CN1517710A - β-连环蛋白寡核苷酸微芯片和使用它检测β-连环蛋白突变的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测在β－连环蛋白基因突变热点区域中的突变的β－连环蛋白寡核苷酸微芯片，其制备方法和一种使用它检测β－连环蛋白突变的方法，其中选择性地设计特异性的寡核苷酸以检测在β－连环蛋白基因的突变热点的各种错义突变和符合读框的缺失。本发明的β－连环蛋白寡芯片可以在检测β－连环蛋白突变和阐明信号转导机制以及与β－连环蛋白基因相关的肿瘤发生的研究中使用。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测在β-连环蛋白基因突变热点区域中的突变的β-连环蛋白寡核苷酸微芯片，其制备方法和使用它检测β-连环蛋白突变的方法。
背景技术
β-连环蛋白，其在Wnt信号途径中作为一种下游转录激活剂起作用，是钙粘着蛋白介导的细胞-细胞粘附系统的膜下组分(Abraham，S.C.等，Am.J.Pathol.158：1005-1010，2001；Abraham，S.C.等，Am.J.Pathol.158：1073-1078，2001)。APC(结肠腺瘤性息肉病(adenomatus polyposiscoli))肿瘤抑制蛋白，与GSK-3β(糖原合成酶激酶-3β)一起，促进在β-连环蛋白基因的外显子3中丝氨酸/苏氨酸残基的磷酸化(Abraham，S.C.等，Am.J.Pathol.158：1073-1078，2001)。发现了APC基因或β-连环蛋白基因的突变导致β-连环蛋白的累积和β-连环蛋白调节活性的丧失(Abraham，S.C.等，Am.J.Pathol.158：1073-1078，2001)。已报道了在许多种人类癌症中，多数β-连环蛋白的突变是在特定的GSK-3β磷酸化位点，即Ser-33，Ser-37，Thr-41，Ser-45，和其它残基(Asp-32和Gly-34)处，所述癌症包括子宫内膜癌，胃癌，卵巢癌，肝胚细胞瘤和结肠直肠癌(Saegusa，M.和Okayasu，I.J.Pathol.194：59-67，2001)。在结肠直肠癌中，已经报道0-60％不同频率的β-连环蛋白突变(Nilbert，M.和Rambech，E.Cancer Genet.Cytogenet.128：43-45，2001；Mirabelli-Primdahl，L.等，Cancer Res.59：3346-51，1999)。大多数β-连环蛋白突变被限制在外显子3中的一些密码子，并且导致氨基酸改变的置换突变在β-连环蛋自基因中占优势(Devereux，T.R.等，Mol.Carcinog.31：68-73，2001；Udatsu，Y.等，Pediatr.Surg.Int.17：508-512，2001；Koch，A.等，Cancer Res.59：269-273，1999；de La Coste，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国95：8847-8851，1998)。
尽管看起来使用常规方法，如PCR-SSCP(单链构象多态性)和直接测序容易检测β-连环蛋白基因突变，但已经报道了与这些β-连环蛋白突变检测方法的低敏感性相关的技术问题(Abraham，S.C.等，Am.J.Pathol.158：1005-1010，2001)。因此，需要开发一种更可靠和更快速的针对β-连环蛋白基因的突变检测技术，其可以用于各种癌症研究，例如Wnt信号相关机制的阐明。
研究表明高频MSI(微卫星不稳定性-H，MSI-H)结肠直肠癌与APC突变不关联(Mirabelli-Primdahl，L.等，Cancer Res.59：3346-51，1999)并且在MSI-H结肠直肠癌中主要诱导β-连环蛋白基因突变(Mirabelli-Primdahl，L.等，Cancer Res.59：3346-51，1999；Shitoh，K.等，GenesChromosomes Cancer 30：32-37，2001)。
Traverso等使用粪便中的MSI作为在粪便中诊断近端结肠癌的标记(Traverso，G.等，Lancet.359：403-404，2002)，并且几种其它标记，例如APC，p53，长DNA(long DNA)和K-ras也已被用于使用粪便DNA的结肠直肠癌诊断(Ahlquist，D.A.等，Gastroenterology 119：1219-1227，2000；Dong S.M.等，J.Natl.Cancer.Inst.93：858-865，2001)。
β-连环蛋白突变易于在近端结肠癌中发生的事实暗示可能利用β-连环蛋白突变来诊断近端结肠癌。因此，本发明人已经开发了一种通过使用自动微阵列点样仪将寡核苷酸固定于一种固体基质的表面之上而制备的β-连环蛋白寡核苷酸微芯片，设计所述寡核苷酸以检测在β-连环蛋白基因突变热点区域的各种突变。本发明的β-连环蛋白寡核苷酸微芯片可以在检测β-连环蛋白突变和阐明信号转导机制以及与β-连环蛋白基因相关的肿瘤发生的研究中使用。
发明内容
发明概述
因此，本发明的一个目的是提供一种β-连环蛋白寡核苷酸微芯片，其可以用作一种用于研究信号转导机制和与β-连环蛋白基因相关的肿瘤发生的快速和可靠的基因诊断工具。
依照本发明的一个方面，提供了一种用于检测β-连环蛋白突变的β-连环蛋白寡核苷酸微芯片以及其制备方法，所述芯片包括固定于固体基质表面上的众多寡核苷酸，其中设计寡核苷酸以检测β-连环蛋白突变热点中的突变。
依照本发明的另一个方面，提供一种使用该微芯片检测β-连环蛋白突变的方法。
附图说明
本发明的上述和其它的目的和特征从结合分别表示的附图的本发明的下述描述中将变得明显；
图1：使用本发明的β-连环蛋白寡核苷酸微芯片检测在结肠癌组织中β-连环蛋白突变的结果；
图2：具有通过本发明β-连环蛋白寡核苷酸微芯片证实的β-连环蛋白突变的结肠癌组织的直接测序结果；
图3：具有通过本发明β-连环蛋白寡核苷酸微芯片证实的β-连环蛋白突变的结肠癌组织的PCR-SSCP分析结果。
发明详述
本发明提供一种用于检测β-连环蛋白突变的β-连环蛋白寡核苷酸微芯片(下文，称为“β-连环蛋白寡芯片”)，其包括使用自动微阵列点样仪被固定于固体基质表面上的寡核苷酸，其中寡核苷酸能够检测在β-连环蛋白基因突变热点区域的各种突变。
首先，设计寡核苷酸以检测在β-连环蛋白基因突变热点，外显子3中的11个密码子处所有可能的错义突变和符合读框的缺失(密码子29，31，32，33，34，35，37，38，41，45和48)。
在多种人类恶性肿瘤中已鉴定到β-连环蛋白突变，大多数是限制在外显子3中热点区域处的错义突变。已知β-连环蛋白突变与具有MSI的结肠直肠癌相关。已经报道在结肠直肠癌中多于70％的β-连环蛋白突变，并且大约90％的那些在热点区域的11个密码子处(密码子29，31，32，33，34，35，37，38，41，45和48)。
