KR100413514B1

KR100413514B1 - 역병 병원균 진단용 디엔에이 표지인자

Info

Publication number: KR100413514B1
Application number: KR10-2000-0033967A
Authority: KR
Inventors: 이윤수; 김경수
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2000-06-20
Filing date: 2000-06-20
Publication date: 2004-01-13
Also published as: KR20020000043A

Abstract

본 발명은 역병 병원균 진단용 DNA 표지인자에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 감자 또는 토마토 역병의 원인균인 파이토프쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans)의 존부를 검출하기 위한 ITS-3와 PISP-1 프라이머쌍(Pair primer)으로 이루어진 역병 병원균 진단용 DNA 표지인자에 관한 것이다. 따라서, 이러한 본 발명에 따른 역병균의 진단방법은 10pg의 역병균 DNA 양으로도 검출할 수 있을 정도로 매우 민감하고 특이성이 뛰어나 종서 유출 단계에서 육안으로 관찰되지 않는 이병된 종서 구분이 가능할 뿐 만 아니라, 감자 생육 기간 중 수시로 샘플을 채취해 감염여부를 확인할 수 있어 병의 확산 방지와 조기 방제가 가능한 효과가 있다.

Description

역병 병원균 진단용 디엔에이 표지인자{A DNA marker for Phytophthora infestans in Potato and Tomato}

본 발명은 역병 병원균 진단용 DNA 표지인자에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 감자 또는 토마토 역병의 원인균인 파이토프쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans)의 존부를 검출하기 위한 ITS-3와 PISP-1 프라이머쌍(Pair primer)으로 이루어진 역병 병원균 진단용 DNA 표지인자에 관한 것이다.

일반적으로, 감자(Solanum tuberosumL.)와 토마토(Lycopersicon esculentumMill.)에 역병을 일으키는 원인균으로는 파이토프쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans(Mont.) de Bary)가 있으며, 이는 전형적인 난균강(Oomycetes)에 속하는 병원균으로 공기 전염하는 분생포자에 의해 폭발적인 전염력을 가지고 있어서 전세계적으로 감자와 토마토가 재배되는 곳에서는 대발생의 가능성이 잠재하고 있다. 이러한 예로, 1845 ∼ 1846년 사이에 발생했던 아일랜드 대기근(Irish Potato Famine)은 유사이래 식물병에 의해 발생한 가장 큰 재난으로 기록되고 있으며, 그 결과, 주식이 감자인 아일랜드에서는 감자 역병의 대발생에 의한 흉작으로 이 기간동안 100만명 이상이 굶어죽고 150만 명이 식량을 찾아 북미 대륙으로 이주하게 되었다. 물론, 우리 나라의 경우도 역병은 감자 재배에 있어서 가장 큰 생산 제한 요소들 중의 하나로 우리나라 주요 감자 생산지인 강원도 고령지를 중심으로 하여 전국의 감자 재배 지역에서 매년 발생하여 심한 피해를 초래하고 있다. 또한, 저장 중에 발병하는 감자역병 병원균의 경우에는 괴경 중에서 균사 상태로 월동하므로 진단이 매우 어렵고, 포장에서의 경우 발병을 조기에 진단하지 못해 방제시기를 놓치거나 방제비용이 많이 소요되며 이로 인해 생산성이 낮은 실정이다. 그리고, 시설 및 노지에서 대량 재배되고 있는 토마토의 경우도 빈번히 발생하는 역병균을 조기에 진단하여 방제 비용을 경감 할 수 있는 기술이 개발되어 있지 않은 상황이다.

