CN111621556A - 一种检测人线粒体atp6基因8993位点基因型的试剂盒及方法 - Google Patents

一种检测人线粒体atp6基因8993位点基因型的试剂盒及方法 Download PDF

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章志国
魏兆莲
周平
王喆
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Abstract

一种检测人线粒体ATP6基因8993位点基因型的试剂盒，包括用于扩增线粒体ATP6基因8993位点的PCR引物和Taqman‑MGB探针。荧光定量PCR法是分子诊断领域应用最广泛的一种检测手段，该方法灵敏度高、操作简便，适合大规模的临床应用，特别是ABI公司的MGB探针技术在单核苷酸分型方面更是具有广阔的市场。MGB探针上的小沟结合物能够提高探针的Tm值，设计的比普通Taqman探针短，无背景荧光，而且具有能分辨一个碱基差异的能力，非常适合用于SNP分型检测。

Description

一种检测人线粒体ATP6基因8993位点基因型的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及一种检测人线粒体ATP6基因8993位点基因型的试剂盒及方法，属于基因检测技术领域。
背景技术
Leigh综合征(Leigh syndrome,LS)是婴儿和儿童时期最常见的一种线粒体疾病，其特征是脑干、基底节、丘脑和脊髓的双侧对称性坏死性病变。LS的遗传方式包括常染色体隐性遗传，X连锁的隐性遗传和母系遗传，这是因为线粒体中的氧化磷酸化酶组成成分是由核基因组和线粒体基因组共同编码的。据国外研究资料，线粒体基因组突变约占Leigh综合征病因的10％。其中以点突变最为多见，极少数为插入和大片段的缺失所致，迄今已经报道了19种与Leigh综合征相关的线粒体基因突变。其中线粒体ATP6基因8993T>G突变已被证实会导致中国人Leigh综合征，在产前诊断筛查线粒体病中有十分重要的意义。
目前常用的检测基因多态性的方法有DNA直接测序法、限制性片段长度多态性分析法(PCR-PFLP)、高分辨溶解曲线(HRM)、基因芯片、液相芯片法、荧光定量PCR法等。测序法是公认的基因突变检测的金标准，能够准确地显示可能存在的具体突变类型，但测序法所用的设备成本高、检测时间稍长、操作繁琐、灵敏度较低，而且结果判读复杂，对操作者要求较高，难以形成商业化的诊断产品。限制性片段长度多态性分析步骤繁多、灵敏度低，而且检测结果经常需要测序法确认，也不是适用于临床检测的简便有效的方法。高分辨溶解曲线是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。但是该方法难于筛查纯合突变，并且假阳性、假阴性较高，PCR条件苛刻，不能分型，而且检测结果需要测序法确认。基因芯片和液相芯片虽能准确区分具体的突变类型，但是其对设备要求高，难以大规模推广，多用于科研单位。
中华神经科杂志2003年2月第36卷第1期公开的《Leigh综合征的线粒体DNA突变分析》，其采用探针为mtDNA第1-740核苷酸的片段。且其结果判断依赖于以内切酶ApaⅠ酶切的结果，没有进行DNA测序进行最终判断，因此，使用该方法的引物是否达到检测的目的无法判断。因此，有必要设计一种检测线粒体8993位点基因型的试剂盒及检测方法。
发明内容
为克服上述现有技术中的不足，本发明目的在于提供一种检测人线粒体ATP6基因8993位点基因型的试剂盒及方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种检测人线粒体ATP6基因8993位点基因型的试剂盒，其特征在于：包括用于扩增线粒体ATP6基因8993位点的PCR引物和Taqman-MGB探针；
所述PCR引物包括：上游引物F：5′-GTTATTATCGAAACCATCAGCCT-3′；
下游引物R：5′-AGTAGGTGGCCTGCAGTAATGT-3′；
所述探针包括：Taqman-MGB探针PT:5′VIC-CAATAGCCCGGGCC-MGB-3′；
Taqman-MGB探针PG:5′FAM-CAATAGCCCTGGCC-MGB-3′。
