CN116656786B - 基于链杂交的crispr-侧向流核酸检测试纸及其中检测探针 - Google Patents
基于链杂交的crispr-侧向流核酸检测试纸及其中检测探针 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于链杂交策略的CRISPR‑侧向流试纸技术及其应用,属于基因检测技术领域。该检测探针包括报告探针、捕获探针和信号探针,所述报告探针包含连接的生物素和第一核苷酸探针序列,所述捕获探针包含连接的生物素和第二核苷酸探针序列,所述信号探针包含连接的信号粒子和互补核苷酸序列,所述第一核苷酸探针序列和第二核苷酸探针序列均可与所述信号探针的互补核苷酸序列互补杂交。该检测技术,通过报告探针(实现阴性检测)、捕获探针(实现阳性检测),与信号探针中核酸序列的高效杂交,实现特异性的检测。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,特别是涉及一种基于链杂交的侧向流试纸技术在CRISPR介导的精准可视化分子诊断中的应用(CRISPR-CHLFA)。
背景技术
基于CRISPR系统的基因编辑技术被认为是21世纪以来最重要的生命科学技术之一,显示出了发展新一代分子诊断技术的巨大潜力。CRISPR系统源自于古细菌和细菌的免疫系统,CRISPR效应蛋白(Cas9、Cas12、Cas13等)可以在向导RNA的指导下,在温和(30-42℃)条件下反应,靶向识别并剪切入侵到机体中的靶标核酸分子,其中Cas12a和Cas13a还表现出对单链核酸的非特异性剪切活性,被称为反式剪切活性(trans-cleavage activity)。
目前,基于Cas蛋白靶向识别和剪切核酸的功能,一系列生物传感技术已被陆续开发出来。其中,利用CRISPR-Cas13a响应靶标RNA而激活其非特异性剪切任意单链RNA的反式剪切活性,张峰团队开创了SHERLOCK技术用于可视化的核酸检测,且具备单碱基突变识别能力,也可用于即时检测场景。此外,Doudna团队基于Cas12a开发了DETECTR技术,并成功用于对HPV DNA的检测。近期,借助于DETECTR技术,结合LAMP扩增和免疫层析试纸,Chiu 等开发出了快速检测SARS-Cov-2的诊断工具。
以上述SHERLOCK和DETECTR技术为代表的基于的Cas12a/Cas13a-免疫层析试纸的核酸可视化检测概念已经广泛被改造、应用于病原体核酸的检测。以Cas12a系统为例,该类方法的关键步骤在于,被扩增后的靶标核酸激活Cas系统的反式切割活性,反式切割活性会切断体系中的单链DNA报告探针Biotin-ssDNA-FAM,在检测时理论上会有两种情况:①当无靶标时,Cas12a未被激活,因此Biotin-ssDNA-FAM探针保持完整状态,探针与免疫层析试纸中的Anti-FAM antibody-GNP通过“FAM-抗体”之间的免疫识别反应结合形成复合物“Biotin-ssDNA-FAM-Anti-FAM antibody-GNP”,溶液在毛细力的作用下在试纸条的硝酸纤维素膜中侧向流动,当流经对照线时,包埋的链霉亲和素与复合物中的biotin结合,从而将复合物捕获在对照线并显红色,而检测线没有条带出现。②当有靶标时,激活后的Cas12a切断Biotin-ssDNA-FAM探针使Biotin和FAM分开,在免疫试纸中形成的“FAM-Anti-FAMantibody-GNP”不会受到对照线的影响而继续流动,流经检测线时被包埋的二抗捕获而累积在此处,显示红色条带。
然而,传统商业化的免疫侧向层析试纸条也存在一些问题,首先是其最初被开发应用于抗原快速检测领域,因此该类试纸条所使用的偶联有抗体的胶体金探针,试纸条的检测线、对照线区域也需要包埋抗体,而胶体金与抗体的偶联过程相对复杂,需使用大量抗体,大量抗体的使用又增加了试纸条的成本。
而CRISPR系统属于可编程核酸酶系统,与该系统联合使用的侧向层析试纸完全可以基于核酸探针构建而不依赖免疫学试剂,但目前尚未有此类产品被开发出来。
发明内容
基于此,针对上述问题,有必要提供一种用于侧向流试纸基于链杂交的CRISPR核酸检测探针,该探针组合可用于构建侧向流试纸平台,与CRISPR技术(如Cas12、Cas13、Cas14蛋白等)结合使用,建立CRISPR-CHLFA(CRISPR-Chain Hybridization-basedLateral Flow Assay)技术体系,应用于呼吸道病毒等病原菌的准确、快速检测中。
一种用于侧向流试纸基于链杂交的CRISPR核酸检测探针,包括报告探针、捕获探针和信号探针,所述报告探针包含连接的生物素和第一核苷酸探针序列,所述捕获探针包含连接的生物素和第二核苷酸探针序列,所述信号探针包含连接的信号分子或粒子和互补核苷酸序列,所述第一核苷酸探针序列和第二核苷酸探针序列均可与所述信号探针的互补核苷酸序列互补杂交。
上述用于侧向流试纸基于链杂交的CRISPR核酸检测探针制备为侧向流试纸后,信号探针在对照线、检测线处的累积完全依赖核酸杂交,因此不涉及抗体、抗原的识别、结合反应,因此信号探针制备成本低、存储稳定,以该探针构建的侧向流试纸同样具有成本低、存储稳定的优势。