本发明提供能用于检测在上述β-连环蛋白基因热点处所有可能的突变的寡核苷酸，其以大于90％所有检查病例的频率发生。因此，本发明的β-连环蛋白寡芯片使得可能以超过90％的置信水平检测突变。另外，由于设计在本发明β-连环蛋白寡芯片中使用的寡核苷酸以检测在11个密码子处所有可能的错义突变，它能够检测在这些密码子处还未发现的任何错义突变。另外，本发明的β-连环蛋白寡芯片还包括用于在各个热点密码子处检测符合读框的缺失(3-碱基缺失)的寡核苷酸。也就是说，由于考虑到基因的特性特别设计本发明的寡核苷酸以检测在β-连环蛋白基因热点处的突变，本发明的β-连环蛋白寡芯片提供在检测β-连环蛋白基因的突变中改善的准确性和效率。
依照本发明的一个方面，本发明的β-连环蛋白寡芯片具有121种类型的被点样和固定在固体基质表面上的寡核苷酸，寡核苷酸能够检测在β-连环蛋白基因的11个热点密码子处的各种错义突变和符合读框的缺失。为了提高的测量信号的准确性，将每种寡核苷酸水平地点样4次。设计九种寡核苷酸(M)以包括在各个热点密码子处所有可能的置换，并且一种寡核苷酸(W)是针对野生型。因此，设计总共10种寡核苷酸以检测针对密码子23，29，31，32，33，34，35，38，41和48的错义突变。另外，设计11种寡核苷酸(D)以检测针对每个热点密码子的符合读框的缺失(3-碱基缺失)。总体上，121种寡核苷酸包括了在外显子3的上述11个密码子处所有的置换和符合读框的缺失。
具体地，针对密码子29使用的是通过分别用ACT(苏氨酸)，GCT(丙氨酸)，CCT(脯氨酸)，TAT(酪氨酸)，TGT(胞嘧啶)，TTT(苯丙氨酸)，TCA(丝氨酸)，TCG(丝氨酸)和TCC(丝氨酸)替代TCT(丝氨酸)而获得的9类被置换了的寡核苷酸，以及一种通过缺失TCT 3碱基获得的缺失寡核苷酸。针对密码子31使用的是通过分别用ATG(蛋氨酸)，TTG(亮氨酸)，GTG(缬氨酸)，CAG(谷氨酸)，CGG(精氨酸)，CCG(脯氨酸)，CTA(亮氨酸)，CTC(亮氨酸)和CTT(亮氨酸)替代CTG(亮氨酸)而获得的9类被置换了的寡核苷酸；以及一种通过缺失CTG 3碱基获得的缺失寡核苷酸。针对密码子32使用的是通过分别用CAC(组氨酸)，TAC(酪氨酸)，AAC(天冬酰胺)，GCC(丙氨酸)，GTC(缬氨酸)，GGC(甘氨酸)，GAG(谷氨酸)，GAT(天冬氨酸)和GAA(谷氨酸)替代GAC(天冬氨酸)而获得的9类被置换了的寡核苷酸；以及一种通过缺失GAC 3碱基获得的缺失寡核苷酸。针对密码子33使用的是通过分别用ACT(苏氨酸)，GCT(丙氨酸)，CCT(脯氨酸)，TGT(半胱氨酸)，TAT(酪氨酸)，TTT(苯丙氨酸)，TCA(丝氨酸)，TCG(丝氨酸)和TCC(丝氨酸)替代TCT(丝氨酸)而获得的9类被置换了的寡核苷酸；以及一种通过缺失TCT 3碱基获得的缺失寡核苷酸。针对密码子34使用的是通过分别用TGA(终止密码子)，AGA(精氨酸)，CGA(精氨酸)，GTA(缬氨酸)，GCA(丙氨酸)，GAA(谷氨酸)，GGT(甘氨酸)，GGG(甘氨酸)和GGC(甘氨酸)替代GGA(甘氨酸)而获得的9类被置换了的寡核苷酸；以及一种通过缺失GGA 3碱基获得的缺失寡核苷酸。针对密码子35使用的是通过分别用GTC(缬氨酸)，CTC(亮氨酸)，TTC(苯丙氨酸)，ACC(苏氨酸)，AGC(丝氨酸)，AAC(天冬酰胺)，ATG(蛋氨酸)，ATA(异亮氨酸)和ATT(异亮氨酸)替代ATC(异亮氨酸)而获得的9类被置换了的寡核苷酸；以及一种通过缺失ATC 3碱基获得的缺失寡核苷酸。针对密码子37使用的是通过分别用ACT(苏氨酸)，CCT(脯氨酸)，GCT(丙氨酸)，TAT(酪氨酸)，TGT(半胱氨酸)，TTT(苯丙氨酸)，TCA(丝氨酸)，TCG(丝氨酸)和TCC(丝氨酸)替代TCT(丝氨酸)而获得的9类被置换了的寡核苷酸；以及一种通过缺失ACT 3碱基获得的缺失寡核苷酸。针对密码子38使用的是通过分别用AGT(丝氨酸)，CGT(精氨酸)，TGT(半胱氨酸)，GAT(天冬氨酸)，GCT(丙氨酸)，GTT(缬氨酸)，GGA(甘氨酸)，GGG(甘氨酸)和GGC(甘氨酸)替代GGT(甘氨酸)而获得的9类被置换了的寡核苷酸；以及一种通过缺失GGT 3碱基获得的缺失寡核苷酸。针对密码子41使用的是通过分别用TCC(丝氨酸)，GCC(丙氨酸)，CCC(脯氨酸)，AGC(丝氨酸)，ATC(异亮氨酸)，AAC(天冬酰胺)，ACA(苏氨酸)，ACT(苏氨酸)和ACG(苏氨酸)替代ACC(苏氨酸)而获得的9类被置换了的寡核苷酸；以及一种通过缺失ACC 3碱基获得的缺失寡核苷酸。针对密码子45使用的是通过分别用ACT(苏氨酸)，GCT(丙氨酸)，CCT(脯氨酸)，TGT(半胱氨酸)，TAT(酪氨酸)，TTT(苯丙氨酸)，TCA(丝氨酸)，TCG(丝氨酸)和TCC(丝氨酸)替代TCT(丝氨酸)而获得的9类被置换了的寡核苷酸；以及一种通过缺失ACT 3碱基获得的缺失寡核苷酸。针对密码子48使用的是通过分别用AGT(丝氨酸)，TGT(半胱氨酸)，CGT(精氨酸)，GAT(天冬氨酸)，GCT(丙氨酸)，GTT(缬氨酸)，GGA(甘氨酸)，GGC(甘氨酸)和GGG(甘氨酸)替代GGT(甘氨酸)而获得的9类被置换了的寡核苷酸；以及一种通过缺失GGT 3碱基获得的缺失寡核苷酸。
针对每个密码子设计一种野生型寡核苷酸(W)以与突变型直接比较和既包括纯合突变又包括杂合突变。例如，针对密码子29将12种寡核苷酸点样，一种是检测正常碱基序列并且剩余的是检测突变的碱基序列。总体上，针对在11个热点密码子处的99种错义突变类型和11种符合读框的缺失类型设计110种突变寡核苷酸，并且针对野生型和阳性对照设计11种寡核苷酸。
本发明的β-连环蛋白寡芯片可以通过使用自动微阵列点样仪，通过一种方法将多至121种的核苷酸固定在固体基质表面，所述方法包括步骤：
1)在微点样溶液中混合各种寡核苷酸并分配至孔板；
2)使用微阵列点样仪将寡核苷酸点样在固体基质表面；
3)将寡核苷酸固定在固体基质表面并洗涤；
4)通过在95℃水中浸泡固体基质使固定了的寡核苷酸变性，然后用硼氢化钠溶液处理固体基质；和
5)洗涤和干燥固体基质。
在步骤(1)中使用的每种寡核苷酸优选具有一种能够与固体基质表面形成稳定的键的官能团。例如，每种寡核苷酸可以与具有5’氨基修饰的12个碳原子的间隔臂连接，例如H2N-(CH2)12-寡核苷酸。该氨基与在固体基质上的醛基进行席夫碱反应而在两者之间形成牢固的键。12碳原子的间隔臂通过促进寡核苷酸和荧光染料标记的靶DNA的接触起提高杂交率的作用。
步骤(1)中使用的微点样溶液可含有适当的盐和聚合物以方便在固体基质上施用寡核苷酸。
