CN114317712A - 用于胚胎植入前线粒体基因检测的试剂盒、建库方法和测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于胚胎植入前线粒体基因检测的试剂盒、建库方法和测序方法,试剂盒包括预扩增试剂和指数扩增试剂,预扩增试剂含有用于预扩增线粒体靶基因的第一特异性引物对,指数扩增试剂含有用于对线粒体靶基因的预扩增产物进行指数扩增的第二特异性引物对,第二特异性引物对连接有测序接头序列。本发明的试剂盒通过预扩增试剂对线粒体靶基因进行预扩增,而后通过指数扩增试剂中对预扩增的产物进行指数扩增,相比于原胚胎样本,放大了线粒体靶基因占全基因组DNA的比例,对于低频的线粒体基因变异也能准确检出,从而提高了胚胎植入前线粒体基因检测的灵敏度和准确度。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体而言,涉及一种用于胚胎植入前线粒体基因检测的试剂盒、建库方法和测序方法。
背景技术
线粒体DNA(mtDNA)异常可导致严重的线粒体遗传病,至今无法治愈,只能依赖于缓解症状以及延缓病情进展的辅助治疗,因此线粒体遗传病的预防尤为重要。目前用于预防线粒体遗传病的常规方法有产前诊断和胚胎植入前遗传学检查(PGT)。其中,产前诊断是在早期妊娠不同阶段对胚胎细胞进行采样,发现高水平mtDNA突变时可选择终止妊娠,降低子代患严重线粒体遗传病的风险。然而,确定一个产前诊断的mtDNA突变安全阈值,并确保该阈值之下的子代以后不会患线粒体遗传病还难以实现,而且产前诊断对于高水平mtDNA突变的胎儿需要进行引产终止妊娠,对孕妇和家庭伤害很大。
基于体外受精-胚胎移植技术的PGT是指从早期胚胎中取出一个或多个细胞进行基因检测,选择无突变或低突变负荷的胚胎移植到子宫,以减少线粒体遗传病的风险。
mtDNA疾病的胚胎植入前遗传学检查通常采用限制性片段长度多态性和扩增阻碍突变系统两种检测手段。其中,限制性片段长度多态性(restriction fragmentlengthpolymporphism,,RFLP)是指由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出现,引起不同个体在用同一限制酶酶切时,DNA片段长度出现差异,进而检测突变;该技术应用在线粒体疾病的胚胎基因筛查时,通常取活检胚胎,通过细胞裂解获取全部的基因组产物,随后通过荧光标记引物进行PCR,采用限制性内切酶消化及电泳的方法对PCR产物进行分析,判断胚胎携带的线粒体变异的比例。然而,限制性内切酶价格昂贵,且不易获得,操作步骤繁琐复杂,费时费力,灵敏度低,且检测结果常需要Sanger测序法验证,而Sanger测序对极低比例的线粒体变异检测灵敏度低,只能检测到20%以上的变异比例;且此方法进行的线粒体疾病胚胎植入前检测只能进行此变异位点的检测,胚胎样本全部用于进行线粒体变异位点检测,无法进行其他基因组检测,如胚胎植入前染色体非整倍体筛查。
扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutation system,ARMS)又称等位基因特异性扩增(A11eles specific amplification,ASA),利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理,设计等位基因特异性PCR扩增引物,只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带,从而检测突变。然而,对于点突变检测,由于野生型与突变型只有一个碱基的区别,即使采用ARMS也会产生非特异性扩增,其准确性及灵敏度较低。
如何提高mtDNA变异检测的灵敏度是mtDNA疾病的胚胎植入前遗传学检查的难点。
发明内容
为了解决上述问题,本发明的第一目的在于提供一种用于胚胎植入前线粒体基因检测的试剂盒,试剂盒包括预扩增试剂和指数扩增试剂,预扩增试剂含有用于预扩增线粒体靶基因的第一特异性引物对,指数扩增试剂含有用于对线粒体靶基因的预扩增产物进行指数扩增的第二特异性引物对,第二特异性引物对连接有测序接头序列,第二特异性引物对的5’端连接有测序接头序列。
