CN1169969C - Ret寡核苷酸微芯片及其用于检测遗传性癌症的方法 - Google Patents

Ret寡核苷酸微芯片及其用于检测遗传性癌症的方法 Download PDF

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Abstract

本发明设计一种用于检测RET基因突变热点区突变的RET寡核苷酸微芯片，其生产方法及其用于检测遗传性癌症的方法，其中有选择地设计了特定寡核苷酸，用来检测RET基因突变热点上的各种错义突变。

Description

RET寡核苷酸微芯片及其用于检测遗传性癌症的方法
发明领域
本发明涉及一种用于检测RET基因突变热点区中突变的RET寡核苷酸微芯片，其生产方法及其用于检测遗传性癌症的方法。
发明背景
据估计自然界中约5～10％的癌症是遗传性的，这种遗传性癌症由基因突变导致。因此，通过检测遗传性癌症患者家族成员中的基因突变，可以早期预防或治愈癌症。遗传性癌症的研究还证明是揭开肿瘤发生的关键线索，以及预防和早期诊断癌症的方法。该研究已经鉴定了几种肿瘤抑制基因。
为了检验高风险家族成员的种系突变，研制出一种寡核苷酸微芯片(下文称为“寡芯片(寡芯片)”)。它被用于检验高风险家族成员中是否存在种系突变，早期检测遗传性癌症，并为种系突变成员提供一种正规的医学治疗方法。该检验的结果还缓解了无种系突变家族成员对癌症的恐惧心理。
通常，该技术涉及实验寡核苷酸与固定在固体基质，即玻璃片或凝胶表面的寡核苷酸杂交。该寡核苷酸涂布的固体基质可以用以下两种方法制备：直接在固体基质表面合成寡核苷酸，或者在固体基质表面固定预先合成的寡核苷酸。前者应用一种光刻寡核苷酸合成技术：承载光保护羟基的表面通过光刻掩蔽照射，在光脱保护区产生游离羟基，然后，该羟基与脱氧核糖核苷氨基亚磷酸酯偶联(Pease，A.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5022～5026，1994)。
在后面的方法中，将携带均聚物尾巴的寡核苷酸和末端脱氧核糖核苷酰转移酶点到尼龙膜上，通过UV照射共价结合(Saiki，R.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6230～6234，1989)。还报道了一种改进方法，其在膜的羧基和结合到寡核苷酸5′端的氨基接头之间形成酰胺键，以避免当应用加热或紫外照射时导致的非特异性固定(Zhang，Y.等，Nucleic Acids Res.19：3929～3933，1991)。
放射性标记或无标记的目的DNA与上述制备的DNA芯片的杂交方法已经成功用于检测RAS点突变、囊性纤维化删除和各种点突变，以及DNA测序(Cantor，C.R.等，Genomics 13：1378～383，1992)。它还曾被用于检测基因突变和研究基因多态型(Lipshutz，R.J.等，Biotechniques19：442～447，1995)。而且，该技术期望对有效确定肿瘤形成和HLA基因型以及诊断遗传性疾病提供一种有力的工具(Saiki，R.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6230～6234，1989)。
然而，用于检测基因突变的寡芯片不容易生产，因此，仅有很少一部分寡芯片商业化，例如Affymetrix(Santa Clara，CA 95051)，并且它们的应用仅限于检测很少几个基因的突变，例如p53、ATM和BRCA1。Affymetrix销售的寡芯片应用光刻法直接将寡核苷酸合成到固体基质表面生产。然而，该寡芯片存在一些问题，例如其生产成本较高；需要应用昂贵的设备；不可能在固体基质表面固定纯化的高质量寡核苷酸；固体基质表面产生的杂交产物的量不足以定量分析。
另一方面，2型多发性内分泌瘤(MEN2)综合症以常染色体显性方式遗传，并具有高度渗透性。它还有三种亚型，即MEN2A、MEN2B和FMTC(家族性甲状腺髓样癌)，RET基因的突变在MEN2综合症中发挥重要作用：在95％以上的MEN2病例中，观察到RET基因的9个密码子(密码子609、611、618、620、630、634、768、804和918)之一发生错义突变。为了考察RET基因的这些突变热点区是否存在突变，应用了一些工具例如SSCP(单链构象多态型)、PTT(蛋白质截断实验)、以及基于凝胶的测序。然而，这些工具相对费时费力，因此有必要研究一种改进的方法。
因此本发明试图研究以符合上述需要，研制了一种RET寡芯片，它通过用自动微点阵仪将寡核苷酸固定到固体基质表面生产，该寡核苷酸被设计用于检测RET基因的突变热点区的错义突变。本发明的RET寡芯片还能够用于研究与RET基因有关的信号传导基质和肿瘤发生。
发明概述
因此，本发明的一个目的在于提供一种RET寡芯片，其可以用作检测RET基因突变和遗传性癌症的快速可靠的遗传诊断设备。
按照本发明的一方面，提供了一种用于检测RET突变的RET寡核苷酸微芯片，其包括固定在固体基质表面的多种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被设计用于检测RET基因突变热点区的错义突变。
按照本发明的另一方面，提供了一种应用所述微芯片检测遗传性癌症的方法。
附图简述
本发明的上述和其它目的和特征将从本发明的下列说明结合分别显示的附图而变得显而易见。
图1：本发明RET寡芯片的外观；
图2：本发明RET寡芯片的一个实施例，它在一个3.7cm×7.6cm的玻璃表面印刻了总共268个寡核苷酸点；
图3：用于通过分析杂交反应后来自各寡核苷酸点的信号强度确定极限值的Sigma曲线(SigmaPlot)，其中实线表示极限值，虚线表示背景的平均值；
图4：应用本发明的RET寡芯片检测各密码子中是否存在RET基因突变，
a：在外显子10(密码子609、611、618、和620)和外显子11(密码子630和634)上的杂交
b：在外显子13(密码子768)和外显子14(密码子804)上的杂交
发明详述
本发明提供了一种用于检测RET突变的RET寡核苷酸微芯片，它包括用自动微点阵仪固定到固体基质表面的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够检测RET基因突变热点区上的错义突变。
首先，寡核苷酸被设计用于检测8个密码子(密码子609、611、618、630、634、768、和804)上可产生的错义突变型和一个密码子918上的错义突变型。
如上所述，RET基因是形成REN2综合症的原因，REN2综合症以常染色体显性方式遗传并具有高度渗透性和多种临床表征。主要的RET突变限于9个密码子(密码子609、611、618、620、630、634、768、804和918)的错义突变。MEN2综合症具有3个亚型：2A型多发性内分泌瘤(MEN2A)、MEN2B、和家族性甲状腺髓样癌(FMTC)。已经鉴定在MEN2A家族中外显子10(密码子609、611、618、和620)和外显子11(密码子630和634)有98％的错义突变，在FMTC家族中有85％的错义突变。已知密码子768和804的错义突变是5～10％FMTC病例的病因。另外，外显子16(密码子918)的错义突变在95％的MEN2B病例中发现。