步骤(2)中使用的固体基质可由玻璃；改性聚硅氧烷；塑料盒；或聚合物如聚碳酸酯或其凝胶制成。可以用可以起使寡核苷酸与基质基底结合作用的化合物涂布固体基质表面。能够用于此涂布的优选化学药品具有官能团如醛基和氨基。在一个优选实施方案中，本发明使用用醛涂布的载玻片。
依照步骤(1)和步骤(2)的一个实施方案，使用自动针型微阵列点样仪将总共484种寡核苷酸以指定的方式排列在固体基质上。优选每种寡核苷酸斑点是直径100-500μm的圆形。一个固体基质的优选实例是3.7cm×7.6cm的载玻片，其每块芯片可容纳约100-10,000个斑点。优选地，可以以多行多列的形式以200-800μm的间隔排列总共484个寡核苷酸斑点，每个直径130μm。
在步骤(3)种，通过在寡核苷酸的氨基和固体基质的醛基之间通过席夫碱反应形成共价键的方法将寡核苷酸固定在固体基质表面。通过用SDS，SSC，SSPE等洗涤固体基质去除游离的未反应的寡核苷酸。
在步骤(4)中，使固定的寡核苷酸变性，并且通过硼氢化钠处理使残留在固体基质上未反应的醛基还原和失活。
通过上述方法制备的本发明的β-连环蛋白寡芯片可方便地用于检测基因突变，并且本发明方法是比常规基因突变检测方法的任何一种简单得多而且更经济：当使用这类常规方法如SSCP(单链构象多态性)，PPT(蛋白质截短试验)，RFLP(限制性片断长度多态性)，克隆，直接测序等检验基因突变的存在时，平均要花几天至几个月的时间。然而，当使用本发明的β-连环蛋白寡芯片时，针对β-连环蛋白基因突变的DNA样品的分析只花不到10-11个小时。另外，可以以比常规芯片少得多的生产成本简单得多地制备本发明的β-连环蛋白寡芯片。一旦合成需要的寡核苷酸，就可能大量生产本发明的载玻片。当使用本发明的β-连环蛋白寡芯片时需要的试剂量比在常规方法中的任何一种所要求的那些少得多。
使用针型微阵列点样仪很容易制备本发明的β-连环蛋白寡芯片，而现有的Affymetrix寡芯片必须使用一种复杂的和花费的光刻技术来制备。
另外，与Affymetrix寡芯片的情形不同，使用本发明的β-连环蛋白寡芯片可以纯化和修饰寡核苷酸，Affymetrix寡芯片是通过在固体基质表面上直接合成寡核苷酸而制备的，其中它不可能纯化或修饰寡核苷酸。因此，本发明的β-连环蛋白寡芯片能够提供比以前可能的更高的实验准确性。
本发明提供一种使用β-连环蛋白寡芯片检测β-连环蛋白突变的方法，其包括步骤：
1)从受试患者的血液制备荧光染料标记的DNA样品；
2)使标记的DNA样品与在β-连环蛋白寡芯片上的寡核苷酸斑点反应；
3)洗涤反应了的寡芯片以去除未结合的样品DNA；
4)使用荧光读数器检测特定寡核苷酸斑点的杂交模式；和
5)检验基因突变的存在。
在步骤(1)中，通过将荧光染料掺入从受试患者获得的血液DNA样品中来制备DNA样品。在荧光染料标记的DNA与寡芯片上特定的寡核苷酸斑点的杂交过程中，可以利用荧光读数器使用合适的软件来分析它。优化的荧光染料包括，但不局限于，Cy5，Cy3，德克萨斯红，荧光素和丽丝胺罗丹明。
在步骤(2)中，将步骤(1)中制备的荧光染料标记的DNA样品与杂交溶液混合并转移至各种寡核苷酸。在用水蒸气饱和的45～60℃的培养箱中进行杂交反应3～9小时。然后，洗涤寡芯片以去除未结合的样品DNA并干燥(步骤3)，利用荧光读数器使用合适的软件分析荧光(步骤4)。在步骤(5)中，将在99％可靠范围(reliable range)处的最大值设定为阈值，显示比阈值高的荧光水平的任何信号被认为对突变存在而言是阳性的。
本发明的β-连环蛋白寡芯片可以有效用于诊断如结肠直肠癌，子宫内膜癌，胃癌，卵巢癌，肝胚细胞瘤等的癌症。由于β-连环蛋白基因在Wnt信号途径中作为一种下游转录激活剂起作用，可以将本发明的β-连环蛋白寡芯片用作一种针对信号转导机制和与β-连环蛋白基因相关的肿瘤发生的研究的有效诊断工具。
针对β-连环蛋白突变的存在，本发明研究了74种结肠直肠癌和31种结肠直肠癌细胞系(参见图1)。在近端结肠癌(N＝34)中鉴定出所有的5种β-连环蛋白突变，但在40种远端结肠癌中不存在β-连环蛋白突变。5种β-连环蛋白突变中的4种是在密码子32，41和45处的点突变，剩余的一种是在密码子45处符合读框的缺失(3碱基缺失)。在31种结肠直肠癌细胞系中，鉴定了4种β-连环蛋白突变。这4种突变中的三种发生在密码子45，剩余的一种发生在密码子41。
在74种结肠直肠癌中和31种结肠直肠癌细胞系中鉴定了总共9种突变。发现9种突变中的六种在密码子45处和2种在密码子41处。在密码子45处的6种突变中，4种是相同的错义突变(TCT→TTT，Ser→Phe；在样品395，400，SNU-1047和LSI17T中)和2种是在样品396和HCT116中相同的符合读框的缺失。已知密码子41和45是GSK-3β磷酸化位点，并且在这些位点的突变可能导致核的β-连环蛋白的累积(Saegusa，M.和Okayasu，I.J.Pathol.194：59-67，2001)。
在结肠组织207中剩余的β-连环蛋白突变发生在密码子32处。已经提出密码子32对于β-连环蛋白的遍在蛋白化和蛋白酶体依赖性的降解是重要的(Tong，J.H.等，Cancer Lett.163：125-130，1999)。密码子32的突变可能影响GSK-3β激酶对丝氨酸33的可接近性，因而抑制它的磷酸化(Koch，A.等，Cancer Res.59：269-273，1999)。已报道特定的密码子45突变(Ser45Phe)在结肠直肠癌中是频繁的，在肝胚细胞瘤中占优势的密码子41的突变在结肠直肠癌中是稀少的(Koch，A.等，Cancer Res.59：269-273，1999)。
在本发明中，在密码子45处鉴定了源于结肠直肠癌的5种β-连环蛋白突变中的三种和源于细胞系的4种β-连环蛋白突变中的三种，并且密码子45处的6种突变的2种是符合读框的缺失。在一种结肠直肠癌细胞系和结肠直肠癌中先前报道了密码子45处的符合读框的缺失，但在其它类型的癌症中没有报道(Ilyas，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国94：10330-10334，1997；Muller，O.等，Genes Chromosomes Cancer 22：37-41，1998)。密码子45处符合读框的缺失可能导致在作为酶GSK-3β目标的蛋白区域中高度保守的丝氨酸残基的丢失(Ilyas，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国94：10330-10334，1997)。这些结果显示密码子45的突变，包括符合读框的缺失在结肠直肠癌中是常见的，但在其它类型的癌症中不常见。
