CN111518944A

CN111518944A - 辣椒细胞质雄性不育恢复基因相关InDel标记D6-26、特异性引物及其应用

Info

Publication number: CN111518944A
Application number: CN202010471435.XA
Authority: CN
Inventors: 张正海; 王立浩; 张宝玺; 曹亚从; 于海龙; 安栋梁; 朱砚姝
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2020-05-29
Publication date: 2020-08-11
Anticipated expiration: 2040-05-29
Also published as: CN111518944B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关InDel标记D6‑26、特异性引物和应用。本发明的辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关InDel标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，SEQ ID No.1所示序列的第64位碱基C后或插入4个碱基ATCT。本发明不需通过辣椒测交和育性表型鉴定，只是利用待测材料的DNA进行PCR和聚丙烯凝胶电泳检测，就可以判断该辣椒材料为保持系还是恢复系，可以广泛应用于分子标记辅助育种。

Description

辣椒细胞质雄性不育恢复基因相关InDel标记D6-26、特异性引物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关InDel标记D6-26、特异性引物和应用。

背景技术

辣椒是我国重要的蔬菜作物，生产上应用的辣椒品种，其中90％以上为杂交一代，主要采用人工去雄授粉杂交，制种成本较高，且往往存在纯度风险，利用辣椒雄性不育系制种是解决此问题的一条有效途径。

利用辣椒细胞核核雄性不育系配制杂交种可以省去人工去雄环节，但母本群体中约有一半的可育株须在花期拔除，一定程度上造成了田地浪费，并影响单产。而选用辣椒细胞质雄性不育系做母本，母本群体中全部为不育植株，较细胞核雄性不育系利用具有成本和产量优势。

辣椒以果实为产品，通常情况下良好的授粉、受精是辣椒果实发育的前提条件，若受精不良，则不能坐果，或者果实不能膨大至正常水平，严重影响辣椒品质和产量。因此，稳定的恢复系的选育就成为辣椒细胞质雄性不育三系育种的关键。恢复系转育过程中需要表型选择、回交和测交评价，转育出目标性状优良的稳定恢复系也比较费时、费力。

研究表明，不同的辣椒细胞质雄性不育恢复系，其恢复基因可能不同。虽然目前已经开发了大量与辣椒细胞质雄性不育恢复性相关的分子标记，但这些分子标记都存在标记和表型不一致以及低适用性等问题。因而针对不同恢复系材料，开发与其恢复基因紧密连锁的分子标记，有助于提高分子标记辅助选择辣椒细胞质雄性不育恢复系的效率和效果。

发明内容

本发明的目的在于提供辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关InDel标记D6-26。

本发明的再一目的在于提供上述InDel标记D6-26PCR的特异性引物。

本发明的再一目的在于提供上述InDel标记D6-26的应用。

本发明的再一目的在于提供筛选辣椒细胞质雄性不育恢复系的方法。

根据本发明具体实施方式的辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关InDel标记D6-26，所述InDel标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其中，SEQ ID No.1所示序列的第64位碱基C后或插入4个碱基ATCT。

SEQ ID No.1

CTACTGGTGGGTTATAGTAGGCGCCATCATGTCCTGAAAAGTTGGGTCGTGACACTATCTCTT[CATCT/C]

ATCTTTCTTAAGAGTAAATAATGAATAGTCGTGAATACTTTGACAAAAACTAGCATCTAAAAGGGAAGA

C碱基位于参考基因组CM334 v1.55第4677900位。

根据本发明具体实施方式的辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关InDel标记D6-26的特异性引物的序列如下：

上游引物:5′-CTACTGGTGGGTTATAGTAGGC-3′，

下游引物:5′-TCTTCCCTTTTAGATGCTAGTT-3′，

本发明还提供辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关InDel标记的应用，尤其是在辣椒分子标记辅助育种中的辣椒细胞质雄性不育恢复系筛选中的应用。