本发明的试剂盒通过预扩增试剂中的第一特异性引物对对线粒体靶基因进行预扩增,而后通过指数扩增试剂中的第二特异性引物对对预扩增的产物进行指数扩增,相比于原胚胎样本,放大了线粒体靶基因占全基因组DNA的比例,对于低频的线粒体基因变异也能准确检出,从而提高了胚胎植入前线粒体基因检测的灵敏度和准确度。
本发明的一种实现方式中,第一特异性引物对和第二特异性引物对的序列相同;和/或
第二特异性引物对包括第一上游引物和第一下游引物,第一上游引物和第一下游引物分别互补于线粒体靶基因不同的两条链;和/或
测序接头序列包括第一测序接头序列和第二测序接头序列,第一上游引物的5’端连接有第一测序接头序列,第一下游引物的5’端连接有第二测序接头序列。
本发明的一种实现方式中,第一上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示,第一下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的一种实现方式中,线粒体靶基因包括ATP6基因。
本发明的一种实现方式中,ATP6基因存在m.8993T>C突变。
本发明的一种实现方式中,第二测序接头的5’端连接有标签序列。
本发明的一种实现方式中,指数扩增试剂还包括通用引物。
本发明的一种实现方式中,通用引物包括通用上游引物和通用下游引物;
通用上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示,通用下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的一种实现方式中,预扩增试剂还包括预扩增缓冲液和预扩增酶液中的至少一种;和/或
指数扩增试剂还包括指数扩增缓冲液、指数扩增酶液以及无核酸酶水中的至少一种。
本发明的一种实现方式中,试剂盒还包括细胞裂解试剂和扩增产物纯化试剂中的至少一种。
本发明的一种实现方式中,细胞裂解试剂包括细胞提取缓冲液、细胞裂解缓冲液,细胞裂解酶液中的至少一种。
本发明的第二目的在于提供一种用于胚胎植入前线粒体基因检测的建库方法,方法包括:
获取胚胎植入前胚胎样本的全基因组DNA;
采用上述试剂盒,利用第一特异性引物对胚胎样本全基因组DNA中的线粒体靶基因进行预扩增,通过用第二特异性引物对胚胎样本基因组DNA的预扩增产物进行指数扩增,以获得胚胎植入前胚胎样本的线粒体靶基因测序文库。
本发明的第三目的在于提供一种用于胚胎植入前线粒体基因检测的检测方法,包括:采用上述建库方法,构建胚胎植入前胚胎样本的线粒体靶基因测序文库,采用线粒体靶基因测序文库进行上机测序,以检测胚胎样本的线粒体基因突变信息。
本发明公开的用于胚胎植入前线粒体基因检测的试剂盒,通过预扩增试剂中的第一特异性引物对对线粒体靶基因进行预扩增,而后通过指数扩增试剂中的连接有测序接头序列的第二特异性引物,对预扩增的产物进行指数扩增即可得到能够用于上机测序的测序文库,相比于原胚胎样本,不仅放大了线粒体靶基因占全基因组DNA的比例,对于低频的线粒体基因变异也能准确检出从而提高了胚胎植入前线粒体基因检测的灵敏度和准确度,还实现了扩增建库的一步完成,提高了线粒体基因变异的检测效率。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
因此,旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述,而非意在限制本发明更广阔的方面。
如本文,术语“引物”指寡核苷酸,无论其是在经纯化的限制性消化物中天然存在或是合成产生的,寡核苷酸当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时(例如,存在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶和在合适的温度和pH下),寡核苷酸能够作为合成的起始点而起作用。引物优选是单链的,以用于扩增的最大效率,但可选地也可以是双链的。如果是双链的,则在用于制备延伸产物前,首先将引物处理以分开其链。优选地,引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物应足够长,以在诱导剂存在的情况下引发延伸产物的合成。引物的精确长度将取决于许多因素,包括温度、引物来源和方法的使用。例如,在一些实施方案中,引物范围为10-100或更多个核苷酸(例如10-300、15-250、15-200、15-150、15-100、15-90、20-80、20-70、20-60、20-50个核苷酸等)。
