイズ（Glycine Max (L.) Merr. (Soybean) cv. Fukuyutaka）における温度記憶種子のバイオマスへの影響 各プロモーターの配列
＜環境記憶型の種子＞
　本発明は、環境記憶型の植物の種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品を提供する。なお、本発明に関し、種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品のうち、種子について説明することがあるが、その説明は当業者であれば、適宜その製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品についても当てはめて理解することができる。
　環境型記憶型種子の例の一つは、有効に制御されたメチル化レベルのポリヌクレオチドを有する種子である。ポリヌクレオチドの例は、SLB1遺伝子、Hd1遺伝子、AGPS2b遺伝子、GBSSI遺伝子、SuSy2遺伝子、AMy1A遺伝子、及びAmy3D遺伝子からなる群より選択されるいずれかの遺伝子のプロモーターである。
　好ましい態様の一つでは、プロモーターは、SLB1遺伝子、AGPS2b遺伝子、GBSSI遺伝子、及びSuSy2遺伝子からなる群より選択されるいずれかの遺伝子のプロモーターであり、このときプロモーターの有効に制御されたメチル化レベルは、基準となる種子のメチル化レベルとは異なる（高い又は低い）メチル化レベルであって、下流の遺伝子の発現を基準となる種子の場合とは変化させることができる程度に高い又は低いということができる。
　別の態様の一つでは、プロモーターは、Hd1遺伝子、AMy1A遺伝子、及びAmy3D遺伝子からなる群より選択されるいずれかの遺伝子のプロモーターであり、このときプロモーターのメチル化レベルは、下流の遺伝子の発現を促進できる程度に低いことが好ましい。
　特に好ましい態様の一つでは、メチル化レベルが制御されたプロモーターは、SLB1遺伝子P2プロモーターである。このとき、植物がイネ科植物（好ましくはイネ）であれば、メチル化レベルとしては、相対メチル化レベルが1.6 % input以上であることが好ましい。
［プロモーター］
　本発明に関連するプロモーターを、Oryza sativa L. cv. Nipponbareの場合を例として、下記に示す。
　好ましい態様の一つでは、SLB1遺伝子のP1プロモーター（SLB1:proP1）とは、下記のいずれかをいう。
（A）配列番号1に記載の配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号1に記載の配列と高い配列同一性を有する配列からなり、SLB1遺伝子の発現を制御する活性を有するポリヌクレオチド。
　好ましい態様の一つでは、SLB1遺伝子のP2プロモーター（SLB1:proP2）とは、下記のいずれかをいう。
（A）配列番号2に記載の配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号2に記載の配列と高い配列同一性を有する配列からなり、SLB1遺伝子の発現を制御する活性を有するポリヌクレオチド。
　好ましい態様の一つでは、SLB1遺伝子のP3プロモーター（SLB1:proP3）とは、下記のいずれかをいう。
（A）配列番号3に記載の配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号3に記載の配列と高い配列同一性を有する配列からなり、SLB1遺伝子の発現を制御する活性を有するポリヌクレオチド。
　好ましい態様の一つでは、Hd1遺伝子のP1プロモーター(Hd1:proP1)とは、下記のいずれかをいう。
（A）配列番号4に記載の配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号4に記載の配列と高い配列同一性を有する配列からなり、Hd1遺伝子の発現を制御する活性を有するポリヌクレオチド。
　好ましい態様の一つでは、Hd1遺伝子のP2プロモーター(Hd1:proP2)とは、下記のいずれかをいう。
（A）配列番号5に記載の配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号5に記載の配列と高い配列同一性を有する配列からなり、Hd1遺伝子の発現を制御する活性を有するポリヌクレオチド。
　好ましい態様の一つでは、Hd1遺伝子のP3プロモーター(Hd1:proP3)とは、下記のいずれかをいう。
（A）配列番号6に記載の配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号6に記載の配列と高い配列同一性を有する配列からなり、Hd1遺伝子の発現を制御する活性を有するポリヌクレオチド。
　好ましい態様の一つでは、Hd3a遺伝子のP1プロモーター(Hd3a:pro1)とは、下記のいずれかをいう。
（A）配列番号7に記載の配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号7に記載の配列と高い配列同一性を有する配列からなり、Hd3a遺伝子の発現を制御する活性を有するポリヌクレオチド。
　好ましい態様の一つでは、Hd3a遺伝子のP2プロモーター(Hd3a:pro2)とは、下記のいずれかをいう。
（A）配列番号8に記載の配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号8に記載の配列と高い配列同一性を有する配列からなり、Hd3a遺伝子の発現を制御する活性を有するポリヌクレオチド。
　好ましい態様の一つでは、AGPS2b遺伝子のプロモーター(AGPS2b:pro)とは、下記のいずれかをいう。
（A）配列番号9に記載の配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号9に記載の配列と高い配列同一性を有する配列からなり、AGPS2b遺伝子の発現を制御する活性を有するポリヌクレオチド。
　好ましい態様の一つでは、GBSSI遺伝子のプロモーター(GBSSI:pro)とは、下記のいずれかをいう。
（A）配列番号10に記載の配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号10に記載の配列と高い配列同一性を有する配列からなり、GBSSI遺伝子の発現を制御する活性を有するポリヌクレオチド。
　好ましい態様の一つでは、SuSy2遺伝子のプロモーター(SuSy2:pro)とは、下記のいずれかをいう。
（A）配列番号11に記載の配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号11に記載の配列と高い配列同一性を有する配列からなり、SuSy2遺伝子の発現を制御する活性を有するポリヌクレオチド。
　好ましい態様の一つでは、Amy1A遺伝子のプロモーター(Amy1A:pro)とは、下記のいずれかをいう。
（A）配列番号12に記載の配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号12に記載の配列と高い配列同一性を有する配列からなり、Amy1A遺伝子の発現を制御する活性を有するポリヌクレオチド。
　好ましい態様の一つでは、AGPS2b遺伝子のプロモーター(AGPS2b:pro)とは、下記のいずれかをいう。
（A）配列番号13に記載の配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号13に記載の配列と高い配列同一性を有する配列からなり、AGPS2b遺伝子の発現を制御する活性を有するポリヌクレオチド。
　本明細書の一部である配列表の配列番号1-13の配列の配列は、イネ（Oryza sativa L）由来の配列である。
　イネ以外の、コムギ、オオムギ、レタス、ササゲ、ダイズにも、これらの遺伝子とそのプロモーターが共通して存在する。Phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）のデータベースにおける関連の配列のID番号を下表に示す。関連の配列は、当業者であれば適宜入手し、上記の配列番号1-13の配列の代わりに用いることができる。
［ヌクレオチド配列の同一性について］
　本発明に関し、ヌクレオチド配列（塩基配列ということもある。）について配列同一性というときは、特に記載した場合を除き、2つの配列を最適の態様で整列させた場合に、2つの配列間で共有する一致したヌクレオチドの個数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝(一致した位置の数/位置の全数)×100で算出できる。これは、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(1990)403-410に記載されるNBLAST及びXBLASTプログラム中に組込まれている。ヌクレオチド配列の同一性の計算は、当業者には周知のプログラム(例えば、BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW)により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。