优选的技术方案为：还包括PCR预混液，该PCR预混液中含有PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、MgCl2和dNTPs。
优选的技术方案为：包含阳性对照品，该阳性对照品包括线粒体ATP6基因8993位点TT型质粒、线粒体ATP6基因8993位点GG型质粒。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种检测线粒体8993位点基因型的方法，包括下列步骤：
步骤1：提取待测样品DNA；
步骤2：在PCR反应管中加入PCR预混液、引物、探针、无菌的超纯水和步骤1提取的模板DNA，得到反应体系；同时建立TT型对照管、GG型对照管、TG型对照管和空白对照管；所述TT型对照管中用线粒体ATP6基因8993位点TT型质粒替代步骤1提取的模板DNA；所述GG型对照管中用线粒体ATP6基因8993位点GG型质粒替代步骤1提取的模板DNA；所述TG型对照管中用线粒体ATP6基因8993位点TT型质粒和线粒体ATP6基因8993位点GG型质粒的混合物替代步骤1提取的模板DNA；所述空白对照管用无菌的超纯水替代步骤1提取的模板DNA；
所述PCR引物包括：上游引物F：5′-GTTATTATCGAAACCATCAGCCT-3′；
下游引物R：5′-AGTAGGTGGCCTGCAGTAATGT-3′；
所述探针包括：Taqman-MGB探针PT:5′VIC-CAATAGCCCGGGCC-MGB-3′；
Taqman-MGB探针PG:5′FAM-CAATAGCCCTGGCC-MGB-3′；
步骤3：将反应体系混合好后，进行荧光PCR扩增；
步骤4：根据FAM通道和HEX通道的扩增情况来进行结果判定，仅FAM通道有扩增S型曲线，判断该样品为TT型，仅VIC通道有扩增S型曲线，判断该样品为GG型，FAM和VIC通道均有S型曲线则判断为TG型。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
荧光定量PCR法是分子诊断领域应用最广泛的一种检测手段，该方法灵敏度高、操作简便，适合大规模的临床应用，特别是ABI公司的MGB探针技术在单核苷酸分型方面更是具有广阔的市场。MGB探针上的小沟结合物能够提高探针的Tm值，设计的比普通Taqman探针短，无背景荧光，而且具有能分辨一个碱基差异的能力，非常适合用于SNP分型检测。
附图说明
图1为检测步骤示意图。
图2为合成TT型对照质粒。
图3为合成GG型对照质粒。
图4为合成TG型对照质粒。
图5为血样DNA模板量梯度稀释扩增结果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1：一种检测人线粒体ATP6基因8993位点基因型的试剂盒及方法
一、胚胎活检操作程序
二、活检液及操作皿的准备
活检液：极体(受精培养液)、卵裂期胚胎(卵裂培养液)、囊胚(囊胚培养液)
活检操作皿：Falcon351006皿，皿底标记患者姓名。做3个10ul活检液滴和1个10ul的PVP滴，封油，置37℃，5％CO2，5％O2，90％N2培养箱备用。
活检后胚胎培养皿：Nunclon108173皿，用平衡后的培养液(极体-受精培养液、卵裂胚-卵裂液、囊胚-囊胚液)做数个(根据活件胚胎数目)35微升的培养滴，封油，置培养箱备用。
胚胎活检操作步骤
打开倒置镜及显微操作系统的开关。在4×物镜下装活检针和固定针，将针尖移至视野中央，在20×物镜下进行微调。
透明带打孔：胚胎活检包括透明带打孔与卵裂球或极体获取两个基本过程。透明带打孔方法：激光打孔法(激光破膜仪，美国Hamilton Thorne公司)。
极体活检：将极体固定在12点位置，在极体右侧水平位置打孔(激光脉冲200微秒，强度100％)，将平口胚胎活检针(ID 15μm)沿透明带破口水平进入，调焦对准极体，将极体缓慢吸出。
卵裂胚胎活检：将待检的卵裂球置于3点位置，在其右侧透明带处激光(激光脉冲400微秒，强度100％)打孔，胚胎活检针(ID 30μm)沿透明带破口进入胚胎内，通过活检针吸取极体或卵裂球，轻轻将该卵裂球吸出。
囊胚活检：取卵后第5-7天的发育到4期的囊胚，将内细胞团置于9点上下位置，活检3点位置滋养层细胞，3点处透明带激光打孔(激光脉冲400微秒，强度100％)；待囊胚皱缩，将活检针(ID 20μm)吸住少量滋养层细胞(约10-15个细胞)，持卵针和活检针慢慢向两边拉；对准被拉开的滋养层细胞之间的胞间连接连续发射激光(激光脉冲700微秒，强度100％)，同时继续轻轻将囊胚和活检的滋养层细胞向两边拉，直至滋养层细胞与囊胚分离。。