上述信号探针指能够作为探针,观测到其信号变化物质,其中的信号分子或粒子,包括但不限于各种具有光、电、磁等信号发生功能的纳米粒子、微粒、化学小分子等。相应的,结果读取方式可以为肉眼直接观察颜色变化,或检测荧光、电、磁等信号。具体可选择如胶体金纳米粒子,则该信号探针即为胶体金探针,信号粒子为胶体金纳米粒子。其中,当信号探针的信号粒子为金纳米颗粒时,可以实现可视化检测,是本发明最为典型的应用模式之一。
并且,本发明人在实践工作中发现,传统免疫学原理试纸检测线背景信号高,在裸眼下观察结果容易出现假阳性判断,而本发明提供的CRISPR-CHLFA,阴性检测反应中,Bio-DNA与GNP probe高效杂交形成复合物,试纸条对照线中包埋的高浓度链霉亲和素高效截留Bio-DNA-GNP probe复合物,背景信号极低,可实现非常准确的裸眼检测,实用价值显著。
具体的,本发明提出基于链杂交原理的侧向层析试纸技术,与CRISPR检测体系和基因探针等结合使用,通过报告探针、捕获探针和信号探针在试纸条上的配合,实现准确的可视化检测,具体原理以CRISPR-Cas12a蛋白为例进行说明:
对于阴性样品的检测而言,Cas12a/crRNA系统未识别到靶基因序列,Cas12a蛋白无核酸酶活性,因此单链的生物素和第一核苷酸探针序列连接(Bio-DNA)的报告探针未被切割从而保持完整,当Cas12a反应液被滴加到侧向流试纸条后,报告探针与信号探针杂交,形成Bio-DNA-Signal probe探针复合物,在流经试纸条的对照线时,包埋在对照线的链霉亲和素结合报告探针末端标记的生物素,使Signal probe被拦截在对照线,因此可以观察到对照线(C线)红色条带显色和检测线(T线)无条带。
对于阳性样品的检测而言,靶基因被扩增为双链DNA,因而被Cas12a/crRNA系统识别,Cas12a蛋白被激活而表现出核酸酶活性,单链的报告探针(Bio-DNA)被切割,因而当Cas12a反应液被滴加到侧向流试纸条后,信号探针无法与报告探针杂交,从而不会被对照线的链霉亲和素截留而流过对照线(即对照线无条带),在流经试纸条的检测线时,包埋在检测线的捕获探针与信号探针杂交,从而将信号探针捕获在检测线处,因此可以观察到检测线为红色条带。
因此,按照上述原理进行反应、层析,通过报告探针(实现阴性检测)、捕获探针(实现阳性检测),与信号探针中的核苷酸序列高效杂交,实现特异性的检测。
可以理解的,报告探针、捕获探针和信号探针中的核苷酸序列包括但不限于DNA、RNA、DNA-PNA嵌合序列、RNA-PNA嵌合序列、DNA-RNA嵌合序列、含有其它化学修饰的核酸序列等,仅需能够进行高效杂交结合即可。也即当信号探针中采用的核苷酸序列为RNA、RNA-PNA嵌合序列、DNA-RNA嵌合序列时,也可以使用CRISPR-Cas13蛋白实现CRISPR-CHLFA的检测构思,本领域技术人员知晓,对于具体选择的Cas蛋白酶类型,可根据核苷酸序列的具体类型不同而进行对应匹配,并不局限于示例类型。
在其中一个实施例中,所述第一核苷酸探针序列和第二核苷酸探针序列分别与所述互补核苷酸序列互补的区域间隔或相邻。也即第一核苷酸探针序列和第二核苷酸探针序列与互补核苷酸序列互补的区域不同且无重叠。
在其中一个实施例中,所述报告探针的工作浓度≥500nM,且所述第一核苷酸探针序列的长度≥14nt。对Cas12a反式切割活性介导的报告探针剪切的灵敏监测是实现高效侧向流层析检测的关键,因此,有效降低反应体系中报告探针的总量,可以最大程度保证检测灵敏度,因此我们对报告探针的浓度和长度进行了进一步优化,通过实验验证得到,报告探针的工作浓度最低可以为500nM,报告探针中的第一核苷酸探针序列的长度最低可以为14nt。
在其中一个实施例中,所述报告探针的工作浓度为500-750nM,且所述第一核苷酸探针序列的长度为14-20nt。报告探针的工作浓度和长度在上述范围内,可以取得较优的检测效果。
在其中一个实施例中,所述第一核苷酸探针序列选自如SEQ ID NO.1-4所示序列,所述第二核苷酸探针序列选自如SEQ ID NO.5所示序列。可以理解的,第一核苷酸探针的序列可根据Cas酶的切割位点要求等进行设计,而采用上述序列,具有最有效利用Cas酶的切割效率的优势,第二核苷酸探针的序列可按照常规要求进行设计,如直接购买商用试剂等。对于互补核苷酸序列,根据第一核苷酸探针的序列和第二核苷酸探针的序列设计互补序列即可。
本发明还公开了一种基于链杂交的CRISPR核酸检测试纸,包括试纸条和检测反应试剂,所述试纸条包括底板和依次层叠固定在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸,所述硝酸纤维素膜上由结合垫端向吸水纸端依次设有对照线和检测线,所述结合垫包埋有上述的信号探针,所述对照线设有报告探针捕获试剂,所述检测线设有链霉亲和素和上述捕获探针结合形成的复合物;
所述检测反应试剂包括:核酸扩增试剂和Cas反应试剂,所述Cas反应试剂包括上述的报告探针。
上述CRISPR核酸检测试纸,其结构与常规侧向流试纸相似,但在CRISPR反应体系中加入报告探针,以及在对照线(C线)设置拦截报告探针的链霉亲和素,在检测线(T线)设置捕获探针拦截未被对照线拦截的信号探针,通过信号粒子(如胶体金)表面DNA探针与报告探针和捕获探针的高效杂交(与报告探针和检测线捕获探针杂交分别对应了阴性检测和阳性检测两种结果),实现特异性的检测,构建基于核酸杂交策略的CRISPR-CHLFA新方法。
可以理解的,对于报告探针捕获试剂,需根据报告探针所携带的标签分子,选择对应的捕获试剂,包括但不限于链霉亲和素、抗FAM抗体、抗地高辛抗体等。核酸扩增试剂为常规试剂,如RPA或RT-RPA反应试剂等。