使用寡核苷酸微阵列进行β-连环蛋白基因的突变分析。作为使用本发明β-连环蛋白寡芯片突变分析的结果，在总共60种样品中检测到9种β-连环蛋白突变阳性样品。本发明人将通过β-连环蛋白寡芯片检测的9种β-连环蛋白突变与几种技术，例如PCR-SSCP，DHPLC，直接测序，克隆测序相比较(参见表2)。已经广泛应用于突变分析的自动直接测序，不能清晰地检测9种β-连环蛋白突变中的2种(参见图2)，PCR-SSCP也遗漏了一种β-连环蛋白突变(参见图3)。这些结果可能是由在癌症组织中的过量野生型DNA或由这两种方法的低敏感性所导致。
在使用BAT-26标记的MSI研究中，本发明证实了MSI是与近端结肠癌紧密相关，其与先前报道相符(p＜0.01)(Mirabelli-Primdahl，L.等，Cancer Res.59：3346-51，1999；Traverso，G.等，Lancet.359：403-404，2002)。MSI在34种近端结肠癌中的10种中出现(29％)，但只在40种远端结肠直肠癌中的2种中出现(5％)。在MSI和β-连环蛋白突变之间的关系方面，在12种具有MSI的结肠直肠癌中的5种中(42％)检测到β-连环蛋白突变，但发现62种MSS结肠直肠癌中没有一种(0％)含有β-连环蛋白突变。在近端结肠癌中发现在具有MSI的结肠癌中检测到的所有的5种β-连环蛋白突变。这些结果证实MSI参与β-连环蛋白突变，并且证明β-连环蛋白突变与近端结肠癌直接相关。
先前已经提出β-连环蛋白突变占大约具有完整APC的结肠直肠癌的一半(Sparks，A.B.等，Cancer Res.59998：1130-1134，1998)。在本发明中，9种有β-连环蛋白突变的样品中只有一种结肠直肠癌细胞系(SNU-1047)在MCR中有APC突变。近来，几个小组已尝试通过使用分子标记如APC，p53，长DNA，K-ras等来诊断结肠直肠癌(Traverso，G.等，Lancet.359：403-404，2002；Ahlquist，D.A.等，Gastroenterology 119：1219-1227，2000；Dong，S.M.等，J.Natl.Cancer Inst.93：858-865，2001)。5个含有MSI的标记中的三个已经用于使用粪便DNA的结肠直肠癌的诊断(Traversb，G.等，Lancet.359：403-404，2002)。另外，MSI已经用于近端结肠癌的诊断，其难以检测，因为在结肠直肠癌中，它们位于离肛门最远处。如果β-连环蛋白突变与在近端结肠中肿瘤的位置相关，β-连环蛋白可以是一种针对近端结肠癌的诊断标记。本发明的结果分别在29％和15％的近端结肠癌中显示MSI和β-连环蛋白突变。尽管所有带有β-连环蛋白突变的样品显示MSI，β-连环蛋白，单独或与MSI一起，可以用于近端结肠癌的诊断。实际上，这样一种系统不应该只是高度自动化，而且可以作为一种高通量诊断工具使用，特别是如果在粪便DNA中使用基质。
仅仅为了举例说明的目的给出下列实施例和测试例，并且不是意欲限制本发明的范围。
具体实施方式
实施例1：β-连环蛋白寡芯片的制备
设计九种寡核苷酸以包括在β-连环蛋白基因11个突变热点密码子(密码子23，29，31，32，34，35，37，38，41，45和48)处所有可能的置换，并且针对野生型设计一种寡核苷酸。另外，设计一种寡核苷酸以检测在那些密码子的每一处符合读框的缺失(3碱基缺失)。设计总共121种寡核苷酸以包括在上述外显子3的11个密码子处的所有置换和符合读框的缺失。
在SEQ ID Nos.1，12，23，34，45，56，67，78，89，100和111中描述的寡核苷酸是野生型。在热点密码子的一处带有错义突变的寡核苷酸是：
在SEQ ID Nos.2至10中描述的寡核苷酸，在密码子29处；
在SEQ ID Nos.13至21中描述的寡核苷酸，在密码子31处；
在SEQ ID Nos.24至32中描述的寡核苷酸，在密码子32处；
在SEQ ID Nos.35至43中描述的寡核苷酸，在密码子33处；
在SEQ ID Nos.46至54中描述的寡核苷酸，在密码子34处；
在SEQ ID Nos.57至65中描述的寡核苷酸，在密码子35处；
在SEQ ID Nos.68至76中描述的寡核苷酸，在密码子37处；
在SEQ ID Nos.79至87中描述的寡核苷酸，在密码子38处；
在SEQ ID Nos.90至98中描述的寡核苷酸，在密码子41处；
在SEQ ID Nos.101至109中描述的寡核苷酸，在密码子45处；
和在SEQ ID Nos.112至120中描述的寡核苷酸，在密码子48处。
另外，在热点密码子的一处带有符合读框的缺失寡核苷酸是：
在SEQ ID No.11中描述的寡核苷酸，在密码子29处；
在SEQ ID No.22中描述的寡核苷酸，在密码子31处；
在SEQ ID No.33中描述的寡核苷酸，在密码子32处；
在SEQ ID No.44中描述的寡核苷酸，在密码子33处；
在SEQ ID No.55中描述的寡核苷酸，在密码子34处；
在SEQ ID No.66中描述的寡核苷酸，在密码子35处；
在SEQ ID No.77中描述的寡核苷酸，在密码子37处；
在SEQ ID No.88中描述的寡核苷酸，在密码子38处；
在SEQ ID No.99中描述的寡核苷酸，在密码子41处；
在SEQ ID No.110中描述的寡核苷酸，在密码子45处；
和在SEQ ID No.121中描述的寡核苷酸，在密码子48处。
从MWG-Biotech(Ebrsberg，德国)获得所有121种寡核苷酸，并通过EPLC纯化，每种在5’末端具有用可以与醛基进行席夫碱反应的氨基修饰的12-碳间隔臂。
<表1a>
| SEQ IDNo. | 寡核苷酸 | 外显子 | 密码子 | 序列 |
| 1 | 29W | 3 | 29 | 5′-CAGCAACAGTCTTACCTGGAC-3′ |
| 2 | 29M1 | 5′-GCAGCAACAG ACTTACCTGGA-3′ | ||
| 3 | 29M2 | 5′-GCAGCAACAG GCTTACCTGGA-3′ | ||
| 4 | 29M3 | 5′-GCAGCAACAG CCTTACCTGGA-3′ | ||
| 5 | 29M4 | 5′-CAGCAACAG TATTACCTGGAC-3′ | ||
| 6 | 29M5 | 5′-CAGCAACAG TGTTACCTGGAC-3′ | ||
| 7 | 29M6 | 5′-CAGCAACAG TTTTACCTGGAC-3′ | ||
| 8 | 29M7 | 5′-AGCAACAG TCATACCTGGACT-3′ | ||
| 9 | 29M8 | 5′-AGCAACAG TCGTACCTGGACT-3′ | ||
| 10 | 29M9 | 5′-AGCAACAG TCCTACCTGGACT-3′ | ||
