CN112980929B - 一种快速检测hla-b*1502的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速检测HLA‑B*1502的试剂盒及其检测方法。本发明提供的试剂盒包括如下成分：干粉反应管、A Buffer、B Buffer、HLA‑B*1502引物Mix、LbaCas12a（Cpf1）、crRNA、ssDNA、胶体金试纸条、阳性质控品、阴性质控品等成分。采用本发明提供的试剂盒检测HLA‑B*1502，在试纸条上能清晰、便捷、有效判断结果，使得检测结果肉眼可见，同时无需昂贵复杂仪器：仅需能稳定37℃加热的仪器即可。

Description

一种快速检测HLA-B*1502的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速检测HLA-B*1502的试剂盒。

背景技术

癫痫是一种由多种病因引起的大脑神经元反复的、突发的过度异常放电导致的慢性脑部疾病。在任何年龄、地区和种族的人群中都有发病，而儿童和青少年发病率较高。据统计，我国癫痫的年均发病率约35/10万，患病率是5‰左右。抗癫痫药物治疗是最重要和最基本的治疗，也往往是癫痫的首选治疗方案。

卡西平/奥卡西平作为特发性全面性癫痫；仅有全面强直阵挛发作的癫痫；儿童良性癫痫伴中央颞区棘波、Panayiotopoulos综合征或晚发性儿童枕叶癫痫等的一线药物，但大约16％的患者出现皮肤型过敏反应，会引起危险的甚至致命的皮肤反应（Stevens-Johnson 综合征和中毒性表皮坏死溶解症，SJS/TEN），严重时出现剥脱性皮炎，通常全身粘膜(眼、嘴、生殖器)溃疡，皮肤起水疱，甚至出现全身表皮脱离，如同大面积烫伤，致死性高达40％。这种过敏在南方汉族人群，尤其是在广东及周边地区的汉族人群中发病率明显高于其它地区及人群。

人类白细胞抗原（Human leukocyte antigens，HLA）是人类主要组织相容性复合体的表达产物，在免疫系统中主要负责细胞间的相互识别和诱导免疫反应，调节免疫应答。HLA-B*1502明确为卡西平导致剥脱性皮炎的基因标记，癫痫患者可通过基因筛查降低甚至避免致死性皮肤型不良反应的发生。

《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南（试行）》指明：HLA-B*1502等位基因与卡西平所致SJS/TEN相关。CPIC（临床药物基因组学实施联盟）（2017）指南也已将HLA-B*1502作为预测卡西平/奥卡西平皮肤毒性的A级药物基因组标记物。CPNDS（加拿大药物基因组学网络）（2014）指南指出，对于携带HLA-B*1502等位基因的患者，不建议使用卡西平。美国FDA已批准在卡西平/奥卡西平药品说明书中增加汉族及东南亚裔人群在服用卡西平/奥卡西平前进行HLA-B*1502等位基因筛查的建议，HLA-B*1502阳性的个体应慎用卡西平/奥卡西平，以避免出现严重的皮肤毒性反应。

目前检测方法主要有Sanger测序法、PCR-荧光探针法。但Sanger需要复杂的步骤、昂贵的仪器，且耗时长。PCR-荧光探针法对温度控制要求高，需要昂贵、精密的仪器。市场急需一种简单、快速、便捷的检测HLA-B*1502的方法。

近年来，一种以成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clus teredregularlyinterspaced short palindromic repeat sequences，CRISPR)为特征的基因检测技术发展了起来。CRISPR是发现于细菌和古细菌的调控型RNA，含与特定基因互补序列的CRISPR和CRISPR相关蛋白(Cas)形成的复合体具有针对特定基因的内切酶效应，是近年来十分热门和有前景的基因编辑工具。在2015年，张锋等人发现了新的CRISPR相关蛋白内切酶Cas12a(之前称为Cpf1)，它与常用的Cas9蛋白一样是RNA引导的特异性DNA核酸内切酶，但与相比Cas9，Cas12a又有它自身特点，比如仅需要crRNA即可引导特异性切割双链DNA，并产生粘性末端等。Cas12a一旦识别并切割由crRNA序列指定的靶标DNA，它就转入了一种酶促“激活”状态，这时它能将任意非靶标的单链DNA切成碎片。这种作用称之为附属活性。