　本発明に関し、配列について、高い同一性というときは、特に記載した場合を除き、いずれの場合も、64%以上、65%以上、69%以上、70%以上、72%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、好ましくは80%以上、81%以上、83%以上、84%以上、より好ましくは85%以上、86%以上、89%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは97.5%以上さらに好ましくは99%以上の配列の同一性を指す。
　イネの各遺伝子のプロモーター領域(当該遺伝子の上流3000塩基長部分の領域)と他の植物由来の対応するものとの配列同一性は、下記のとおりである。
1. SLB1遺伝子
1.1 wheat:
Gene ID: Traes_3AL_8BD2EAD06.1 (Thromboxane-A synthase, CYTOCHROME P450 711A1) 
配列同一性: 75%
1.2 maize: 
Gene ID: Zm00001d039697_T001 (Thromboxane-A synthase, CYTOCHROME P450 711A1) 
配列同一性: 72% 
1.3 lettuce: 
Gene ID: Lsat_1_v5_gn_6_14580.1 (Thromboxane-A synthase, CYTOCHROME P450 B-class) 
配列同一性: 70% 
1.4 Brassica rapa: 
Gene ID: Brara.C02476.1 (Thromboxane-A synthase, CYTOCHROME P450 B-class) 
配列同一性: 69% 
2. Hd1遺伝子
2.1 wheat: 
Gene ID: Traes_7DS_46E811D74.1 (CCT-motif B-box Zinc finger) 
配列同一性: 81% 
2.2 maize: 
Gene ID: Zm00001d045735_T002 (CCT-motif B-box Zinc finger) 
配列同一性: 72%
2.3 ettuce: 
Gene ID: Lsat_1_v5_gn_2_86121.1 (BBOX Zinc finger protein CONSTANS related) 
配列同一性: 70% 
2.4 Brassica rapa: 
Gene ID: Brara.A02054.1 (ZINC FINGER PROTEIN CONSTANS-RELATED) 
配列同一性: 83% 
3. Hd3a遺伝子
3.1 wheat: 
Gene ID: Traes_7AS_EBD5F1F54.1 (Flowering locus T-related) 
配列同一性: 86%
3.2 maize: 
Gene ID: Zm00001d036242_T001 (Flowering locus T-related) 
配列同一性: 89%
3.3 lettuce: 
Gene ID: Lsat_1_v5_gn_2_17881.1 (Flowering locus T) 
配列同一性: 78% 
3.4 Turnip mustard: 
Gene ID: Brara.G03476.1 (Flowering locus-T) 
配列同一性: 69%
4. AGPS2b遺伝子
4.1 wheat: 
Gene ID: Traes_7AS_1B2A8C929.2 (Glucose-1-phosphate adenylyltransferase/ ADP-glucose synthase) 
配列同一性: 90% 
4.2 maize: 
Gene ID: Zm00001d025723_T001 (Glucose-1-phosphate adenylyltransferase/ ADP-glucose synthase) 
配列同一性: 72% 
4.3 lettuce: 
Gene ID: Lsat_1_v5_gn_7_98980.1 (GLUCOSE-1-PHOSPHATE ADENYLYLTRANSFERASE SMALL SUBUNIT, CHLOROPLASTIC) 
配列同一性: 79% 
4.4 Brassica rapa: 
Gene ID: Brara.G00430.1 (GLUCOSE-1-PHOSPHATE ADENYLYLTRANSFERASE SMALL SUBUNIT, CHLOROPLASTIC) 
配列同一性: 79% 
5. GBSSI遺伝子
5.1 wheat: 
Gene ID: Traes_4AL_4B9D56131.1 (NDP-glucose--starch glucosyltransferase / Waxy protein) 
配列同一性: 78% 
5.2 maize: 
Gene ID: Zm00001d045462_T001 (NDP-glucose--starch glucosyltransferase / Waxy protein)  
配列同一性: 90% 
5.3 lettuce: 
Gene ID: Lsat_1_v5_gn_2_73301.1 (NDP-glucose--starch glucosyltransferase / Waxy protein)  
配列同一性: 76% 
5.4 Brassica rapa: 
Gene ID: Brara.E01764.1 (NDP-glucose--starch glucosyltransferase / Waxy protein)
配列同一性: 72% 
6. SuSy2遺伝子
6.1 Homology to wheat: 
Gene ID: Traes_7DS_529BAB150.2 (GLYCOSYLTRANSFERASE)
配列同一性: 81% 
6.2 maize: 
Gene ID: Zm00001d045042_T014 (SUCROSE SYNTHASE)
配列同一性: 84% 
6.3 lettuce: 
Gene ID: Lsat_1_v5_gn_5_119340.1 (GLYCOSYLTRANSFERASE // SUCROSE SYNTHASE 1-RELATED)
配列同一性: 77% 
6.4 Brassica rapa: 
Gene ID: Brara.C00954.1 (Sucrose synthase) 
配列同一性: 70% 
7. Amy1A遺伝子
7.1 wheat: 
Gene ID: Traes_6AL_AC7FC445B.1 (ALPHA-AMYLASE) 
配列同一性: 81% 
7.2 maize: 
Gene ID: Zm00001d018159_T001 (ALPHA-AMYLASE) 
配列同一性: 72% 
7.3 lettuce: 
Gene ID: Lsat_1_v5_gn_6_112060.1 L (ALPHA-AMYLASE) 
配列同一性: 64%
7.4 Brassica rapa: 
Gene ID: Brara.A02054.1 (ALPHA-AMYLASE) 
配列同一性: 65% 
8. Amy3D遺伝子
8.1 wheat: 
Gene ID: Traes_5BL_C3DA62711.1 ALPHA-AMYLASE) 
配列同一性: 81% 
8.2 maize: 
Gene ID: Zm00001d031794_T001 (ALPHA-AMYLASE) 
配列同一性: 89% 
8.3 lettuce: 
Gene ID: at_1_v5_gn_6_112060.1 (ALPHA-AMYLASE) 
配列同一性: 70% 
8.4 Brassica rapa: 
Gene ID: Brara.A02054.1 (ALPHA-AMYLASE) 
配列同一性: 70%
［メチル化レベル］
　本発明に関し、メチル化のレベルが有効に制御されたというときは、特に記載した場合を除き、その下流の遺伝子の発現を制御できる程度にメチル化されていることを指す。メチル化の程度はまた、標準となる個体があれば、そのメチル化レベルより、一定の割合以上に高い又は低いレベルであり得る。
　メチル化レベルは、対象となる種子から適切な方法で抽出したDNAについて、メチル化の程度を測定することにより決定できる。測定方法は、特に限定されず、（Ａ）メチル化ＤＮＡを断片化、濃縮してメチル化ＤＮＡを解析する方法、（Ｂ）バイサルファイト処理してシーケンスする解析方法、（Ｃ）メチル化感受性の制限酵素を利用した解析方法、（Ｄ）メチル化特異的ＰＣＲ法を利用した解析方法等があり、そのいずれを利用してもよい。
　好適な一例は、ソニケーションや酵素により断片化された１本鎖DNAに対して、5-メチルシトシン(5-mC)に対する抗体を用いて１本鎖DNA (ssDNA)断片上の5-mCを免疫沈降して濃縮する方法である。この測定のためには、市販のキット、例えばMeDIP Kitに名を使用することができる。
　メチル化レベルは、解析に用いたDNA（input)に対するメチル化されたDNAの割合として% inputで表すことができる（https://www.diagenode.com/files/products/kits/magmedip-qpcr-kit-manual.pdf）。
　プロモーターと、好ましいメチル化レベルの例は、下記である。
SLB1遺伝子のP1プロモーター
相対メチル化レベル：0.028 % input以上、好ましくは0.046 % input以上、より好ましくは0.049 % input以上、さらに好ましくは0.062 % input以上である。
SLB1遺伝子のP2プロモーター