| 11 | 29D | 5′-GGCAGCAACAGTACCTGGACT-3′ | ||
| 12 | 31W | 31 | 5′-CAGTCTTACCTGGACTCTGGA-3′ | |
| 13 | 31M1 | 5′-ACAGTCTTAC ATGGACTCTGG-3′ | ||
| 14 | 31M2 | 5′-ACAGTCTTAC TTGGACTCTGG-3′ | ||
| 15 | 31M3 | 5′-ACAGTCTTAC GTGGACTCTGG-3′ | ||
| 16 | 31M4 | 5′-CAGTCTTAC CAGGACTCTGGA-3′ | ||
| 17 | 31M5 | 5′-CAGTCTTAC CGGGACTCTGGA-3′ | ||
| 18 | 31M6 | 5′-CAGTCTTAC CCGGACTCTGGA-3′ | ||
| 19 | 31M7 | 5′-AGTCTTAC CTAGACTCTGGAA-3′ | ||
| 20 | 31M8 | 5′-AGTCTTAC CTCGACTCTGGAA-3′ | ||
| 21 | 31M9 | 5′-AGTCTTAC CTTGACTCTGGAA-3′ | ||
| 22 | 31D | 5′-AACAGTCTTACGACTCTGGAA-3′ |
<表1b>
| SEQ IDNo. | 寡核苷酸 | 外显子 | 密码子 | 序列 | |
| 23 | 32W | 3 | 32 | 5′-TCTTACCTGGACTCTGGAATC-3′ | |
| 24 | 32M1 | 5′-GTCTTACCTG CACTCTGGAAT-3′ | |||
| 25 | 32M2 | 5′-GTCTTACCTG TACTCTGGAAT-3′ | |||
| 26 | 32M3 | 5′-GTCTTACCTG AACTCTGGAAT-3′ | |||
| 27 | 32M4 | 5′-TCTTACCTG GCCTCTGGAATC-3′ | |||
| 28 | 32M5 | 5′-TCTTACCTG GTCTCTGGAATC-3′ | |||
| 29 | 32M6 | 5′-TCTTACCTG GGCTCTGGAATC-3′ | |||
| 30 | 32M7 | 5′-CTTACCTG GAGTCTGGAATCC-3′ | |||
| 31 | 32M8 | 5′-CTTACCTG GATTCTGGAATCC-3′ | |||
| 32 | 32M9 | 5′-CTTACCTG GAATCTGGAATCC-3′ | |||
| 33 | 32D | 5′-AGTCTTACCTGTCTGGAATCC-3′ | |||
| 34 | 33W | 33 | 5′-TACCTGGACTCTGGAATCCAT-3′ | ||
| 35 | 33M1 | 5′-TTACCTGGAC ACTGGAATCCA-3′ | |||
| 36 | 33M2 | 5′-TTACCTGGAC GCTGGAATCCA-3′ | |||
| 37 | 33M3 | 5′-TTACCTGGAC CCTGGAATCCA-3′ | |||
| 38 | 33M4 | 5′-TACCTGGAC TGTGGAATCCAT-3′ | |||
| 39 | 33M5 | 5′-TACCTGGAC TATGGAATCCAT-3′ | |||
| 40 | 33M6 | 5′-TACCTGGAC TTTGGAATCCAT-3′ | |||
| 41 | 33M7 | 5′-ACCTGGAC TCAGGAATCCATT-3′ | |||
| 42 | 33M8 | 5′-ACCTGGAC TCGGGAATCCATT-3′ | |||
| 43 | 33M9 | 5′-ACCTGGAC TCCGGAATCCATT-3′ | |||
| 44 | 33D | 5′-TTACCTGGACGGAATCCATTC-3′ | |||
<表1c>
| SEQ IDNo. | 寡核苷酸 | 外显子 | 密码子 | 序列 |
| 45 | 34W | 3 | 34 | 5′-CTGGACTCTGGAATCCATTCT-3′ |
| 46 | 34M1 | 5′-CCTGGACTCT TGAATCCATTC-3′ | ||
| 47 | 34M2 | 5′-CCTGGACTCT AGAATCCATTC-3′ | ||
| 48 | 34M3 | 5′-CCTGGACTCT CGAATCCATTC-3′ | ||
| 49 | 34M4 | 5′-CTGGACTCT GTAATCCATTCT-3′ | ||
| 50 | 34M5 | 5′-CTGGACTCT GCAATCCATTCT-3′ | ||
| 51 | 34M6 | 5′-CTGGACTCT GAAATCCATTCT-3′ | ||
| 52 | 34M7 | 5′-TGGACTCT GGTATCCATTCTG-3′ | ||
| 53 | 34M8 | 5′-TGGACTCT GGGATCCATTCTG-3′ | ||
| 54 | 34M9 | 5′-TGGACTCT GGCATCCATTCTG-3′ | ||
| 55 | 34D | 5′-CCTGGACTCTATCCATTCTGG-3′ | ||
| 56 | 35W | 35 | 5′-GACTCTGGAATCCATTCTGGT-3′ | |
| 57 | 35M1 | 5′-GGACTCTGGA GTCCATTCTGG-3′ | ||
| 58 | 35M2 | 5′-GGACTCTGGA CTCCATTCTGG-3′ | ||
| 59 | 35M3 | 5′-GGACTCTGGA TTCCATTCTGG-3′ | ||
| 60 | 35M4 | 5′-GACTCTGGA ACCCATTCTGGT-3′ | ||
| 61 | 35M5 | 5′-GACTCTGGA AGCCATTCTGGT-3′ | ||
| 62 | 35M6 | 5′-GACTCTGGA AACCATTCTGGT-3′ | ||
| 63 | 35M7 | 5′-ACTCTGGA ATGCATTCTGGTG-3′ | ||
| 64 | 35M8 | 5′-ACTCTGGA ATACATTCTGGTG-3′ | ||
| 65 | 35M9 | 5′-ACTCTGGA ATTCATTCTGGTG-3′ | ||
| -66 | 35D | 5′-GGACTCTGGACATTCTGGTGC-3′ |
<表1d>
| SEQ IDNo. | 寡核苷酸 | 外显子 | 密码子 | 序列 | |
| 67 | 37W | 3 | 37 | 5′-GGAATCCATTCTGGTGCCACT-3′ | |
| 68 | 37M1 | 5′-TGGAATCCAT ACTGGTGCCAC-3′ | |||