本发明提供了各种能够用于检测上述RET基因突变热点区错义突变的寡核苷酸，这些错义突变在所有检查病例中的发生几率超过了95％。因此，本发明的RET寡芯片以大于95％的可信度检测突变是可能的。另外，因为本发明的RET寡芯片中使用的寡核苷酸被设计用来检测8个密码子上的所有可能错义突变，因此检测这些密码子上尚未发现的任何错义突变也是可能的。在密码子918，发生的主要突变是Met→Thr型突变，因此，本发明使用的寡核苷酸被设计用来检测这种类型突变。也就是说，本发明人将基因特征考虑在内特别设计了用于检测RET基因热点区突变的寡核苷酸，本发明的RET寡芯片在检测RET基因突变时具有更高的准确性和效率。
按照本发明的一个方面，本发明的RET寡芯片具有67种点样并固定到固体基质表面的上的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够检测RET基因9个热点上的各种错义突变。每个寡核苷酸水平点样4次，以增加测量信号的准确性，结果如表1、图1和图2所示。首先点1和50位，然后点26到50位，最后点51到67位。1和50位分别是外显子10和11的阳性对照。其它寡核苷酸为：2-33是外显子10(密码子609、611、618、和、620)；34-49是外显子11(密码子630和634)；51-58是外显子13(密码子768)；59-65是外显子14(密码子804)；和66-67是外显子16(密码子918)。
具体地说，对于密码子609、611、618、620、630、634、和768，点了具有7种错义突变的寡核苷酸(M)和一种野生型寡核苷酸(W)；对于密码子804，点了具有6种错义突变的寡核苷酸(M)和一种野生型寡核苷酸(W)；对于密码子918，点了具有主要突变类型的寡核苷酸(M)和一种野生型寡核苷酸(W)。为了说明得更具体，用于密码子609、611、618、620、630、和634的是7种如下取代得到的寡核苷酸：分别用CGC(精氨酸)、AGC(丝氨酸)、GGC(甘氨酸)、TTC(苯丙氨酸)、TAC(酪氨酸)、TCC(丝氨酸)和TGG(色氨酸)取代TGC(半胱氨酸)。用于密码子768的是7种如下取代得到的寡核苷酸：分别用CAG(谷氨酰胺)、AAG(赖氨酸)、GCG(丙氨酸)、GGG(甘氨酸)、GTG(缬氨酸)、GAC(天冬氨酸)和GAT(天冬氨酸)取代GAG(谷氨酸)。对于密码子804，使用6种突变的寡核苷酸：分别用CTG(亮氨酸)、ATG(蛋氨酸)、TTG(亮氨酸)、GAG(谷氨酸)、GCG(丙氨酸)和GGG(甘氨酸)取代GTG(缬氨酸)。密码子918的突变体是用ACC(苏氨酸)取代ATG(蛋氨酸)得到的寡核苷酸。
为各个密码子都设计了一种野生型寡核苷酸(W)，用于直接与突变型比较。例如，对于密码子618，点了8个寡核苷酸，一个用于检测正常碱基序列，其余的检测突变的碱基序列。总共为9个热点密码子上的56种错义突变型设计了56个突变寡核苷酸和用于野生型和阳性对照的11个寡核苷酸(参见表1a和1b)。设计的阳性对照是针对大多数突变已经被鉴定出来的外显子10和11的。
SEQ ID Nos.4、20、和44中分别描述的三种寡核苷酸被设计具有16个碱基的较短长度而不是20个碱基。初步实验表明当使用20个碱基的寡核苷酸时，常发生某些G-A错配(4、20、和44位)，从而表现出非特异性信号。例如，在SEQ ID Nos.4(-GGC-)和8(-TGC-)中描述的寡核苷酸情况下，样品DNA中的互补序列(-ACG)原则上仅与SEQ ID No.8的寡核苷酸杂交。然而，也可能与表现G-A错配恒定结合亲合力水平的SEQ ID No.4的寡核苷酸非特异性杂交。据报道，G-T和G-A错配略微使双链不稳定，而A-A、T-T、C-T、和C-A错配导致显著不稳定(IkutaS.等，Nucleic Acids Res.15：797-811，1987)。还报道提高清洗温度能够清晰分辨精确匹配双链与错配双链(Ikuta S.等，Nucleic Acids Res.15：797-811，1987)，当室温为约60℃时，则不可能充分分辨特异性信号与非特异性信号。因此，为了减少本发明中由于非特异性杂交导致的实验误差，寡核苷酸的长度在三个情况下(4、20、和44位)从20个碱基减少到16个碱基，以便降低G-A错配导致的不稳定作用。这些16个碱基的寡核苷酸用精确匹配寡核苷酸分析。
可以利用包括以下步骤的方法，用自动微点阵仪将多达67个寡核苷酸固定到固体基质表面生产本发明的RET寡芯片：
1)在微量点样溶液中混合每一种寡核苷酸，然后分配到平板的孔中；
2)用微点阵仪将寡核苷酸点到固体基质表面；
3)将寡核苷酸固定到固体基质表面，并清洗；
4)将固体基质浸泡到95℃水中，使固定的寡核苷酸变性，然后用硼氢化钠溶液处理固体基质；和
5)清洗并干燥固体基质。
步骤(1)中使用的每种寡核苷酸优选具有功能基团，该基团可以用于与固体基质表面形成稳定的结合。例如，各寡核苷酸可以连接有含5’氨基功能的12碳间隔区，例如H2N-(CH2)12-寡核苷酸。该氨基可与固体基质表面的醛基发生Schiff碱反应，在其间形成牢固结合。12碳间隔区通过促进寡核苷酸和荧光标记的目的DNA之间接触，而增强杂交速率。
步骤(1)中使用的微量点样溶液可以含有适当的盐和聚合物，以便有利于将寡核苷酸点到固体基质上。
步骤(2)中使用的固体基质可以用玻璃、改良硅胶、塑料盒、或聚合物例如聚碳酸酯或其凝胶制得。固体基质表面可以涂布化合物，其有助于寡核苷酸与基质底物结合。可以用于涂布的优选化合物具有例如醛基或氨基这样的功能基团。在一个优选实施方式中，本发明使用了一个用乙醛涂布的玻璃片。
按照步骤(1)和(2)的一个实施方式，将总共268种寡核苷酸用自动针式微点阵仪以指定方式排列到固体基质上。各寡核苷酸点优选为直径100到500μm的圆形。固体基质的优选实施例是尺寸约为3.7cm×7.6cm的玻璃片，该玻璃片可以容纳约100到10000个点。优选地，可以将总共268种寡核苷酸点，直径各自为130μm，以300μm的间隔排列成多列和多排(参见图2)。
在步骤(3)中，通过在寡核苷酸的氨基和固体基质的醛基之间经Schiff碱反应形成共价键的方式，将寡核苷酸固定到固体基质表面。游离未反应的寡核苷酸用SDS、SSC、SSPE等从固体基质上清洗除去。
在步骤(4)中，将固定的寡核苷酸变性，通过硼氢化钠处理减少和灭活保留在固体基质上的未反应醛基。
通过上述方法生产的本发明的RET寡芯片可以有利地检测基因突变，本发明的方法比任何常规基因突变检测方法更简单、更经济：用这些常规方法例如SSCP(单链和构象多态型)、PTT(蛋白质截断实验)、RFLP(限制性片段长度多态型)、克隆、直接测序等检查是否存在基因突变平均须花费几天到数月。然而，当使用本发明的RET寡芯片分析RET基因突变的DNA样品仅花费不到9小时。另外，本发明的RET寡芯片可以以比常规芯片更少的生产成本更简单地生产。一旦合成所需的寡核苷酸后，可以大量生产本发明的玻璃片。使用本发明的RET寡芯片所需的试剂量远远少于任何常规方法中所需的试剂量
本发明的RET寡芯片用针式微点阵仪可容易地生产，而现有的Affymetrix寡芯片必须用复杂和昂贵的光刻技术制备。
另外，用本发明的RET寡芯片纯化和修饰寡核苷酸是可能的，相比较而言，通过在固体基质表面直接合成寡核苷酸制备的Affymetrix寡芯片不可能纯化或修饰寡核苷酸。因此，本发明的RET寡芯片能够提供比以前可能得到的更好的实验准确度。
本发明提供了一种用RET寡芯片检测遗传性癌症的方法，包括以下步骤：
1)从受试患者的血液制备荧光标记的DNA样品；
2)使标记的DNA样品与RET寡芯片上的寡核苷酸点反应；
3)清洗反应后的寡芯片，除去未结合的样品DNA；
4)用荧光读数仪检测特定寡核苷酸点的杂交模式；和
5)检查是否存在基因突变。