在其中一个实施例中,所述信号探针为胶体金探针,所述信号粒子为胶体金纳米粒子,所述链霉亲和素的浓度为4±0.5mg/mL,在试纸条上的用量为0.7±0.1μL/cm;所述捕获探针中的浓度为50±5μM,在试纸条上的用量为0.7μL/cm;所述胶体金探针的浓度为8±1nM,在试纸条上的用量为7±1μL/2.8mm。以上述用量进行检查,具有较好的检测结果。
在其中一个实施例中,所述核酸扩增试剂包括:RPA、RT-RPA、RAA、RT-RAA、LAMP、RT-LAMP核酸扩增试剂;
所述Cas反应试剂包括:crRNA,Cas12a酶。上述RPA反应试剂和Cas反应试剂根据常规恒温扩增和CRISPR/Cas反应要求设置即可。如Cas12a酶可选LbaCas12a等。
在其中一个实施例中,所述CRISPR核酸检测试纸用于SARS-CoV-2Omicron变异株del69-79突变位点检测,所述扩增引物对选自如SEQ ID NO.6-7所示序列,所述crRNA选自如SEQ ID NO.8所示序列;
或者
所述CRISPR核酸检测试纸用于结核分枝杆菌检测,所述扩增引物对选自如SEQ IDNO.9-10所示序列,所述crRNA选自如SEQ ID NO.11所示序列。
采用上述扩增引物对和crRNA对SARS-CoV-2Omicron变异株进行检测,其检测限可达10拷贝;采用上述扩增引物对和crRNA对结核分枝杆菌进行检测,其最少可以检测到单拷贝当量的IS1081基因靶标;具有非常优异的检测性能。
本发明还公开了一种用于非诊断治疗目的的基于链杂交的CRISPR-侧向流核酸检测方法,采用上述的CRISPR核酸检测试纸进行检测,包括以下步骤:
恒温扩增:取待测样本,以所述RPA反应试剂进行恒温扩增反应,得到扩增产物;
Cas反应:取上述扩增产物,加入所述Cas反应试剂,孵育,反应,得到反应液;
层析:将上述反应液滴加到所述试纸条的样品垫上,进行层析,根据所述对照线和检测线的显色情况,获取检测结果。
可以理解的,具体进行层析步骤中,需滴加running buffer以促使层析进行,随后等待观察检测结果。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明的用于侧向流试纸基于链杂交的CRISPR核酸检测探针,其可用于构建侧向流试纸,得到基于链杂交的侧向层析试纸完全不依赖抗体的偶联、包埋,而完全采用核酸探针实现检测,通过报告探针(实现阴性检测)、捕获探针(实现阳性检测),与胶体金表面DNA探针的高效杂交,实现特异性的检测,因此制备成本和存储稳定性比传统基于免疫原理的侧向层析试纸条有显著优势。
同时,本发明公开的基于链杂交的侧向层析试纸与CRISPR技术结合的实际应用中显示,对阴性标本的检测结果中检测线背景信号极低,因此可以保证肉眼直接读取检测结果的准确度,实用价值巨大;而传统免疫层析试纸却极易出现背景信号,对直接肉眼观察检测结果造成极大干扰。
且基于该技术平台,本发明还开发得到了对SARS-CoV-2Omicron变异株和结核分枝杆菌进行检测的试纸,对SARS-CoV-2Omicron变异株的检测限可达10拷贝,对结核分枝杆菌最少可以检测到单拷贝当量的IS1081基因靶标,具有非常优异的检测性能。
附图说明
图1为本发明的基于链杂交的CRISPR核酸检测原理示意图;
图2为实施例4中CRISPR-CHLFA可行性验证试验结果图;
图3为实施例5中CHLFA参数优化结果图;
图4为实施例6中检测SARS-CoV-2Omicron BA.4/5Spike基因del69-70突变的Cas12a/crRNA体系的设计及筛选实验结果;
图5为实施例6中crRNA转录产物电泳条带图;
图6为实施例6中RPA扩增电泳结果图;
图7为实施例6中CRISPR-CHLFA系统的性能评价结果图;
图8为实施例6中SARS-CoV-2临床样本分析结果;
图9为实施例7中用于检测结核分枝杆菌IS1081基因的CRISPR-CHLFA系统的建立过程和结果;
图10为实施例7中crRNAs体外转录纯化后电泳结果;
图11为实施例7中MTB临床样本分析结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下实施例中所用原料,如非特别说明,均为市售可得;以下实施例所用方法,如非特别说明,均为常规方法可实现。
以下实施例中crRNA的制备参照常规方法,具体如下:
crRNA的体外转录:以100μL RNA体外转录体系为例,T7 RNA聚合酶购自NEB,每个转录反应体系由52μL RNase-free水、10μL 10×RNA polymerase buffer、20μL 10mM NTPmixture、10μL T7 RNA polymerase、4μL recombinant RNase inhibitor(大连宝生物)、4μL 10μM模板DNA,4μL 10μM T7 RNA promoter(TAATACGACTCACTATAGGG,SEQ ID NO.12)充分混匀后置于PCR仪37℃孵育4–16小时进行转录。
crRNA的纯化:取1μL转录产物进行PAGE电泳鉴定,其余转录产物用RNA纯化试剂盒(购自Zymo rsearch)纯化,并测定RNA产物的浓度,稀释至1μM,于冰箱中-20℃保存备用。
实施例1