따라서, 그와 같은 감자와 토마토에 치명적인 역병 방제를 위한 기존의 방법은 이미 병이 확산된 경우 또는 재배 환경상 병 발생 우려가 있을 경우에 살균제를 통한 구제가 주로 이루어 졌다. 그러나, 감자 역병이 이미 확산된 경우는 농약 살포량과 비용에 있어 큰 타격을 초래하며 또한 육안으로 관찰되지 않는 식물 지하부 괴경은 이미 역병균에 피해를 입은 상태여서 구제하기에는 더욱 난해한 문제점이 있어 왔다. 또한, 재배 환경상 병 발생을 우려해 농약을 조기에 살포하는 경우는 환경과 국민건강 측면에서 뿐만 아니라, 적절한 농약 선택면에서도 비효율적이라 할 수 있다. 그러므로, 이러한 역병균을 보다 조기에 진단할 필요성이 대두되었으나, 과거에는 보통 형태학적 관점에서의 연구를 통해 이를 해결하고자 하였다. 그러나, 파이토프쏘라(Phytophthora)를 포함한 몇몇 속의 경우, 분리 동정을 위한 뚜렷한 형태학적 특징보다는 서로간에 공유하고 있는 특징이 더 많이 존재하기 때문에 정확한 동정을 위해서는 많은 시간적 소요와 노력이 수반되어야 하는 문제점이있었으며, 게다가 대부분의 경우 육안으로 관찰 가능한 단계에서 식물체에서의 병원균 진단이 이루어지므로 이미 병이 확산된 상태이기 때문에 효과적인 병 방제가 미흡한 문제점이 있어 왔다. 또한, 상기와 같은 문제점을 개선시키기 위하여 PCR 기법과 같은 분자 생물학적 기법으로 ITS 지역의 염기서열 분석을 통해 역병균을 검출하는 방법이 보고된 바 있다[참조: Tooleyet al, USA]. 그러나, 이 방법은 파이토프쏘라 인페스탄스 뿐 만 아니라 표1에 제시한 파이토프쏘라 칵토럼에도 반응함을 보여 종 동정과 특이성에서 미흡함을 보였다[참조: Troutet al, USA] 또한 기존에 개발된 프라이머는 본 연구자가 개발한 PISP-1 보다 프라이머 자체 안정 속성에 약세를 보유한다. 따라서 PISP-1 은 감자 또는 토마토 역병의 병원균인 파이토프쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans)를 정확하고 신속하게 진단하기 위해 민감도와 특이성을 높혀 조기진단 효율을 높이고 진단에 필요한 소요작업 시간을 단축시켜야 하는 필요성이 절실히 대두되었다.

이에, 본 발명의 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 예의 연구 노력한 결과, ITS3 프라이머(GCATCGATGAAGAACGCAGC)와 ITS4 프라이머(TCCTCCGCTTTATTGATATGC)를 이용하여 ITS(internal transcribed spacer) II 지역을 PCR로 증폭한 다음, 염기 서열을 밝힌 후 DNA STAR 프로그램을 이용하여 감자 및 토마토 역병균에만 특이적으로 반응하는 프라이머를 제작하고, 이들 프라이머를 이용하면 목적하는 역병의 원인균에서만 특이적으로 PCR 증폭산물을 얻을 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 서열번호 1의 ITS-3와 서열번호 3의 PISP-1 프라이머 쌍(Pair primer)으로 이루어진 역병 병원균 진단용 DNA 표지인자를 제공하는 데 있다.

도 1은 파이토프쏘라 종(Phytophthoraspecies)으로부터 rDNA를 증폭시키는데 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 위치를 나타내는 rDNA 반복단위의 유전자지도를 나타낸 것이다.

도 2는 파이토프쏘라 인페스탄스(P. infestans)만을 특이적으로 검출하기 위해 ITS-3와 PISP-1을 프라이머쌍으로 이용하여 증폭된 453bp의 전기영동 사진을 나타낸 것이다.

도 3은 파이토프쏘라 인페스탄스(P. infestans) 분리균 P9829로부터 클론된 ITS II 지역을 함유한 라벨표지된 pGEMT-이지 벡터와의 써던 혼성화(Southern hybridization)의 결과이다.

도 4는 ITS-3와 PISP-1 프라이머를 이용하여 파이토프쏘라 인페스탄스(P. infestans)의 주형 DNA의 양에 따른 프라이머의 민감도(Sensitivity)를 나타낸 전기영동 사진을 나타낸 것이다. Lane M; Gibco 1kb plus ladder, 1; control (no DNA), 2; 100 ng, 3; 10 ng, 4; 1 ng, 5; 800 pg, 6; 600 pg, 7; 400 pg, 8; 200 pg, 9; 100 pg, 10; 80 pg, 11; 60 pg, 12; 40 pg, 13; 20 pg, and 14; 10 pg.

