CN111676281A - 一种基于hrm法检测人线粒体nd3基因10191位点基因型的试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于HRM法检测人线粒体ND3基因10191位点基因型的试剂盒，包括扩增线粒体ND3基因10191位点的PCR引物；所述PCR引物包括：上游引物F：5′‑AACTCAACGGCTACATAG‑3′；下游引物R：5′‑TTTATGGAGAAAGGGACG‑3′。本发明的HRM技术不会受到碱基的位点或者碱基的类型限制，也不需要合成价格较高的探针，只需要在反应结束后对反应产物进行一步溶解，再用仪器对溶解曲线进行分析，完成基因分型和突变位点的扫描。

Description

一种基于HRM法检测人线粒体ND3基因10191位点基因型的试 剂盒及方法
技术领域
本发明涉及一种基于HRM法检测人线粒体ND3基因10191位点基因型的试剂盒及方法，属于基因检测技术领域。
背景技术
Leigh综合征(Leigh syndrome,LS)是婴儿和儿童时期最常见的一种线粒体疾病，其特征是脑干、基底节、丘脑和脊髓的双侧对称性坏死性病变。LS的遗传方式包括常染色体隐性遗传， X连锁的隐性遗传和母系遗传，这是因为线粒体中的氧化磷酸化酶组成成分是由核基因组和线粒体基因组共同编码的。据国外研究资料，线粒体基因组突变约占Leigh综合征病因的10％。其中以点突变最为多见，极少数为插入和大片段的缺失所致，迄今已经报道了19种与Leigh 综合征相关的线粒体基因突变。其中线粒体ND3基因10191T>G突变已被证实会导致中国人 Leigh综合征，在产前诊断筛查线粒体病中有十分重要的意义。
目前常用的检测基因多态性的方法有DNA直接测序法、限制性片段长度多态性分析法 (PCR-PFLP)、高分辨溶解曲线(HRM)、基因芯片、液相芯片法、荧光定量PCR法等。测序法是公认的基因突变检测的金标准，能够准确地显示可能存在的具体突变类型，但测序法所用的设备成本高、检测时间稍长、操作繁琐、灵敏度较低，而且结果判读复杂，对操作者要求较高，难以形成商业化的诊断产品。限制性片段长度多态性分析步骤繁多、灵敏度低，而且检测结果经常需要测序法确认，也不是适用于临床检测的简便有效的方法。高分辨溶解曲线是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。但是该方法难于筛查纯合突变，并且假阳性、假阴性较高，PCR条件苛刻，不能分型，而且检测结果需要测序法确认。基因芯片和液相芯片虽能准确区分具体的突变类型，但是其对设备要求高，难以大规模推广，多用于科研单位。
中华神经科杂志2003年2月第36卷第1期公开的《Leigh综合征的线粒体DNA突变分析》，其采用探针为mtDNA第1-740核苷酸的片段。且其结果判断依赖于以内切酶ApaⅠ酶切的结果，没有进行DNA测序进行最终判断，因此，使用该方法的引物是否达到检测的目的无法判断。因此，有必要设计一种检测线粒体8993位点基因型的试剂盒及检测方法。
发明内容
为克服上述现有技术中的不足，本发明目的在于提供一种基于HRM法检测人线粒体 ND3基因10191位点基因型的试剂盒及方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种基于HRM法检测人线粒体ND3基因10191位点基因型的试剂盒，包括扩增线粒体ND3基因10191位点的PCR 引物；
所述PCR引物包括：上游引物F：5′-AACTCAACGGCTACATAG-3′；
下游引物R：5′-TTTATGGAGAAAGGGACG-3′。
优选的技术方案为：还包括2×PCR反应MIX、1×EvaGreen荧光染料、MgCl2、阳性对照品和无菌水；2×PCR反应MIX包括Taq DNA聚合酶和dNTPs；1×EvaGreen荧光染料浓度为5μmol/L；MgCl2浓度为2.5mM；阳性对照品包括线粒体ND3基因10191位点TT型质粒、线粒体ND3基因10191位点CC型质粒。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种基于HRM法检测人线粒体ND3基因10191位点基因型的试剂盒的方法，包括下列步骤：
步骤1：提取待测样品DNA；
步骤2：在PCR反应管中加入2×PCR反应MIX、引物、1×EvaGreen荧光染料、MgCl2、无菌的超纯水和步骤1提取的模板DNA，得到反应体系；同时建立TT型对照管、CC型对照管、TG型对照管和空白对照管；所述TT型对照管中用线粒体ATP6基因8993位点TT型质粒替代步骤1提取的模板DNA；所述CC型对照管中用线粒体ATP6基因8993位点CC型质粒替代步骤1提取的模板DNA；所述空白对照管用无菌的超纯水替代步骤1提取的模板 DNA；