一种用于侧向流试纸基于链杂交的CRISPR核酸检测探针,包括报告探针、捕获探针和胶体金探针,所述报告探针包含连接的生物素和第一核苷酸探针序列,所述捕获探针包含连接的生物素和第二核苷酸探针序列,所述胶体金探针包含连接的金纳米粒子和互补核苷酸序列,所述第一核苷酸探针序列和第二核苷酸探针序列均可与所述胶体金探针的互补核苷酸序列互补杂交。
1、胶体金探针的制备
1.1金纳米粒子(GNP)的合成:
分别配制100mL浓度为1mM的氯金酸(HAuCl4)和100mL浓度为38.8mM的柠檬酸钠溶液,接着将100mL氯金酸与磁子加入到锥形瓶中,并置于磁力加热搅拌器上;磁力加热搅拌器的温度设定至280℃左右,加热氯金酸溶液直至沸腾;迅速加入10ml的柠檬酸钠溶液并持续快速搅拌;15~20min后停止加热并持续搅拌,待其冷却至室温,于冰箱中4℃保存。
1.2胶体金探针的合成:
①将1OD巯基DNA探针与500μL胶体金溶液混合后于-20℃冰箱冻存过夜,该DNA探包含如SEQ ID NO.13(5’-HS-AAAAA TTTTT CATTGCTAGAGCAGG GTG TTT AGG ATT TGC-3’)所示序列的互补核苷酸序列,包含与报告探针第一核苷酸探针序列的结合区(用于与报告探针杂交)和与捕获探针第二核苷酸探针序列的结合区(用于与捕获探针杂交),在本实施例中,与第二核苷酸探针序列的结合区直接与胶体金的金纳米粒子连接;
②取出放置至室温溶解,13000rpm 4℃离心30min,弃上清;
③加入1ml buffer 1溶液(0.01M磷酸盐,0.1M NaCl,pH 7.4)充分吹打混匀,13000rpm4℃离心30min,弃上清;
④重复步骤③一次;
⑤加入1ml buffer 2溶液(0.01M磷酸盐,0.3M NaCl,pH 7.4)充分吹打混匀,13000rpm4℃离心30min,弃上清;
⑥用重悬buffer(20mM Na3PO4,5%BSA,0.25%Tween-20,and 10%sucrose)重悬,即得胶体金探针(GNP probe)。
2、报告探针的制备
将生物素和如SEQ ID NO.1-4所示序列之一的第一核苷酸探针连接,可按常规方法制备或自商业化生物公司订购,即得报告探针(reporter probe),其结构为Bio-DNA。
SEQ ID NO.1:TT AAT GCA AAT CCT AAA CAC;
SEQ ID NO.2:TT AAT GCA AAT CCT AAA C;
SEQ ID NO.3:TT AAT GCA AAT CCT AA;
SEQ ID NO.4:TT AAT GCA AAT CCT。
3、捕获探针的制备
将生物素和如SEQ ID NO.5所示序列(5’-CCTGCTCTAGCAATG-3’)的第二核苷酸探针连接,得到捕获探针,再制备得到链霉亲和素和捕获探针结合形成的复合物。方法为:将4mg/mL链霉亲和素与100μM捕获探针按照1:1体积比混合后,室温放置10分钟后,即得链霉亲和素和捕获探针结合形成的复合物(链霉亲和素-生物素-捕获探针复合物),其结构为链霉亲和素-生物素-CCTGCTCTAGCAATG,其中捕获探针的浓度为50μM。
实施例2
一种基于链杂交的CRISPR核酸检测试纸,包括试纸条和检测反应试剂。
所述试纸条包括底板和依次层叠固定在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸,所述硝酸纤维素膜上由结合垫端向吸水纸端依次设有对照线和检测线,所述结合垫包埋有实施例1制备得到的胶体金探针(GNP probe),所述对照线设有链霉亲和素,所述检测线设有实施例1制备得到的链霉亲和素-生物素-捕获探针复合物。
所述检测反应试剂包括:RPA反应试剂和Cas反应试剂,所述Cas反应试剂包括实施例1制备得到的报告探针(reporter probe)。
1、试纸条
此试纸条为侧向流试纸条,按常规方法,由底板和依次层叠附着在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸组装而成,本实施例的试纸条宽度为2.8mm,可以理解的,在其它实施例中,可根据实际情况进行调整。
具体的,使用杭州峰航科技有限公司的HSG510型划线仪进行对照线和检测线试剂的包埋,将4mg/mL的链霉亲和素包埋在对照线,将实施例1制备得到的链霉亲和素-生物素-捕获探针复合物包埋在检测线,划线量为0.7μL/cm,并于37℃烘干24小时。在结合垫包埋有实施例1的胶体金探针,每条试纸条包埋7μL浓度为8nM的胶体金探针。
2、RPA反应试剂
RPA反应试剂选用常规RPA反应试剂即可,如在本实施例中,RPA反应试剂为TwistAmp Basic Kit,反应条件以50μL RPA扩增反应为例,向每管RPA TwistAmp BasicKit冻干粉中加入29.5μL Primer free Rehydration buffer、2.4μL上游引物(10μM)、2.4μL下游引物(10μM)、9.2μL H2O、4μL模板DNA,充分混匀后加入2.5μL MgOAc(280mM),在39℃孵育20min,反应结束后取4μL扩增产物进行电泳检测。在进行RNA靶标的扩增时,在上述体系的基础上加入2.5μL M-MuLV RT(200U/μL),反应温度为41℃。
上述上游引和下游引物为用于扩增检测靶序列的扩增引物对。
3、Cas反应试剂