在步骤(1)中，通过将荧光染料加入到从受试患者得到的血液DNA样品中制备DNA样品。可以应用适当软件用荧光读数仪分析荧光染料标记的DNA与寡芯片上某寡核苷酸点的杂交。优选的荧光染料包括，但不限于Cy5和Cy3。
在步骤(2)中，将步骤(1)中制备的荧光染料标记的DNA样品与杂交溶液混合，然后转移到各种寡核苷酸点中。在45～60℃、水蒸汽饱和的保温箱中进行杂交反应3-9小时。然后清洗寡芯片，除去未结合的样品DNA，并干燥(步骤3)，应用合适的软件用荧光读数仪分析产生的荧光(步骤4)。在步骤(5)中，在99％可靠范围内设置一个最大值作为极限值，认为荧光值高于极限值的任何信号对于突变的存在是阳性的。
本发明的RET寡芯片可以有效地用于诊断诸如MEN2A、MEN2B、FMTC等的遗传性癌症。因为RET基因属于受体酪氨酸激酶家族，在细胞信号转导途径中起作用，因此本发明的RET寡芯片可以用作研究癌症细胞的有效诊断工具。
下述实施例和实验例仅为说明的目的提供，并不是想限制本发明的范围。
实施例1：用RET寡芯片检查RET突变
(步骤1)RET寡芯片的生产
如下生产67种寡核苷酸，设计用于检测RET基因的9个突变热点密码子上的共56种错义突变(表1a和1b)。SEQ ID Nos.1和50中描述的寡核苷酸10-PC和11-PC为阳性对照，SEQ ID Nos.9、17、25、33、41、49、58、65、和67中描述的寡核苷酸为野生型。其它寡核苷酸各自在一个热点密码子上存在：SEQ ID Nos.2到8描述的寡核苷酸在密码子609上有错义突变；SEQ ID Nos.10到16描述的寡核苷酸在密码子611上有错义突变；SEQ ID Nos.18到24描述的寡核苷酸在密码子618上有错义突变；SEQ ID Nos.26到32描述的寡核苷酸在密码子620上有错义突变；SEQ ID Nos.34到40描述的寡核苷酸在密码子630上有错义突变；SEQ ID Nos.42到48描述的寡核苷酸在密码子634上有错义突变；SEQ ID Nos.51到57描述的寡核苷酸在密码子768上有错义突变；SEQID Nos.59到64描述的寡核苷酸在密码子804上有错义突变；和SEQ IDNo.66描述的寡核苷酸在密码子918上有错义突变。
<表1a>
SEQ IDNo. 寡核苷酸    外显子   密码子                序列
    1  10-PCa     10 5′-GGGGATTAAAGCTGGCTATGG-3′
    2  609Mb-(R)c     10     609 5′-CTATGGCACCCGCAACTGCTT-3′
    3  609M-(S) 5′-CTATGGCACCAGCAACTGCTT-3′
    4  609M-(G) 5′-TGGCACCGGCAACTGC-3′
    5  609M-(F) 5′-CTATGGCACCTTCAACTGCTTC-3′
    6  609M-(Y) 5′-CTATGGCACCTACAACTGCTTC-3′
    7  609M-(S) 5′-TATGGCACCTCCAACTGCTTC-3′
    8  609M-(W) 5′-TATGGCACCTGGAACTGCTTC-3′
    9  609Wd-(C) 5′-TATGGCACCTGCAACTGCTTC-3′
    10  611M-(R)     10     611 5′-ACCTGCAACCGCTTCCCTGA-3′
    11  611M-(S) 5′-CACCTGCAACAGCTTCCCTGA-3′
    12  611M-(G) 5′-ACCTGCAACGGCTTCCCTGA-3′
    13  611M-(F) 5′-ACCTGCAACTTCTTCCCTGAG-3′
    14  611M-(Y) 5′-ACCTGCAACTACTTCCCTGAG-3′
    15  611M-(S) 5′-ACCTGCAACTCCTTCCCTGAG-3′
    16  611M-(W) 5′-ACCTGCAACTGGTTCCCTGAG-3′
    17  611W-(C) 5′-ACCTGCAACTGCTTCCCTGAG-3′
    18  618M-(R)     10     618 5′-AGGAGAAGCGCTTCTGCGAG-3′
    19  618M-(S) 5′-GAGGAGAAGAGCTTCTGCGAG-3′
    20  618M-(G) 5′-GAGAAGGGCTTCTGCG-3′
    21  618M-(F) 5′-AGGAGAAGTTCTTCTGCGAG-3′
    22  618M-(Y) 5′-AGGAGAAGTACTTCTGCGAG-3′
    23  618M-(S) 5′-AGGAGAAGTCCTTCTGCGAG-3′
    24  618M-(W) 5′-AGGAGAAGTGGTTCTGCGAG-3′
    25  618W-(C) 5′-GAGGAGAAGTGCTTCTGCGAG-3′
    26  620M-(R)     10     620 5′-AAGTGCTTCCGCGAGCCCGA-3′
    27  620M-(S) 5′-AAGTGCTTCAGCGAGCCCGA-3′
    28  620M-(G) 5′-AAGTGCTTCGGCGAGCCCGA-3′
    29  620M-(F) 5′-AAGTGCTTCTTCGAGCCCGA-3′
    30  620M-(Y) 5′-AAGTGCTTCTACGAGCCCGA-3′
    31  620M-(S) 5′-AAGTGCTTCTCCGAGCCCGA-3′
    32  620M-(W) 5′-AAGTGCTTCTGGGAGCCCGA-3′
    33  620W-(C) 5′-AAGTGCTTCTGCGAGCCCGA-3′
<表1b>
SEQ IDNo. 寡核苷酸    外显子    密码子                 序列
    34  630M-(M)     11     630 5′-GATCCACTGCGCGACGAGCT-3
    35  630M-(S) 5′-GATCCACTGAGCGACGAGCT-3′
    36  630M-(G) 5′-GATCCACTGGGCGACGAGCT-3′
    37  630M-(F) 5′-GATCCACTGTTCGACGAGCT-3′
    38  630M-(Y) 5′-GATCCACTGTACGACGAGCT-3′
    39  630M-(S) 5′-GATCCACTGTCCGACGAGCT-3′
    40  630M-(W) 5′-GATCCACTGTGGGACGAGCT-3′
    41  630W-(C) 5′-GATCCACTGTGCGACGAGCT-3′
    42  634M-(R)     11     634 5′-GACGAGCTGCGCCGCACGGT-3′
    43  634M-(S) 5′-GACGAGCTGAGCCGCACGGT-3′
    44  634M-(G) 5′-CGAGCTGGGCCGCACG-3
    45  634M-(F) 5′-GACGAGCTGTTCCGCACGGT-3′
    46  634M-(Y) 5′-GACGAGCTGTACCGCACGGT-3′
    47  634M-(S) 5′-GACGAGCTGTCCCGCACGGT-3′
    48  634M-(W) 5′-GACGAGCTGTGGCGCACGGT-3′