相対メチル化レベル：0.116 % input以上、好ましくは0.148 % input以上、より好ましくは0.195 % input以上、さらに好ましくは0.198 % input以上である。
SLB1遺伝子のP3プロモーター
相対メチル化レベル：0.144 % input以上、好ましくは0.163 % input以上、より好ましくは0.169 % input以上、さらに好ましくは0.171 % input以上である。
Hd1遺伝子のP1プロモーター
相対メチル化レベル：0.222 % input以上、好ましくは0.308 % input以上、より好ましくは0.558 % input以上、さらに好ましくは0.761 % input以上である。
Hd1遺伝子のP2プロモーター
相対メチル化レベル：0.019 % input以上、好ましくは0.032 % input以上、より好ましくは0.040 % input以上、さらに好ましくは0.049 % input以上である。
Hd1遺伝子のP3プロモーター
相対メチル化レベル：0.002 % input以上、好ましくは0.004 % input以上、より好ましくは0.008 % input以上、さらに好ましくは0.012 % input以上である。
Hd3遺伝子のP1プロモーター
相対メチル化レベル：0.009 % input以上、好ましくは0.011 % input以上、より好ましくは0.012 % input以上、さらに好ましくは0.015 % input以上である。
Hd3遺伝子のP2プロモーター
相対メチル化レベル：0.002 % input以上、好ましくは0.005 % input以上、より好ましくは0.006 % input以上、さらに好ましくは0.012 % input以上である。
AGPS2b遺伝子のプロモーター
相対メチル化レベル：0.003 % input以上、好ましくは0.010 % input以上、より好ましくは0.018 % input以上、さらに好ましくは0.022 % input以上である。
GBSSI遺伝子のプロモーター
相対メチル化レベル：0.019 % input以上、好ましくは0.027 % input以上、より好ましくは0.036 % input以上、さらに好ましくは0.040 % input以上である。
SuSy2遺伝子のプロモーター
相対メチル化レベル：0.005 % input以上、好ましくは0.010 % input以上、より好ましくは0.014 % input以上、さらに好ましくは0.019 % input以上である。
AMy1A遺伝子のプロモーター
相対メチル化レベル：0.027 % input以上、好ましくは0.033 % input以上、より好ましくは0.039 % input以上、さらに好ましくは0.065 % input以上である。
相対メチル化レベル：Amy3D遺伝子のP3プロモーター
0.005 % input以上、好ましくは0.006 % input以上、より好ましくは0.007 % input以上、さらに好ましくは0.009 % input以上である。
［植物］
　本発明は、種々の植物に適用することができる。植物の例として、イネ科、キク科、シソ科、アブラナ科、セリ科、及びヒユ科から選択されるいずれかの科に属する植物を挙げることができる。
  本発明が適用される植物は、特に限定されないが、好ましく適用できる植物の一例は、単子葉植物網に属する植物であり、より好ましくはツユクサ亜網に属する植物であり、さらに好ましくはイネ科（Poaceae（Gramineae））に属する植物であり、例えばイネ（Oryza）、オオムギ、ライムギ、パンコムギ、イヌムギ、ハトムギ、サトウキビ、トウモロコシ、モロコシ、アワ、キビ、ヒエいずれかの属に属する植物である。イネ科に属する植物のうちでは、好ましくはイネ属に属する植物であり、より好ましくはイネ（Oryza sativa L.）である。本発明が適用される植物は、Hd1のメチル化レベルの変化が収穫物に影響を与える植物であるという観点からは、イネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、大豆、トウモロコシ、ソルガム、カボチャ、シロイヌナズナが適している。
　本発明が好ましく適用できる植物の他の例は、双子葉植物網に属する植物であり、具体的には、キク科、シソ科、アブラナ科、セリ科、マメ科のいずれかに属する植物で
　より具体的な植物の例は、下記である：
　イネ科：イネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、トウモロコシ
　キク科：レタス、サンチュ、チシャ
　シソ科：バジル
　アブラナ科：コマツナ、ミズナ、ハツカダイコン、Brassica rapa（アブラナ、 在来ナタネ、ハクサイ、カブ、イエローサルソン、コウサイタイ、タイサイ、チンゲンサイ、アブラナ (oleifera亜種)、アブラナ (campestris亜種)）
　セリ科：パクチー
　ヒユ科：ホウレンソウ
　マメ科：ダイズ、エンドウ、ヒヨコマメ、インゲンマメ、ヤハズエンドウ、クローバー、ソラマメ、ムラサキウマゴヤシ、ササゲ（Vigna unguiculata）、リョクトウ（Vigna radiata）、ケツルアズキ（もやし豆）（Vigna radiata）、モスビーン（Vigna aconitifolia）
  本発明に関し、植物というときは、特に記載した場合を除き、植物個体又はその一部の意味で用いており、またその一部というときは、特に記載した場合を除き、種子（発芽種子、未熟種子を含む。）、器官又はその部分（葉、根、茎、花、雄蕊、雌蘂、それらの片を含む）、植物培養細胞、カルス、プロトプラストを含む。植物には、遺伝子操作植物及び形質転換植物が含まれる。植物には、収穫物及び繁殖材料が含まれる。本発明に関し、繁殖材料とは、特に記載した場合を除き、植物体の全部又は一部で繁殖の用に供されるもの（種苗ということもある。）をいい、例えば、種子、苗、細胞、カルス、幼芽がある。本発明に関し、収穫物とは、特に記載した場合を除き、通常の意味で用いており、植物体の全部又は一部で繁殖の用に供されないもの、例えば、植物がイネである場合、収穫物には、刈り取った稲、もみが含まれる。収穫物は、作物、又は農作物と称されることもある。本発明に関し加工品というときは、特に記載した場合を除き、収穫物から直接的に又は間接的に生産される加工品をいう。本発明の範囲は、少なくとも、本発明の収穫物における特徴を反映した加工品が含まれる。例えば、植物がイネである場合、精米した米、米飯、米粉、米粉を使用したパン類、菓子類、饅頭類、ピザ、酒は、加工品の範囲に含まれる。
　本発明に関し、植物について、子孫というときは、特に記載した場合を除き、当該植物を、少なくとも一方の遺伝的な親及び／又は祖先とする植物をいう。子孫には、目的の形質が受け継がれている限り、親である形質転換植物より得られた後代（T1等）又はその子孫、T0又はT1を一方の親とする交雑後代（例えばF1）及びその子孫が含まれる。
　種子の製品の例は、複数の種子、例えば100粒以上、1,000粒以上、10,000粒以上を袋詰めしたものである。製品は、作物の生産のためのものであってもよい。植物がイネである場合、製品は、生産のための種子は、原料籾、種籾と称されることがある。
　この場合の種子の製品は、品質が基準以上のものであってもよい。基準の例を以下に示す。
　水分：籾水分が14.0～16.0 %
　浮籾割合：浄水選5 % 以内（100粒中5粒）
　篩上比率：2.2 mm 筋上98 % 以上
　発芽：発芽率90 % 以上
　その他：脱ぷ粒・割籾、異種穀粒、異物混入なし
　うるち混：混入限度は0.04 %（10,000粒中4粒）
［有用な特徴］
　本発明により提供される環境記憶型の種子からは、有用な特徴を有する植物を生育することができる。本発明に関し、有用な特徴の例は、バイオマスの増加、開花促進、子実収量増加、高温登熟耐性の付与である。
　植物がイネ科植物である場合、環境記憶型の種子から得られた植物の有用な特徴は、分げつ数の増加、栽培面積当たりの収量の増加、出穂期の早化、白未熟粒型の割合が低いことからなる群より選択されるいずれかである。白未熟粒の発生率(%)は、本明細書の実施例の項での分類にしたがい、脱穀した粒を5群に分け、（opaque数）/（全数）×100で計算できる。
　好ましい態様においては、環境記憶型コムギ種子から得られた植物の有用な特徴は、収量の増加である。具体的には、登熟期に温度ストレス（例えば、15℃）を受けたコムギから得られた環境記憶型コムギ種子からは、通常の種子を用いて同じ条件で栽培されたものより、収量が50％以上、好ましくは100％以上、より好ましくは200％以上、さらに好ましくは300％以上、例えば340％程度、増加しうる。コムギ以外のイネ科植物、あるいはイネ科植物以外の植物でも同様のことが期待できる。
　好ましい態様においては、環境記憶型オオムギ種子から得られた植物の有用な特徴は、収量の増加である。具体的には、登熟期に高温ストレス（例えば、25℃）を受けたオオムギから得られた、環境記憶型オオムギ種子からは、通常の種子を用いて同じ条件で栽培されたものより、収量が20％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは40％以上、さらに好ましくは45％以上、例えば49％程度、増加しうる。オオムギ以外のイネ科植物、あるいはイネ科植物以外の植物でも同様のことが期待できる。