将活检出来的极体/卵裂球/滋养层细胞用拉制的巴斯德管转移至含有4μl PBS的PCR管内用于DNA提取和数字PCR检测，活检后的卵子或胚胎移入相应培养液继续培养。
三、待测样品DNA提取
血液样品DNA提取：采用磁珠法核酸提取试剂盒提取，提取的DNA测定OD值，并保存于-20度。
6份囊胚细胞、4份极体细胞DNA提取：采用REPLI-g Singel Cell Kit试剂盒提取，做到加stop buffer后保存于-20度。
试剂盒：包括引物、探针、PCR预混液、标准对照品、无菌水。
所述的用于扩增线粒体ATP6基因8993位点的PCR引物和Taqman-MGB探针。
上游引物F：5′-GTTATTATCGAAACCATCAGCCT-3′；
下游引物R：5′-AGTAGGTGGCCTGCAGTAATGT-3′；
Taqman-MGB探针PT:5′VIC-CAATAGCCCGGGCC-MGB-3′；
Taqman-MGB探针PG:5′FAM-CAATAGCCCTGGCC-MGB-3′；
所述的PCR预混液中含有PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs。PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2购自天根生化科技(北京)有限公司，PCR缓冲液为10xPCRbuffer,Taq DNA聚合酶含量5U/μl，dNTPs含量2.5mM,MgCl2含量1.5mM
所述的阳性对照品包括线粒体ATP6基因8993位点TT型质粒、线粒体ATP6基因8993位点GG型质粒。TT型质粒和GG型质粒、TG型阳性对照质粒由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
四、荧光定量PCR扩增体系和条件：
配置如下反应体系：采用20μL反应体系，在PCR反应管中加入PCR预混液10μL,上游引物F(10pmol/μL)1μL,下游引物R(10pmol/μL)1μL,Taqman-MGB探针PT(10pmol/μL)0.5μL,Taqman-MGB探针PG(10pmol/μL)0.5μL,提取的模板DNA 1μL，无菌的超纯水6μL；
扩增条件：95℃/5min，95℃/15sec，60℃/1min，其中95℃/15sec至60℃/1min过程进行40个循环。
五、构建数字PCR扩增体系和条件
配置如下反应体系：采用25μL反应体系，在PCR反应管中加入ddPCR预混液13μL,上游引物F(10pmol/μL)1μL,下游引物R(10pmol/μL)1μL,Taqman-MGB探针PT(10pmol/μL)0.5μL,Taqman-MGB探针PG(10pmol/μL)0.5μL,提取的模板DNA1μL，无菌的超纯水8μL；采用数字PCR专用微滴发生板，添加70ul/孔微滴发生油，在微滴发生器中制备成油包水溶液，再转移至96孔板中。
扩增条件：第一阶段，50℃/5min，95℃/5min；第二阶段，95℃/15sec，60℃/1min，，45个循环；第三个阶段，98℃/10min，4℃保存。摸索DNA模板量和通道扩增情况：
采用两管血样对数字PCR扩增条件进行摸索和优化，A04、B04与C04、D04，后者DNA模板浓度稀释10倍，E04、F04仅放入FAM标记探针，G04、H04仅放入VIC标记探针，扩增结果如下：
Figure BDA0002352278350000051
仅FAM通道有扩增S型曲线，判断该样品为TT型，仅VIC通道有扩增S型曲线，判断该样品为GG型，FAM和VIC通道均有S型曲线则判断为TG型。
可以看出模板浓度稀释10倍后，能得到较合适的拷贝数范围，两条探针单独扩增状况良好，在统一体系互相干扰程度也不高，合适作为分型探针使用。
六、荧光定量PCR对实际样品基因型检测
Figure BDA0002352278350000052
Figure BDA0002352278350000061
荧光定量PCR因为未构建标准曲线不能对T和G基因型进行准确的拷贝数定量，但通过CT值大小可以区分哪种基因型占比超过50％。