除报告探针外,Cas反应试剂选用常规Cas反应试剂即可。在本实施例中,以20μL反应体系为例,向EP管中加入11.8μL RNase-free水、2μL NEB buffer 2.1、1μL 10uM权利要求1制备得到的报告探针、1.7μL crRNA(1uM,具体根据不同的检测目标序列而设置)、1.5μLLbaCas12a(1uM)、2μL RPA扩增产物,充分混匀后置于37℃孵育25分钟。
实施例3
一种基于链杂交的CRISPR核酸检测方法,采用实施例2的CRISPR核酸检测试纸进行检测,包括以下步骤:
一、恒温扩增。
取待测样本,以实施例2的RPA反应试剂和条件进行恒温扩增反应,得到扩增产物。
二、Cas反应
取上述扩增产物,加入实施例2的Cas反应试剂,按照上述方法进行孵育,反应,得到反应液。
三、层析
将上述反应液滴加到所述试纸条的样品垫上,进行层析,根据所述对照线和检测线的显色情况,获取检测结果。
上述检测的原理为:
本发明的核酸靶标检测原理如图1所示,其中,A为基于核酸杂交原理的侧向流检测过程;B为基于链杂交的侧向层析试纸结构示意图;C为胶体金探针的设计原理。
以CRISPR-Cas12a为例进行检测原理的说明,待测样本首先进行恒温扩增RPA反应,如存在检测靶标,靶标基因得到扩增。在随后的Cas反应中,体系中包括报告探针,crRNA,Cas12a酶,则Cas12a可表现出核酸酶活性,将报告探针切割。因而,从图1A中可以看出:(1)在阴性样品的检测中,Cas12a/crRNA未识别到靶基因序列,Cas12a无核酸酶活性,因此单链的Bio-DNA报告探针未被切割从而保持完整,当Cas反应液被滴加到侧向流试纸后,报告探针与胶体金探针(GNP probe)杂交(图1C),形成Bio-DNA-GNP复合物,在流经对照线时,链霉亲和素结合报告探针末端标记的生物素(图1B),使胶体金被拦截在C线,因此可以观察到C线红色条带和检测线无条带。(2)在阳性样品的检测中,靶基因被扩增为双链DNA,因而被Cas12a/crRNA识别,Cas12a被激活而表现出核酸酶活性,单链的Bio-DNA报告探针被切割,因而当Cas反应液被滴加到侧向流试纸后,报告探针已不存在,无法与胶体金探针杂交的序列,因而胶体金探针(GNP probe)不会被对照线的链霉亲和素截留而流过对照线,在流经检测线时,包埋的检测线捕获探针与胶体金表面的探针杂交(图1B,C),从而将胶体金粒子捕获在检测线处,因此可以观察到检测线为红色条带。
实施例4
初步验证。
1、方法
采用已经验证的crRNA和对应的双链DNA靶标(详见A RISPR-Drivencolorimetric code platform for highly accurate telomerase activity assay,Biosensors and Bioelectronics,MCheng,172(2021)112749)进行可行性验证,所用的验证样本和靶标参见上述文献,已验证crRNA为文献中crRNA2,DNA靶标为文献中TSNT序列。
crRNA为通过体外转录获得。双链DNA靶标为通过单链DNA链杂交获得,将10μL靶标DNA单链、10μL靶标DNA互补链、2.5μL RNase-free水、2.5μL 10×buffer(100mM Tris-HCl,500mM KCl,15mM MgCl2)混合,于95℃变性5min后,再以每分钟降低2℃的速度逐步降低至室温,制备得到双链DNA靶标。在Cas12a检测反应中,按照实施例2的描述配制Cas反应液,向Cas反应液中加入2μL 100nM双链DNA靶标作为阳性检测组,向Cas反应液中加入2μL RNase-free水作为阴性检测组。将上述Cas反应液于37℃反应25min后,滴加到试纸条上进行检测。
2、结果
对CHLFA检测功能进行初步验证结果显示,CHLFA平台在检测阳性样本时,检测线(T)处出现了非常明显的条带,而检测阴性样本时,检测线(T)处未观察到任何颜色变化,表明没有检测背景,表现出高度的特异性(图2),上述结果初步证明了本发明所构建的CHLFA检测平台的检测可行性。
实施例5
对Cas12a反式切割活性介导的Bio-DNA报告探针剪切的灵敏监测是实现高效侧向流层析检测的关键,有效降低反应体系中Bio-DNA报告探针的总量,可以最大程度保证检测灵敏度。因此,本实施例对报告探针的浓度及长度(表1)进行了进一步优化。
表1.Bio-DNA报告探针序列表
实验方法为:
实验方法参照实施例2中所描述的Cas反应试剂的制备体系,并分别使用表1所示不同长度的Bio-DNA报告探针,以实施例4中的样本、靶标开展优化实验
结果如图3所示,图3为CHLFA参数优化结果。其中,A为CHLFA系统中Bio-DNA报告探针的浓度优化结果;B为A中试纸条条带灰度统计结果;C为CHLFA系统中Bio-DNA报告探针的长度优化结果;D为C中试纸条条带灰度统计结果。
结果表明,Bio-DNA的工作浓度最低可以为500nM,Bio-DNA中核苷酸序列的长度最低可以为14nt。
实施例6
SARS-CoV-2Omicron BA.4/5是当前全球流行最广泛的新冠病毒变异毒株,本实施例的目的为构建基于Cas12a-CHLFA的高准确度的SARS-CoV-2Omicron BA.4/5谱系Spike基因del60-70变异位点的检测体系。
1、Cas检测体系