도 5는 ITS-3와 PISP-1 프라이머를 이용하여 감염 조직부위에 따른 파이토프쏘라 인페스탄스(P. infestans)의 검출을 나타낸 전기영동 사진을 나타낸 것이다.

도 6은 ITS-3와 PISP-1 프라이머를 이용하여 교잡형태(mating type) 및 메탈락실(metalaxy)에 대한 민감성 정도에 따른 파이토프쏘라 인페스탄스(P. infestans)의 검출여부를 비교한 전기영동 사진을 나타낸 것이다.

이하, 이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 하기 서열번호 1의 ITS-3와 서열번호 3의 PISP-1 프라이머 쌍(Pair primer)으로 이루어진 역병 병원균 진단용 DNA 표지인자로서, 감자 또는 토마토 역병의 원인균인 파이토프쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans)를 보다 정확하고 신속하게 검출하기 위한 진단용 DNA 표지에 관한 것이다.

[탄저병 진단용 DNA 표지인자의 제작]

하기 표 1에 제시한 수종의 곰팡이와 세균의 게놈 DNA를 추출한 후, ITS3 프라이머(GCATCGATGAAGAACGCAGC)와 ITS4 프라이머(TCCTCCGCTTTATTGATATGC)를 이용하여 ITS(internal transcribed spacer) II 지역을 PCR을 이용하여 증폭한다(도 1 참조). 그런 다음, 증폭된 PCR 산물을 pGEM -T 이지벡터(easy vector)에 클로닝하고 시퀀싱(sequencing)을 통해 염기 서열을 밝힌 후, 하기 도 1의 유전자 지도에서 ITS Ⅱ 지역의 서열을DNASTAR프로그램을 이용하여 배열시켜 감자 및 토마토 역병균에만 특이적으로 반응하는 프라이머를 제작한다. 그 결과, 서열번호 3과 같은 PISP-1 프라이머(5'-AATGCCAAGCTAAAGAGCCA-3')를 제작하고, 이 프라이머와 ITS3 프라이머를 각각 역방향 및 순방향 프라이머로 이용하여 감자 또는 토마토 역병의 원인균인 파이토프쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans)를 보다 정확하고 신속하게 검출하기 위한 진단용 DNA 표지로서 사용한다.

파이토프쏘라 인페스탄스(P. infestans)의 종-특이적 검출을 위해 이용된 곰팡이분리균주

번호	병원균	숙 주	번호	병원균	숙 주
1	P. infestans	Lycopersicon esculentumMILL.	12	P. citricola	Zizyphus jujubaMILL.
2	P. infestans	Lycopersicon esculentumMILL.	13	P. cryptogea	Brassica campestrissubsp.
3	P. infestans	Lycopersicon esculentumMILL.	14	P. capsici	Capsicum annuumL.
4	P. infestans	Solanum tuberosumL.	15	P. capsici	Capsicum annuumL.
5	P. infestans	Solanum tuberosumL.	16	Fusarium oxysporum	Cucumis sativusL.
6	P. infestans	Solanum tuberosumL.	17	Fusarium oxysporum	-
7	Phytophthorasp.	-	18	Rhizoctonia solani	Solanum tuberosumL.
8	P. megasperma	Lycopersicon esculentumMILL.	19	Rhizoctonia solani	Solanum tuberosumL.
9	P. sojae	Glycine maxMERR.	20	Erwinia carotovorasubsp.atroseptica	Solanum tuberosumL.
10	P. cactorum	-	21	Erwinia carotovorasubsp.atroseptica	Capsicum annuumL.
11	P. cinnamomi	-	22	Pseudomonas solanacearum	Solanum tuberosumL.

감자 생체 조직에 따른 파이토프쏘라 인페스탄스(P. infestans)의 검출.