所述PCR引物包括：
上游引物F：5′-AACTCAACGGCTACATAG-3′；
下游引物R：5′-TTTATGGAGAAAGGGACG-3′；
步骤3：将反应体系混合好后，进行荧光PCR扩增；
步骤4：扩增结果由HRM分析软件自动分析和判别，与TT型质粒在一个类别判定该样品基因型为TT纯合型，与CC型在一个类别判定该样品基因型为CC纯合型，与TC型在一个类别判定该样品基因型为TC杂合型。
优选的技术方案为：所述荧光PCR扩增条件：第一阶段95℃/5min，第二阶段 95℃/10sec，53-60℃/20sec，72℃/30sec，其中退火温度从第一个循环开始每个循环增加 0.5℃，达到60℃后保持直到第40个循环结束，第三阶段95℃/1min，40℃/1min， 65℃/1sec。
优选的技术方案为：2×PCR反应MIX、1×EvaGreen荧光染料、MgCl2、阳性对照品和无菌水；2×PCR反应MIX包括Taq DNA聚合酶和dNTPs；1×EvaGreen荧光染料浓度为5μmol/L；MgCl2浓度为2.5mM；阳性对照品包括线粒体ND3基因10191位点TT型质粒、线粒体ND3基因10191位点CC型质粒。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。HRM检测技术除了具有高通量、低成本、灵敏性和特异性高之外，真正实现了闭管操作。本发明的HRM技术不会受到碱基的位点或者碱基的类型限制，也不需要合成价格较高的探针，只需要在反应结束后对反应产物进行一步溶解，再用仪器对溶解曲线进行分析，完成基因分型和突变位点的扫描。
附图说明
图1为检测步骤示意图。
图2为设计的引物扩增的序列导入uMeltbatch软件预测溶解曲线和Tm温度差异1。
图3为设计的引物扩增的序列导入uMeltbatch软件预测溶解曲线和Tm温度差异2。
图4为预测结果。
图5为质粒作为标准品对HRM法荧光定量PCR扩增体系和条件的确定。
图6为HRM法荧光定量PCR对实际样品进行分型检测。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1-6。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1：一种检测线粒体8993位点基因型的试剂盒及方法
一、胚胎活检操作程序
活检液及操作皿的准备
活检液：极体(受精培养液)、卵裂期胚胎(卵裂培养液)、囊胚(囊胚培养液)
活检操作皿：Falcon351006皿，皿底标记患者姓名。做3个10ul活检液滴和1个10ul的PVP滴，封油，置37℃，5％CO2，5％O2，90％N2培养箱备用。
活检后胚胎培养皿：Nunclon108173皿，用平衡后的培养液(极体-受精培养液、卵裂胚- 卵裂液、囊胚-囊胚液)做数个(根据活件胚胎数目)35ul的培养滴，封油，置培养箱备用。
胚胎活检操作步骤
打开倒置镜及显微操作系统的开关。在4×物镜下装活检针和固定针，将针尖移至视野中央，在20×物镜下进行微调。
透明带打孔：胚胎活检包括透明带打孔与卵裂球或极体获取两个基本过程。透明带打孔方法：激光打孔法(激光破膜仪，美国Hamilton Thorne公司)。
极体活检：将极体固定在12点位置，在极体右侧水平位置打孔(激光脉冲200微秒，强度100％)，将平口胚胎活检针(ID 15μm)沿透明带破口水平进入，调焦对准极体，将极体缓慢吸出。
卵裂胚胎活检：将待检的卵裂球置于3点位置，在其右侧透明带处激光(激光脉冲400 微秒，强度100％)打孔，胚胎活检针(ID 30μm)沿透明带破口进入胚胎内，通过活检针吸取极体或卵裂球，轻轻将该卵裂球吸出。
囊胚活检：取卵后第5-7天的发育到4期的囊胚，将内细胞团置于9点上下位置，活检3 点位置滋养层细胞，3点处透明带激光打孔(激光脉冲400微秒，强度100％)；待囊胚皱缩，将活检针(ID 20μm)吸住少量滋养层细胞(约10-15个细胞)，持卵针和活检针慢慢向两边拉；对准被拉开的滋养层细胞之间的胞间连接连续发射激光(激光脉冲700微秒，强度100％)，同时继续轻轻将囊胚和活检的滋养层细胞向两边拉，直至滋养层细胞与囊胚分离。。
将活检出来的极体/卵裂球/滋养层细胞用拉制的巴斯德管转移至含有4μl PBS的PCR管内用于DNA提取和数字PCR检测，活检后的卵子或胚胎移入相应培养液继续培养。
二、待测样品DNA提取