| 69 | 37M2 | 5′-TGGAATCCAT CCTGGTGCCAC-3′ | |||
| 70 | 37M3 | 5′-TGGAATCCAT GCTGGTGCCAC-3′ | |||
| 71 | 37M4 | 5′-GGAATCCAT TATGGTGCCACT-3′ | |||
| 72 | 37M5 | 5′-GGAATCCAT TGTGGTGCCACT-3′ | |||
| 73 | 37M6 | 5′-GGAATCCAT TTTGGTGCCACT-3′ | |||
| 74 | 37M7 | 5′-GAATCCAT TCAGGTGCCACTA-3′ | |||
| 75 | 37M8 | 5′-GAATCCAT TCGGGTGCCACTA-3′ | |||
| 76 | 37M9 | 5′-GAATCCAT TCCGGTGCCACTA-3′ | |||
| 77 | 37D | 5′-TGGAATCCATGGTGCCACTAC-3′ | |||
| 78 | 38W | 38 | 5′-ATCCATTCTGGTGCCACTACC-3′ | ||
| 79 | 38M1 | 5′-AATCCATTCT AGTGCCACTAC-3′ | |||
| 80 | 38M2 | 5′-AATCCATTCT CGTGCCACTAC-3′ | |||
| 81 | 38M3 | 5′-AATCCATTCT TGTGCCACTAC-3′ | |||
| 82 | 38M4 | 5′-ATCCATTCT GATGCCACTACC-3′ | |||
| 83 | 38M5 | 5’-ATCCATTCT GCTGCCACTACC-3′ | |||
| 84 | 38M6 | 5′-ATCCATTCT GTTGCCACTACC-3′ | |||
| 85 | 38M7 | 5′-TCCATTCT GGAGCCACTACCA-3′ | |||
| 86 | 38M8 | 5′-TCCATTCT GGGGCCACTACCA-3′ | |||
| 87 | 38M9 | 5′-TCCATTCT GGCGCCACTACCA-3′ | |||
| 88 | 38D | 5′-AATCCATTCTGCCACTACCAC-3′ | |||
<表1e>
| SEQ IDNo. | 寡核苷酸 | 外显子 | 密码子 | 序列 |
| 89 | 41W | 3 | 41 | 5′-GGTGCCACTACCACAGCTCCT-3′ |
| 90 | 41M1 | 5′-TGGTGCCACT TCCACAGCTCC-3′ | ||
| 91 | 41M2 | 5′-TGGTGCCACT GCCACAGCTCC-3′ | ||
| 92 | 41M3 | 5′-TGGTGCCACT CCCACAGCTCC-3′ | ||
| 93 | 41M4 | 5′-GGTGCCACT AGCACAGCTCCT-3′ | ||
| 94 | 41M5 | 5′-GGTGCCACT ATCACAGCTCCT-3′ | ||
| 95 | 41M6 | 5′-GGTGCCACT AACACAGCTCCT-3′ | ||
| 96 | 41M7 | 5′-GTGCCACT ACAACAGCTCCTT-3 | ||
| 97 | 41M8 | 5′-GTGCCACT ACTACAGCTCCTT-3′ | ||
| 98 | 41M9 | 5′-GTGCCACT ACGACAGCTCCTT-3′ | ||
| 99 | 41D | 5′-TGGTGCCACTACAGCTCCTTC-3′ | ||
| 100 | 45W | 45 | 5′-ACAGCTCCTTCTCTGAGTGGT-3′ | |
| 101 | 45M1 | 5′-CACAGCTCCT ACTCTGAGTGG-3′ | ||
| 102 | 45M2 | 5′-CACAGCTCCT GCTCTGAGTGG-3′ | ||
| 103 | 45M3 | 5′-CACAGCTCCT CCTCTGAGTGG-3′ | ||
| 104 | 45M4 | 5′-ACAGCTCCT TGTCTGAGTGGT-3′ | ||
| 105 | 45M5 | 5′-ACAGCTCCT TATCTGAGTGGT-3′ | ||
| 106 | 45M6 | 5′-ACAGCTCCT TTTCTGAGTGGT-3′ | ||
| 107 | 45M7 | 5′-CAGCTCCT TCACTGAGTGGTA-3′ | ||
| 108 | 45M8 | 5′-CAGCTCCT TCGCTGAGTGGTA-3′ | ||
| 109 | 45M9 | 5′-CAGCTCCT TCCCTGAGTGGTA-3′ | ||
| 110 | 45D | 5′-CCACAGCTCCTCTGAGTGGTA-3′ |
<表1f>
| SEQ IDNo. | 寡核苷酸 | 外显子 | 密码子 | 序列 |
| 111 | 48W | 3 | 48 | 5′-TCTCTGAGTGGTAAAGGCAAT-3′ |
| 112 | 48M1 | 5′-TTCTCTGAGT AGTAAAGGCAA-3′ | ||
| 113 | 48M2 | 5′-TTCTCTGAGT TGTAAAGGCAA-3′ | ||
| 114 | 48M3 | 5′-TTCTCTGAGT CGTAAAGGCAA-3′ | ||
| 115 | 48M4 | 5′-TCTCTGAGT GATAAAGGCAAT-3′ | ||
| 116 | 48M5 | 5′-TCTCTGAGT GCTAAAGGCAAT-3′ | ||
| 117 | 48M6 | 5′-TCTCTGAGT GTTAAAGGCAAT-3′ | ||
| 118 | 48M7 | 5′-CTCTGAGT GGAAAAGGCAATC-3′ | ||
| 119 | 48M8 | 5′-CTCTGAGT GGCAAAGGCAATC-3′ | ||
| 120 | 48M9 | 5′-CTCTGAGT GGGAAAGGCAATC-3′ | ||
| 121 | 48D | 5′-TTCTCTGAGTAAAGGCAATCC-3′ |
将各种寡核苷酸与微点样溶液(TeleChem Intemational Inc，Sunnyvale，CA)以1∶1的混合比率混合，并将40μl的各种寡核苷酸转移至96孔平板。将针对密码子37，41和45的寡核苷酸点样20pmol/μl，对于剩余八个密码子点样40pmol/μl。在将点样的96孔平板置于针型微阵列点样仪(Microsys 5100 Cartesian，Cartesian Technologies Inc，Irvine，CA)后，将每种寡核苷酸印在醛涂布的载玻片(26×76×1mm，CEL Associates Inc，Houston，TX)上。以多行多列的形式以300μm的间隔排列斑点，每个直径大小为130μm。使用0.2％SDS洗涤用寡核苷酸点样了的载玻片两次，然后使用蒸馏水洗涤一次。将载玻片浸于热水(95℃)中以使寡核苷酸变性，然后浸于硼氢化钠溶液中5分钟以使未反应的醛基失活。然后，用0.2％SDS洗涤载玻片两次，接着，用蒸馏水洗涤一次，离心和干燥。