重组酶-聚合酶扩增(RPA)是一种快速兴起的恒温扩增技术，通过能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和具有链置换功能的DNA聚合酶，在室温(最佳反应温度为37℃)下即可获得可检测级别的扩增核酸。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种快速检测HLA-B*1502的试剂盒。采用本发明提供的试剂盒检测HLA-B*1502，在试纸条上能清晰、便捷、有效判断结果，使得检测结果肉眼可见，同时无需昂贵复杂仪器：仅需能稳定37℃加热的仪器即可。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种快速检测HLA-B*1502的试剂盒，包括如下组分：干粉反应管、A Buffer、Bbuffer、HLA-B*1502引物Mix、LbaCas12a、crRNA、ssDNA、试纸条、阳性质控品、阴性质控品。

优选地，所述试剂盒中各组分的量为：干粉反应管30管，A Buffer 1.4mL，Bbuffer 85μL，HLA-B*1502引物Mix 140μL，LbaCas12a 70μL，crRNA 70μL，ssDNA 70μL，试纸条30条，阳性质控品25μL，阴性质控品25μL。

优选地，所述HLA-B*1502引物Mix包括HLA-B*1502-F及HLA-B*1502-R，所述HLA-B*1502-F的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.1所示，所述HLA-B*1502-R的核苷酸序列信息如SEQID NO.2所示。

TTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGGATGGC（SEQ ID NO.1）；

GCAGGCTCTCTCGGTAAGTCTGTGTGTTGGT（SEQ ID NO.2）;

优选地，所述crRNA的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.3所示，所述ssDNA的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.4所示，所述ssDNA的核苷酸序列的前后末端分别标有地高辛和生物素标记。

GAUUUAGACUACCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCUAUCUCGUCCUCCCCGGCCUCAUAAC（SEQ IDNO.3）；

Dig-TTTGAAGTGACCAGTAG-biotin（SEQ ID NO.4）；

优选地，所述试纸条为胶体金试纸条，包括样品垫、胶体金标垫、基膜、吸水垫。

优选地，所述胶体金标垫上包含胶体金标记鼠抗地高辛抗体；所述基膜上包含C线及T线，C线为兔抗鼠IgG抗体线，T线是链霉亲和素线。

优选地，所述阳性质控品为含HLA-B*1502基因片段的溶液，所述阴性质控品为水。

本发明还提供了一种利用所述试剂盒快速检测HLA-B*1502的方法，包括如下步骤：

S1、取样本核酸进行RPA反应，获得RPA产物；

S2、将步骤S1获得的RPA产物经Cas12a-crRNA处理，获得经Cas12a-crRNA处理的产物；

S3、将步骤S2所得经Cas12a-crRNA处理的产物进行试纸条检测，判断样本是否属于HLA-B*1502型别。

优选地，步骤S1所述的RPA反应过程如下：往干粉反应管中依次加入10μL的ABuffer、2μL的HLA-B*1502引物Mix、3μL的B Buffer、5μL的模板；振荡混匀；3000-5000rpm离心5s；置于恒温金属浴，于37℃下反应20min。

优选地，步骤S2所述的Cas12a-crRNA处理过程为：向反应管中加入2μL的LbaCas122μL的crRNA和2μL的ssDNA，振荡混匀；3000-5000rpm离心5s；置于恒温金属浴，于37℃下处理15min。

与现有技术相比，本发明提供的试剂盒及其检测方法具有如下优势：

（1）本发明提供的试剂盒中添加了试纸条，使得试验结果在试纸条上能清晰、便捷、有效地判断，且可肉眼判断；

（2）本发明提供的试剂盒应用前景广泛，抛弃了复杂、笨重的仪器，可适用于设备简陋的偏远地区；

（3）采用本发明提供的试剂盒检测HLA-B*1502时，无需昂贵复杂仪器：仅需能稳定37℃加热的仪器即可，如水浴锅、金属浴等，有效降低了检测成本。

附图说明

图1为阳性、阴性结果示意图；

图2为特异性检测结果图；

图3为灵敏度检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例中所用引物、crRNA、ssDNA由生工生物工程股份有限公司合成，干粉反应管、A Buffer、B buffer、LbaCas12a（Cpf1）购自广东美格基因科技有限公司；QIAamp®DNA Mini Kit核酸提取试剂盒（用于提取基因组DNA）购自QIAGEN公司。

实施例1一种用于检测HLA-B*1502的试剂盒和方法

所述试剂盒包括：干粉反应管、A Buffer、Bbuffer、HLA-B*1502引物Mix、LbaCas12a（Cpf1）、crRNA、ssDNA、胶体金试纸条、阳性质控品、阴性质控品、说明书。试剂盒中各成分的主要组分见表1所述：