40份血液样品DNA提取：采用磁珠法核酸提取试剂盒提取，提取的DNA测定OD值，并保存于-20度。
10份囊胚细胞DNA提取：采用REPLI-g Singel Cell Kit试剂盒提取，做到加stopbuffer 后保存于-20度。
三、分型用引物设计
采用Beacon Designer 8.0软件设计人线粒体DNA T10191C多态位点HRM分型引物，所设计引物如下：
上游引物F：5′-AACTCAACGGCTACATAG-3′
下游引物R：5′-TTTATGGAGAAAGGGACG-3′；
四、采用uMeltbatch软件对设计的HRM引物和扩增效果进行评估
将设计的引物扩增的序列导入uMeltbatch软件预测溶解曲线和Tm温度差异，如图2和图3：
Wild Amplicon Bases:Tm＝89℃
AACTCAACGGCTACATAGAAAAATCCACCCCTTACGAGTGCGGCTTCGACCCTATATCCCCCGCCCGCGTCCCTTTCTCCATAAA
Mutant Amplicon Bases:Tm＝90℃
AACTCAACGGCTACATAGAAAAATCCACCCCTTACGAGTGCGGCTTCGACCCTATACCCCCCGCCCGCGTCCCTTTCTCCATAAA
经uMeltbatch软件预测，野生型和突变型解链温度分别是89℃和90℃，差异大于0.3℃，满足HRM法分型条件。五、采用The DINAMelt Web Server在线功能Two-statemelting(folding)检查设计的引物扩增序列二级结构和折叠特性
预测结果如图4，ΔG＝-3.5表明二级结果对扩增产物的影响较小，可以接受，从预测的图中也可以看出仅有两个地方形成颈环结构，且在两头引物区域均未见复杂二级结构。
六、质粒作为标准品对HRM法荧光定量PCR扩增体系和条件的摸索：
配置如下反应体系：采用25μL反应体系，在PCR反应管中加入2×PCR反应MIX 10μL, 上游引物F(10pmol/μL)1μL,下游引物R(10pmol/μL)1μL,1×EvaGreen荧光染料(5 μmol/L)5μL,MgCl2(2.5mM)2μL,提取的模板DNA 1μL，无菌的超纯水3μL；
扩增条件：95℃/5min，第二阶段95℃/10sec，53-60℃/20sec，72℃/30sec，其中退火温度从第一个循环开始每个循环增加0.5℃，达到60℃后保持直到第40个循环结束，第三阶段 95℃/1min，40℃/1min，65℃/1sec；
可见本发明的HRM法可以很好地对T10191C多态位点进行准确分型。
四、HRM法荧光定量PCR对实际样品进行分型检测
经统计4份血液样品和10份囊胚细胞样品采用本专利发明的HRM法分型结果如下表：
Figure RE-GDA0002622256910000051
实施例2：一种检测线粒体8993位点基因型的试剂盒及方法
一种基于HRM法检测人线粒体ND3基因10191位点基因型的试剂盒，包括扩增线粒体 ND3基因10191位点的PCR引物；
所述PCR引物包括：上游引物F：5′-AACTCAACGGCTACATAG-3′；
下游引物R：5′-TTTATGGAGAAAGGGACG-3′。
优选的技术方案为：还包括2×PCR反应MIX、1×EvaGreen荧光染料、MgCl2、阳性对照品和无菌水；2×PCR反应MIX包括Taq DNA聚合酶和dNTPs，Taq DNA聚合酶和dNTPs 购自天根生化科技(北京)有限公司，Taq DNA聚合酶含量5U/μl，dNTPs含量2.5mM； 1×EvaGreen荧光染料浓度为5μmol/L；MgCl2浓度为2.5mM；阳性对照品包括线粒体ND3 基因10191位点TT型质粒、线粒体ND3基因10191位点CC型质粒。TT型质粒和CC型质粒由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
一种基于HRM法检测人线粒体ND3基因10191位点基因型的试剂盒的方法，包括下列步骤：
步骤1：提取待测样品DNA；
步骤2：在PCR反应管中加入2×PCR反应MIX、引物、1×EvaGreen荧光染料、MgCl2、无菌的超纯水和步骤1提取的模板DNA，得到反应体系；同时建立TT型对照管、CC型对照管、TC型对照管和空白对照管；所述TT型对照管中用线粒体ATP6基因8993位点TT型质粒替代步骤1提取的模板DNA；所述CC型对照管中用线粒体ATP6基因8993位点CC型质粒替代步骤1提取的模板DNA；所述空白对照管用无菌的超纯水替代步骤1提取的模板 DNA；