    49  634W-(C) 5′-GACGAGCTGTGCCGCACGGT-3′
    50  11-PCa     11 5′-CCGCTGTCCTCTTCTCCTTC-3′
    51  768M-(Q)     13     768 5′-TCCCCGAGTCAGCTTCGAGA-3′
    52  768M-(K) 5′-CTCCCCGAGTAAGCTTCGAGA-3′
    53  768M-(A) 5′-TCCCCGAGTGCGCTTCGAGA-3′
    54  768M-(G) 5′-TCCCCGAGTGGGCTTCGAGA-3′
    55  768M-(V) 5′-TCCCCGAGTGTGCTTCGAGA-3′
    56  768M-(D) 5′-TCCCCGAGTGACCTTCGAGA-3′
    57  768M-(D) 5′-TCCCCGAGTGATCTTCGAGAC-3′
    58  768W-(E) 5′-TCCCCGAGTGAGCTTCGAGA-3′
    59  804M-(L)     14     804 5′-CTCCTCATCCTGGAGTACGC-3′
    60  804M-(M) 5′-CCTCCTCATCATGGAGTACGC-3′
    61  804M-(L) 5′-CCTCCTCATCTTGGAGTACGC-3′
    62  804M-(E) 5′-CTCCTCATCGAGGAGTACGC-3′
    63  804M-(A) 5′-CTCCTCATCGCGGAGTACGC-3′
    64  804M-(G) 5′-CTCCTCATCGGGGAGTACGC-3′
    65  918M-(T) 5′-CTCCTCATCGTGGAGTACGC-3′
    66  918W-(M)     16     918 5′-CAGTTAAATGGACGGCAATTGAAT-3′
    67  918W-(M) 5′-CAGTTAAATGGATGGCAATTGAAT-3′
a：阳性对照；b：突变的；c：氨基酸；d：野生型
所有67个寡核苷酸，各自具有一个5’-末端用可与醛基发生Schiff碱反应的氨基残基修饰的12碳间隔区，从MWG-Biotech(Ebrsberg，德国)得到，然后固定到玻璃片上。每种寡核苷酸各20pmole/μl，与微量点样溶液(TeleChem International Inc，Sunnyvale，CA)混合，混合比例为1∶1，得到的寡核苷酸10pmol/μl的终体积，将每种寡核苷酸各40μl转移到96孔平板上。当将该96孔平板置于针式微点阵仪(Microsys 5100 Cartesian，Cartesian Technologies Inc，Irvine，CA)后，将各寡核苷酸印迹到醛基涂布的玻璃片上(26×76×1mm，CEL Associates Inc，Houston，TX)。每点直径130μm，以300μm的间隔多列多排排列。点印寡核苷酸的玻璃片用0.2％SDS清洗两次，然后用蒸馏水清洗一次。将玻璃片浸泡到热水(95℃)中，使寡核苷酸变性，然后放入硼氢化钠溶液5分钟，使未反应的醛基失活。然后，用0.2％SDS清洗玻璃片2次，用蒸馏水洗一次，离心，干燥。
(步骤2)DNA样品的制备
从与5个MEN2A家族有关的23位个体采集学样(表2)。23位中22位(SNU-MEN1A-I，II，III，IV)经常规方法确认为MEN2A患者，剩余的一位(SNU-MEN2A-V)是未知受试者。
<表2>
  家族 受影响成员的数目 基因携带者的数目   突变 直接测序a 克隆和测序 RET寡芯片
    I     5     4   C634Wb     +c     +     +
    II     2     3   C634R     +     +     +
    III     2     1   C634R     +     +     +
    IV     11     9   C618S     +     +     +
    V     1   C634Y   未检测     +     +
a：测序；b：在密码子634位的突变(TGC→TGG，Cys→Trp)；c：检测
在表2中，术语“受影响成员”指表现MEN2A临床症状的MEN2A患者，术语“基因携带者”指未表现MEN2A临床症状的突变RET基因携带者。
用Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia-biotech Ltd，Uppsala，Sweden)和TRI试剂(Molecular Research Center，Cincinati，OH)，按照生产商的说明，提取各血样中的总基因组DNA。为了产生荧光标记的DNA样品，用提取出的DNA作为模版和SEQ ID Nos.68到77中描述的5对引物(MWG-Biotech，Ebersberg，Germany)进行PCR扩增(表3)。按照Takiguchi-Shirahama，S.等，Hum.Genet.95：187-190，1995的描述使用外显子10和11的PCR引物，按照Shuffenecker I.等，Am.J.Hum.Genet.62：233-237，1997的描述使用外显子14的PCR引物，按照Karaga，H.J.等，Eur.J.Endocrinol.139：410-415，1998的描述使用外显子13和16的PCR引物。PCR反应液的组成为：100ng基因组DNA、10pmol各种引物、40μM dCTP、20μM荧光染料Cy5-dCTP(MEN)或Cy3-dCTP(Amersham-biotech Ltd.，Buckinghamshire，UK)，体积为25μl。在程序化热循环仪(Perkin Elmer Cetus 9600；Roche Molecular Systems，Inc.，NJ)中，94℃变性5分钟开始反应。PCR条件为：94℃ 30秒、60℃ 30秒、和72℃ 1分钟，循环35次，最后在72℃延长7分钟。每种外显子单独扩增。PCR扩增后，用纯化试剂盒(Qiagen Inc，Valencia，CA)纯化Cy5-或Cy3-标记的PCR产物，然后用0.25U DNase I(Takara，Shiga，Japan)在25℃消化10分钟。剩余的酶在95℃灭活10分钟，并通过上述纯化程序除去，收集Cy5-或Cy3-标记的DNA样品。
<表3>
SEQ ID No.   引物     扩增区   扩增数量
    68   外显子-10F     外显子10     199bp
    69   外显子-10R
    70   外显子-11F     外显子11     279bp
    71   外显子-11R
    72   外显子-13F     外显子13     209bp
    73   外显子-13R
    74   外显子-14F     外显子14     287bp
    75   外显子-14R
    76   外显子-16F     外显子16     186bp
    77   外显子-16R
(步骤3)杂交反应和分析
