CN115747218A - 用于猴痘病毒核酸检测的crRNA及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸检测的crRNA，以及采用上述crRNA的猴痘病毒核酸快速检测试剂盒。具体的，本发明提供了一种用于猴痘病毒核酸检测的crRNA，该crRNA包含如SEQ NO.12或SEQ NO.19所示的核苷酸序列。同时，本发明提供了一种猴痘病毒核酸检测试剂盒，试剂盒包括针对猴痘病毒基因的特异性扩增引物、上述crRNA中的一种或两种，CRISPR/Cas12a蛋白以及单链DNA(ssDNA)报告系统。本发明系首次实现采用CRISPR/Cas12a检测猴痘病毒，通过利用CRISPR/Cas12a特异识别猴痘病毒核酸，完成对猴痘病毒核酸的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测。

Description

用于猴痘病毒核酸检测的crRNA及试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸快速检测领域，具体涉及一种用于猴痘病毒核酸检测的crRNA及相关检测试剂盒和制备方法。

背景技术

猴痘(Monkeypox)是由猴痘病毒(Monkeypox virus，MP)引起的急性传染病。猴痘病毒于1958年被首次发现，当时一组用于研究的猴子中出现“痘状”传染病，因此得名。自世界卫生组织1980年宣布人类彻底消灭天花以来，猴痘病毒已成为对公共卫生影响最大的正痘病毒。该病传染性强，病死率为1-10％。截止2022年6月16日，全球猴痘确诊病例突破2000,达到了2027例。猴痘病毒属于痘病毒科正痘病毒属，是对人类致病的4种正痘病毒属之一，另外3种是天花病毒、痘苗病毒和牛痘病毒。痘病毒科(Poxviridae)，是最大的一类DNA病毒,结构复杂。正痘病毒基因组为双链DNA，基因组大小在130-375kb之间，包含大约190个开放性阅读框，编码213个蛋白。在猴痘治疗方面，目前暂无治疗猴痘感染的特效药。仅有部分药物可以使用。因此，猴痘需要早诊断、早治疗，实验室病原学诊断是猴痘病毒感染诊断的关键。

根据猴痘病毒的检测方法包括病毒培养和核酸检测。病毒培养方法利用采集的病理标本进行病毒培养，并分离猴痘病毒，该方法所需时间周期长，不利于快速鉴别，同时病毒培养环境条件要求严格，需要在三级及以上生物安全实验室开展。核酸检测采用核酸扩增检测方法在皮疹、疱液、痂皮、口咽或鼻咽分泌物等标本中可检测出猴痘病毒核酸。目前核酸检测的常见方法为常规聚合酶链反应(PCR)或实时荧光PCR。核酸检测可以是针对正痘病毒(OPXV)大类的，也可以是专门针对猴痘病毒(MPXV，MP)。第一步以PCR反应检测人类致病的OPXV，但不确定具体种类。然后可以进行第二步，可基于PCR或利用测序以专门检测MPXV。尽管如此，基于PCR的方法有严格的环境依赖和仪器依赖，不利于基层医疗机构或居家检测的推广应用。

等温扩增技术(isothermal amplification technology，IAT)是近年来发展起来的基于恒温扩增的新型核酸扩增技术。通过不同的酶和特异性引物在恒温条件下快速扩增，主要包括环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、交叉引物扩增(crossing priming amplification，CPA)、链替代扩增(strand displacementamplification，SDA)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)、依赖核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)和依赖解旋酶的扩增(helicase-dependentamplification，HDA)等。与PCR方法相比，等温扩增技术使用的仪器设备简单且扩增时间缩短。目前已有研究利用LAMP技术对猴痘病毒进行快速鉴定。尽管如此，LAMP方法涉及到引物较多和引物设计要求较高等问题，从而限制了其在病原检测中的应用，此外，等温扩增还需克服非特异性扩增的假阳性瓶颈。

近年来，以Crispr/cas9为代表的基因编辑系统发展迅猛，高效率的精准DNA、RNA编辑已广泛应用于生物医学、农业等诸多领域。同时，人们发现部分Crispr系统，如Cas12a/b,Cas13在被激活后还具有非特异性的核酸剪切活性，如来自Lachnospiraceae bacteriumND2006 Cas12a(LbCas12a)，在引导RNA引导(例如天然crRNA)下，能够快速的降解单链M13DNA噬菌体，由此提出了LbCas12a在与靶DNA结合后具有强大的非特异性裂解单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)的能力，即“附属切割”活性。至此以后，基于“附属切割”活性，结合携带荧光的单链DNA，开发了多种特异性靶序列检测技术，这使得该技术不仅仅可以用于核酸编辑还可以用于核酸变异检测。因此，基于Crispr系统的核酸检测技术在理论上可以具有较高的特异性，弥补等温扩增特异性不足的问题，但其灵敏度有限，更为重要的是，引导RNA，如crRNA或gRNA的容错率较高，很难对单碱基突变进行分辨。目前尚无基于Crispr系统的猴痘病毒检测技术的报道。

发明内容

本发明提供一种基于CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸检测的crRNA，以及采用上述crRNA的猴痘病毒核酸快速检测试剂盒。

根据第一方面，本发明提供了一种用于猴痘病毒核酸检测的crRNA，该crRNA包含如SEQ NO.12或SEQ NO.19所示的核苷酸序列。

进一步的，本发明中的crRNA的5’端包含发夹序列，在本发明的一种具体实施方式，该发夹序列如SEQ NO.23所示。

同时，本发明还提供了上述crRNA的制备方法，包括：针对猴痘病毒crmB基因区、猴痘病毒基因46428-46723区，寻找包含CRISPR/Cas12a识别序列的靶向序列，设计20-23nt长度的核苷酸序列(该核苷酸序列可与待测靶DNA特异性识别)，通过体外转录或者合成获得上述crRNA。

根据第二方面，本发明提供了一种猴痘病毒核酸检测试剂盒，试剂盒包括上述crRNA中的一种或两种。上述试剂盒还可进一步包括针对猴痘病毒基因的特异性扩增引物、上述crRNA，CRISPR/Cas12a蛋白以及单链DNA(ssDNA)报告系统。

具体的，上述针对猴痘病毒基因的特异性扩增引物包括针对猴痘病毒crmB基因区和/或针对猴痘病毒基因46428-46723区的特异性扩增引物。上述单链DNA报告系统包括ssDNA FQ reporter或ssDNA DB reporter。上述CRISPR/Cas12a蛋白为LbCas12a蛋白。

本发明的有益效果在于：本发明系首次实现采用CRISPR/Cas12a检测猴痘病毒，通过利用CRISPR/Cas12a特异识别猴痘病毒核酸，完成对猴痘病毒核酸的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测。基于CRISPR/Cas12a识别特定PAM序列特点，根据猴痘病毒基因靶序列设计得到特异性crRNA。通过检测实验验证了所设计的crRNA能有效屏蔽其他正痘病毒而特异性识别猴痘病毒，进而提供了一种基于CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸快速检测试剂盒，该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型实验设备等优势，便于实验室和临床医学对猴痘病毒核酸的快速检测和诊断。