根据本发明具体实施方式的筛选辣椒细胞质雄性不育恢复系的方法，所述方法包括应用上述InDel标记筛选辣椒细胞质雄性不育恢复基因的步骤。

根据本发明具体实施方式的鉴定筛选辣椒细胞质雄性不育恢复系的方法，当所述辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关InDel标记的特异性引物的PCR扩增产物经聚丙烯凝胶电泳后获得133-bp片段时，则待测辣椒材料为纯合基因型“恢复系”；获得133-bp和137-bp两条片段时，则待测辣椒材料为杂合基因型“恢复系”；，得137-bp片段时，则待测辣椒材料为“保持系”。

本发明的有益效果：

本发明不需通过辣椒测交和育性表型鉴定，只是利用待测材料的DNA进行PCR和聚丙烯凝胶电泳检测，就可以判断该辣椒材料为保持系还是恢复系，可以广泛应用于分子标记辅助育种。

本发明提供的分子标记实现了在苗期筛选辣椒恢复材料，大大缩短了育种时间，节约了人力、物力。利用本发明的特异性引物并采用PCR产物聚丙烯凝胶电泳分型技术，获得133-bp片段时，则待测辣椒材料为纯合基因型“恢复系”；获得133-bp和137-bp两条片段时，则待测辣椒材料为杂合基因型“恢复系”；，得137-bp片段时，则待测辣椒材料为“保持系”。通过该分子标记可进行辣椒恢复系的分子标记辅助选择和转育，提高了育种效率。

附图说明

图1显示InDel标记D6-26在2个恢复系及其杂交组合中的扩增情况，其中，137-bp为保持系扩增结果；133-bp为恢复系扩增结果；F₁为杂合型。

图2显示InDel标记D6-26在13个辣椒材料中的扩增结果，其中，rfrf为保持系单株；RfRf为恢复系纯合单株；Rfrf为恢复系杂合单株。

图3显示InDel标记D6-26在41株77013A×0601M回交后代材料中的扩增结果，其中，rfrf为雄性不育单株；RfRf为雄性可育纯合单株；Rfrf为雄性可育杂合单株。

具体实施方式

本发明涉及的辣椒材料如下：77013A、83-163、IVF2000080、0601M、75-7-3-1、TOM4、7714、猪大肠、南京早椒、Numex R-Naky、CM334、RP4、IVF2014043、9825M、RP38。

实施例1辣椒细胞质雄性不育恢复基因相关的InDel标记D6-26及其应用

1.试验材料

以辣椒77013A为母本，分别以辣椒CM334(Kim，S，ParkM，YeomS-I，etal.2014.Genome sequence ofthe hot pepper provides insights into theevolution ofpungency in Capsicum species.Nat Genet，46：270–278.)和0601M为父本与其杂交获得F₁代试验材料。

2.表型鉴定

对上述各辣椒材料恢复性的表型鉴定采用测交法，在材料生长季节，通过肉眼观察F₁代10个单株不同部位花朵的花药是否有花粉散出判断育性。对于肉眼难于判断的植株，进一步利用醋酸洋红染色法观察花粉的有无。另外在生长季结束后，再次根据植株上果实的有无，以及果实内种子的有无判断可育和不育表型。

鉴定结果表明，2个杂交组合后代各单株均有大量花粉散出，各单株正常坐果，果实发育正常，2个父本材料为细胞质雄性不育恢复材料。

3.辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关的InDel位点及其PCR引物的确定

(1)基因组重测序和分子标记设计

对77013和0601M基因组进行重测序，以CM334为参考基因组，确定样本中的InDel位点，并设计相应的PCR引物。

上游引物:5′-CTACTGGTGGGTTATAGTAGGC-3′，

下游引物:5′-TCTTCCCTTTTAGATGCTAGTT-3′，

(2)多态性InDel标记的筛选

采用CTAB法提取辣椒基因组DNA，提取到组织DNA用Biospec-nano微量分光光度计测定浓度和质量，将浓度稀释至100ng/μl，进行PCR扩增，PCR扩增产物通过聚丙烯凝胶电泳进行分析。在点样孔内加入1.5μl的PCR产物，同时在凝胶两端加入100bp的DNAMarker。凝胶在电压220V，电流180mA条件下电泳80min。电泳结束后用染色液染色3min；随后用显色液使电泳条带显示出来。