将步骤(2)中制备的各外显子的Cy5-或Cy3-标记的DNA样品单独混合，然后重悬浮于预热的1×UniHyb溶液(TeleChem International Inc，Sunnyvale，CA)中，至体积为2～4μl。将2μl混合的DNA样品滴到步骤(1)制备的玻璃片上，然后用一块盖玻片覆盖这块玻璃片。将这块玻璃片在饱和蒸汽试管中于60℃保温3小时进行杂交反应。将该杂交后的玻璃片置于2×SSC+0.2％SDS缓冲液中室温下漂洗10～30分钟，然后，在蒸馏水中漂洗5分钟，随后离心和干燥。用ScanArray Lite(ParkardInstrument Co，Meriden，CT)扫描玻璃片，用定量微点阵分析软件(QuantArray，version 2.0)分析。为了确定极限值，所有数据用SigmaPlot(SPSS Inc.，San Rafael，CA)进行分析，计算平均值和标准差。
将99％可信度范围的最大值设置为极限值，分析存在RET各密码子突变的阳性信号(图3和4)。图4(a)显示外显子10(密码子609、611、618、和620)和外显子11(密码子630和634)上发生的杂交的范围。据报道超过95％的MEN2A突变发生在外显子10和外显子11。Fig.4(b)表明外显子13(密码子768)和14(密码子804)上的杂交。经鉴定大多数FMTC突变发生在外显子13和外显子14上；而观察到大多数MEN2B突变发生在外显子16(密码子918)上。
22个样品(SNU-MEN2A-I，II，III，IV)的杂交结果与之前的测序数据一致。至于未知的SNU-MEN2A-V样品，应用本发明的RET寡芯片的杂交实验表明密码子634发生了从TGC(半胱氨酸)到TGG(色氨酸)的突变，而不是之前用常规方法确定的野生型序列。为了确定该突变在密码子634位上，进行克隆和直接测序。将外显子11的PCR产物连接到PCR-TOPO载体上，用TA克隆系统(Invitrogen，Caelsbad，CA)进行亚克隆。用Taq双脱氧末端循环测序试剂盒和ABI 377 DNA序列仪(Perkin-Elmer，Foster City，CA)进行双向测序。结果证实SNU-MEN2A-V样品在密码子634上有一个突变(48：C634W，TGC→TGG，外显子11)。也就是说，本发明的RET寡芯片能够检测到直接测序辨认错误的RET基因突变。
虽然描述和说明了本发明的实施方式，显然在不偏离仅由所附权利要求范围限定的本发明实质的情况下，可以进行各种改变和修饰。
序列表
<110>国立癌中心
<120>RET寡核苷酸微芯片及其用于检测遗传性癌症的方法
<130>PCA11254/PJG
<160>67
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>10-PC
<400>1
ggggattaaa gctggctatg g                                              21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>609M-(R)
<400>2
ctatggcacc cgcaactgct t                                              21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>609M-(S)
<400>3
ctatggcacc agcaactgct t                                              21
<210>4
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>609M-(G)
<400>4
tggcaccggc aactgc                                                    16
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>609M-(F)
<400>5
ctatggcacc ttcaactgct tc                                             22
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>609M-(Y)
<400>6
ctatggcacc tacaactgct tc                                             22
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>609M-(S)
<400>7
tatggcacct ccaactgctt c                                              21
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>609M-(W)
<400>8
tatggcacct ggaactgctt c                                              21
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>609M-(C)
<400>9
tatggcacct gcaactgctt c                                              21
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>611M-(R)
<400>10
acctgcaacc gcttccctga                                                20
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>611M-(S)
<400>11
cacctgcaac agcttccctg a                                              21
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>611M-(G)
<400>12
acctgcaacg gcttccctga                                                20
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>611M-(F)
<400>13
acctgcaact tcttccctga g                                              21
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>611M-(Y)
<400>14
acctgcaact acttccctga g                                              21
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>611M-(S)
<400>15
acctgcaact ccttccctga g                                              21
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>611M-(W)
<400>16