同时，本发明提供了两个猴痘病毒检测位点，并对其分别设计了特异性的引物及crRNA，不仅可以实现单靶标检测，也可以进行双靶标检测，有效确保检测的准确性。此外，本发明的试剂盒可通过荧光发射器、实时荧光定量PCR仪和胶体金试纸条实现对猴痘病毒核酸的快速、高特异性、高灵敏性和可视化检测，因此，该试剂盒可提供多种具体的检测形式，为临床诊断和实验室研究提供了一个准确、快速、简便的检测方法。

附图说明

图1为不同的正痘病毒crmB基因区域多序列比对结果图；

图2为采用不同crRNA(crRNA1-3)进行CRISPR/Cas12a荧光发射器(紫外光)检测猴痘病毒crmB基因区结果图；

图3为采用不同crRNA(crRNA1-3)进行CRISPR/Cas12a荧光发射器(蓝光)检测猴痘病毒crmB基因区结果图；

图4为采用crRNA1进行CRISPR/Cas12a实时荧光定量PCR仪检测猴痘病毒crmB基因区结果图；

图5为采用crRNA1进行CRISPR/Cas12a胶体金试纸条检测猴痘病毒crmB基因区结果图；

图6为采用crRNA1进行CRISPR/Cas12a检测猴痘病毒crmB基因区荧光法灵敏度的结果图；

图7为采用crRNA1进行扩增检测结合法CRISPR/Cas12a荧光发射器(紫外光)检测猴痘病毒crmB基因区结果图；

图8为采用crRNA1进行扩增检测结合法CRISPR/Cas12a检测猴痘病毒crmB基因区荧光法灵敏度的结果图；

图9为类似猴痘病毒基因(46428-46723)区域的多种正痘病毒的多序列比对结果图；

图10为采用不同crRNA(crRNA4-7)进行CRISPR/Cas12a荧光发射器(紫外光)检测猴痘病毒基因(46428-46723)区结果图；

图11为采用不同crRNA(crRNA4-7)进行CRISPR/Cas12a荧光发射器(蓝光)检测猴痘病毒基因(46428-46723)区结果图；

图12为采用不同crRNA(crRNA4-7)进行CRISPR/Cas12a实时荧光定量PCR仪检测猴痘病毒基因(46428-46723)区结果图；

图13为采用crRNA4进行CRISPR/Cas12a胶体金试纸条检测猴痘病毒基因(46428-46723)区结果图；

图14采用crRNA4进行CRISPR/Cas12a检测猴痘病毒基因(46428-46723)区荧光法灵敏度的结果图；

图15采用crRNA4进行扩增检测结合法CRISPR/Cas12a荧光发射器(紫外光)检测猴痘病毒基因(46428-46723)区结果图；

图16采用crRNA4进行扩增检测结合法CRISPR/Cas12a检测猴痘病毒基因(46428-46723)区荧光法灵敏度的结果图；

图17为采用crRNA1、crRNA4进行CRISPR/Cas12a荧光发射器(紫外光)检测猴痘病毒双靶点结果图；

图18为采用crRNA1、crRNA4进行CRISPR/Cas12a荧光发射器(蓝光)检测猴痘病毒双靶点结果图；

图19为采用crRNA1、crRNA4进行CRISPR/Cas12a实时荧光定量PCR仪检测猴痘病毒双靶点结果图；

图20为采用crRNA1进行CRISPR/Cas12a检测猴痘病毒双靶点荧光法灵敏度的结果图；

图21为采用crRNA4进行CRISPR/Cas12a检测猴痘病毒双靶点荧光法灵敏度的结果图；

图22采用crRNA1、crRNA4进行扩增检测结合法CRISPR/Cas12a荧光发射器(紫外光)检测猴痘病毒双靶点结果图。

具体实施方式

基于CRISPR/Cas12a的核酸检测技术的关键在于crRNA，当待测样品中存在可与crRNA杂交的靶DNA时，crRNA即可激活CRISPR/Cas12a，此时，CRISPR/Cas12a具有核酸内切酶活性，可非特异性的对单链DNA(非靶ssDNA)进行剪切，而利用这一原理则可进一步通过设计ssDNA报告系统实现猴痘病毒核酸的快速检测。单独基于Crispr系统的核酸检测灵敏性相对较低，无法对痕量核酸样本进行高效检测，更为重要的是，不同引导RNA的效率和容错率差异较大，导致该系统需要进行细致设计与充分的实验验证，才有可能获得检测效率和特异性都满足需求的引导RNA。本发明正对猴痘病毒基因进行了大量的研究和筛选，并通过实验验证，在猴痘病毒crmB基因区及猴痘病毒基因(46428-46723)区设计得到了两条特异性crRNA，并利用上述crRNA可有效构建得到基于CRISPR/Cas12a的猴痘病毒检测体系。本发明中crRNA的详细的设计过程及相关方法将在后续实施例中做进一步的描述。

需要说明的是，适用于CRISPR/Cas12a蛋白的crRNA包含可与CRISPR/Cas12a蛋白结合的发夹序列以及与该发夹序列相邻连接且可与靶DNA杂交的核苷酸序列，其中，发夹序列位于crRNA的5’端。前文中提到的与靶DNA杂交即指该段序列与靶DNA具有互补性，在某些文献中也称这段序列为指导序列(Guide sequence)。crRNA的模式结构图可简述为：5’-【发夹序列】【可与靶DNA杂交的核苷酸序列】-3’。crRNA设计思路和其与靶DNA结合后激活CRISPR/Cas12a蛋白的原理有关，因此，在设计时首先需要对靶DNA序列进行研究找到具有包含CRISPR/Cas12a识别序列(PAM)的靶向序列。发夹序列的具体选择与CRISPR/Cas12a蛋白的具体类型有关。在本发明中的一种具体实施方式中，采用CRISPR/Cas12a蛋白为Lbcas12a，故本发明中crRNA的发夹序列为SEQ NO.23所示的序列。但由于CRISPR/Cas12a蛋白包括若干不同类型，例如Lbcas12a、Ascas12a、Fncas12a等，因此本领域技术人员可以根据CRISPR/Cas12a蛋白的不同类型，选择适当的序列作为crRNA中的发夹序列，发夹序列的具体选择并不构成对本发明的限制。同样，crRNA的具体设计也根据选择CRISPR/Cas12a蛋白的具体类型而做相应的调整。

基于上述特异性crRNA，本发明进一步提供了一种基于CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸检测试剂盒，包括针对猴痘病毒基因的特异性扩增引物、上述特异性crRNA中的一种或两种，CRISPR/Cas12a蛋白以及单链DNA(ssDNA)报告系统。