所述PCR引物包括：
上游引物F：5′-AACTCAACGGCTACATAG-3′；
下游引物R：5′-TTTATGGAGAAAGGGACG-3′；
步骤3：将反应体系混合好后，进行荧光PCR扩增；
步骤4：扩增结果由HRM分析软件自动分析和判别，与TT型质粒在一个类别判定该样品基因型为TT纯合型，与CC型在一个类别判定该样品基因型为CC纯合型，与TC型在一个类别判定该样品基因型为TC杂合型。
优选的实施方式：所述荧光PCR扩增条件：第一阶段95℃/5min，第二阶段95℃/10sec， 53-60℃/20sec，72℃/30sec，其中退火温度从第一个循环开始每个循环增加0.5℃，达到 60℃后保持直到第40个循环结束，第三阶段95℃/1min，40℃/1min，65℃/1sec。
优选的实施方式：2×PCR反应MIX、1×EvaGreen荧光染料、MgCl2、阳性对照品和无菌水；2×PCR反应MIX包括Taq DNA聚合酶和dNTPs，Taq DNA聚合酶和dNTPs购自天根生化科技(北京)有限公司，Taq DNA聚合酶含量5U/μl，dNTPs含量2.5mM；1×EvaGreen荧光染料浓度为5μmol/L；MgCl2浓度为2.5mM；阳性对照品包括线粒体ND3基因10191位点 TT型质粒、线粒体ND3基因10191位点CC型质粒。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Figure RE-GDA0002622256910000081

Claims (5)

1.一种基于HRM法检测人线粒体ND3基因10191位点基因型的试剂盒，其特征在于：包括扩增线粒体ND3基因10191位点的PCR引物；
所述PCR引物包括：上游引物F：5′-AACTCAACGGCTACATAG-3′；
下游引物R：5′-TTTATGGAGAAAGGGACG-3′。
2.根据权利要求1所述的基于HRM法检测人线粒体ND3基因10191位点基因型的试剂盒，其特征在于：还包括2×PCR反应MIX、1×EvaGreen荧光染料、MgCl2、阳性对照品和无菌水；2×PCR反应MIX包括Taq DNA聚合酶和dNTPs；1×EvaGreen荧光染料浓度为5μmol/L；MgCl2浓度为2.5mM；阳性对照品包括线粒体ND3基因10191位点TT型质粒、线粒体ND3基因10191位点CC型质粒。
3.一种基于HRM法检测人线粒体ND3基因10191位点基因型的试剂盒的方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤1：提取待测样品DNA；
步骤2：在PCR反应管中加入2×PCR反应MIX、引物、1×EvaGreen荧光染料、MgCl2、无菌的超纯水和步骤1提取的模板DNA，得到反应体系；同时建立TT型对照管、CC型对照管、TG型对照管和空白对照管；所述TT型对照管中用线粒体ATP6基因8993位点TT型质粒替代步骤1提取的模板DNA；所述CC型对照管中用线粒体ATP6基因8993位点CC型质粒替代步骤1提取的模板DNA；所述空白对照管用无菌的超纯水替代步骤1提取的模板DNA；
所述PCR引物包括：
上游引物F：5′-AACTCAACGGCTACATAG-3′；
下游引物R：5′-TTTATGGAGAAAGGGACG-3′；
步骤3：将反应体系混合好后，进行荧光PCR扩增；
步骤4：扩增结果由HRM分析软件进行分析和判别，与TT型质粒在一个类别判定该样品基因型为TT纯合型，与CC型在一个类别判定该样品基因型为CC纯合型，与TC型在一个类别判定该样品基因型为TC杂合型。
4.根据权利要求3所述的检测线粒体8993位点基因型的方法，其特征在于：所述荧光PCR扩增条件：第一阶段95℃/5min，第二阶段95℃/10sec，53-60℃/20sec，72℃/30sec，其中退火温度从第一个循环开始每个循环增加0.5℃，达到60℃后保持直到第40个循环结束，第三阶段95℃/1min，40℃/1min，65℃/1sec。
5.根据权利要求3所述的检测线粒体8993位点基因型的方法，其特征在于：2×PCR反应MIX、1×EvaGreen荧光染料、MgCl2、阳性对照品和无菌水；2×PCR反应MIX包括Taq DNA聚合酶和dNTPs；1×EvaGreen荧光染料浓度为5μmol/L；MgCl2浓度为2.5mM；阳性对照品包括线粒体ND3基因10191位点TT型质粒、线粒体ND3基因10191位点CC型质粒。
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