现有预防线粒体遗传病的常规方法有产前诊断和胚胎植入前遗传学检查(PGT)。其中,产前诊断对于高水平mtDNA突变的胎儿需要进行引产终止妊娠,对孕妇和家庭伤害很大;采用限制性片段长度多态性进行PGT需要使用限制性内切酶,其价格昂贵,且不易获得,操作步骤繁琐复杂,费时费力,灵敏度低,且检测结果常需要Sanger测序法验证,而Sanger测序对极低比例的线粒体变异检测灵敏度低,只能检测到20%以上的变异比例;且此方法进行的线粒体疾病胚胎植入前检测只能进行此变异位点的检测,胚胎样本全部用于进行线粒体变异位点检测,无法进行其他基因组检测,如胚胎植入前染色体非整倍体筛查;采用扩增阻碍突变系统进行PGT会产生非特异性扩增,其准确性及灵敏度较低。
为了至少部分解决上述技术问题的至少一个,本发明的第一方面提供了一种用于胚胎植入前线粒体基因检测的试剂盒,试剂盒包括预扩增试剂和指数扩增试剂,预扩增试剂含有用于预扩增靶基因的第一特异性引物对,用于对线粒体靶基因进行特异性扩增,指数扩增试剂包括第二特异性引物对,第二特异性引物对和第一特异性引物对具有相同的碱基序列,且第二特异性引物对连接有测序接头,用于对胚胎样本的预扩增产物进行指数扩增,以在扩增结束后放大胚胎样本线粒体靶基因的同时,实现线粒体靶基因测序文库的构建。
本实施例用于胚胎植入前线粒体基因检测的试剂盒,采用预扩增试剂和指数扩增试剂组合,相比于原胚胎样本,提高了指数扩增时线粒体靶基因模板比例,放大了指数扩增产物中胚胎样本的线粒体基因信息,使得低频线粒体基因变异也能准确检出,从而提高了胚胎植入前线粒体基因检测的灵敏度和准确度。
此外,本实施例在进行指数扩增时,第二特异性引物对连接有测序接头序列,能够在对预扩增产物进行扩增时,实现线粒体靶基因测序文库的构建,后续上机测序前,不需要再构建测序文库,简化了线粒体基因变异检测的流程,提高了线粒体基因变异检测的效率。
在一些实施方案中,测序接头序列包括适用于MGI/BGI、Ion Torrent、Illumina平台的测序接头序列中的至少一种。其中,MGI/BGI测序平台是指华大基因的测序平台,IonTorrent是指半导体测序平台,Illumina是指Illumina公司的测序平台。
一些实施方案中,第二特异性引物对包括第一上游引物和第一下游引物,第一上游引物的5’端连接有第一测序接头序列,第一下游引物的5’端连接有第二测序接头序列,以用于对预扩增的线粒体靶基因进一步进行特异性指数扩增。
一些实施方案中,第二测序接头序列的3’端连接有标签序列,标签序列也可以称为barcode序列,用于作为不同样品的测序数据的身份标识。
一些实施方案中,第一特异性引物对包括第二上游引物和第二下游引物,第二上游引物和第一上游引物的序列相同,第二下游引物和第一下游引物的序列相同。
一些具体实施方案中,线粒体靶基因包括ATP6基因,ATP6基因存在m.8993T>C突变,第一上游引物的序列第一上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示,第一下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示,从而能够对线粒体靶基因ATP6基因的m.8993T>C突变进行检测;
其中,SEQ ID NO.1:CCCTAGCCCACTTCTTACCA;
SEQ ID NO.2:GGTGGCCTGCAGTAATGTTAG。
一些实施方案中,指数扩增试剂中含有通用引物,通用引物能够对全基因组进行扩增,其扩增产物既能用于线粒体靶基因的检测,又能够用于开展胚胎植入前非整倍体筛查,从而可以提高胚胎利用率。