正如上文中所述，构建基于CRISPR/Cas12a的猴痘病毒检测体系优选对待测样品进行靶DNA扩增，而本发明的试剂盒中优选针对猴痘病毒crmB基因区和/或针对猴痘病毒基因(46428-46723)区进行特异性扩增。因此，本发明提供了两个可选择使用的靶点，可实现单靶点检测，也可实现双靶点检测，本领域技术人员可根据需要采用具体的检测模式。而关于上述靶点的具体的扩增方法可以是多种的，在本发明中优选采用等温扩增技术，例如重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、多酶恒温快速扩增技术(MIRA)等，本领域技术人员可根据需要选择合适的扩增方法。同时，本领域技术人员可根据扩增方法实际基于上述片段设计具体的特异性的靶DNA扩增引物。在本发明的具体实施方式中提供了若干优选的引物，这些引物可用于不同的扩增方式，例如MPoxL1和MPoxR1可与MPoxL2和MPoxR2合用于靶DNA的MIRA扩增，同时，MPoxL1和MPoxR1也可单独用于靶DNA的RPA扩增。扩增引物的具体选择不构成对本发明的限定，本领域技术人员可以根据上述特异性crRNA，在猴痘病毒crmB基因区、猴痘病毒基因(46428-46723)区设计合适的扩增引物。在本发明的一种具体实施方式中，优选采用MIRA进行扩增。此时，针对猴痘病毒crmB基因区的特异性扩增引物包括：MPoxL1和MPoxR1，其序列分别如SEQ NO.8和SEQ NO.9所示；和MPoxL2和MPoxR2，其序列分别如SEQ NO.10和SEQ NO.11所示。针对猴痘病毒基因46428-46723区的特异性扩增引物包括：MPL1和MPR1，其序列分别如SEQ NO.15和SEQ NO.16所示；和MPL2和MPR2，其序列分别如SEQ NO.17和SEQNO.18所示。

需要说明的是，基于本发明的发明构思，ssDNA报告系统的作用是为显示待测样品中是否存在靶DNA而提供可测量的检测信号，该可检测的测量信号可以是当ssDNA被CRISPR/Cas12a非特异性切割时产生的任何可测量信号，因此，该报告系统中的ssDNA没有特殊限制，但要求其不与crRNA杂交。基于上述原理，适用于本发明的ssDNA报告系统可具有多种具体实现形式，而选择不同的ssDNA报告系统时，本发明的试剂盒具有不同的具体实现方式。本领域技术人员可根据本发明的具体实施方式的示范，以及上述原理，选择满足检测需求的其他合适的具体的ssDNA报告系统。进一步的，在本发明的具体实施方式中，ssDNAFQ reporter为优选利用羧基荧光素(FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA，标记产物如下：/5FAM/TTATTATT/3BHQ1/，完整命名为ssDNA FQ reporter/5FAM/ATTATTT/3BHQ1/。在使用实时荧光定量PCR仪检测时，当CRISPR/Cas12a检测体系中存在猴痘病毒基因时，会由在猴痘病毒特异性crRNA介导下特异性激活CRISPR/Cas12a蛋白的核酸内切酶活性。激活后的CRISPR/Cas12a蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA FQ reporter,从而释放激活荧光基团，使用实时荧光定量PCR仪可以检测到随反应时间而上升的荧光值。相对应的，待检测样品中不存在猴痘病毒基因序列时，荧光值显示随反应时间不变的基底值。而在使用荧光发射器检测时，当CRISPR/Cas12a检测体系中存在猴痘病毒基因时，会由在猴痘病毒特异性crRNA介导下特异性激活CRISPR/Cas12a蛋白的核酸内切酶活性。激活后的CRISPR/Cas12a蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA FQ reporter,从而释放激活荧光基团，使用凝胶成像仪可以观察到有荧光产生。相对应的，待检测样品中不存在猴痘病毒基因序列时，无荧光产生。在本发明的另一种具体实施方中，ssDNA DB reporter为优选利用6-羧基荧光素(6-FAM)和生物素(Biotin)标记的ssDNA ,标记产物如下：/5 6FAM/TTATTATT/3Biotin/，完整命名为ssDNA DB reporter/5 6FAM/TTATTATT/3Biotin/。在使用免疫胶体金试纸条检测时，将CRISPR/Cas12a切割后的待检测样品加入到胶体金试纸条后，被胶体金标记的鼠抗6-羧基荧光素抗体会与6-羧基荧光素标记的ssDNA报告系统结合，复合物随液流方向从质控线走向检测线；质控线链霉亲和素饱和抓获标记有生物素标的ssDNA报告系统，从而显示条带；当CRISPR/Cas12a检测到猴痘病毒的基因时时，会将标记有6-羧基荧光素和生物素ssDNA报告系统切割断开，从而会有6-羧基荧光素标记的ssDNA片段被检测线抓获显色，当CRISPR/Cas12a检测不到猴痘病毒的基因序列时，不能将标记有6-羧基荧光素和生物素ssDNA报告系统切割断开，从而不会产生6-羧基荧光素标记的ssDNA片段被检测线抓获的显色。关于适用于上述胶体金试纸条或类似原理的快速检测试纸中，ssDNA的双标记可选择不同的标记物，所述标记物与检测线和质控线中的捕获物相适应即可，本领域技术人员可根据具体的选择。

需进一步说明的是，本发明的具体检测过程可先进行样品扩增，再将扩增产物与crRNA、CRISPR/Cas12a蛋白及ssDNA reporter混合切割后进行结果检测。也可以将特异性扩增产物、crRNA、CRISPR/Cas12a蛋白及ssDNA reporter混合，即将靶DNA扩增和CRISPR/Cas12a蛋白切割结合到一管进行反应(在本发明的实施例中也称为扩增检测结合法)，以此实现猴痘病毒核酸的快速检测。换而言之，在本发明中的试剂盒具体使用时可采用不同的检测步骤。因此，试剂盒的使用步骤本身不构成对本发明试剂盒的限制。

同时，适用于本发明的CRISPR/Cas12a蛋白，可采用直接购买或根据其序列(包括其适当优化后的序列)进行人工合成，CRISPR/Cas12a蛋白的获取方式和具体序列并不构成对本发明的限制。

现就本发明具体实施方式中涉及的具体相关材料做以下说明：本发明中DNA恒温快速扩增试剂盒购自安普未来生物科技有限公司；用于crRNA体外转录盒子TranscriptAidT7High Yield Transcription Kit购自Thermo Fisher Scientific公司；纯化盒子RNAClean&Concentrator-5购自Zymo Research公司；CRISPR/Cas12a蛋白及NEBuffer r2.1(10X)购自NEB公司；胶体金试纸条HybriDetect Universal LateralFlow Assay Kit购自Milenia Biotec公司；核酸和ssDNA探针合成由北京六合华大基因科技有限公司完成。

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

实施例一：猴痘病毒核酸crmB基因核酸片段快速灵敏检测

1、核酸制备

通过大量研究和比对，本发明选择针对猴痘病毒核酸crmB基因片段进行相关特异性crRNA的设计。本例中正痘病毒crmB基因片段，利用NCBI数据库BLAST工具下载，序列包括猴痘病毒(Monkeypox virus strain Congo_8；Monkeypox virus strain Nigeria-SE-1971；Monkeypox virus isolate MpxV/human),痘苗病毒(vaccinia virus)天花病毒(variola virus)骆驼痘病毒(Camelpox virus)，马痘病毒(horsepox virus),水牛痘病毒(Buffalopox virus),兔痘病毒(rabbitpox virus)，牛痘病毒(Cowpox virus)等。对下载的片段序列利用CLUSTAL O(1.2.4)软件进行多序列分析(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)，分析结果如图1所示。然后根据上述多序列比对结果选取保守区段进行等温扩增引物设计，选取变异区段进行特异性cRNA设计。