　好ましい態様においては、環境記憶型イネ種子から得られる植物の有用な特徴の一つは、低窒素条件下でのバイオマスの増加である。バイオマスの増加の程度は、地上部の長さ、地下部の長さ、及び乾燥重量からなる群より選択されるいずれかにより判断できる。具体的には、環境記憶型イネ種子からは、発芽後21日の乾燥重量で、通常の種子を用いて同様の低窒素条件で栽培された植物より、乾燥物の重量が30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは60％以上、例えば70％程度、増加しうる。イネ以外のイネ科植物、あるいはイネ科植物以外の植物でも同様のことが期待できる。
　好ましい態様においては、環境記憶型レタス種子から得られる植物の有用な特徴の一つは、バイオマスの増加である。具体的には、環境記憶型レタス種子からは、通常の種子から同じ日数栽培した場合より、地上部の重量が30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは60％以上、例えば70％程度、増加しうる。レタス以外のキク科植物、あるいはキク科植物以外の植物でも同様のことが期待できる。
　好ましい態様においては、環境記憶型レタス種子から得られる植物の有用な特徴の一つは、バイオマスの増加が早いことである。具体的には、環境記憶型レタス種子からは、目的の量のバイオマスが得られるまでの日数が、通常の種子から栽培したものより、5日以上、好ましくは10日以上、より好ましくは20日以上、さらに好ましくは30日以上、例えば35日程度、早いことである。レタス以外のキク科植物、あるいはキク科植物以外の植物でも同様のことが期待できる。
　好ましい態様においては、環境記憶型ササゲ種子から得られる植物の有用な特徴の一つは、種子の数が多いことである。具体的には、環境記憶型ササゲ種子からは、通常の種子から同じ条件で栽培した場合より、3％以上、好ましくは5％以上、より好ましくは7％以上以上、さらに好ましくは10％以上、例えば15％程度、多いことである。ササゲ以外のマメ科植物、あるいはマメ科植物以外の植物でも同様のことが期待できる。
＜環境ストレス下での種子の生産方法＞
　本発明はまた、有用な特徴を有する植物の種子の生産方法に関する。本発明の生産方法は、下記の工程を含む：
第１世代の植物を環境ストレス下で栽培する工程；
栽培された植物又はその子孫から、環境ストレスが記憶された種子を得る工程。
［環境ストレス］
　環境ストレスの例として、温度ストレス（高温ストレス、又は低温ストレス）、低窒素ストレス、塩類ストレス、寡照ストレス、強光ストレス、乾燥ストレス、過湿ストレス、高温ストレス、低温ストレス、栄養ストレス、重金属ストレス、病害ストレス、酸素欠乏ストレス、オゾンストレス、Co2ストレス、強風ストレスが挙げられる。環境ストレスは、好ましくは種子が発育する時期の温度ストレス（高温ストレス、又は低温ストレス）、又は低窒素ストレスである。種子が発育する時期を、登熟期ということがある。
　植物がイネ科植物である場合、環境ストレスの好ましい例の一つが、種子が発育する時期の高温ストレスであり、高温ストレスが、出穂後６週間以上、その時期の平均気温より５℃以上高い環境温度で栽培することである。
　コムギの場合、環境ストレスの好ましい例の一つが、種子が発育する時期の温度ストレス（例えば10～20℃、例えば15℃とする。）である。オオムギの場合、環境ストレスの好ましい例の一つが、種子が発育する時期の高温ストレス（例えば20～30℃、例えば25℃とする。）である。レタスの場合、環境ストレスの好ましい例の一つが、種子が発育する時期の高温ストレス（例えば20～32℃、例えば25℃、又は30℃とする。）である。ササゲの場合、環境ストレスの好ましい例の一つが、種子が発育する時期の高温ストレス（例えば20～30℃、例えば25℃とする。）である。ダイズの場合、環境ストレスの好ましい例の一つが、種子が発育する時期の温度ストレス（例えば15～25℃、例えば20℃とする。）である。
　本発明においては、環境ストレスの記憶が、Heading date 1(Hd1)遺伝子のプロモーターにおけるDNAのメチル化レベルの変化であることが好ましい。変化は、増加すること又は減少することをいう。
＜イネ＞
［材料及び方法］
1.植物材料、生育条件及び生育測定
　イネ（Oryza sativa L. cv.Nipponbare）を自然環境下で栽培した。栽培場所は、2015～2018年の間は九州大学箱崎キャンパス（福岡県、日本、33°67’N,130°42’E）、2019～2020年は九州大学伊都キャンパス（福岡県、日本、33°37’N,130°25’E）とした。イネを対照条件で生育させ、すでに報告のあるように、登熟期に高温ストレス処理を施した（Suriyasak et al. 2020）。生育測定用に、対照及び高温ストレス処理した3週齢のイネ実生を1本ずつ、基肥を加えた1／5000ワグネルポットに移植した。基肥については先行研究に記載の通りとした（Suriyasak et al. 2020）。移植後、分げつ数と草丈を5日おきに測定し、開花後（DAF）49日目に植物を収量解析のために収穫した。葉の表現型と出穂の表現型の観測用に、3週齢の実生を10本、1つのポットに移植した。最高分げつ期に完全に生育した分げつを取り除き、中心の茎だけをその後も生育させて、葉の試料採取と出穂日の確認に用いた。止葉の表現型を評価するために、出穂後、完全に展開した止葉の長さを測定した。止葉の中心部を回収し、解析するまでFAA（ホルマリン-酢酸-エチルアルコール）溶液中で保存した。その後、OCTコンパウンドを用いた凍結切片作成法により、葉試料から厚さ15μmの切片を作成し（ライカCM1950、ライカマイクロシステムズ株式会社）、顕微鏡で可視化して（BZ-X710、キーエンス）、葉の厚み、幅、及び細胞層をイメージJ（ImageJ）で測定した。
2.収量解析
　ポットでの栽培用に、各処理から3週齢の実生を1本ずつ、前述したように肥料を施した1／5000aのワグネルポットに移植した。圃場での実験用には、各処理した3週齢の実生を、大学の実験用水田に移植した。この実験では、各処理に個別の実験区を準備し、それぞれの実験区につき49本のイネを30×30cm間隔の密度で植えた。移植の前に、遅効溶出性のシグモイド型肥料を混合した。実験区の中心部から、連続して植っている15本のイネを収量解析用に収穫し、区ごとの穂数と小穂の総数を測定した。脱穀した後、玄米を1.8mmの篩いを使って回収し、登熟率と他の収量構成要素を測定した。子実の水分含量は80℃で24時間乾燥させた子実の乾物重から算出し、総収量と千粒重は水分含量を15％として算出した。
3.全ゲノムバイサルファイトシーケンス法（WGBS）による網羅的なDNAのメチル化解析
　各試料のゲノムDNAを、アイソスピンプラントDNA抽出キット（ニッポンジーン）を使用し、20粒の乾燥種子から抽出した。各処理に由来する10の試料から抽出してプールしておいたgDNAを、シーケンス解析の前にバイサルファイト処理に供した。参照ゲノム配列、遺伝子及びTE（転位因子）のアノテーションはRAP-DBから取得した。メチル化レベルの差が1.25倍を上回っていたもの（対照区と処理区のメチル化の差が±２５％のもの）を（P値が0.05未満とする）、メチル化変化部位（DMP）及びメチル化変化領域（DMR）として抽出し、抽出したDMRをスライディングウィンドウ方式で100 bpずつスクリーニングした。また、翻訳領域の上流及び下流それぞれ3000bpの範囲内にあるDMRをプロモーターのTSS（転写開始点）とみなしている。遺伝子オントロジー（GO）解析を、パンサーソフトウェアー(PANTHER)の“GO biological process complete”, “GO molecular function complete” 及び “GO cellular component complete” の解析セットと‘Fisher’s Exact’ test with ‘No correlation’の設定を使用して行い、それぞれのGOに関与している遺伝子を数の多い順を表に表した。
4.RNAの配列解析及び定量的リアルタイムPCR
　各成長段階ごとに合わせた解析を行った。最高分げつ期の根と葉（OsSLB1）、又は最も新しく、完全に展開した葉を、それぞれの遺伝子の概日性発現にあわせて午前10時（OsHd3a）と午後8時（OsHd1）に採取した。また、播種後（DAS）55日目の最高分げつ期に成長中の根を、開花後（DAF）15日目に成熟途中の子実を採取した。凍結保存しておいた葉、根又は成熟途中の子実から、SDS／フェノール／リチウムクロライド法（Chirgwin et al. 1979）により、全RNAを抽出し、各処理（55DAS、PM）につき2つの生物学的複製を用いて、RNAの配列解析を行った。すべての発現変化遺伝子（DEG、P＜0.05）を解析し、オリジンプロ（OriginPro）を利用して、RNAリードのヒートマップを生成した。DMRに関して前述したのと同じ方法で、DEGに関するGO解析を行った。定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）用に、抽出したRNAから、リバトラエース（ReverTra Ace）逆転写酵素（東洋紡）を使用し、製造業者の説明に従ってcDNAを合成した。定量的リアルタイムPCRは、CFXコネクト（Connect）光学モジュールリアルタイムPCR検出システム（バイオラッド）を、SYBRグリーン（Green）（東洋紡）と共に使用し、製造業者の説明に従って実施した。qRT-PCRに使用したプライマーは補足の表S5に列挙している。PCRの条件は以下の通りとした。最初に変性を94℃2分間行った後、変性を94℃で20秒、アニーリングをプライマーごとに設定した温度で20秒、伸長を72℃20秒で40サイクル繰り返し、その後、融解し、プレートを解読した。結果を、OsUBQ（葉試料）又はOsActin（根及び成熟途中の子実試料）の発現レベルに基づいて正規化した。