一些具体实施方案中,通用引物包括通用上游引物和通用下游引物;其中,通用上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示,通用下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
其中,SEQ ID NO.3:TGTGTTGGGTGTGTTTGG;
SEQ ID NO.4:GGTTTGTGTGGGTTGTGT。
一些实施方案中,预扩增试剂还包括预扩增缓冲液和预扩增酶液中的至少一种。
一些具体实施方案中,预扩增缓冲液包括氯化镁、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、二硫苏糖醇,预扩增酶液包括DNA聚合酶、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钾、二硫苏糖醇和甘油。
一些实施方案中,指数扩增试剂还包括指数扩增缓冲液、指数扩增酶液以及无核酸酶水中的至少一种。
一些具体实施方案中,指数扩增缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾、二硫苏糖醇;指数扩增酶液包括DNA聚合酶、乙二胺四乙酸、氯化钾、二硫苏糖醇和甘油。
一些实施方案中,试剂盒还包括细胞裂解试剂和扩增产物纯化试剂中的至少一种。
一些具体实施方案中,标签序列可以为适用于MGI平台的标签序列,如TGGCAAGCTA。
一些实施方案中,细胞裂解试剂包括细胞提取缓冲液、细胞裂解缓冲液,细胞裂解酶液中的至少一种。
一些具体实施方案中,细胞提取缓冲液包括磷酸二氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾;细胞裂解缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇;细胞裂解酶液包括细胞裂解酶液、乙二胺四乙酸、氯化钾、二硫苏糖醇和甘油。
本申请的第二方面提供了一种用于胚胎植入前线粒体基因检测的建库方法,包括:
获取胚胎植入前胚胎样本的全基因组DNA;
采用上述试剂盒,利用第一特异性引物对胚胎样本全基因组DNA中的线粒体靶基因进行预扩增,通过用第二特异性引物对胚胎样本基因组DNA的预扩增产物进行指数扩增,以获得胚胎植入前胚胎样本的线粒体靶基因测序文库。
在一些实施方案中,胚胎植入前胚胎样本为单细胞胚胎样本,通过对单细胞胚胎样本进行细胞裂解,得到胚胎样本的全基因组DNA。
一些具体实施方案中,可以通过Picoplex全基因组扩增方法扩增全基因组DNA,以获取胚胎样本的全基因组DNA。
进一步,采用上述试剂盒中预扩增试剂提高全基因组DNA中的靶基因模板的比例,并采用指数扩增试剂对胚胎样本的全基因组DNA进行扩增,以及对靶基因进行指数扩增放大全基因组DNA中的靶基因信息,对扩增产物纯化后,得到含有接头的靶基因测序文库,该测序文库能够直接用于上机测序,不仅实现同步对靶基因的扩增和建库,简化了线粒体基因的测序流程,提高了测序效率,还实现对低频的线粒体变异基因进行检出,提高线粒体基因变异的检测灵敏度和准确度。
因此,本申请的第三方面提供了一种用于胚胎植入前线粒体基因检测的测序方法,包括:采用上述建库方法构建胚胎植入前胚胎样本的靶基因测序文库,对测序文库进行上机测序,以检测胚胎样本的线粒体基因突变信息。
一些具体实施方案中,根据测序接头类型的不同,可以对文库进行相应的处理。如华大平台要求上机的文库为纳米球(DNB),正向引物5’端需要磷酸化,制备好的靶基因文库需要变性成单链DNA,再通过连接反应将单链DNA连接成单链环状DNA,制备成纳米球文库后再在华大平台上机测序。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1
本实施例募集了1个有线粒体疾病的患者家系和1个胚胎活检样本,样本信息见表1,抽取患者家系成员的外周血样本,利用天根全血提取试剂盒提取家系基因组DNA 100pg,极低起始量外周血基因组DNA和胚胎活检样本均通过Picoplex全基因组扩增方法扩增全基因组DNA,并在预扩增后,通过加入带MGI平台接头的引物,通过指数扩增获得目标区域扩增子文库,检测患者家系的线粒体突变信息。