本案例中正痘病毒猴痘(Monkeypox,MP)、天花(variola,VV)、骆驼痘(Camelpox,CV)、兔痘(rabbitpox，RV)基因片段是参考NCBI数据库中MP、VV、CV、RV的crmB基因片段，由北京六合华大基因科技有限公司分别合成MP、VV、CV、RV部分基因的MP1片段(308bp，其序列如SEQ NO.1所示)、VV片段(308bp，其序列如SEQ NO.2所示)、CV1片段(305bp，其序列如SEQNO.3所示)、RV片段(271bp，其序列如SEQ NO.4所示)，并构建到PMV载体，命名为PMV-MP1、PMV-VV、PMV-CV1、PMV-RV。

本例中采用MIRA进行扩增，其MIRA扩增引物包括SEQ NO.8到SEQ NO.11，具体信息如表1所示。

表1.MIRA扩增引物序列

SEQname	Primename	Primesequence(5’-3’)
			SEQ NO.8	MPoxL1	CGTGTGGTTCGGATACCTTTACATCTCAC
SEQ NO.9	MPoxR1	TGTTACACGATCGCGTCTCTACCTGATTACT
			SEQ NO.10	MPoxL2	AATAAACGGAAGAGATATAGCACCACATGCAC
SEQ NO.11	MPoxR2	CAATAATATCCTGGAGAGCATTCACAGATTCT

参考DNA恒温快速扩增试剂盒操作步骤，对上述MP1片段、VV片段、CV1片段、RV片段进行扩增获得待检测样品(分别记作MP1、VV、CV1、RV)。具体操作如下：本扩增采用50μL体系如表2所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：

表2.MIRA扩增体系

成分	用量
		A buffer(已加入干粉管中混合溶剂)	29.4μL
MpoxL(1+2)(10μM)	2μL
		MPoxR(1+2)(10μM)	2μL
DNA(1ng/μL)	5μL
		B buffer	2.5μL
ddH<sub>2</sub>O	9.1μL

根据表2体系依次加入各种成分后，混合均匀，于37℃反应30min，获得待测样品(MP1、VV、CV1、RV)以备后续的核酸检测。

1.2猴痘病毒特异性crRNA的设计制备

crRNA制备按照如下方案进行，针对1.1中提及的MP、VV、CV、RV的crmB基因片段，寻找包含CRISPR/Cas12a识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计20nt长度的核苷酸序列(指导序列)，本例中选择了理论上较为优选的三条核苷酸序列作为crRNA中用于与靶DNA杂交的片段，该片段是crRNA的核心部分，对应将其最终得到的完整crRNA分别命名为crRNA1、crRNA2和crRNA3，具体信息如表3所示。

表3.猴痘病毒crmB基因区特异性crRNA对应的可与靶DNA杂交的片段

SEQname	对应的crRNA	对应的可与靶DNA杂交的片段(5’-3’)
			SEQ NO.12	crRNA1	CAGGCUUGUCUAAGUUGUAA
SEQ NO.13	crRNA2	CAUCUCACAAUAAUCAUUUA
			SEQ NO.14	crRNA3	CCCGCUUGUCUAAGUUGUAA

本例中采用体外转录的方式获得最终的特异性crRNA，故制备特异性crRNA时，根据上述表3中的序列信息，先设计对应的DNA序列，并在每个DNA序列的5’端添加T7启动子序列和与其相邻连接的发夹序列，T7启动子位于5’端。

需要说明的是，本例中选择的启动子是T7启动子，但也可选择其他启动子，T7启动子的序列如SEQNO.24所示：SEQ NO.24：CTAATACGACTCACTATAGGG。

由于后续实施例中采用Lbcas12a蛋白，故在本例设计特异性crRNA时，Lbcas12a相关的crRNA的发夹结构序列如SEQ NO.23所示：SEQ NO.23：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU。

根据上述序列进行设计并交于北京六合华大基因科技有限公司合成DNA oligo，通过T7启动子介导的体外转录获得靶序列相关的crRNAs，最终得到的每个crRNA(crRNA1、crRNA2和crRNA3)均包含相同的5’端的发夹序列以及各自可与靶DNA杂交的核苷酸序列。

本例中采用TranscriptAid T7High Yield Transcription Kit试剂盒进行体外转录。将1μL10×PCRBuffer，4μL T7启动子DNA，4μL T7-crRNA，1μL ddH₂O，混合均匀，于95℃退火5min，室温放置1h，获得的样品进行下一步体外转录。体外转录采用的体系如表4所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整。

表4.crRNA体外转录体系

成分	用量
		5×TranscriptAid Reaction Buffer	2μL
TranscriptAid Enzyme Mix	1μL
		dATP	1μL
dCTP	1μL
		dUTP	1μL
dGTP	1μL
		DNA	3μL

各组分混合均匀后，37℃过夜，获得的样品进行下一步RNA纯化。使用RNA Clean&Concentrator-5试剂盒进行crRNA纯化和浓缩，获得纯化的目标crRNAs(crRNA1、crRNA2和crRNA3)，并利用Nanodrop2000进行RNA浓度测定，最后置于-20℃或-80℃保存。

1.3荧光发射器荧光检测

利用上述1.2得到crRNAs(crRNA1、crRNA2和crRNA3)以及1.1中制备得到的待测样品(MP1、VV、CV1、RV)，进行荧光发射器荧光检测。在检测体系依次加入各种组分，各组分混合均匀后于37℃反应15min。其中，上述反应体系中CRISPR/Cas12a为1μM，ssDNA FQreporter浓度为10μM，crRNA(crRNA1、crRNA2、crRNA3)浓度为1μM。其中，ssDNA FQreporter为：/5FAM/TTATTATT/3BHQ1/。本检测采用10μL体系如表5所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：

表5.猴痘病毒CRISPR/Cas12a检测体系

成分	用量
		NEBuffer r2.1(10X)	1μL
CRISPR/Cas12a(1μM)	0.5μL
		crRNA(1μM)	0.5μL
DNA(待测样品)	1μL
		ssDNA reporter(10μM)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	6.5μL

待反应完成后，利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。具体的，使用凝胶成像仪或蓝光切胶仪用于检测反应的荧光，在反应8-15min后，观察是否有荧光产生。

本例中针对猴痘病毒crmB基因区的不同crRNA的检测结果如图2、图3所示，图中包括crRNA1-3对不同样品的检测结果，检测样本分别为MP1(猴痘)、CV1(骆驼痘)、VV(天花)、RV(兔痘)和水(空白对照)。其中，crRNA1可以对猴痘病毒进行特异性检测(即图2和3中仅针对MP1样本有荧光产生)。crRNA2对MP1、CV1、VV均有荧光反应，crRNA3对MP1没有荧光反应，但对CV1、VV、RV有荧光反应，故crRNA2和crRNA3不能对猴痘病毒进行特异性检测。