图1显示了InDel标记D6-26在2个恢复系杂交组合中的扩增情况。利用2个不同的杂交组合进行多态性筛选，从恢复系CM334和0601M中扩增到133-bp条带，从不育系77013A中扩增到137-bp条带，从F₁代中扩增出133-bp和137-bp两条带，结果表明InDel标记D6-26为共显性标记，与辣椒恢复基因相关。

实施例2利用标记D6-26从自然群体中筛选辣椒细胞质雄性不育恢复材料

选用13份辣椒材料，使用D6-26标记进行PCR扩增。实验结果见表1、图2、所示。图2显示D6-26标记在13个辣椒材料中的扩增结果，其中，rfrf为保持系单株；RfRf为恢复系纯合单株；Rfrf为恢复系杂合单株。结果表明，当供试辣椒为“恢复系”时，分子标记D6-26对应的PCR扩增条带均为133-bp；当供试辣椒为“保持系”时，分子标记D6-26对应的PCR扩增条带为137-bp。因此，本发明标记D6-26可以用来从自然群体中辅助筛选辣椒细胞质雄性不育恢复材料。

表1分子标记D6-26在辣椒自然群体中的分型情况

实施例3利用标记D6-26对77013A×0601M回交后代进行基因型分析并选择含有恢复基因的可育材料。

选用41株77013A×0601M回交后代育性分离材料，经可育性表型鉴定和使用D6-26标记进行PCR扩增。图3显示了InDel标记D6-26在48个77013A×0601M回交后代材料中的扩增结果，其中，扩增出137-bp条带的植株为隐性纯合基因型rfrf，表现为雄性不育，共19株；扩增出133-bp条带的植株为显性纯合基因型RfRf，表现为雄性可育，共1株；扩增出137-bp和133-bp两条带的植株为杂合基因型Rfrf，表现为雄性可育，共21株。结果表明此回交后代的可育性与D6-26标记基因型共分离，利用D6-26标记可实现标记辅助恢复基因的回交转育。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 辣椒细胞质雄性不育恢复基因相关InDel标记D6-26、特异性引物及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 133

<212> DNA

<213> 辣椒(Capsicum annuum)

<220>

<221> allele

<222> (64)..(64)

<223> CATCT

<400> 1

ctactggtgg gttatagtag gcgccatcat gtcctgaaaa gttgggtcgt gacactatct 60

cttcatcttt cttaagagta aataatgaat agtcgtgaat actttgacaa aaactagcat 120

ctaaaaggga aga 133

Claims

1.辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关InDel标记D6-26，其特征在于，所述InDel标记D6-26的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其中，SEQ ID No.1所示序列的第64位碱基为CATCT或C。

2.权利要求1所述的辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关InDel标记D6-26的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的序列如下：

上游引物:5′-CTACTGGTGGGTTATAGTAGGC-3′，

下游引物:5′-TCTTCCCTTTTAGATGCTAGTT-3′。

3.权利要求1所述的辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关InDel标记D6-26的应用。

4.权利要求1所述的辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关InDel标记D6-26在辣椒分子标记辅助育种中的应用。

5.权利要求1所述的辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关InDel标记D6-26用于筛选辣椒细胞质雄性不育恢复系的应用。

6.筛选辣椒细胞质雄性不育恢复系的方法，其特征在于，所述方法包括应用权利要求1所述的辣椒细胞质雄性不育恢复性状相关InDel标记D6-26筛选辣椒雄性不育恢复基因的步骤。

7.根据权利要求6所述的鉴定筛选辣椒细胞质雄性不育恢复系的方法，其特征在于，使用以下特异性引物进行PCR扩增，所述特异性引物的序列如下：

上游引物:5′-CTACTGGTGGGTTATAGTAGGC-3′，

下游引物:5′-TCTTCCCTTTTAGATGCTAGTT-3′。

8.根据权利要求7所述的鉴定筛选辣椒细胞质雄性不育恢复系的方法，其特征在于，

当PCR产物经聚丙烯凝胶电泳后获得133bp片段时，则待测辣椒材料为纯合基因型恢复系；

当PCR产物经聚丙烯凝胶电泳后获得133bp和137bp两条片段时，则待测辣椒材料为杂合基因型恢复系；

当PCR产物经聚丙烯凝胶电泳后获得137bp片段时，则待测辣椒材料为保持系。