七、数字PCR对实际样品基因型进行检测和拷贝数定量
Figure BDA0002352278350000062
数字PCR可以无需标准曲线即可对T和G基因型拷贝数进行准确定量，各囊胚和极体样品中T和G基因型拷贝数以及T/(T+G)比例见上表，另外可与荧光定量PCR检测结果进行比较，可知两种方法检测结果大体分型一致，表明建立的两种方法可有效地对血液、囊胚和极体样品中mtDNA 8993位点T和G基因型拷贝数进行准确定量。
实施例2：一种检测人线粒体ATP6基因8993位点基因型的试剂盒及方法
一种检测人线粒体ATP6基因8993位点基因型的试剂盒，包括用于扩增线粒体ATP6基因8993位点的PCR引物和Taqman-MGB探针；
所述PCR引物包括：上游引物F：5′-GTTATTATCGAAACCATCAGCCT-3′；
下游引物R：5′-AGTAGGTGGCCTGCAGTAATGT-3′；
所述探针包括：Taqman-MGB探针PT:5′VIC-CAATAGCCCGGGCC-MGB-3′；
Taqman-MGB探针PG:5′FAM-CAATAGCCCTGGCC-MGB-3′。
优选的实施方式为：还包括PCR预混液，该PCR预混液中含有PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、MgCl2和dNTPs。
优选的实施方式为：包含阳性对照品，该阳性对照品包括线粒体ATP6基因8993位点TT型质粒、线粒体ATP6基因8993位点GG型质粒。
一种检测线粒体8993位点基因型的方法，包括下列步骤：
步骤1：提取待测样品DNA；
步骤2：在PCR反应管中加入PCR预混液、引物、探针、无菌的超纯水和步骤1提取的模板DNA，得到反应体系；同时建立TT型对照管、GG型对照管、TG型对照管和空白对照管；所述TT型对照管中用线粒体ATP6基因8993位点TT型质粒替代步骤1提取的模板DNA；所述GG型对照管中用线粒体ATP6基因8993位点GG型质粒替代步骤1提取的模板DNA；所述TG型对照管中用线粒体ATP6基因8993位点TT型质粒和线粒体ATP6基因8993位点GG型质粒的混合物替代步骤1提取的模板DNA；所述空白对照管用无菌的超纯水替代步骤1提取的模板DNA；
所述PCR引物包括：上游引物F：5′-GTTATTATCGAAACCATCAGCCT-3′；
下游引物R：5′-AGTAGGTGGCCTGCAGTAATGT-3′；
所述探针包括：Taqman-MGB探针PT:5′VIC-CAATAGCCCGGGCC-MGB-3′；
Taqman-MGB探针PG:5′FAM-CAATAGCCCTGGCC-MGB-3′；
步骤3：将反应体系混合好后，进行荧光PCR扩增；
步骤4：根据FAM通道和HEX通道的扩增情况来进行结果判定，仅FAM通道有扩增S型曲线，判断该样品为TT型，仅VIC通道有扩增S型曲线，判断该样品为GG型，FAM和VIC通道均有S型曲线则判断为TG型。
优选的实施方式为：所述荧光PCR扩增条件：95℃/5min，95℃/15sec，60℃/1min，其中95℃/15sec至60℃/1min过程进行40个循环。
优选的实施方式为：所述PCR预混液，该PCR预混液中含有PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、MgCl2和dNTPs。
优选的实施方式为：线粒体ATP6基因8993位点TT型质粒和线粒体ATP6基因8993位点GG型质粒按照1：1的质量比例构成的混合物替代步骤1提取的模板DNA。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Figure BDA0002352278350000081
Figure BDA0002352278350000091
序列表
<110> 安徽医科大学第一附属医院，合肥海关技术中心
<120> 一种检测线粒体3243位点基因型的试剂盒及方法
<130> 20191231
<160> 4
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 上游引物F
<400> 1
GTTATTATCGAAACCATCAGCCT 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 下游引物R