实施例2：使用β-连环蛋白寡芯片检验β-连环蛋白突变
(步骤1)DNA样品的制备
从汉城国立大学医院(Seoul National University Hospital)收集74种结肠直肠癌样品，并从韩国细胞系储存库(KCLB)获得31种结肠直肠癌细胞系。在74种结肠直肠癌中，34种是源于近端结肠(盲肠至脾曲(splenic flexure))并且40种是源于远端结肠直肠(脾曲至直肠)。在31种结肠直肠癌细胞系中，7种源于近端结肠，6种源于远端结肠直肠。剩余18种结肠直肠癌细胞系的来源是未知的。使用胃癌细胞系SNU-638和SNU-719作为对于β-连环蛋白突变的阳性对照(Woo，D-K.等，Int.J.Cancer 95：108-113，2001)。SNU-638具有在密码子41处的β-连环蛋白突变(ACC→GCC，Thr→Ala)并且SNU-791具有在密码子34处的β-连环蛋白突变(GGA→GTA，Gly→Val)。
使用TRI试剂(Molecular Research Center，Cincinnati，OH，美国)或自动的基于磁珠的系统(KingFisher，ThermoLabsystems，Finland)，依照产品说明从冷冻样品提取基因组DNA。为了产生荧光染料标记的DNA样品，使用提取的DNA作为模板和在SEQ ID Nos.122至125中描述的两对引物(MWG-Biotech，Ebersberg，德国)进行PCR扩增。如表2中所示，如在Mirabelli-Primdahl，L.等(Cancer Res.59：3346-51，1999)中所描述使用针对外显子3的SEQ ID Nos.122和123 PCR引物，并且如在Udatsu Y.等(Pediatr Surg.Int.17：508-512，2001)中所描述使用针对β-连环蛋白基因的中间大的缺失的SEQ ID Nos.124和125的PCR引物。
<表2>
| SEQ IDNo. | 引物 | 扩增区域 | 扩增大小 | 序列 |
| 122 | 外显子-3F | 外显子3 | 218bp | 5′-GATTTGATGGAGTTGGACATGG-3′ |
| 123 | 外显子-3R | 5′-TGTTCTTGAGTGAAGGACTGAG-3′ | ||
| 124 | 长-3F | 外显子2部分～外显子3部分 | 1115bp | 5′-AAAATCCAGCGTGGACAATGG-3′ |
| 125 | 长-3R | 5′-TGTGGCAAGTTCTGCATCATC-3′ |
每个PCR反应溶液(25μl)含有100ng基因组DNA，10pmol各个引物，40μM dCTP，20μM荧光染料Cy5-dCTP(MEN)或Cy3-dCTP(Amersham-biotech Ltd.，Buckinghamshire，英国)。在可编程的热循环仪(Perkin Elmer Cetus 9600；Roche Molecular Systems，Inc.，新泽西)中通过在94℃变性5分钟引发反应。PCR条件包括94℃30秒，56℃ 30秒，和72℃ 1分钟的35个循环，和在72℃7分钟的最后延伸。在PCR扩增后，使用纯化试剂盒(Qiagen Inc，Valencia，加利福尼亚)纯化Cy5-或Cy3-标记的PCR产物，并用0.25 U的Dnase I(Takara，Shiga，日本)25℃消化10分钟。在85℃10分钟使残余的酶失活，通过重复上述纯化步骤去除残余的酶，回收Cy5-或Cy3-标记的DNA样品。
(步骤2)杂交反应和分析
将步骤(1)中制备的Cy5-或Cy3-标记的DNA样品混合并悬浮在5X杂交液中(TeleChem International Inc，Sunnyvale，加利福尼亚)至2～4μl的体积。将2μl实施例1中制备的混合DNA样品滴在载玻片上并用盖玻片覆盖载玻片。通过将盖玻片孵育在56℃的饱和蒸气管之中3小时进行杂交反应。在室温下在0.2％SDS+2×SSC的缓冲液中漂洗杂交的载玻片15～30分钟，然后在蒸馏水中漂洗5分钟，接着离心和干燥。使用ScanArray Lite(Parkard Instmment Co，Meriden，康涅狄格)扫描载玻片，并使用Imagine(Biodiscovery，版本4.2)和定量微阵列分析软件(QuantArray，版本2.0)分析载玻片。
将11个野生型信号相互比较，并通过信号规范化调整至相等。同样以与野生型信号相同的方式调整剩余的在各个密码子处的110个信号。在信号规范化后，如先前描述重新分析所有的信号(Kim，I.J.等，Clin.Cancer Res.8：457-463，2002)。计算背景信号的平均值(BA)和标准偏差(BSD)，并且确定截止电平为BA+2.58BSD。(BA+2.58BSD)表示99％置信区间的上限，并且将高于该值的信号确定为有意义信号。使用SigmaPlot(SPSS Inc.，San Rafael，加利福尼亚)进行所有的数据分析，并使用Microsoft Excel程序计算平均值和标准偏差。在表3中显示结肠直肠癌和结肠直肠癌细胞系的突变分析结果。
<表3>
| 样品 | β-连环蛋白突变 | MSI | APC突变 | |||
| 名称 | 类型 | 位置 | 密码子 | 突变 | ||
| 207 | 肿瘤 | 上升的c | 32 | GAC→AAC | +f | -g |
| 395 | 肿瘤 | 上升的 | 45 | TCT→TTT | + | - |
| 396 | 肿瘤 | 上升的 | 45 | 符合读框的缺失 | + | - |
| 400 | 肿瘤 | 上升的 | 45 | TCT→TTT | + | - |
| 435 | 肿瘤 | 上升的 | 41 | ACC→GCC | + | - |
| SNU-407a | 细胞系 | 横的d | 41 | ACC→GCC | + | - |
| SNU-1047a | 细胞系 | 横的 | 45 | TCT→TTT | + | 4107缺失C |
| LS174Tb | 细胞系 | 结肠e | 45 | TCT→TTT | + | - |
| HCT116b | 细胞系 | 结肠 | 45 | 符合读框的缺失 | + | - |