建立用于检测SARS-CoV-2Omicron BA.4/5变异株的CRISPR-Cas12a系统的部分过程和结果如图4所示。其中,A为SARS-CoV-2Omicron BA.4/5变异株Spike基因del69-70突变位点的序列示意图;B为用于检测SARS-CoV-2Omicron BA.4/5变异株Spike基因del69-70突变的crRNA/PAM序列设计方案;C为以SARS-CoV-2Omicron BA.4/5和1株Spike基因扩增产物为靶标,评价不同CRIPSR-Cas12a/crRNAs的响应效率(每组柱状图从左至右依次为OmicronBA.4/5、1株、无靶标);D为不同CRIPSR-Cas12a/crRNAs对Omicron BA.4/5Spike基因检测效率的区分系数。
Spike基因del69-70突变是Omicron BA.4/5变异株区别于野生型毒株及当前流行的另一变异谱系Omicron BA.3的标志性基因变异位点之一(如图4A所示)。我们设计了一系列靶向该变异位点的crRNA(如图4B和下表2所示),并转录出了上述crRNA(其转录产物电泳条带如图5所示),并以del69-70变异位点扩增产物为阳性靶标,以野生型毒株为对照靶标,开展了荧光反应动力学实验及结果的信噪比分析。
表2.用于转录crRNA的DNA模板序列
结果显示,编号为15的LbacrRNA-Omicron BA.4/5在检测突变位点时表现出现最高的反应效率,且信噪比值最高(结果如图4C,D所示),因此选择15号crRNA(SEQ ID NO.8)开展后续实验。
2、RPA扩增体系
为了筛选出扩增能力更好的RPA引物,首先以含有目标基因片段的质粒DNA为模板(根据在NCBI网站查询基因序列订购全基因合成基因片段,合成的片段克隆到pUC57质粒中),用引物扩增不同浓度的DNA模板,评价引物对靶标的扩增灵敏度。恒温扩增引物序列如下表3所示,其它条件参照实施例2。
表3.SARS-CoV-2 Spike基因del69-70突变位点恒温扩增引物序列
DNA模板名称 | 序列(5’-3’) | 编号 |
OF(1) | TTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGT | SEQ ID NO.6 |
OF(2) | CATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTC | SEQ ID NO.32 |
OR(2) | CCT CTT ATT ATG TTA GAC TTC TCA GTG GAA | SEQ ID NO.7 |
OF(3) | ACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCC | SEQ ID NO.33 |
OR(3) | CTT CTC AGT GGA AGC AAA ATA AAC ACC ATC | SEQ ID NO.34 |
OF(4) | TTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGG | SEQ ID NO.35 |
OR(4) | ACC ATC ATT AAA TGG TAG GAC AGG GTT ATC | SEQ ID NO.36 |
最终全基因合成的DNA为模板(SARS-CoV-2 Spike基因部分序列)序列为:ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTATAACCAGAACTCAATCAATTACCTCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAA(SEQ ID NO.37)
结果如图6所示,图6所示电泳结果为SARS-CoV-2Omicron BA.4/5Spike基因del69-70突变区域RPA恒温扩增引物的筛选结果,引物OF(1)/OR(2)对靶标的扩增灵敏度达到1aM,同时阴性对照组的引物二聚体也较少,因此选择OF(1)/OR(2)(SEQ ID NO.6和SEQID NO.7)作为最优扩增引物。
3、CRISPR-CHLFA系统检测SARS-CoV-2Omicron BA.4/5变异株突变基因的分析性能评价
基于上述结果中筛选出来的用于检测del69-70突变区的LbacrRNA和RPA扩增引物,我们进一步评价检测体系的特异性和灵敏度。试纸制备方法如实施例2,其中crRNA选择15号crRNA(SEQ ID NO.8)。
结果如图7所示,图7为CRISPR-CHLFA系统的性能评价结果图。其中,A为用常见冠状病毒评价所构建的Cas-NHLFA系统的特异性,其它常见冠状病毒包括毒株Spike基因,NL63,HKUI,OC43,229E,FluA,FluB,其模板序列为根据在NCBI网站查询的部分长度基因序列订购全基因合成基因片段,合成的片段克隆到pUC57质粒中,NL63,HKUI,OC43,229E,FluA,FluB核酸标本为广州医科大学附属第一医院检验科收集、储存;B为A中试纸条条带的灰度分析结果;C为CRISPR-CHLFA平台对SARS-CoV-2Omicron BA.4/5Spike基因检测灵敏度的评价结果;D为C中试纸条条带的灰度分析结果。
从上述图7A和7B结果中可以看出,对毒株Spike基因和常见冠状病毒的检测证明了检测体系的特异性,灵敏度评价结果显示该体系对Omicron BA.4/5谱系del69-70突变位点基因的检测限达到10拷贝(如图7C,7D)。上述结果说明所建立的检测体系具有出色的检测性能。