<400> 2
AGTAGGTGGCCTGCAGTAATGT 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Taqman-MGB探针PT
<400> 3
CAATAGCCCGGGCC 14
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Taqman-MGB探针PG
<400> 4
CAATAGCCCTGGCC 14

Claims (7)

1.一种检测人线粒体ATP6基因8993位点基因型的试剂盒，其特征在于：包括用于扩增线粒体ATP6基因8993位点的PCR引物和Taqman-MGB探针；
所述PCR引物包括：上游引物F：5′-GTTATTATCGAAACCATCAGCCT-3′；
下游引物R：5′-AGTAGGTGGCCTGCAGTAATGT-3′；
所述探针包括：Taqman-MGB探针PT:5′VIC-CAATAGCCCGGGCC-MGB-3′；
Taqman-MGB探针PG:5′FAM-CAATAGCCCTGGCC-MGB-3′。
2.根据权利要求1所述的检测线粒体8993位点基因型的试剂盒，其特征在于：还包括PCR预混液，该PCR预混液中含有PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、MgCl2和dNTPs。
3.根据权利要求1所述的检测线粒体8993位点基因型的试剂盒，其特征在于：包含阳性对照品，该阳性对照品包括线粒体ATP6基因8993位点TT型质粒、线粒体ATP6基因8993位点GG型质粒。
4.一种检测线粒体8993位点基因型的方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤1：提取待测样品DNA；
步骤2：在PCR反应管中加入PCR预混液、引物、探针、无菌的超纯水和步骤1提取的模板DNA，得到反应体系；同时建立TT型对照管、GG型对照管、TG型对照管和空白对照管；所述TT型对照管中用线粒体ATP6基因8993位点TT型质粒替代步骤1提取的模板DNA；所述GG型对照管中用线粒体ATP6基因8993位点GG型质粒替代步骤1提取的模板DNA；所述TG型对照管中用线粒体ATP6基因8993位点TT型质粒和线粒体ATP6基因8993位点GG型质粒的混合物替代步骤1提取的模板DNA；所述空白对照管用无菌的超纯水替代步骤1提取的模板DNA；
所述PCR引物包括：上游引物F：5′-GTTATTATCGAAACCATCAGCCT-3′；
下游引物R：5′-AGTAGGTGGCCTGCAGTAATGT-3′；
所述探针包括：Taqman-MGB探针PT:5′VIC-CAATAGCCCGGGCC-MGB-3′；
Taqman-MGB探针PG:5′FAM-CAATAGCCCTGGCC-MGB-3′；
步骤3：将反应体系混合好后，进行荧光PCR扩增；
步骤4：根据FAM通道和HEX通道的扩增情况来进行结果判定，仅FAM通道有扩增S型曲线，判断该样品为TT型，仅VIC通道有扩增S型曲线，判断该样品为GG型，FAM和VIC通道均有S型曲线则判断为TG型。
5.根据权利要求4所述的检测线粒体8993位点基因型的方法，其特征在于：所述荧光PCR扩增条件：95℃/5min，95℃/15sec，60℃/1min，其中95℃/15sec至60℃/1min过程进行40个循环。
6.根据权利要求4所述的检测线粒体8993位点基因型的方法，其特征在于：所述PCR预混液，该PCR预混液中含有PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、MgCl2和dNTPs。
7.根据权利要求4所述的检测线粒体8993位点基因型的方法，其特征在于：线粒体ATP6基因8993位点TT型质粒和线粒体ATP6基因8993位点GG型质粒按照1：1的质量比例构成的混合物替代步骤1提取的模板DNA。
CN201911420591.7A 2019-12-31 2019-12-31 一种检测人线粒体atp6基因8993位点基因型的试剂盒及方法 Pending CN111621556A (zh)

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