表1
编号 | 样本 | m.8993T>C理论突变负荷 |
1 | 家系成员1 | 0.512 |
2 | 家系成员2 | 0.0412 |
3 | 家系成员3 | 0.0704 |
4 | 家系成员4 | 0.0253 |
5 | 胚胎活检样本 | 0 |
表2
引物名称 | 序列 |
m.8993F | CCCTAGCCCACTTCTTACCA |
m.8993R | GGTGGCCTGCAGTAATGTTAG |
表3
本实施例以线粒体ATP6基因m.8993T>C突变检测为例,设计了一对特异性引物对,扩增产物覆盖m.8993突变位点,特异性引物对信息见表2,在特异性引物对包括的引物上加上MGI接头,加接头后引物信息见表3,其中,表3中下划线部分的序列即为MGI平台Barcode序列,对患者家系进行m.8993T>C突变负荷分析,实现了准确检测一个患者家系m.8993T>C突变负荷,具体实验步骤如下。
1.利用Picoplex全基因组扩增法扩增外周血和胚胎活检样本全基因组DNA
1.1细胞裂解
1)将装有细胞样本的0.2mL PCR管短暂离心10秒,放置于冰上,在装有细胞样本的0.2mL PCR管中依次加入表4中的试剂,涡旋5秒,使溶液混匀,用离心机低速离心10秒,使管壁和盖子上无明显液滴。
表4
组分 | 反应体积(μL) |
单细胞样本 | X(X≤2.5) |
细胞提取缓冲液 | 5-X |
细胞裂解缓冲液 | 4.8 |
细胞裂解酶液 | 0.2 |
反应体系总量 | 10 |
2)设置PCR仪反应程序,按照表5的反应条件进行孵育。
表5
1.2预扩增
1)从PCR仪中取出反应结束的样本,室温放置,依次加入表6中的试剂,涡旋5秒,使溶液混匀,用离心机低速离心10秒,使管壁和盖子上无明显液滴,其中,m.8993位点特异性引物信息见表2。
表6
组分 | 反应体积(μL) |
裂解后的样本 | 10 |
预扩增缓冲液 | 4.6 |
10×特异性引物Mix | 0.2 |
预扩增酶液 | 0.2 |
反应体系总量 | 15 |
2)设置PCR仪反应程序,按照表7的反应条件进行孵育。
表7
1.3指数扩增
1)从PCR仪中取出反应结束的样本,放置于冰上,依次加入表8中的试剂,涡旋5秒,使溶液混匀,用离心机低速离心10秒,使管壁和盖子上无明显液滴,其中,带MGI平台接头引物信息见表3。
表8
2)设置PCR仪反应程序,按照表9的反应条件进行孵育。
表9
1.4扩增产物纯化
PCR反应结束后,产物短暂离心,加入125μL AMPure XP磁珠,用枪吹打混匀,室温放置5分钟,放置到磁力架上,等液体清亮,去上清,用200μL的80%酒精清洗,重复一次,室温干燥磁珠,用33μL Nuclease free-water进行磁珠重悬,洗脱DNA。
1.5扩增文库定量
使用q-PCR进行文库定量。
2.上机测序
制备好的文库变性成单链DNA,再通过连接反应将单链DNA连接成单链环状DNA,制备成纳米球文库后,在华大平台上机测序。
3.数据分析
将上机测序得到的reads比对到hg19参考基因组,未比对上的reads和比对到线粒体的reads合并到一起,再重新比对到线粒体基因组,采用商业软件sention TNscope检测线粒体变异。
4.分析结果
m.8993T>C突变负荷的检测结果如表10所示。
表10
样本编号 | 样本 | 检出突变负荷 | 理论突变负荷 |
1 | 家系成员1 | 0.5540±0.1762 | 0.5120 |
2 | 家系成员2 | 0.0393±0.0225 | 0.0412 |
3 | 家系成员3 | 0.0927±0.0078 | 0.0704 |
4 | 家系成员4 | 0.0197±0.0104 | 0.0253 |
5 | 阴性对照 | 0.0027±0.0006 | 0 |
6 | 胚胎活检样本 | 0.0026±0.0002 | 0 |
根据表10检测结果可知,本实施例对线粒体基因m.8993T>C位点的突变负荷进行检测,对于极低突变负荷2%~7%的情形,在微量DNA水平下,也能对低频突变负荷成功检测出;对于高频突变负荷(50%以上)也能够准确检测,而对于阴性样本及阴性胚胎活检样本,其突变负荷检出接近0,检出的这种及低频的变异比例为测序背景误差导致。