故1.2设计得到的crRNA中仅crRNA1可在荧光发射器下实现对猴痘病毒的检测。

1.4实时荧光定量PCR仪荧光检测

利用上述1.2得到crRNA1以及1.1中制备得到的待测样品(MP1、VV、CV1、RV)，进行实时荧光定量PCR仪荧光检测。在检测体系依次加入各种组分，各组分混合均匀后于实时荧光定量PCR仪进行检测。其中，上述反应体系中CRISPR/Cas12a为1μM，ssDNA FQ reporter浓度为10μM，crRNA1浓度为1μM。其中，ssDNA FQ reporter为：/5FAM/TTATTATT/3BHQ1/。

利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。在实时荧光定量PCR仪中37℃反应30min，检测最终荧光数值。其中猴痘病毒的CRISPR/Cas12a检测如图4所示，crRNA1仅对MP1表现出很高荧光值，对CV1、VV、RV和水中均无荧光值，本例说明采用crRNA1并利用实时荧光定量PCR结果判定方案，可实现对猴痘病毒的特异性检测。

1.5胶体金试纸条检测

利用上述1.2得到crRNA1对1.1中制备得到的MP1、CV1样品进行胶体金试纸条检测(空白对照为水)。在检测体系依次加入各种组分，各组分混合均匀后于37℃反应15min。其中，上述反应体系中CRISPR/Cas12a为1μM，ssDNA DB reporter浓度为10μM，crRNA(crRNA1)浓度为1μM。其中，ssDNA DB reporter为：/5 6FAM/TTATTATT/3Biotin/。

本发明中免疫胶体金试纸条检测步骤如下：将100μL胶体金试纸条缓冲液加入到EP管中，将上述10μL CRISPR/Cas12a切割产物加入到试纸条上，然后将试纸条浸入缓冲液中，反应3分钟后，可由肉眼进行结果判定，及进行拍照记录。其结果如图5所示，靠下的质控线均显色，但靠上的检测线仅MP试纸条显色，说明采用crRNA1并利用胶体金检测试纸条可实现对猴痘病毒的快速特异性检测。

实施例二：CRISPR/Cas12a检测猴痘病毒crmB基因区核酸灵敏度

在灵敏度检测案例中，将1.1中制备的PMV-MP1质粒根据分子量转换为拷贝数，进行10倍梯度稀释，获得每微升含有2×10⁸、2×10⁷、2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²拷贝数(copy/μL)的不同浓度的梯度稀释样品。将上述不同的5μL梯度稀释样品，分别进行MIRA扩增反应：29.4μL Abuffer(已加入干粉管中混合溶剂)，2μL MPoxL(1+2)，2μL MPoxR(1+2)，2.5μL B buffer和9.1μL ddH₂O，混合均匀，于37℃反应30min,标记各扩增后的样品进行下一步核酸检测。上述扩增引物同表1。

本检测采用10μL体系如表6所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：

表6.猴痘病毒CRISPR/Cas12a检测体系

成分	用量
		NEBuffer r2.1(10X)	1μL
CRISPR/Cas12a(1μM)	0.5μL
		crRNA1(1μM)	0.5μL
DNA	1μL
		ssDNA FQ reporter(10μM)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	6.5μL

本例中，利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。利用实时荧光定量PCR仪，37℃反应30min，检测荧光数值。检测结果如图6所示，本案例中，采用crRNA1进行CRISPR/Cas12a荧光法检测猴痘病毒核酸，能够实现2×10²拷贝猴痘病毒的高灵敏度检出。

实施例三：扩增检测结合法进行猴痘病毒crmB基因区核酸的快速检测

3.1扩增检测结合法的特异性检测

本例是将扩增和检测结合到一管进行反应，以此实现猴痘病毒的快速检测。本检测采用10μL体系如表7所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整。其中，表7中MPoxL和MPoxR同上述1.1中的表1，ssDNA FQ reporter同上述1.3。DNA为：PMV-MP1、PMV-VV、PMV-CV1、PMV-RV。

表7.猴痘病毒扩增检测结合法CRISPR/Cas12a检测体系

本例中，利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。将各组分混合均匀，在37℃反应30min。使用凝胶成像仪用于检测反应的荧光，观察是否有荧光产生。检测结果如图7所示，仅MP1中产生荧光反应，说明采用crRNA1可通过扩增检测结合法实现猴痘病毒核酸的特异性快速检测。

3.2扩增检测结合法的灵敏度检测

在灵敏度检测中，将1.1中制备的PMV-MP1质粒根据分子量转换为拷贝数，进行10倍梯度稀释，获得每微升含有2×10⁸、2×10⁷、2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²拷贝数(copy/μL)的不同浓度的梯度稀释样品。将上述不同的1μL梯度稀释样品，分别采用扩增检测结合法进行CRISPR/Cas12a检测反应。

本检测采用10μL体系如表8所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整。

表8.猴痘病毒扩增检测结合法CRISPR/Cas12a检测体系

成分	用量
		NEBuffer r2.1(10X)	1μL
CRISPR/Cas12a(1μM)	0.25μL
		crRNA1(1μM)	0.25μL
DNA	1μL
		ssDNA FQ reporter(10μM)	0.25μL
MPoxL(1+2)(10μM)	0.2μL
		MPoxR(1+2)(10μM)	0.2μL
A buffer(已加入干粉管中混合溶剂)	2.94μL
		B buffer	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	3.41μL

本例中，利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。利用实时荧光定量PCR仪，37℃反应30min，检测荧光数值。检测结果如图8所示，本例中，采用crRNA1进行扩增检测结合法CRISPR/Cas12a检测猴痘病毒核酸，能够实现2×10²拷贝猴痘病毒的高灵敏度检出。

实施例四：猴痘病毒基因(46428-46723)核酸片段快速灵敏检测

4.1核酸制备

通过大量研究和对比，本发明选择针对猴痘病毒核酸(46428-46723)片段进行相关特异性crRNA的设计。本例中根据猴痘病毒基因(46428-46723)片段，利用NCBI数据库BLAST工具下载，寻找相似的正痘病毒基因片段，序列包括猴痘病毒(Monkeypox virus)，牛痘病毒(Cowpox virus)，痘苗病毒(Vaccinia virus)，阿巴蒂诺正痘病毒(OrthopoxvirusAbatino)，水牛痘病毒(Buffalopox virus)，兔痘病毒(Rabbitpox virus)，沙鼠痘病毒(Taterapox virus)，艾赫米塔病毒(Akhmeta virus)，骆驼痘病毒(Camelpox virus)，马痘病毒(Horsepox virus)，天花病毒(Variola virus)，鼠痘病毒(Ectromelia virus)，浣熊痘病毒(Raccoonpox virus)，臭鼬痘病毒(Skunkpox virus)等。对下载的片段序列利用CLUSTAL O(1.2.4)软件进行多序列分析(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)，分析结果如图9所示。然后根据上述多序列比对结果选取保守区段进行等温扩增引物设计，选取变异区段进行特异性cRNA设计。