表1 本发明试剂盒中各组分及其主要组成

编号	组分名称	主要组成成分	总含量
				001	干粉反应管	重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）、链置换DNA聚合酶	30管
002	A Buffer	Tris-AC、KAC等	1.4mL
				003	B Buffer	醋酸镁	85μL
004	HLA-B*1502引物Mix	目的基因引物	140μL
				005	LbaCas12（Cpf1）	Cas蛋白	70μL
006	crRNA	RNA片段	70μL
				007	ssDNA	单链DNA	70μL
008	胶体金试纸条	样品垫、胶体金标垫、基膜、吸水垫等	30条
				P	阳性质控品	含HLA-B*1502基因片段溶液	25μL
N	阴性质控品	水	25μL

所述HLA-B*1502引物Mix包含HLA-B*1502-F及HLA-B*1502-R，所述HLA-B*1502-F的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.1所示，所述HLA-B*1502-R的核苷酸序列信息如SEQ IDNO.2所示；在用于检测HLA-B*1502时，将HLA-B*1502-F及HLA-B*1502-R用双蒸水稀释至0.2-0.5μmol/L，二者等体积混合。

所述crRNA的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.3所示，在实际使用时，用双蒸水稀释至0.1-0.5μmol/L；所述LbaCas12a（Cpf1）在实际使用时，用双蒸水稀释至50-100nmol/L；所述ssDNA的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.4所示；在实际用于检测时用双蒸水稀释至0.2-0.5μmol/L。

所述试剂盒的胶体金试纸条包括：依次相连接的样品垫、胶体金标垫（含胶体金标记鼠抗地高辛抗体）、基膜、吸水垫；所述基膜上设置有C线和T线。

其中C线是兔抗鼠IgG抗体线，T线是链霉亲和素线；其阳性、阴性示意图如图1所示。

当模板为HLA-B*1502阳性的人DNA：恒温扩增（即RPA扩增）中，有靶基因扩增产物；Cas12a在crRNA指导下和扩增产物DNA结合，切割产物DNA和ssDNA。crRNA+Cas12a结合在一起，经过金标垫并结合胶体金；经过C线时显色（胶体金标记鼠抗地高辛抗体和兔抗鼠IgG抗体结合）；经过T线时不显色（ssDNA已经被切割）；判断为阳性。

当模板为不含HLA-B*1502基因片段时：恒温扩增（即RPA）中，没有靶基因扩增产物；指导下没有扩增产物DNA和Cas12a-crRNA结合，则Cas12a的酶活性没被激活，不切割ssDNA。经过金标垫并结合胶体金，在经过C线时显色（胶体金标记鼠抗地高辛抗体和兔抗鼠IgG抗体结合）；经过T线时显色（ssDNA的地高辛和胶体金标记鼠抗地高辛抗体结合，而ssDNA上的生物素和链霉亲和素结合）；判断为阴性。

实施例2特异性检测

以HLA-B*1502阳性的人DNA1（浓度大于等于0.01ng/μL）、HLA-B*1502阴性的人DNA2（浓度大于等于0.01ng/μL）、大肠杆菌DNA、老鼠DNA、阴阳性质控品为样本，分别用本试剂盒进行检测：

1.RPA反应：往干粉反应管中依次加入10μL的A Buffer、2μL的HLA-B*1502引物Mix、3μL的B Buffer、5μL的模板；振荡混匀；3000-5000rpm离心5秒；置于恒温金属浴，37度，20分钟；所述引物Mix由HLA-B*1502-F及HLA-B*1502-R按体积比1：1混合，使用前用双蒸水稀释至0.4μmol/L；

2.Cas12a-crRNA反应：再往反应管中加入2μL的LbaCas12（Cpf1）、2μL的crRNA和2μL的ssDNA，振荡混匀；4000rpm离心5秒；置于恒温金属浴，37度，15分钟；所述LbaCas12（Cpf1）使用前用双蒸水稀释至80nmol/L；所述crRNA使用前用双蒸水稀释至0.3μmol/L；所述ssDNA使用前稀释至0.35μmol/L。