5.MeDIP-qPCRによるDNAメチル化解析
　乾燥種子、成長中の葉、及び成熟途中の子実から、DNイージープラントミニキット（DNeasy Plant Mini Kit、キアゲン）を用いてゲノムDNAを抽出し、超音波処理によって、およそ500bpの断片に剪断した。MeDIP-qPCR用に、1000ngの剪断したDNAを使った免疫沈降を、免疫沈降キット（Active Motif）を用い、製造業者によるプロトコールに記載のあるように行った。免疫沈降したDNAをqRT-PCRに供し、DNAのメチル化レベルが変化した位置を検出した。% inputは、製造業者によるプロトコールに記載されているように算出した（https://www.diagenode.com/files/products/kits/magmedip-qpcr-kit-manual.pdf）。具体的には、% inputは、解析に用いたDNA（input)に対するメチル化抗体で沈降したDNAの割合である。MeDIP-qPCRに用いた特定のプライマーは下表に列挙している。
6.登熟期における高温耐性の評価
　自然環境で生育させ、開花した後、対照と高温処理した植物をそれぞれ、対照から対照（25℃）、対照から高温処理（30℃）、及び高温処理から高温処理（30℃）の3群に分けて、高温耐性実験に用いた。SPAD測定は5日おきに実施した。各ポットから3枚の止葉を選び、葉の上部、中央部、下部の三ヶ所を測定して平均SPAD値を生成し、その後も毎回、同じ止葉の同じ場所を測定した。開花後（DAF）26日目に、止葉の中央部（3 - 4複製）の光合成速度を測定した。この測定は、晴れた日の8：00 - 14：00の間に、LCi携帯式光合成システム（ライコールバイオサイエンシズ（Li-COR Biosciences）、リンカーン、ネブラスカ、米国）を使って行った。測定条件は、チャンバー温度を25℃、光合成有効放射（PAR）を1,500光量子束密度（μmol　m-2s-1）とし、天然雰囲気のCO2を参照バックグランドとした。各処理ごとの成熟途中の子実における遺伝子発現を前述したように解析し、白未熟粒の分類は、先行研究に記載があるように行った。具体的には、透過照明下で下方から穀粒を目視で観察し、正常な米粒は光を透過して半透明であり、未熟なものは不透明な部分やカルキ質の部分が光の透過を妨げることから暗い部分ができることに基づき評価した。Ishimaruら（2009）の基準に従い、opaque、white-belly、white-based、white-backed、immatureの5群に分類した。 
［結果］
1.登熟期の高温ストレスによって後代植物では表現型が変化し、収量が増加する
　登熟期の高温ストレスが後代の表現型の変化にどのように影響するかを明らかにするために、対照と高温ストレス処理した植物の種子を播種し、自然環境下で生育させた。その結果、高温登熟させた種子は、その後の成長において、栄養成長期には対照よりも分げつが促進され、加えて最高分げつ期には、対照よりも草丈が低下することが観察された（図1a - c）。また、登熟期に高温ストレスを受けた植物の葉の表現型は、対照の植物と比較して、止葉が有意に短く、かつ、厚くなり、維管束に隣接する細胞層が増加した一方で、葉の幅に変化は見られなかった（図1d - f）。出穂期では、高温登熟させた植物では早い出穂が認められ、同じ自然環境下で生育させた対照植物よりもおよそ2日早く出穂した（図1g、h）。収穫期には、高温登熟させた植物では、1鉢あたり1本の植物の総収量が、対照に比べて、14.47％有意に増加した（図1i、j）。また、圃場実験でも同様の結果が得られ、登熟期に高温ストレスを受けることにより、植物の収量は対照と比較して、1平方メートルあたり9.51％増加した（表2）。ポットを使った実験と圃場実験の両方において、登熟期に高温ストレスを受けた種子から育てた植物では、穂数が有意に増加した一方で、穂あたりの小穂数、登熟率及び千粒重に変化は見られず（表2）、このことから、高温登熟させた次世代植物で見られた収量増加は、主に、穂数の増加によるものであることが示唆された。このように、登熟期に高温ストレスを受けることによって後代植物の表現型には、対象と比較して、分げつ数の増加、止葉の表現型の変化、出穂の促進、最終収量の増加などの有意な変化が認められた。またこれらの変化は、他の年に実施した再現実験においても認められた。
2.登熟期の高温ストレスによって、乾燥種子では網羅的なメチロームの変化が誘導される
　我々は、エピジェネティックな制御、特にDNAメチル化がこの世代間記憶に重要な役割を果たしているのではないかと考え、対照種子と高温ストレスを受けた種子のメチル化シトシンを1塩基単位で比較して、メチロームを生成した。全ゲノムバイサルファイトシーケンス（WGBS）による網羅的なメチル化解析の結果、対照種子ではCG、CHG、CHHコンテキストそれぞれにおいてシトシン残基の56.6％、27.0％、及び14.1％がメチル化されていたのに対し、高温ストレスを受けた種子では合計3,991,072,994のシトシンが配列決定され、CG、CHG、CHHコンテキストのそれぞれで、57.8％、28.5％、及び15.5％がメチル化されていた（表3）。
　まとめると、登熟期に高温ストレスを受けることで、メチル化シトシンのすべてのコンテキストにおいて約1％の高メチル化が引き起こされた。染色体上のすべてのコンテキストにおける平均メチル化レベルを、染色体マップとして1Mbpウィンドウのサイズでプロットしたところ、高温ストレスを受けた種子では、対照と比較して、ゲノム全体でメチル化レベルが変化していた（図2a）。次に、対照と比較して、高温登熟させた種子におけるメチル化変化領域（DMR）を同定し、高メチル化DMRを268、低メチル化DMRを189、合計で457のDMRを同定した。DMRの分布から、CGコンテキストにおけるDMRの大部分が遺伝子プロモーターと重なっており、次いで、TE領域に高メチル化と低メチル化の両方が多いことがわかった（図2b）。
　一方、非CGコンテキストではDMRの多くがTE領域に存在し、次いでプロモーター領域に存在した。さらに、レトロトランスポゾンではTEと重複しているDMRが最も多いことがわかった。タンパク質のコード遺伝子と重なるDMRをGO解析した結果、ストレス応答、金属イオン輸送、酸化ストレスへの応答や様々な生物学的過程に関連するDMRが豊かに存在していることが明らかになった（図2c）。
　このことから、登熟期に高温ストレスに曝されることによって、網羅的なメチロームの変化が、特にコード遺伝子のプロモーター領域において引き起こされることが示唆された。
3.登熟期の高温ストレスによって、栄養成長の過程で転写変化が生じる
　植物発生過程における網羅的なDNAメチル化の変化が転写制御にどのような影響を与えるかをより深く理解するために、栄養成長期の葉のRNAを用いてRNA配列解析を行った。
　その結果、1,510の発現上昇遺伝子と1,338の発現低下遺伝子を発見し、合計で2,848の発現変化遺伝子（DEG）を同定した（図3a）。全DEGの遺伝子オントロジー解析の結果には、例えば酸化ストレス応答、光合成、代謝過程及び細胞内の解剖学的構造などの、様々な制御経路に関わる多くの遺伝子が含まれていた（図3b）。
　発現が低下したDEGのうち、ストリゴラクトン生合成遺伝子1（Strigolactone Biosynthesis1、OsSLB1）はシロイヌナズナ地上部の枝分かれに関与しているMAX1のオルソログであることから、イネの分げつ抑制に関与している可能性が推測された。これまでの研究から、ストリゴラクトン（SL）が主に根で合成され、求頂的に地上部へと向かうことで（Wang and Li et al. 2011）、イネの分げつを抑制しつつ草丈を伸ばすことが示唆されている（Liu et al. 2020）。そこで、根におけるOsSLB1遺伝子の発現を解析したところ、高温登熟させた植物ではその発現が約10分の1と顕著に抑制されていることがわかった（図3c）。加えて、OsSLB1の発現は、高温登熟させた植物の葉でも有意に抑制されていた（図3d）。
　発現が上昇したDEGの中には、シロイヌナズナのCONSTANのオルソログであり、イネでは出穂時期の制御に重要な役割を果たしている出穂関連遺伝子の「出穂期遺伝子1（Heading　date1）」（OsHd1）が見いだされた。高温登熟させた植物における早期出穂の表現型に関与する候補遺伝子を明らかにするために、イネの出穂制御に関与する遺伝子の発現ヒートマップを生成したところ（図3e）、高温登熟させた植物では、シロイヌナズナのCONSTANのオルソログである出穂期遺伝子1（OsHd1）の発現が上昇し、またこの遺伝子が、有意に上昇したDEG中にも見出されることが明らかになった。そこで、OsHd1と、その下流にあり、シロイヌナズナのFTのオルソログである「出穂期遺伝子3（Heading date3a）」（OsHd3a）の出穂前の発現量を確認した結果、高温登熟させた植物ではOsHd1とOsHd3a両方の発現が上昇し（図3f - g）、早期出穂を誘導することが明らかになった。