本案例中正痘病毒猴痘(Monkeypox,MP)、牛痘(Cowpox,CV)、鼠痘(Ectromelia，EV)基因片段是参考NCBI数据库中猴痘病毒基因(46428-46723)相似的片段，由北京六合华大基因科技有限公司合成MP、CV、EV部分基因的MP2片段(296bp，其序列如SEQ NO.5所示)、CV2片段(298bp，其序列如SEQNO.6所示)、EV(298bp，其序列如SEQ NO.7所示)，并构建到PMV载体，命名为PMV-MP2、PMV-CV2、PMV-EV。

本例中采用MIRA进行扩增，其MIRA扩增引物包括SEQ NO.15到SEQ NO.18，具体信息如表9所示。

表9.MIRA扩增引物序列

SEQname	Primename	Primesequence(5’-3’)
			SEQ NO.15	MPL1	ACCATAGCACTACGTTGAAGATCATACAGA
SEQ NO.16	MPR1	TAGATGACGGGTTAATCAGAGCTACATTCG
			SEQ NO.17	MPL2	CAGAGCTTTATTAACTTCTCGCTTCTCCAT
SEQ NO.18	MPR2	CTACATTCGATAGGAACGACGAACCACCAG

参考DNA恒温快速扩增试剂盒操作步骤，对上述MP2片段、CV2片段、EV片段进行扩增获得待检测样品(分别记作MP2、CV2、EV)。

具体操作如下：本扩增采用50μL体系如表10所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：

表10.MIRA扩增体系

成分	用量
		A buffer(已加入干粉管中混合溶剂)	29.4μL
MPL(1+2)(10μM)	2μL
		MPR(1+2)(10μM)	2μL
DNA(1ng/μL)	5μL
		B buffer	2.5μL
ddH<sub>2</sub>O	9.1μL

根据表10体系依次加入各种成分，混合均匀，于37℃反应30min，获得样品(MP2、CV2、EV)以备后续的核酸检测。

4.2猴痘病毒基因(46428-46723)区特异性crRNA的设计制备

特异性crRNA制备按照如下方案进行，针对上述4.1中提及的MP、CV、EV的基因片段(46428-46723)区，寻找包含CRISPR/Cas12a识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计20nt长度的核苷酸序列(该核苷酸序列可与待测靶DNA特异性识别，指导序列)，本例中选择了理论上较为优选的四条核苷酸序列作为crRNA中用于与靶DNA杂交的片段，该片段是crRNA的核心部分，对应将其最终得到的完整crRNA分别命名为crRNA4、crRNA5、crRNA6和crRNA7，具体信息如表11所示。

表11.猴痘病毒基因(46428-46723)区特异性crRNA对应的可与靶DNA杂交的片段

SEQname	对应的crRNA	对应的可与靶DNA杂交的片段(5’-3’)
			SEQ NO.19	crRNA4	AUAACCGCACACAAUCUCUG
SEQ NO.20	crRNA5	GAGAGAACUAACGCAACUAGCAA
			SEQ NO.21	crRNA6	UUGCUAGUUGCGUUAGUUCUCUC
SEQ NO.22	crRNA7	AACGCUCGUCAAUAUAGAUCUUA

本例中采用体外转录的方式获得最终的特异性crRNA，根据上述表11中的序列信息，先设计对应的DNA序列，并在每个DNA序列的5’端添加T7启动子序列和与其相邻连接的发夹序列，T7启动子位于5’端。

需要说明的是，本例中选择的启动子是T7启动子，但也可选择其他启动子，T7启动子的序列如SEQNO.24所示：SEQ NO.24：CTAATACGACTCACTATAGGG。

由于后续实施例中采用Lbcas12a蛋白，故在本例设计crRNA时，Lbcas12a相关的crRNA的发夹结构序列如SEQ NO.23所示：SEQ NO.23：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU。

根据上述序列进行设计并交于北京六合华大基因科技有限公司合成DNA oligo，通过T7启动子介导的体外转录获得靶序列相关的crRNAs，最终得到的每个crRNA(crRNA4、crRNA5、crRNA6和crRNA7)均包含相同的5’端的发夹序列以及各自可与靶DNA杂交的核苷酸序列。

本例中采用TranscriptAid T7High Yield Transcription Kit试剂盒进行体外转录。将1μL10×PCRBuffer，4μL T7启动子DNA，4μL T7-crRNA，1μL ddH₂O，混合均匀，于95℃退火5min，室温放置1h，获得的样品进行下一步体外转录。

体外转录采用的体系如表12所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整。

表12.crRNA体外转录体系

成分	用量
		5×TranscriptAid Reaction Buffer	2μL
TranscriptAid Enzyme Mix	1μL
		dATP	1μL
dCTP	1μL
		dUTP	1μL
dGTP	1μL
		DNA	3μL

各组分混合均匀后，37℃过夜，获得的样品进行下一步RNA纯化。使用RNA Clean&Concentrator-5试剂盒进行crRNA纯化，获得纯化的目的crRNA(crRNA4、crRNA5、crRNA6和crRNA7)。

4.3荧光发射器荧光检测

利用上述4.2得到crRNAs(crRNA4、crRNA5、crRNA6和crRNA7)以及4.1中制备得到的待测样品(MP2、CV2、EV)，进行荧光发射器荧光检测。在检测体系依次加入各种组分，各组分混合均匀后于37℃反应15min。其中，上述反应体系中CRISPR/Cas12a为1μM，ssDNA FQreporter浓度为10μM，crRNA(crRNA4、crRNA5、crRNA6、crRNA7)浓度为1μM。其中，ssDNA FQreporter为：/5FAM/TTATTATT/3BHQ1/。

本检测采用10μL体系如表13所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：

表13.猴痘病毒CRISPR/Cas12a检测体系

成分	用量
		NEBuffer r2.1(10X)	1μL
CRISPR/Cas12a(1μM)	0.5μL
		crRNA(1μM)	0.5μL
DNA(待测样品)	1μL
		ssDNA reporter(10μM)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	6.5μL

待反应完成后，利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。具体的，使用凝胶成像仪或蓝光切胶仪用于检测反应的荧光，在反应8-15min后，观察是否有荧光产生。

本例中不同crRNA的检测结果如图10、图11所示，图中包括crRNA4-7对不同样品的检测结果，检测样本分别为MP2、CV2、EV和水(空白对照)。其中，crRNA6对MP2和CV2均有荧光反应，故crRNA6不能对猴痘病毒进行特异性检测，而crRNA4、crRNA5、crRNA7仅针对MP2有荧光反应可进行进一步的验证。

4.4实时荧光定量PCR仪荧光检测

利用上述4.2得到crRNAs(crRNA4、crRNA5、crRNA6和crRNA7)以及4.1中制备得到的待测样品(MP2、CV2、EV)，进行实时荧光定量PCR仪荧光检测。在检测体系依次加入各种组分，各组分混合均匀后于实时荧光定量PCR仪进行检测。其中，上述反应体系中CRISPR/Cas12a为1μM，ssDNA FQ reporter浓度为10μM，crRNA(crRNA4、crRNA5、crRNA6、crRNA7)浓度为1μM。其中，ssDNA FQ reporter为：/5FAM/TTATTATT/3BHQ1/。