번호	조직별 DNA 추출 부위
m	marker XVII (Boehringer Mannheim, Germany)
1	no DNA
2	비 감염된 건전한 괴경
3	비 감염된 건전한 잎
4	인위적으로 감염시킨 괴경, 역병 중심부위
5	인위적으로 감염시킨 괴경, 역병 중심에서 약간 벗어난 부위
6	인위적으로 감염시킨 괴경, 역병 가장자리 부위
7	인위적으로 감염시킨 괴경, 역병 가장자리 밖의 희미한 부위
8	인위적으로 감염시킨 괴경, 역병증상을 보이지 않는 괴경 부위
9	자연적으로 감염된 괴경, 역병 증상 중심부위
10	자연적으로 감염된 괴경, 역병 중심에서 약간 벗어난 부위
11	자연적으로 감염된 괴경, 역병 가장자리 부위
12	자연적으로 감염된 괴경, 역병 가장자리 밖의 희미한 부위
13	자연적으로 감염된 괴경, 역병증상을 보이지 않는 괴경 부위
14	자연적으로 감염된 잎, 괴사 중심부위
15	자연적으로 감염된 잎, 역병균 포자 형성 부위
16	자연적으로 감염된 잎, 수침상 부위
17	자연적으로 감염된 잎, 건전한 부위
18	감연된 근두부위
19	감염된 줄기부의

교배형과 메탈락실 저항성이 다른 파이토프쏘라 인페스탄스(P. infestans)의 검출.

번호	균주 번호	교배형	메탈락실저항성
M	Gibco 1kb ladder
1	negative control (no DNA)
2	KAW11	A1	저항성
3	KAW25	A1	저항성
4	KAW08	A1	중도 저항성
5	KAW02	A1	중도 저항성
6	KAW82	A1	민감성
7	KAW83	A1	민감성
8	KAW63	A2	저항성
9	KAW71	A2	저항성
10	KAW33	A2	중도 저항성
11	KAW40	A2	중도 저항성

이하, 본 발명에 대해 실시예 및 실험예를 통하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예: 탄저병 진단용 분자표지인자의 제작

상기 표 1에 제시한 수종의 곰팡이와 세균의 게놈 DNA를 추출한 후, 서열번호 1의 ITS3 프라이머(GCATCGATGAAGAACGCAGC)와 서열번호 2의 ITS4 프라이머(TCCTCCGCTTTATTGATATGC)를 이용하여 ITS(internal transcribed spacer) II 지역을 PCR을 이용하여 preheating을 95℃에서 1분 한 후 94℃, 55℃, 72℃에서 각각 30초씩 30회 반복하고 이후 72℃에서 8분 과정으로 증폭하였다. 반응 산물은 총 24 ㎕ 중에 genomic DNA 10 ng, dNTP μM, 각각의 primer 0.1μM, Taq polymerase 1 unit, 10 x buffer, 그리고 dH2O로 조성되었다. 이렇게 증폭된 PCR 산물을 pGEM -T 이지벡터에 클로닝하고 시퀀싱 과정을 통해 염기 서열을 밝힌 후, ITS Ⅱ 지역의 서열을DNASTAR프로그램을 이용하여 배열(alignment)을 수행했으며, 그 결과 감자 및 토마토 역병균에만 특이적으로 반응하는 프라이머인 서열번호 3의 PISP-1 프라이머(5'-AATGCCAAGCTAAAGAGCCA-3')를 제작하였다.

실험예 1: 파이토프쏘라 인페스탄스( P. infestans )에 대한 특이성 시험

상기 실시예 1에서 제작한 서열번호 3의 PISP-1 프라이머와 ITS 3 프라이머를 프라이머쌍으로 이용하여 표 1에 제시된 수 종의 곰팡이 분리균주에 대하여 preheating을 95℃에서 1분 한 후, 94℃, 55℃, 72℃에서 각각 30초씩 30회 반복하고 이후 72℃에서 8분 확장하는 조건으로 PCR을 수행하였다. 반응 산물은 총 24 ㎕ 중에 genomic DNA 10 ng, dNTP μM, 각각의 primer 0.1μM, Taq polymerase 1 unit, 10 x buffer, 그리고 dH2O로 조성되었다. 그 결과는 다음 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 파이토프쏘라 인페스탄스(P. infestans) 균주에서만 453bp의 밴드를 얻을 수 있었으며, 그외 다른 파이토프쏘라 종(Phytophthoraspecies), 후자리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum)이나 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에서는 밴드를 검출할 수 없었다. 또한, 세균성 병원균(baterial pathogens)에서도 어떠한 PCR 증폭산물도 얻을 수 없었으며(도 2), 이 결과는 써던 블롯 혼성화(southern blot hybridization)에서도 동일하게 나타났다(도 3).