　これらのことから、OsSLB1の発現低下とOsHd1の発現上昇が、登熟期に高温ストレスを受けた次世代植物での分げつ促進及び早期出穂の発現型において、重要な役割を果たしている可能性が示された。
4.乾燥種子におけるDNAメチル化の変化は、成長中の器官でも維持されて転写制御に関わる
　ここまでの結果から、高温ストレスを受けた植物では、植物の成長過程におけるOsSLB1とOsHd1の転写変化が分げつと出穂それぞれの促進に関与していることが示され、これら遺伝子のプロモーターにおけるDNAのメチル化レベルの変化が、転写制御に重要な役割を果たしている可能性が予想された。そこで、乾燥種子と成長中の器官の両方におけるOsSLB1、OsHd1、OsHd3a遺伝子プロモーターのDNAのメチル化レベルを、遺伝子座特異的アンプリコンを用いたMeDIP-qPCR（メチル化DNA免疫沈降-qPCR）によって分析した。
　高温ストレスを受けた乾燥種子では、OsSLB1のプロモーター領域が有意に高メチル化され、OsHd1のプロモーター領域は有意に低メチル化されていることが示された（図4b、c）。また、高温登熟した植物の、最高分げつ期にある成長中の根では、OsSLB1のプロモーター領域で有意な高メチル化が観察され（図4e）、同時に、葉ではOsHd1プロモーター領域の有意な低メチル化が観察された（図4f）。しかし、OsSLB1プロモーターのメチル化レベルは、葉では対照と高温ストレス処理の間で差がなかった。なお、OsHd3aプロモーター自体のメチル化レベルには、乾燥種子と葉の両方で大きな変化は見られなかった（図4d、4g）。このことは、OsHd3aの転写上昇の原因は、そのDNAのメチル化状態自体ではなく、上流にあるOsHd1のメチル化状態にある可能性を示唆している。
　まとめると、これらのデータから、登熟期に高温ストレスを受けると、OsSLB1のプロモーターの高メチル化とOsHd1プロモーターの低メチル化が誘導されて分げつの増加と早期出穂の表現型が現れ、さらにそのDNAメチル化状態の一部は、乾燥種子から成長中の器官にまで維持されることが示唆された。
5.高温ストレスを受けた植物の後代は、登熟期に高温耐性を示す
　多くのDMRやDEGが非生物的ストレスへの応答や解毒に関与していることが見出されたことから、親植物が登熟期に高温ストレスに曝されると、そのような繰り返されるストレスに対処するために、ストレスの記憶が世代を渡って引き継がれるのではないかと考えた。そこで、高温ストレスを受けた植物の後代が登熟期に高温耐性を示すかどうかを観察するために、開花後、植物を対照-対照（25℃）、対照-高温処理（30℃）、高温処理-高温処理（30℃）の3群に分けた。前者と後者の温度はそれぞれ、親植物と次世代植物の登熟期の生育温度を指す。
　その結果、登熟期に高温ストレスを受けた植物では、SPAD値の低下を伴う止葉の老化促進が認められ、加えて、対照-対照植物と比較して、対照-高温処理植物では光合成速度の低下が観察された（図5a、b）。しかしながら、同じ高温ストレス条件でも、高温処理-高温処理植物は対照-高温処理植物に比べて、葉の老化が有意に遅れ、光合成速度も高かった（図5a、b）。このことから、高温ストレスに起因する葉の老化や光合成速度の低下が、高温処理-高温処理植物では抑制されていることが示唆された。
　イネでは、登熟時の高温ストレスにより、デンプン生合成遺伝子の発現低下とデンプン分解遺伝子の発現上昇が起こり、白未熟粒が発生して穀物の品質を低下させることが知られている（Hakata et al. 2012, Tanamachi et al. 2016, Suriyasak et al. 2017）。本研究では、収穫後の高温処理-高温処理植物では、対照-高温処理植物と比較して白未熟粒は有意に減少し（図5c、d）、全粒収量に変化はなかった。そこで、15DAFの発育種子におけるデンプン生合成遺伝子のOsAGPS2b（ADP-グルコースピロホスホリラーゼサブユニット　2b）とOsGBSSI（顆粒結合デンプン合成酵素）、OsSuSy2（スクロース合成酵素2）、及びデンプン分解遺伝子のOSAmy1A（α-アミラーゼ1A）とOSAmy3D（α-アミラーゼ3D）の発現量について調べたところ、対照-高温処理植物では、対照と比較して、デンプン生合成遺伝子の発現が有意に低下し、デンプン分解遺伝子の発現が有意に上昇していた（図5a）。一方、高温処理-高温処理植物では、高温ストレスによるデンプン生合成遺伝子の発現抑制とデンプン分解遺伝子の発現誘導は見られず、その結果、対照-高温処理植物と比較して、デンプン生合成遺伝子の発現が有意に高く、デンプン分解遺伝子の発現は低下した（図5a）。
　これらの結果は、高温処理-高温処理植物における葉の老化の遅延と、成熟途中の子実におけるデンプン代謝の転写変化が、高温ストレス下でより良い穀物品質をもたらす高温耐性に寄与したことを示唆しており、同様の現象は他の年に行った再現実験においても認められた。
　高温ストレスを受けた植物の後代が、繰り返される高温ストレス下でどのように転写レベルを変化させるのかを説明するために、乾燥種子と成熟途中の子実を用い、デンプン代謝遺伝子のプロモーター領域におけるMeDIP-qPCRを実施した。高温ストレスを受けた種子では、デンプン生合成遺伝子のプロモーターは有意に低メチル化されており、デンプン分解遺伝子のプロモーターは高メチル化されていた（図6a）。
　成熟途中の子実では、デンプン生合成遺伝子のメチル化レベルは対照-高温処理植物と高温処理-高温処理植物の間では変化がなかったにもかかわらず、デンプン分解遺伝子OSAmy3Dのプロモーター領域は高温処理-高温処理植物で有意に高メチル化が維持されていた（図6b）。
　まとめると、これらの結果は、登熟期に高温ストレスを受けると種子のDNAメチル化状態が変化して高温耐性が誘導され、繰り返される高温ストレス条件下でも穀物の品質が維持されることを示唆するものであった。
　なお、プロモーター領域のメチル化レベルに関し、MeDIP-qPCRによるDNAメチル化解析の数値データを下表に示す。
［考察］
　本研究の結果から、親植物が登熟期に高温ストレスを受けたイネの後代植物では、対照と比較して、分げつが促進され、草丈が短くなるなど、表現型に複数の変化が生じることが示された。植物ホルモンであるストリゴラクトンが、イネの分げつ促進と草丈の抑制に重要な役割を果たすことが、これまでの研究で明らかにされている（Wang and Li 2011）。本研究では、高温ストレスを受けた植物では、ストリゴラクトンの生合成がそのプロモーター領域の高メチル化によって阻害され、その結果、栄養成長期に分げつが促進され、草丈が抑制される可能性を示した。したがって、高温ストレス処理した植物で見られた草丈の低下は、分げつと垂直方向への成長との間の恒常性維持やエネルギーバランスによるものであった可能性がある。
　また、イネの枝分かれにおけるOsHd3aの別の機能を説明した研究がある。葉身で生成されたHd3aタンパク質は、葉の師部を通って頂端分裂組織に輸送され、腋芽の伸長に関わる（Tsuji et al. 2015）。このことから、高温ストレスを受けた植物では分げつの促進に影響を及ぼす出穂関連遺伝子の発現が上昇している可能性が示唆される。イネ科植物において、分げつは穀物生産を左右する重要な農学形質であることが知られている（Hussien et al. 2014）。本研究では、高温登熟させた植物では、主に、分げつ促進に起因する穂数の増加によって収量が増加したが、他の収量成分には対照と高温処理との間で差は見られなかった。穂数が増えることで1植物体当たりの小穂が多くなることは、植物の生殖戦略にとって有利になり、人間には収穫量の増加という面で貢献する可能性がある。
　また、高温ストレスを受けた植物は、止葉が短く厚くなるという表現型の変化を示した。このような葉の形態の変化が、対照-高温処理植物と比較して、高温ストレス下での葉の老化の遅延と光合成速度の向上をもたらした可能性がある。高温ストレス下のドクムギでは、葉の厚さと葉のH2O2含量の間に有意な負の相関が、厚さと光合成パラメーターの間に正の相関が観察されている（Soliman et al. 2015）。また、登熟期のクロロフィル量や光合成速度は、イネの収量や品質に影響を与える重要な因子である（Yang et al. 2015）。したがって、高温登熟によって引き起こされる止葉の構造特性の変化は、次世代の高温耐性を高め、穀物の品質を向上させるために重要な役割を果たすことが示唆された。現在までのところ、止葉の長さや厚さの制御に関わる候補遺伝子が同定されていないため、どの遺伝子がこの現象に関与しているかは不明であるが、遺伝子オントロジー解析で示された解剖学的構造に関連する遺伝子が、葉のこのような形態変化に寄与している可能性が考えられる。
　自然環境下で栽培した場合、開花期においては、高温ストレスを受けた植物は対照植物よりも早く出穂期に達した。イネでは通常、出穂前の高温はOsHd3aの発現上昇を介して早い出穂を誘導するが（Luan et al. 2009）、本研究でも同様の、世代を超えた現象が観察された。また別の研究では、生育地域ごとの温暖な気候と冷涼な気候が栄養成長期の水温の違いを生み、イネの後代植物の出穂日に影響を与えることが示されている（Koumoto et al. 2018）。出穂に関するエピジェネティックな制御については、DTH8-Hd1のOsHd3a遺伝子座への結合に対するヒストン修飾、H3K27me3の役割が提唱されているが（Du et al. 2017）、イネの出穂表現型に対する世代間を超えて受け継がれる誘導性DNAメチル化の関与については今もよくわかっていない。