4、SARS-CoV-2临床样本的检测
将上述构建的CRISPR-CHLFA系统用于SARS-CoV-2Omicron BA.4/5变异株核酸临床样本的检测,核酸临床样本由广州医科大学附属第一医院检验科收集、储存,同时以基于商业化的CRISPR-LFA体系用于平行对照。
具体方法如下:将核酸临床样本加入到RT-RPA反应试剂中后,41℃孵育20分钟进行基因扩增,扩增产物加入到Cas12a反应液中进行Cas识别、酶切反应。其中CRISPR-CHLFA体系使用筛选的Bio-DNA报告探针,传统CRISPR-LFA体系使用Bio-FAM报告探针,37℃孵育20分钟后滴加到CHLFA或LFA试纸进行检测。
结果如图8所示,图8为SARS-CoV-2临床样本分析结果。其中,A为使用CHLFA和传统LFA方法检测SARS-CoV-2Omicron BA.4/5.1变异株临床样本的结果;B为对NHLFA、LFA方法检测SARS-CoV-2临床样本的试纸条条带灰度分析结果;C为对SARS-CoV-2临床样本检测结果进行ROC曲线分析的结果;D为NHLFA和传统LFA方法检测SARS-CoV-2临床样本的性能比较。
上述结果显示,本发明构建的方法仅在检测存在Spike基因69-70del基因变异位点的SARS-CoV-2Omicron BA.4/5谱系样本时能在见检测线能观察到有色条带,显示阳性检测结果,在检测非Omicron BA.4/5谱系及阴性样本时均不能在试纸条检测线观察到条带,即显示阴性结果。
最为关键的是,本发明建立的CHLFA方法可以达到接近无背景的阴性样本检测(图8A,B),相反的是,传统LFA方法的阴性检测结果在检测线仍然有微弱的背景条带,且难以用肉眼区分阴性与弱阳性检测结果,使LFA方法学在可视化检测应用中的可行性、可信度受到极大影响。
进一步对试纸条检测线的灰度进行统计并分析检测数据,统计学分析显示,CHLFA和LFA方法均表现出较高的综合检测性能,基于CHLFA方法对阴性及的检测没有出现假阳性、假阴性结果(图8C),而基于商业化LFA的检测结果出现一个假阴性(图8C,D),通过对检测结果进行ROC分析显示(图8D),CHLFA(AUC=1)表现出比传统LFA(AUC=0.9378)平台稍高的整体检测精准度,在与金标准方法进行比较也显示出较高的检测一致性(图8D)。
然而,CHLFA和LFA侧向流技术概念的核心在于准确的可视化检测应用,因此即使通过对检测结果进行定量分析后显示较高的检测性能,但是在可视化分析中,传统LFA技术由于存在明显的条带背景,导致难以实现准确的可视化检测结果读取,而本发明构建的NHLFA技术能够实现极低背景的检测结果输出,因此可以准确的裸眼观察、读取检测结果,从而实现精准的可视化检测。
实施例7
为了验证本发明CHLFA平台的通用性,本实施例进一步建立了用于结核分枝杆菌检测的CRISPR-CHLFA体系。
1、性能验证
方法为:首先以结核分枝杆菌IS1081基因为靶标设计四条crRNA(图9A),并通过Cas12a荧光反应动力学实验筛选出LbacrRNA-IS1081-4为最优(图9B)。基于建立的RPA-Cas12a基因扩增、Cas检测体系,分别检测不同拷贝数的靶标基因,评价IS1081基因检测灵敏度(图9C)。
结果如图9-10所示,图9为用于检测结核分枝杆菌IS1081基因的CRISPR-CHLFA系统的建立过程和结果。其中,A为靶向IS1081基因的crRNAs设计示意图;B为以IS1081基因扩增产物为靶标,评价不同CRIPSR-Cas12a/crRNAs的响应效率;C为基于LbacrRNA-IS1081-4的CRISPR-CHLFA平台对IS1081基因检测灵敏度的评价结果。
从上述结果中可以看出,以结核分枝杆菌IS1081基因为靶标设计4条crRNAs(见下表)并进行了体外转录与纯化,电泳结果显示crRNA被成功制备(图10)。
表4.用于转录crRNA的DNA模板序列
接下来开展了Cas12a反应荧光动力学实验以评估所设计的crRNA体系,荧光动力学实验方法为:以20μL反应体系为例,向EP管中加入11.8μL RNase-free水、2μL NEBbuffer 2.1、1μL 10uM DNA reporter(FAM-TTTTT-BHQ)、1.7μL crRNA(1uM)、1.5μLLbaCas12a(1uM)、2μL RPA扩增产物(靶标基因或对照基因或阴性对照),充分混匀后置于荧光定量PCR仪37℃孵育30分钟,每隔1分钟读取一次荧光值。
结果显示,LbacrRNA-IS1081-4为最优选项(图9B),并以下述序列为扩增引物对,在此基础上进一步评价了所构建CRISPR-CHLFA体系的检测灵敏度,如图9C所示,本体系最少可以检测到单拷贝当量的IS1081基因靶标。
表5.结核分枝杆菌IS1081基因恒温扩增引物序列
引物名称 | 序列(5’-3’) | 编号 |
IS1081-F1(rpa) | CCAAGCTGCGCCAGGGCAGCTATTTCCCGGAC | SEQ ID NO.9 |
IS1081-R1(rpa) | TTGGCCATGATCGACACTTGCGACTTGGA | SEQ ID NO.10 |
2、MTB临床样本的检测