3.取10μL的PCR产物加入到试纸条的样本垫中，室温静置10min，观察试纸条的C线和T线。

试验结果如下表2及图2所示

表2 不同样品特异性检测结果

序号	模板	C线	T线	结果
					1号	HLA-B*1502阳性的人DNA1	显色	不显色	阳性
2号	HLA-B*1502阴性的人DNA1	显色	显色	阴性
					3号	大肠杆菌DNA	显色	显色	阴性
4号	老鼠DNA	显色	显色	阴性
					5号	阳性质控品	显色	不显色	阳性
6号	阴性质控品	显色	显色	阴性

由表2可知，含HLA-B*1502阳性基因片段的模板检测结果是阳性；不含HLA-B*1502阳性基因片段的模板检测结果是阴性，这说明本试剂盒的特异性很好；同时，本发明提供的试剂盒检测HLA-B*1502整个过程的时间为2小时，而已知的检测较快的方法为sanger测序法，说明本发明提供的试剂盒还有效缩短了检测时间。

实施例3灵敏度的检测

将HLA-B*1502阳性的人DNA1分别稀释至10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL，分别以本试剂盒进行检测：

1.往干粉反应管中依次加入10μL的A Buffer、2μL的HLA-B*1502引物Mix、3μL的BBuffer、5μL的模板；振荡混匀；3000rpm离心5秒；置于恒温金属浴，37度，20分钟；所述引物Mix由HLA-B*1502-F及HLA-B*1502-R按体积比1：1混合，使用前用双蒸水稀释至0.3μmol/L；

2.再往反应管中加入2μL的LbaCas12（Cpf1）、2μL的crRNA和2μL的ssDNA，振荡混匀；3000-5000rpm离心5秒；置于恒温金属浴，37度，15分钟；所述LbaCas12（Cpf1）使用前用双蒸水稀释至70nmol/L；所述crRNA使用前用双蒸水稀释至0.5μmol/L；所述ssDNA使用前稀释至0.35μmol/L。

3.将PCR产物加到试纸条的样本垫中，室温静置10min，观察试纸条的C线和T线。

试验结果如图3及表3所示。

表3 不同试验样品的灵敏度检测结果

模板浓度（ng/μL）	T线	C线	结果
				10	显色	不显色	阳性
1	显色	不显色	阳性
				0.1	显色	不显色	阳性
0.01	显色	不显色	阳性

综上，本发明试剂盒的特异性强、灵敏度高；无需昂贵复杂仪器，仅需能稳定37℃加热的仪器即可（如水浴锅、金属浴）；可适用于设备简陋的偏远地区等使用。

最后，应当说明的是，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效试剂变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 广州海思医疗科技有限公司

<120> 一种快速检测HLA-B*1502的试剂盒

<130> 2021.4.6

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> HLA-B*1502-F

<400> 1

ttcgacagcg acgccgcgag tccgaggatg gc 32

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> HLA-B*1502-R

<400> 2

gcaggctctc tcggtaagtc tgtgtgttgg t 31

<210> 3

<211> 62

<212> RNA

<213> crRNA的核苷酸序列(Nucleotide sequence of crRNA)

<400> 3

gauuuagacu acccaaaaac gaaggggacu aaaaccuauc ucguccuccc cggccucaua 60

ac 62

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> ssDNA的核苷酸序列(The nucleotide sequence of ssDNA)

<400> 4

tttgaagtga ccagtag 17

Claims (5)

1.一种快速检测HLA-B*1502的试剂盒，其特征在于，包括如下组分：干粉反应管、HLA-B*1502引物Mix、LbaCas12a、crRNA、ssDNA、试纸条、阳性质控品、阴性质控品；所述HLA-B*1502引物Mix包括HLA-B*1502-F及HLA-B*1502-R，所述HLA-B*1502-F的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.1所示，所述HLA-B*1502-R的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.2所示；所述crRNA的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.3所示，所述ssDNA的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.4所示，所述ssDNA的核苷酸序列的前后末端分别标有地高辛和生物素标记。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各组分的量为：干粉反应管30管，HLA-B*1502引物Mix 140μL，LbaCas12a 70μL，crRNA 70μL，ssDNA 70μL，试纸条30条，阳性质控品25μL，阴性质控品25μL。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试纸条为胶体金试纸条，包括样品垫、胶体金标垫、基膜、吸水垫。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述胶体金标垫上包含胶体金标记鼠抗地高辛抗体；所述基膜上包含C线及T线，C线为兔抗鼠IgG抗体线，T线是链霉亲和素线。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含HLA-B*1502基因片段的溶液，所述阴性质控品为水。

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