acctgcaact ggttccctga g                                              21
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>611W-(C)
<400>17
acctgcaact gcttccctga g                                              21
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>618M-(R)
<400>18
aggagaagcg cttctgcgag                                                20
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>618M-(S)
<400>19
gaggagaaga gcttctgcga g                                              21
<210>20
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>618M-(G)
<400>20
gagaagggct tctgcg                                                    16
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>618M-(F)
<400>21
aggagaagtt cttctgcgag                                                20
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>618M-(Y)
<400>22
aggagaagta cttctgcgag                                                20
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>618M-(S)
<400>23
aggagaagtc cttctgcgag                                                20
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>618M-(W)
<400>24
aggagaagtg gttctgcgag                                                20
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>618W-(C)
<400>25
gaggagaagt gcttctgcga g                                              21
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>620M-(R)
<400>26
aagtgcttcc gcgagcccga                                                20
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>620M-(S)
<400>27
aagtgcttca gcgagcccga                                                20
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>620M-(G)
<400>28
aagtgcttcg gcgagcccga                                                20
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>620M-(F)
<400>29
aagtgcttct tcgagcccga                                                20
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>620M-(Y)
<400>30
aagtgcttct acgagcccga                                                20
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>620M-(S)
<400>31
aagtgcttct ccgagcccga                                                20
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>620M-(W)
<400>32
aagtgcttct gggagcccga                                                20
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>620W-(C)
<400>33
aagtgcttct gcgagcccga                                                20
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>630M-(M)
<400>34
gatccactgc gcgacgagct                                                20
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>630M-(S)
<400>35
gatccactga gcgacgagct                                                20
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>630M-(G)
<400>36
gatccactgg gcgacgagct                                                20
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>630M-(F)
<400>37
gatccactgt tcgacgagct                                                20
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>630M-(Y)
<400>38
gatccactgt acgacgagct                                                20