실험예 2: 민감도 시험

PCR에 의한 PISP-1과 ITS3 프라이머의 증폭 민감성 정도를 측정하기 위해 음성대조군(negative control)과 함께, 본 발명에 따른 파이토프쏘라 인페스탄스(P. infestans)의 게놈 DNA 양을 최고 100ng에서 최저 10pg까지 조절한 다음, 여기에 PISP-1과 ITS3 프라이머를 연속적으로 반응시켜 확인하였으며, 그 결과는 다음 도 4에 나타내었다. 그 결과, PCR 산물의 양의 농도별로 서로 다르게 나타났으며 최저 검출 수준은 10pg이었으며, 최고 100ng에서도 증폭이 가능함을 알 수 있었다(도 4).

실험예 3: 감자 생체조직에 따른 검출능력

파이토프쏘라 인페스탄스(P. infestans)에 의해 감염된 식물체내에서 본 병원균에 대한 검출력을 조사하기 위해 자연적으로 감염된 감자 잎과 괴경 그리고 인위적으로 감염시킨 괴경을 감염 부위별로 섹션한 후 생체에서 직접 DNA를 분리하여 ITS3와 PISP-1 프라이머를 이용하여 preheating을 95℃에서 1분 한 후 94℃, 55℃, 72℃에서 각각 30초씩 30회 반복하고 이후 72℃에서 8분 과정으로 PCR 증폭을 수행하였다. 반응 산물은 총 24 ㎕ 중에 genomic DNA 10 ng, dNTP μM, 각각의 primer0.1μM, Taq polymerase 1 unit, 10 x buffer, 그리고 dH2O로 조성 되었다. 그 결과, ITS3와 PISP-1 프라이머로 증폭시킨 결과 감염되지 않은 괴경, 잎, 그리고 대조군에서는 어떠한 밴드로 검출되지 않은 반면, 이병된 괴경과 잎 조직에서는 약 450bp의 밴드가 증폭됨을 확인할 수 있었다. 게다가, 이병된 괴경 분석에서의 검출범위는 최초 감염부위 뿐만 아니라 병 확산이 육안으로 식별되지 않는 건전하게 보이는 부위에서도 파이토프쏘라 인페스탄스(P. infestans)를 검출할 수 있었다(도 5).

실험예 4: 교잡형태 및 메탈락실에 대한 민감성

교잡형태(mating type; A1, A2)와 메탈락실(matalaxyl)에 대한 민감성 정도에 따라 ITS3와 PISP-1 프라이머가 파이토프쏘라 인페스탄스(P. infestans) 분리균에 대한 검출 여부가 어떻게 다른지 확인하고자 ITS3와 PISP-1 프라이머로 각각의 분리균을 preheating을 95℃에서 1분 한 후 94℃, 55℃, 72℃에서 각각 30초씩 30회 반복하고 이후 72℃에서 8분 과정으로 증폭하였다. 반응 산물은 총 24 ㎕ 중에 genomic DNA 10 ng, dNTP μM, 각각의 primer 0.1μM, Taq polymerase 1 unit, 10 x buffer, 그리고 dH2O로 조성되었다. 그 결과, 교잡형태(mating type; A1, A2)와 메탈락실(matalaxyl)에 대한 민감성 정도에 상관없이 모든 파이토프쏘라 인페스탄스(P. infestans) 분리균을 증폭시킬 수 있음을 확인할 수 있었다(도 6).

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 단감나무 탄저병 진단용 분자표지인자에 관한 것이다. 따라서, 이러한 본 발명에 따른 역병균의 진단방법은 10pg의 역병균 DNA 양으로도 검출할 수 있을 정도로 매우 민감하고 특이성이 뛰어나 종서 유출 단계에서 육안으로 관찰되지 않는 이병된 종서 구분이 가능할 뿐 만 아니라, 감자 생육 기간 중 수시로 샘플을 채취해 감염여부를 확인할 수 있어 병의 확산 방지와 조기 방제가 가능한 효과가 있다.

Claims

서열번호 1의 ITS-3와 서열번호 3의 PISP-1 프라이머 쌍(Pair primer)으로 이루어져, 감자 또는 토마토 역병의 병원균인 파이토프쏘라 인펜스탄스(Phytophthora infestans)를 특이적으로 진단하는 역병 병원균 진단용 DNA 표지인자.
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