　本研究の結果から、登熟期に高温ストレスを受けると、乾燥種子と葉ではOsHd1プロモーターの有意な低メチル化が引き起こされ、その結果、OsHd1そのものとその下流にあるOsHd3a遺伝子の発現が開花前に上昇することが示された。OsHd3aのプロモーター領域におけるメチル化レベルは対照と変わらないにもかかわらず、高温ストレスを受けた植物ではOsHd3a遺伝子の発現が有意に誘導された。このことから、OsHd1が世代を超えたDNAメチル化に重要な役割を果たしており、その下流にあるOsHd3aを制御し、それによってイネの出穂を誘導していると推測される。Hd1は短日条件下（SD）と長日条件下（LD）のそれぞれで、出穂を誘導する効果と抑制する効果の両方をもつことが分かっている（Liu et al. 2014）。そこで高温ストレスを受けた植物をSD及びLD条件下で栽培すると、その高いHd1発現によって、SDでは出穂が早まり、LDでは遅くなることを我々も観察した。これらのことから、OsHd1がイネにおいて、登熟期の高温ストレスによるDNAメチル化の変化を介して、日長依存的な出穂日の制御に重要な役割を担っている可能性が示唆された。
　シロイヌナズナでは、親が高温ストレスに曝された後代植物がFTの発現上昇により早咲きの表現型を示すことから、双子葉植物の開花日に対する高温ストレス誘導性の世代間効果の存在が示唆されている（Liu et al. 2019）。さらに、この世代を超える効果は熱ショック転写因子A2（HEAT SHOCK TRANSCRIPTION FACTOR A2、HSFA2）のH3K27me3によってエピジェネティックに制御されており、少なくとも連続した2世代にわたって高温ストレスの除去に働くことが分かっている（Liu et al. 2019）。また別の研究では、2世代前に受けた高温ストレスが、後代の開花日に影響を及ぼすことも報告されている（Groot et al. 2017）。本研究では、高温ストレスを受けた後、2世代（HCC）にわたって高温ストレスを除去した植物では、OsHd1及びOsHd3a遺伝子の発現が高温ストレス処理した植物と同レベルまで上昇しているとともに、早期出穂表現型を示すことを確認した。また、HCC植物のOsHd1プロモーターの低メチル化は、高温ストレスを受けた乾燥種子と同程度に維持されていた。したがって、高温ストレスによって誘導されるDNAメチル化を介した出穂日に関する世代間記憶は、その後、少なくとも2世代続けてストレスを除去すれば、長く維持されることが示唆された。しかし、何世代ストレス除去すれば世代間記憶が維持されるのかは現時点では不明であり、また、表現型の違いによってもストレス除去に必要な世代数が異なる可能性もあるため、さらなる研究が必要である。
　親植物が高温ストレスを受けた後代の植物は、その登熟時に高温耐性を獲得していることを示した。また、前述したような止葉の形態変化に加えて、デンプンの代謝に関わる遺伝子の転写変化も観察された。イネは高温に曝されると、デンプン分解遺伝子の発現上昇とデンプン生合成遺伝子の発現低下により、品質低下の主要因の1つである白未熟粒を生じる（Tanamachi et al. 2016, Yamakawa et al. 2007）。本研究では、乾燥種子において、デンプン生合成遺伝子とデンプン分解遺伝子がそれぞれ低メチル化及び高メチル化され、その結果、転写制御が促進されていることが観察された。しかし、高温処理-高温処理植物の成熟途中の種子で有意に維持されていたのは、OSAmy3Dの高メチル化のみであった。OsAmy3Dは高温ストレス下では腹側に発現することが知られており（Nakata et al. 2017）、そのプロモーターの高メチル化による著しい発現抑制が、高温処理-高温処理植物での膨張した白未熟粒を減少させ、結果として、全体の品質向上において重要な役割を果たすと予想された。
　以上のような表現型の変化から、登熟期に受けた高温ストレスによる網羅的なDNAメチル化の変化が、これらの現象において重要な役割を担っていると考えることができる。遺伝子のプロモーター領域におけるメチル化は、その転写制御に関連することが知られている（Zhang et al. 2006）。本研究では、遺伝子領域、特にプロモーターに最も多くのDMRが見出され、生育に伴う様々な転写変化に寄与している可能性が示唆された。また、DMRはTE領域、特に、様々な刺激に応答して遺伝子発現に影響を与えることが知られているレトロトランスポゾン（Galindo-Gonzalez et al. 2017）にも見られた。以上のことから、本研究は、イネの世代間記憶におけるDNAメチル化の役割を提唱するものであるが、TE制御やヒストン修飾などの他のエピジェネティックな目印に関しては、今後さらに明らかにしていく必要がある。
　結論として、本研究は、登熟期の高温ストレスは、種子で生じる網羅的なDNAメチル化を通じて後代植物の表現型の変化に大きな影響を与え、その一部が生育中の器官では特定の遺伝子座に維持されて、転写制御に関わっていることを提唱するものである。観察された表現型の変化のうち、分げつの増加による収穫期の収量の増加や高温耐性の獲得による穀物品質の向上は、イネ生産に有利な形質であり、人類に多大な利益をもたらすと考えられる。
　本研究で明らかになったことは、植物自身の「エピジェネティックな記憶（エピ記憶、epi-memory）」を利用する、様々な植物種や様々な非生物的ストレスに関する遺伝子組み換えを使わない持続可能な農業に応用できると推測される。そして本研究が、近未来の気候変動に適応した世界の農業生産向上のための、さらに興味深く、洞察に満ちた研究を行うための新たな光明となることを期待する。
＜コムギ＞
　コムギ（Triticum aestivum L. cv. Shiroganekomugi）を栽培した。処理温度を15、20、及び25℃とした以外は、通常の場合と同様に、また、イネの場合に準じて栽培した。
　結果を図7及び8に示す。コムギの場合もイネと同様の結果が得られた。
＜低窒素条件下における高温記憶種子のバイオマス増加＞
［材料及び方法］
　発芽したイネ（Oryza sativa L. cv. Nipponbare、以下の実験でも、特に記載した場合を除き、同品種を用いた。）の種子を砂に播種し、葉の3枚ステージに乾物を測定した。肥料条件は、窒素は与えずに播種時に塩化カリ（カリウム60％）は2.27 g/L、過リン酸石灰（リン17.5％）は7.77 g/Lになるように水で調製し、植物１個体当たりに１mLずつ加えた。なお、通常は、この条件に硫酸アンモニウム（窒素21％）6.48g/Lを、植物１個体当たりに１mLを加える。
［結果］
　低窒素条件下において、高温を記憶した種子（登熟期に高温ストレス処理を施した（Suriyasak et al. 2020）種子をいう。以下の実験でも、高温を記憶した種子というときは、特に記載した場合を除き、これを指す。）は地上部と地下部の長さ、及び乾物の増加が見られた。高温種子の植物は対照区と比べて全体的の乾物の重量が70％増加した（図9）。
＜高温ストレス件下における高温記憶種子の高温耐性獲得＞
［材料及び方法］
　平等に発芽したイネの種子を播種し、インキュベーター内で35℃の高温ストレスを与え、発芽した芽の成長を測定した。また、発芽して4週間たったイネに35℃の高温ストレスを与え、高温の影響をFLIR C2 (FLIR System AB, Sweden)サーモグラフィーカメラで解析した。
［結果］
　高温記憶した種子（HDS）から育った植物体は対照区（CS）より35℃の高温ストレス条件下で成長することができ、蒸散をたくさんし、ストレス耐性を獲得することが明らかになった。（図10）。
＜オオムギ・レタス・ササゲ・ダイズ＞
［材料及び方法］
　単子葉のオオムギ(Hordeum vulgare L. cv. Ichibanboshi)を栽培した。処理温度（登熟期に高温ストレスを与えるための温度）を15、20、及び25℃と設定した。双子葉はレタス (Lactuca sativa) を栽培し、高温区を、品種チマサンチュは25℃、品種レッドファイアーは30℃と設定した。ササゲ (Vigna unguiculata cv. IT98K-205-8)の処理区温度を25℃（Control）及び30℃（ Heat(D)、Heat(I)）に設定し、有限伸育（Heat(D)）又は無限伸育（Heat(I)）で栽培した。ダイズ(Glycine Max (L.) Merr.cv. Fukuyutaka)は処理温度を25℃と30℃に設定した。
［結果］
　単子葉、及び双子葉の作物について、イネと同様の結果が得られた（図12～14）。
＜実施例の項で引用した文献＞
　Suriyasak, C. et al. Mechanism of delayed seed germination caused by high temperature during grain filling in rice (Oryza sativa L.). Sci. Rep. 10, 17378 (2020).（前掲非特許文献２）
　Tanamachi, K. et al. Differential responses to high temperature during maturation in heat-stress-tolerant cultivars of Japonica rice. Plant Prod. Sci. 19, 300-308 (2016).