实施例2
本实施例与实施例1的建库方式以及其他实验步骤相同,但建库过程中使用的特异性引物不同,进而采用的带MGI平台接头引物序列也与实施例1不同,从而对线粒体基因m.8993T>C位点的突变负荷进行检测。
本实施例使用的线粒体基因特异性引物序列见表11,带MGI平台接头的引物序列见表12。
表11
引物名称 | 序列 |
m8993F2 | CACCTACACCCCTTATCCTC |
m8993R2 | GTAGAGGCTTACTAGAAGTGTG |
表12
本对比例对线粒体基因m.8993T>C位点的突变负荷的检测结果如表13所示。
表13
根据表13的检测结果可知,线粒体基因的不同特异性引物通过扩增构建的测序文库对于线粒体基因m.8993T>C位点的突变负荷检测的具有不同的影响,实施例1中的特异性引物通过一步扩增构建的测序文库对于线粒体基因m.8993T>C位点的突变负荷检测的准确性更高。
实施例3
本实施例采用与实施例1的建库方式不同,其他实验步骤相同的方法,对线粒体基因m.8993T>C位点的突变负荷进行检测。本实施例采用常规建库方式,通过Picoplex全基因组扩增方法扩增全基因组DNA,采用与实施例1表2中给出的m.8993位点特异性引物构建扩增目的区域的带MGI平台接头引物序列,然后通过MGIEasy酶切DNA文库制备试剂盒建库。
具体地,本实施例采用以下步骤对线粒体基因m.8993T>C位点的突变负荷进行检测:
1.利用Picoplex全基因组扩增法扩增外周血和胚胎活检样本全基因组DNA
1.1细胞裂解方法同实施例1
1.2预扩增
1)从PCR仪中取出反应结束的样本,室温放置,依次加入表14中的试剂,涡旋5秒,使溶液混匀,用离心机低速离心10秒,使管壁和盖子上无明显液滴。
表14
组分 | 反应体积(μL) |
裂解后的样本 | 10 |
预扩增缓冲液 | 4.8 |
预扩增酶液 | 0.2 |
反应体系总量 | 15 |
2)设置PCR仪反应程序,按照表15的反应条件进行孵育。
表15
1.3指数扩增
1)从PCR仪中取出反应结束的样本,放置于冰上,依次加入表16中的试剂,涡旋5秒,使溶液混匀,用离心机低速离心10秒,使管壁和盖子上无明显液滴。
表16
组分 | 反应体积(μL) |
预扩增样本 | 15 |
扩增缓冲液 | 25 |
扩增酶 | 0.8 |
无核酸酶水 | 34.2 |
反应体系总量 | 75 |
2)设置PCR仪反应程序,按照表17的反应条件进行孵育。
表17
1.4扩增产物纯化
PCR反应结束后,产物短暂离心,加入125μL AMPure XP磁珠,用枪吹打混匀,室温放置5分钟,放置到磁力架上,等液体清亮,去上清,用200μL的80%酒精清洗,重复一次,室温干燥磁珠,用33μL Nuclease free-water进行磁珠重悬,洗脱DNA。
1.5PCR扩增
1)将0.2mL PCR管放置于冰上,向0.2mL PCR管中依次加入表18中的试剂,涡旋5秒,使溶液混匀,用离心机低速离心10秒,使管壁和盖子上无明显液滴,其中,m.8993位点特异性引物信息见表2。
表18
2)设置PCR仪反应程序,按照表19的反应条件进行孵育。
表19
1.6文库构建
通过MGIEasy酶切DNA文库制备试剂盒对上述扩增产物进行末端修复&加A尾,接头连接,PCR扩增,从而构建出扩增子文库。
1.7扩增文库定量
吸取2μL纯化后文库进行Qubit浓度测定。
2.上机测序
制备好的文库变性成单链DNA,再通过连接反应将单链DNA连接成单链环状DNA,制备成纳米球文库后,在华大平台上机测序。
3.数据分析
将上机测序得到的reads比对到hg19参考基因组,未比对上的reads和比对到线粒体的reads合并到一起,再重新比对到线粒体基因组,采用商业软件sention TNscope检测线粒体变异。
4.分析结果
m.8993T>C突变负荷的检测结果如表20所示。
表20
本发明方法比常规建库方法操作简单,更节约成本和时间。根据表20检测结果可知,采用本发明方法比常规建库方法在线粒体基因m.8993T>C位点的突变负荷检测时准确性更高。