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>630M-(S)
<400>39
gatccactgt ccgacgagct                                                20
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>630M-(W)
<400>40
gatccactgt gggacgagct                                                20
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>630W-(C)
<400>41
gatccactgt gcgacgagct                                                20
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>634M-(R)
<400>42
gacgagctgc gccgcacggt                                                20
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>634M-(S)
<400>43
gacgagctga gccgcacggt                                                20
<210>44
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>634M-(G)
<400>44
cgagctgggc cgcacg                                                    16
<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>634M-(F)
<400>45
gacgagctgt tccgcacggt                                                20
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>634M-(Y)
<400>46
gacgagctgt accgcacggt                                                20
<210>47
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>634M-(S)
<400>47
gacgagctgt cccgcacggt                                                20
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>634M-(W)
<400>48
gacgagctgt ggcgcacggt                                                20
<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>634W-(C)
<400>49
gacgagctgt gccgcacggt                                                20
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>11PC
<400>50
ccgctgtcct cttctccttc                                                20
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>768M-(Q)
<400>51
tccccgagtc agcttcgaga                                                20
<210>52
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>768M-(K)
<400>52
ctccccgagt aagcttcgag a                                              21
<210>53
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>768M-(A)
<400>53
tccccgagtg cgcttcgaga                                                20
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>768M-(G)
<400>54
tccccgagtg ggcttcgaga                                                20
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>768M-(V)
<400>55
tccccgagtg tgcttcgaga                                                20
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>768M-(D)
<400>56
tccccgagtg accttcgaga                                                20
<210>57
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>768M-(D)
<400>57
tccccgagtg atcttcgaga c                                              21
<210>58
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>768W-(E)
<400>58
tccccgagtg agcttcgaga                                                20
<210>59
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>804M-(L)
<400>59
ctcctcatcc tggagtacgc                                                20
<210>60
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>804M-(M)
<400>60
cctcctcatc atggagtacg c                                              21
<210>61
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>804M-(L)