利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。在实时荧光定量PCR仪中37℃反应30min，检测荧光数值。其中猴痘病毒的CRISPR/Cas12a检测如图12所示，crRNA4仅对MP2表现出很高荧光值，对CV2、EV和水中均无荧光值，crRNA5、crRNA6、crRNA7均在除MP2以外的其他样本中有不同程度的荧光值，故crRNA5、crRNA6、crRNA7都不能对猴痘病毒进行特异性检测，仅crRNA4可以对猴痘病毒进行特异性检测。

本例说明采用crRNA4并利用实时荧光定量PCR结果判定方案，可实现对猴痘病毒的特异性检测。

4.5胶体金试纸条检测

利用上述4.2得到crRNA4以及4.1中制备得到的待测样品(MP2、CV2)进行胶体金试纸条检测(空白对照为水)。在检测体系依次加入各种组分，各组分混合均匀后于37℃反应15min。其中，上述反应体系中CRISPR/Cas12a为1μM，ssDNA DB reporter浓度为10μM，crRNA(crRNA4)浓度为1μM。其中，ssDNA DB reporter为：/5 6FAM/TTATTATT/3Biotin/。

本发明中免疫胶体金试纸条检测步骤如下：将100μL胶体金试纸条缓冲液加入到EP管中，将10μLCRISPR/Cas12a切割产物加入到试纸条上，然后将试纸条浸入缓冲液中，反应3分钟后，可由肉眼进行结果判定，及进行拍照记录。其结果如图13所示，靠下的质控线均显色，但靠上的检测线仅MP试纸条显色，说明采用crRNA4并利用胶体金检测试纸条可实现对猴痘病毒的快速特异性检测。

实施例五：CRISPR/Cas12a检测猴痘病毒基因(46428-46723)区核酸灵敏度

在灵敏度检测案例中，将4.1中制备的PMV-MP2质粒根据分子量转换为拷贝数，进行10倍梯度稀释，获得每微升含有2×10⁸、2×10⁷、2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²拷贝数(copy/μL)的不同浓度的梯度稀释样品。将上述不同的5μL梯度稀释样品，分别进行MIRA扩增反应：29.4μL A buffer(已加入干粉管中混合溶剂)，2μL MPL(1+2)，2μL MPR(1+2)，2.5μL B buffer和9.1μL ddH₂O，混合均匀，于37℃反应30min,标记各扩增后的样品进行下一步核酸检测。上述扩增引物同表9。

本检测采用10μL体系如表14所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：

表14.猴痘病毒CRISPR/Cas12a检测体系

成分	用量
		NEBuffer r2.1(10X)	1μL
CRISPR/Cas12a(1μM)	0.5μL
		crRNA4(1μM)	0.5μL
DNA	1μL
		ssDNA FQ reporter(10μM)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	6.5μL

本例中，利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。利用实时荧光定量PCR仪，37℃反应30min，检测荧光数值。检测结果如图14所示，本案例中，采用crRNA4内进行CRISPR/Cas12a荧光法检测猴痘病毒核酸，能够实现2×10²拷贝猴痘病毒的高灵敏度检出。

实施例六：扩增检测结合法进行猴痘病毒基因(46428-46723)区核酸的快速检测

6.1扩增检测结合法的特异性检测

本例是将扩增和检测结合到一管进行反应，以此实现猴痘病毒的快速检测。本检测采用10μL体系如表15所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：其中，表15中MPL和MPR同上述4.1中的表9，ssDNA FQ reporter同上述4.3。DNA为：PMV-MP2、PMV-CV2、PMV-EV。

表15.猴痘病毒扩增检测结合法CRISPR/Cas12a检测体系

本例中，利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。将各组分混合均匀，在37℃反应30min。使用凝胶成像仪用于检测反应的荧光，观察是否有荧光产生。检测结果如图15所示，仅MP2中产生荧光反应，说明采用crRNA4可通过扩增检测结合法实现猴痘病毒核酸的特异性快速检测。

6.2扩增检测结合法的灵敏度检测

在灵敏度检测案例中，将4.1中制备的PMV-MP2质粒根据分子量转换为拷贝数，进行10倍梯度稀释，获得每微升含有2×10⁸、2×10⁷、2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²拷贝数(copy/μL)的不同浓度的梯度稀释样品。将上述不同的1μL梯度稀释样品，分别采用扩增检测结合法进行CRISPR/Cas12a检测反应。本检测采用10μL体系如表16所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整。

表16.猴痘病毒扩增检测结合法CRISPR/Cas12a检测体系

成分	用量
		NEBuffer r2.1(10X)	1μL
CRISPR/Cas12a(1μM)	0.25μL
		crRNA4(1μM)	0.25μL
DNA	1μL
		ssDNA FQ reporter(10μM)	0.25μL
MPL(1+2)(10μM)	0.2μL
		MPR(1+2)(10μM)	0.2μL
A buffer(已加入干粉管中混合溶剂)	2.94μL
		B buffer	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	3.41μL

本例中，利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。利用实时荧光定量PCR仪，37℃反应60min，检测荧光数值。检测结果如图16所示，本例中，采用crRNA4进行扩增检测结合法CRISPR/Cas12a检测猴痘病毒核酸，能够实现2×10⁴拷贝猴痘病毒的高灵敏度检出。

实施例七：基于双靶点的猴痘病毒检测

7.1基于双靶点的猴痘病毒的特异性检测

本例中，将1.1所制备的PMV-MP1与4.1所制备的PMV-MP2等浓度等体积混合,并命名为MPs；将1.1所制备的PMV-VV、PMV-CV1、PMV-RV与4.1所制备的PMV-CV2、PMV-EV等浓度等体积混合,并命名为Ex MPs；将1.1所制备的PMV-MP1、PMV-VV、PMV-CV1、PMV-RV与4.1所制备的PMV-MP2、PMV-CV2、PMV-EV等浓度等体积混合,并命名为Ex MPs+MPs。

本例中采用MIRA进行扩增，参考DNA恒温快速扩增试剂盒操作步骤，对上述MPs、ExMPs、Ex MPs+MPs进行扩增获得待检测样品。具体操作如下：

本扩增采用50μL体系如表17所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：

表17.MIRA扩增体系

根据表17体系依次加入各种成分，混合均匀，于37℃反应30min，获得样品(MPs、ExMPs、Ex MPs+MPs)以备后续的核酸检测。

利用上述1.2得到crRNA1、4.2得到的crRNA4以及制备得到的待测样品(MPs、ExMPs、Ex MPs+MPs)，进行荧光发射器荧光检测。在检测体系依次加入各种组分，各组分混合均匀后于37℃反应15min。其中，上述反应体系中CRISPR/Cas12a为1μM，ssDNA FQ reporter浓度为10μM，crRNA(crRNA1、crRNA4)浓度为1μM。其中，ssDNA FQ reporter为：/5FAM/TTATTATT/3BHQ1/。