　Liu, X. et al. ζ-Carotene isomerase suppresses tillering in rice through the coordinated biosynthesis of strigolactone and abscisic acid. Mol. Plant 13, 1784-1801 (2020).
　Hakata, M. et al. Suppression of α-amylase genes improve quality of rice grain ripened under high temperature. Plant Biotechnol. J. 10, 1110-1117 (2012).
　Suriyasak, C. et al. Reactive oxygen species induced by heat stress during grain filling of rice (Oryza sativa L.) are involved in occurrence of grain chalkiness. J. Plant Physiol. 216, 52-57 (2017).
　Wang, L. & Li, J. Branching in rice. Curr. Opin. Plant Biol. 14, 94-99 (2011).
　Tsuji, H. Hd3a promotes lateral branching in rice. Plant J. 82, 256-266 (2015).
　Hussien, A. et al. Genetics of tillering in rice and barley. Plant Genome 7, 1-20 (2014).
　Ishimaru, T. et al. Formation of grain chalkiness and change in water distribution in developing rice caryopses grown under high-temperature stress. Journal of Cereal Science, 50, 166-174.10.1016/j.jcs.2009.04.011
　Zheng, X. et al. Transgenerational epimutations induced by multi-generation drought imposition mediate rice plant’s adaptation to drought condition. Sci. Rep. 7, 39843 (2017)
　Soliman, W. S. et al. Heat tolerance and suppression of oxidative stress: Comparative analysis of 25 cultivars of the C3 grass Lolium perenne. Environ. Exp. Bot. 78, 10-17 (2015).
　Yang, Y. et al. PGL, encoding chlorophyllide a oxygenase 1, impacts leaf senescence and indirectly affects grain yield and quality in rice. J. Exp. Bot. 67, 1297-1310 (2016).
　Luan, W. et al. The effect of the crosstalk between photoperiod and temperature on the heading-date in rice. PLoS One 4, e5891 (2009).
　Du, A. et al. The DTH8-Hd1 module mediates day-length-dependent regulation of rice flowering. Mol. Plant 10, 948-961 (2017).
　Koumoto, T. et al. Transgenerational effect of maternal growth environment on flowering date in rice (Oryza sativa L.). Environ. Exp. Bot. 155, 307-312 (2018)
　Liu, X. et al. The rice enhancer of zeste [E(z)] genes SDG711 and SDG718 are respectively involved in long day and short day signaling to mediate the accurate photoperiod control of flowering time. Front. Plant Sci. 5, DOI:10.3389/fpls.2014.0059 (2014).
　Liu, J. et al. An H3K27me3 demethylase-HSFA2 regulatory loop orchestrates transgenerational thermomemory in Arabidopsis. Cell Res. 29, 379-390 (2019).
　Yamakawa, H., Hirose, T., Kuroda, M. & Yamaguchi, T. Comprehensive expression profiling of rice grain filling-related genes under high temperature using DNA microarray. Plant Physiol. 144, 258-277 (2007).
　Nakata, M. et al. High temperature-induced expression of rice α-amylase in developing endosperm produces chalky grains. Front. Plant Sci. 8, 2089 (2017). 
　Zhang, X. et al. Genome-wide-high-resolution mapping and functional analysis of DNA methylation in Arabidopsis. Cell 126, 1189-1201 (2006).
　Galindo-Gonzalez, L. et al. LTR retrotransposons in plants: Engines of evolution. Gene 626, 14-25 (2017).
＜配列表に記載した配列＞
SEQ ID NO:1. OsSLB1:proP1 
SEQ ID NO:2. OsSLB1:proP2
SEQ ID NO:3. OsSLB1:proP3
SEQ ID NO:4. OsHd1:proP1
SEQ ID NO:5. OsHd1:proP2
SEQ ID NO:6. OsHd1:proP3
SEQ ID NO:7. OsHd3a:proP1
SEQ ID NO:8. OsHd3a:proP2
SEQ ID NO:9. OsAGPS2b:pro
SEQ ID NO:10. OsGBSSI:pro
SEQ ID NO:11. OsSuSy2:pro
SEQ ID NO:12. OsAmy1A:pro
SEQ ID NO:13. OsAmy3D:pro
　本発明により、環境ストレス耐性を高めた農作物生産用種子の生産を行うことができ、農業、農作物の工業的生産等の分野で有用である。本発明は、高収量性・早生性農作物の生産、工場生産用の種子の生産、工場での農作物の生産、農作物・種子の生産システムの構築のための利用が期待できる。

Claims (12)

  1. 　SLB1遺伝子、Hd1遺伝子、AGPS2b遺伝子、GBSSI遺伝子、SuSy2遺伝子、AMy1A遺伝子、及びAmy3D遺伝子からなる群より選択されるいずれかの遺伝子の、メチル化レベルが有効に制御されたプロモーターを有する、植物の種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品。
  2. 　プロモーターが、SLB1遺伝子、AGPS2b遺伝子、GBSSI遺伝子、及びSuSy2遺伝子からなる群より選択されるいずれかの遺伝子の、高メチル化プロモーターである、請求項１に記載の種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品。
  3. 　プロモーターが、Hd1遺伝子、AMy1A遺伝子、及びAmy3D遺伝子からなる群より選択されるいずれかの遺伝子の、低メチル化プロモーターである、請求項１に記載の種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品。
  4. 　プロモーターが、SLB1遺伝子P2プロモーターである、請求項２に記載の種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品。
  5. 　植物がイネ科植物であり、相対メチル化レベルが1.6 % input以上である、請求項４に記載の種子、若しくはその製品、又はそれから得られた収穫物、若しくはその加工品。
  6. 　有用な特徴を有する植物の種子の生産方法であって：
    第１世代の植物を環境ストレス下で栽培する工程；
    栽培された植物又はその子孫から、環境ストレスが記憶された種子を得る工程
    を含む、生産方法。
  7. 　環境ストレスの記憶が、Heading date 1(Hd1)遺伝子のプロモーター領域におけるDNAのメチル化レベルの変化である、請求項６に記載の生産方法。
  8. 　環境ストレスが、種子が発育する時期の温度ストレス、又は低窒素ストレスである、請求項６に記載の生産方法。
  9. 　植物がイネ科植物であり、有用な特徴が、バイオマスの増加、開花促進、子実収量増加、高温登熟耐性の付与、低窒素耐性の付与、早生性からなる群より選択されるいずれかである、請求項６から８のいずれか１項に記載の生産方法。
  10. 　植物がイネ科植物であり、有用な特徴が、分げつ数の増加、単位面積当たりの収量の増加、出穂期の早化、白未熟粒の発生率からなる群より選択されるいずれかである、請求項６から９のいずれか１項に記載の生産方法。
  11. 　植物がイネ科、マメ科、又はキク科に属する植物であり、環境ストレスが、種子が発育する時期の温度ストレス
    である、請求項６から８のいずれか１項に記載の生産方法。
  12. 　植物がイネであり、環境ストレスが、種子が発育する時期の高温ストレスであり、高温ストレスが、出穂後６週間以上、その時期の平均気温より５℃以上高い環境温度で栽培することである、請求項６から９のいずれか１項に記載の生産方法。
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