将上述所构建的CRISPR-CHLFA系统用于MTB临床样本的检测,同时以基于商业化CRISPR-LFA的体系用于平行对照(图11A)。
具体方法如下:将核酸临床样本加入到RPA反应试剂中后,38℃孵育20分钟进行基因扩增,扩增产物加入到Cas12a反应液中进行Cas识别、酶切反应。其中CRISPR-CHLFA体系使用筛选的Bio-DNA报告探针,传统CRISPR-LFA体系使用Bio-FAM报告探针,37℃孵育20分钟后滴加到CHLFA或LFA试纸进行检测。
对试纸条检测线的灰度进行统计并分析检测数据,结果如图11所示,图11为MTB临床样本分析,其中,A为使用CHLFA和传统LFA方法检测MTB临床样本的结果;B为对检测MTB临床样本的试纸条条带灰度分析结果;C为对MTB临床样本检测结果进行ROC曲线分析的结果。
结果显示,基于CHLFA技术的检测,无论通过裸眼观察还是通过定量分析检测线条带灰度,都不会出现假阴性的结果判定(如图11A,B);而在基于商业化LFA技术的检测结果中,通过灰度定量统计及对数据的ROC分析,计算结果显示出现两个假阳性结果(如图11B,C),相对应的,通过裸眼观察检测结果也可以发现,部分阴性样本检测产生的检测线有微弱条带,并且与弱阳性样本的检测条带在视觉上没有显著差异,因此对结果的观察判定造成极大干扰,难以实现准确的可视化检测。对MTB临床样本的检测结果进行定量统计分析显示,NHLFA技术表现出极高的检测精准度(AUC=1),显示出巨大的应用价值。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种用于侧向流试纸基于链杂交的CRISPR核酸检测探针,其特征在于,包括报告探针、捕获探针和信号探针,所述报告探针包含连接的生物素和第一核苷酸探针序列,所述捕获探针包含连接的生物素和第二核苷酸探针序列,所述信号探针包含连接的信号分子或粒子和互补核苷酸序列,所述第一核苷酸探针序列和第二核苷酸探针序列均可与所述信号探针的互补核苷酸序列互补杂交;
所述信号探针为胶体金探针;所述胶体金探针包含如5’-HS-AAAAATTTTTCATTGCTAGAGCAGGGTGTTTAGGATTTGC-3’所示序列的互补核苷酸序列,包含与报告探针第一核苷酸探针序列的结合区和与捕获探针第二核苷酸探针序列的结合区,与第二核苷酸探针序列的结合区直接与胶体金的金纳米粒子连接;
所述第一核苷酸探针序列选自如SEQ ID NO.1-4所示序列,所述第二核苷酸探针序列选自如SEQ ID NO.5所示序列。
2.根据权利要求1所述的用于侧向流试纸基于链杂交的CRISPR核酸检测探针,其特征在于,所述报告探针的工作浓度≥500nM。
3.根据权利要求2所述的用于侧向流试纸基于链杂交的CRISPR核酸检测探针,其特征在于,所述报告探针的工作浓度为500-750nM。
4.一种基于链杂交的CRISPR-侧向流核酸检测试纸,其特征在于,包括试纸条和检测反应试剂,所述试纸条包括底板和依次层叠固定在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸,所述硝酸纤维素膜上由结合垫端向吸水纸端依次设有对照线和检测线,所述结合垫包埋有权利要求1所述的信号探针,所述对照线设有报告探针捕获试剂,所述检测线设有链霉亲和素和权利要求1所述的捕获探针结合形成的复合物;
所述检测反应试剂包括:核酸扩增试剂和Cas反应试剂,所述Cas反应试剂包括权利要求1所述的报告探针。
5.根据权利要求4所述的基于链杂交的CRISPR核酸检测试纸,其特征在于,所述信号探针为胶体金探针,所述信号粒子为胶体金纳米粒子,所述链霉亲和素的浓度为4±0.5 mg/mL,在试纸条上的用量为0.7±0.1 μL/cm;所述捕获探针中的浓度为50±5μM,在试纸条上的用量为0.7 μL/cm;所述胶体金探针的浓度为8±1 nM,在试纸条上的用量为7±1 μL/2.8mm。
6.根据权利要求4所述的基于链杂交的CRISPR核酸检测试纸,其特征在于,所述核酸扩增试剂包括:RPA、RAA、或LAMP核酸扩增试剂;
所述Cas反应试剂包括:crRNA,Cas12a酶。
7.根据权利要求6所述的基于链杂交的CRISPR核酸检测试纸,其特征在于,所述核酸扩增试剂包括:RT-RPA、RT-RAA或RT-LAMP核酸扩增试剂。
8.根据权利要求4所述的基于链杂交的CRISPR核酸检测试纸,其特征在于,所述CRISPR核酸检测试纸用于SARS-CoV-2 Omicron变异株del69-79突变位点检测,扩增引物对选自如SEQ ID NO.6-7所示序列,所述crRNA选自如SEQ ID NO.8所示序列;
或者
所述CRISPR核酸检测试纸用于结核分枝杆菌检测,扩增引物对选自如SEQ ID NO.9-10所示序列,所述crRNA选自如SEQ ID NO.11所示序列。
9.一种用于非疾病诊断目的的基于链杂交的CRISPR核酸检测方法,其特征在于,采用权利要求4-8任一项所述的CRISPR核酸检测试纸进行检测,包括以下步骤:
恒温扩增:取待测样本,以所述核酸扩增试剂进行恒温扩增反应,得到扩增产物;
Cas反应:取上述扩增产物,加入所述Cas反应试剂,孵育,反应,得到反应液;
层析:将上述反应液滴加到所述试纸条的样品垫上,进行层析,根据所述对照线和检测线的显色情况,获取检测结果。
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