本检测采用10μL体系如表18所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：

表18.猴痘病毒CRISPR/Cas12a检测体系

成分	用量
		NEBuffer r2.1(10X)	1μL
CRISPR/Cas12a(1μM)	0.5μL
		crRNA(1μM)	0.5μL
DNA(待测样品)	1μL
		ssDNA reporter(10μM)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	6.5μL

待反应完成后，利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。具体的，使用凝胶成像仪或蓝光切胶仪用于检测反应的荧光，在反应8-15min后，观察是否有荧光产生。

本例中不同crRNA的检测结果如图17、图18所示，图中包括crRNA1、crRNA4对不同样品的检测结果，检测样本分别为MPs、Ex MPs、Ex MPs+MPs和水(空白对照)。结果表明可使用crRNA1和crRNA4对猴痘病毒进行双靶点特异性检测。

利用上述1.2得到crRNA1、4.2得到的crRNA4以及制备得到的待测样品(MPs、ExMPs、Ex MPs+MPs)，进行实时荧光定量PCR仪荧光检测。在检测体系依次加入各种组分，各组分混合均匀后于实时荧光定量PCR仪进行检测。其中，上述反应体系中CRISPR/Cas12a为1μM，ssDNA FQ reporter浓度为10μM，crRNA(crRNA1、crRNA4)浓度为1μM。其中，ssDNA FQreporter为：/5FAM/TTATTATT/3BHQ1/。

利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。在实时荧光定量PCR仪中37℃反应30min，检测荧光数值。其中猴痘病毒的CRISPR/Cas12a检测如图19所示.本例说明采用crRNA1与crRNA4并利用实时荧光定量PCR结果判定方案，可实现对猴痘病毒双靶点的特异性检测。

7.2基于双靶点的猴痘病毒的核酸灵敏度

在灵敏度检测案例中，将7.1中制备的MPs质粒根据分子量转换为拷贝数，进行10倍梯度稀释，获得每微升含有2×10⁸、2×10⁷、2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴拷贝数(copy/μL)的不同浓度的梯度稀释样品。将上述不同的5μL梯度稀释样品，分别进行MIRA扩增反应：29.4μLA buffer(已加入干粉管中混合溶剂)，2μL MPL(1+2)，2μL MPR(1+2)，2μL MPoxL(1+2)，2μLMPoxR(1+2)，2.5μL B buffer和5.1μL ddH₂O，混合均匀，于37℃反应30min,标记各扩增后的样品进行下一步核酸检测。上述扩增引物同表1、表9。

本检测采用10μL体系如表19所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：

表19.猴痘病毒CRISPR/Cas12a检测体系

本例中，利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。利用实时荧光定量PCR仪，37℃反应30min，检测荧光数值。检测结果如图20、图21所示，本案例中，采用crRNA1、crRNA4内进行CRISPR/Cas12a荧光法检测双靶点的猴痘病毒核酸，能够实现2×10⁴拷贝猴痘病毒的高灵敏度检出。

7.3基于双靶点的猴痘病毒的扩增检测结合法特异性检测

例是将扩增和检测结合到一管进行反应，以此实现猴痘病毒的快速检测。本检测采用10μL体系如表20所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：

其中，表20中MPL、MPR、MPoxL、MPoxR同上述中的表1、表9，crRNA为上述7.1中的crRNA1、crRNA4，ssDNA FQ reporter同上述7.1。DNA为：MPs、Ex MPs。

表20.猴痘病毒扩增检测结合法CRISPR/Cas12a检测体系

成分	用量
		NEBuffer r2.1(10X)	1μL
CRISPR/Cas12a(1μM)	0.25μL
		crRNA(1μM)	0.25μL
DNA(1ng/μL)	1μL
		ssDNA FQ reporter(10μM)	0.25μL
MPL(1+2)(10μM)	0.2μL
		MPR(1+2)(10μM)	0.2μL
MPoxL(1+2)(10μM)	0.2μL
		MPoxR(1+2)(10μM)	0.2μL
A buffer(已加入干粉管中混合溶剂)	2.94μL
		B buffer	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	3.01μL

本例中，利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系检测活性。将各组分混合均匀，在37℃反应30min。使用凝胶成像仪用于检测反应的荧光，观察是否有荧光产生。检测结果如图22所示，仅MPs中产生荧光反应，说明采用crRNA1、crRNA4可通过扩增检测结合法实现双靶点猴痘病毒核酸的特异性快速检测。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (10)

1.一种用于猴痘病毒核酸检测的crRNA，其特征在于，所述crRNA包含如SEQ NO.12或SEQ NO.19所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的crRNA，其特征在于，所述crRNA的5’端包含发夹序列；

优选的，所述发夹序列如SEQ NO.23所示。

3.一种猴痘病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于猴痘病毒核酸检测的crRNA，所述crRNA包括：

含有如SEQ NO.12所示的核苷酸序列的crRNA；和/或，

含有如SEQ NO.19所示的核苷酸序列的crRNA；

优选的，所述crRNA的5’端包含发夹序列；

进一步优选的，所述发夹序列如SEQ NO.23所示。

4.如权利要求3所述的猴痘病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括CRISPR/Cas12a蛋白；

优选的，所述CRISPR/Cas12a蛋白为LbCas12a蛋白。

5.如权利要求3所述的猴痘病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对猴痘病毒基因的特异性扩增引物；

优选的，所述针对猴痘病毒基因的特异性扩增引物包括针对猴痘病毒crmB基因区和/或针对猴痘病毒基因46428-46723区的特异性扩增引物。

6.如权利要求5所述的猴痘病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述针对猴痘病毒crmB基因区的特异性扩增引物包括：

MPoxL1和MPoxR1，其序列分别如SEQ NO.8和SEQ NO.9所示；和/或

MPoxL2和MPoxR2，其序列分别如SEQ NO.10和SEQ NO.11所示。

7.如权利要求5所述的猴痘病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述针对猴痘病毒基因46428-46723区的特异性扩增引物包括：

MPL1和MPR1，其序列分别如SEQ NO.15和SEQ NO.16所示；和/或

MPL2和MPR2，其序列分别如SEQ NO.17和SEQ NO.18所示。

8.如权利要求3所述的猴痘病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括单链DNA报告系统；

优选的，所述单链DNA报告系统包括ssDNA FQ reporter或ssDNA DB reporter。

9.如权利要求8所述的猴痘病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述ssDNA FQreporter为羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记产物为/5FAM/TTATTATT/3BHQ1/；所述ssDNA DB reporter为6-羧基荧光素和生物素标记的ssDNA，标记产物为/5 6FAM/TTATTATT/3Biotin/。

10.一种如权1或2所述的crRNA的制备方法，包括：针对猴痘病毒crmB基因区和/或猴痘病毒基因46428-46723区，寻找包含CRISPR/Cas12a识别序列的靶向序列，设计20-23nt长度的核苷酸序列，通过体外转录或者合成获得所述crRNA。

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