<400>61
cctcctcatc ttggagtacg c                                              21
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>804M-(E)
<400>62
ctcctcatcg aggagtacgc                                                20
<210>63
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>804M-(A)
<400>63
ctcctcatcg cggagtacgc                                                20
<210>64
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>804M-(G)
<400>64
ctcctcatcg gggagtacgc                                                20
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>804W-(V)
<400>65
ctcctcatcg tggagtacgc                                                20
<210>66
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>918M-(T)
<400>66
cagttaaatg gacggcaatt gaat                                           24
<210>67
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>918W-(M)
<400>67
cagttaaatg gatggcaatt gaat                                           24
<210>68
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Exon-10F
<400>68
gtaggaattc gacacgagcc tggggagc                                       28
<210>69
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Exon-10R
<400>69
catcgaattc ttgttggacc tcagatgtgc                                     30
<210>70
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Exon-11F
<400>70
gtaggaattc gcagcctgta cccagtggtg                                     30
<210>71
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Exon-11R
<400>71
catcgaattc accggaagag gagtagctg                                      29
<210>72
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Exon-13F
<400>72
taatacgact cactataggg cttccaggag cgatcgttt                           39
<210>73
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Exon-13R
<400>73
atttaggtga cactatagca ccctgcagct ggcctt                              36
<210>74
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Exon-14F
<400>74
tggctcctgg aagacccaa                                                 19
<210>75
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Exon-14R
<400>75
tgcacgcacc ttcatctcg                                                 19
<210>76
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Exon-16F
<400>76
taatacgact cactataggg agagttagag taacttcaat gtc                      43
<210>77
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Exon-16R
<400>77
atttaggtga cactatagta acctccaccc caagaga                             37

Claims (5)

1.一种用于检测RET突变的RET寡核苷酸微芯片，包括固定在固体基质表面的多种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被设计用来检测RET基因突变热点的错义突变型并且具有选自SEQ ID Nos.2到8，SEQ ID Nos.10到16，SEQ ID Nos.18到24，SEQ ID Nos.26到32，SEQ ID Nos.34到40，SEQ ID Nos.42到48，SEQ ID Nos.51到57，SEQ ID Nos.59到64，和SEQ ID No.66的核苷酸序列。
2.权利要求1的RET寡核苷酸微芯片，其中热点是密码子609、611、618、620、630、634、768、804和918。
3.权利要求1的RET寡核苷酸微芯片，其中寡核苷酸被设计用来检测密码子609、611、618、620、630、634、和768上的7种错义突变，密码子804上的6种错义突变，密码子918上的一种错义突变，9种各密码子的野生型，和2种外显子10和11的阳性对照。
4.权利要求1至3中任何一个的RET寡核苷酸微芯片的生产方法，包括：
1)将各种寡核苷酸混合到微量点样溶液中，然后分配到平板的孔中；
2)用微量点阵仪将寡核苷酸点到固体基质的表面；
3)将寡核苷酸固定到固体基质表面，并清洗；
4)将固体基质浸泡到95℃水中，使固定的寡核苷酸变性，然后用硼氢化钠溶液处理固体基质；和
5)清洗和干燥固体基质。
5.权利要求4的生产方法，其中步骤(1)中使用的每种寡核苷酸具有一个5’氨基修饰的12碳间隔区。
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