因此,本发明的检测方法对于低含量DNA的突变负荷的检测具有高准确性,对于胚胎水平的线粒体突变负荷检测也具有可行性,可应用于线粒体疾病的胚胎植入前遗传学检测,通过对胚胎线粒体变异位点的检测,选择无突变或者极低突变负荷的胚胎进行植入,生育无线粒体疾病表型的下一代,阻断线粒体疾病的向下传递。
此外,本发明利用单细胞扩增方法放大了胚胎基因组信息,除了可以用于线粒体突变负荷的检测,同时可开展胚胎植入前非整倍体筛查,提高了胚胎样本的利用率。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (12)
1.一种用于胚胎植入前线粒体基因检测的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括预扩增试剂和指数扩增试剂,所述预扩增试剂含有用于预扩增线粒体靶基因的第一特异性引物对,所述指数扩增试剂含有用于对线粒体靶基因的预扩增产物进行指数扩增的第二特异性引物对,所述第二特异性引物对连接有测序接头序列。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述第一特异性引物对和所述第二特异性引物对的序列相同;和/或
所述第二特异性引物对包括第一上游引物和第一下游引物,所述第一上游引物和第一下游引物分别互补于线粒体靶基因不同的两条链;和/或
所述测序接头序列包括第一测序接头序列和第二测序接头序列,所述第一上游引物的5’端连接有第一测序接头序列,所述第一下游引物的5’端连接有第二测序接头序列。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述第一上游引物的序列如SEQ IDNO.1所示,所述第一下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述线粒体靶基因包括ATP6基因。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述ATP6基因存在m.8993T>C突变。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述指数扩增试剂还包括通用引物;和/或
所述预扩增试剂还包括预扩增缓冲液和预扩增酶液中的至少一种;和/或
所述指数扩增试剂还包括指数扩增缓冲液、指数扩增酶液以及无核酸酶水中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述通用引物包括通用上游引物和通用下游引物;
所述通用上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示,所述通用下游引物的序列如SEQ IDNO.4所示。
8.根据权利要求1~7任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括细胞裂解试剂和扩增产物纯化试剂中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述细胞裂解试剂包括细胞提取缓冲液、细胞裂解缓冲液和细胞裂解酶液中的至少一种。
10.一种用于胚胎植入前线粒体基因检测的建库方法,其特征在于,所述方法包括:
获取胚胎植入前胚胎样本的全基因组DNA;
采用权利要求1~9任一项所述的试剂盒中的所述第一特异性引物对胚胎样本全基因组DNA中的线粒体靶基因进行预扩增,通过用第二特异性引物对胚胎样本基因组DNA的预扩增产物进行指数扩增,以获得胚胎植入前胚胎样本的线粒体靶基因测序文库。
11.一种用于胚胎植入前线粒体基因的检测方法,其特征在于,包括:采用如权利要求10所述的建库方法,构建胚胎植入前胚胎样本的线粒体靶基因测序文库;
采用所述线粒体靶基因测序文库进行上机测序,以检测胚胎样本的线粒体基因突变信息。
12.根据权利要求10所述的用于胚胎植入前线粒体基因检测的建库方法,或者根据权利要求11所述的用于胚胎植入前线粒体基因的检测方法,其特征在于,所述胚胎样本为单细胞胚胎样本。
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