| aOh，J.H.等，Int.J.Cancer 81：902-910，1999bIlyas，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国94：10330-10334，1997c升结肠d横结肠e不能发现关于这些细胞系起源的详细信息。已证实这些细胞系来源于人结肠腺癌。fBAT-26中的MSIg在MCR中未发现APC突变 | ||||||
如表3中显示，在74种结肠直肠癌中的5种(组织样品207，395，396，400和435)(5/14，7％)中鉴定出β-连环蛋白基因突变。在34种近端结肠癌中发现这五种β-连环蛋白突变(5/34，15％)，并且在40种远端结肠直肠癌中没有发现一个突变(0/40，0％)。在34种近端结肠癌中，在25种右侧结肠癌中发现五种β-连环蛋白突变，在9种横结肠癌中没发现突变。这些结果表明β-连环蛋白突变与近端结肠中的肿瘤相关(p＝0.017)。
在31种结肠直肠癌细胞系中，在SNU-407，SNU-1047，LS174T和HCT116的细胞系中发现4种β-连环蛋白突变。在这4种β-连环蛋白突变中，在来源于近端结肠(横结肠)的细胞系中发现两种(SNU-407和SNU-1047)。没有确定其它2种(LS174T和HCT116)含有β-连环蛋白突变的细胞系的来源。
在74种结肠直肠癌组织和31种结肠直肠癌细胞系中发现总共9种突变。在GSK-3β磷酸化位点鉴定这9种突变中的八种突变。所有的点突变是氨基酸置换并发生在密码子32，41和45处。在密码子45处集中六种突变。这6种在密码子45处的点突变中的四种是相同的错义突变(TCT→TTT，Set→Phe；在样品395，400中，SNU-1047和LS174T)，并且剩余2种突变是与样品396和HCT116中相同的符合读框的缺失。没有检测到β-连环蛋白基因的中间大的缺失。
在组织400的情形中，观察到与野生型信号结合的另外的信号，其表示在密码子45处的错义突变(TCT→TTT，Ser→Phe)(图1)。9种带有β-连环蛋白突变的样品中的八种不但显示在各个密码子处的野生型信号而且显示异常信号，这指出存在杂合突变。同时，LS174T在密码子45处只显示异常信号不存在野生型信号，其意指LS174T具有纯合β-连环蛋白突变。
针对在MCR(密码子1263-1513)中APC突变研究了所有具有β-连环蛋白突变的9种样品。只有一种细胞系(SNU-1047)在密码子1369(4107缺失C)处含有APC截短突变。在本发明中发现已报道不携带β-连环蛋白突变的细胞系LS174T含有β-连环蛋白突变(密码子45，TCT→TTT，Ser→Phe)(Ilyas，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国94：10330-10334，1997)。
实施例3：通过β-连环蛋白寡芯片检测的β-连环蛋白突变的证实
为了证实通过本发明β-连环蛋白寡芯片检测的β-连环蛋白突变，将九种β-连环蛋白突变样品如下进行PCR-SSCP，DHPLC，PTT，克隆测序和直接测序。
如先前描述(Kim，I.J.等，Int.J.Cancer 86：529-532，2000；Wagner，T.等，Genomics 62：369-376，1999)进行PCR-SSCP和DHPLC分析。使用WAVE(Transgenomic，Omaha，新英格兰)实行DHPLC分析，并且使用WAVEMAKER软件优化运行条件。如先前描述(Won，Y.J.等，J.Hum.Genet.44：103-108，1999)，针对APC基因突变簇区域(MCR，密码子1263-1513)的突变检测进行蛋白截短试验(PTT)。在克隆过程中，将新鲜的PCR产物连接于PCR-TOPO载体中，并使用TA克隆系统(Invitrogen，Carlsbad，加利福尼亚)亚克隆。使用Taq双脱氧终止子循环测序试剂盒和ABI 3100 DNA测序仪(Applied Biosystems，Forster City，加利福尼亚)进行双向测序。
<表4>
| 样品 | SSCP | DHPLC | 直接测序 | 克隆测序 | β-连环蛋白寡芯片 |
| 207 | +a | + | ND | + | + |
| 395 | + | + | + | + | + |
| 396 | + | + | + | + | + |
| 400 | NDb | + | ND | + | + |
| 435 | + | + | + | + | + |
| SNU-407 | + | + | + | + | + |
| SNU-1047 | + | + | + | + | + |
| LS174T | + | + | + | + | + |
| HCT116 | + | + | + | + | + |
| a检测到b没有检测到 | |||||
在常规技术中，已广泛用于突变分析的自动化直接测序方法没有清晰地检测到9种β-连环蛋白突变中的2种(图2)。PCR-SSCP也遗漏了一种β-连环蛋白突变。这些结果可能是由在癌症组织中的过量野生型DNA或由这两种方法的低敏感性所导致。
实施例4：β-连环蛋白突变和MSI的关系
已经报道MSI的状态可以有意义地与近端结肠癌相关，MSI可以用作一种用于近端结肠癌诊断的诊断标记(Traverso，G.等，Lancet359：403-403，2002)。为了确定MSI的状态，使用BAT-26标记(Shitoh，K.等，Genes Chromosomes Cancer 30：32-37，2001；Samowits，W.S.等，Am.J.Pathol.158：1517-1524，2001)将从74种结肠直肠癌提取的基因组DNA进行PCR。
每个PCR反应溶液(25μl)含有100ng使用Picoll-Paque和Trizol试剂从正常和癌症组织提取的基因组DNA，0.25μl各个10pmol SEQ IDNos.126和127的BAT26-F和BAT26-R引物，2.5mM的dNTP 0.5μl，10x PCR缓冲液2.5μl，[α-32P]dCTP 0.25μl，和Taq DNA聚合酶(5单位/μl)。在可编程的热循环仪(Perkin Elmer Cetus 9600；Roche MolecularSystems，Inc.，新泽西)中通过在94℃变性5分钟引发反应。PCR条件包括94℃30秒，52℃30秒，和72℃ 1分钟的35个循环，和最后在72℃ 7分钟的延伸。在95℃加热反应混合物5分钟并在冰浴中冷却。将35μl的冷却反应混合物进行40％聚丙烯酰胺凝胶(29∶1)电泳，将凝胶干燥并暴露于X-射线。
为了确定β-连环蛋白突变，MSI和肿瘤位置之间的关系，使用x2或费歇尔精确检验，使用STATISTICA软件(StatSoft Inc.，Tulsa，俄克拉荷马州)将a＝0.05设定为显著性水平进行统计分析。
结果，74种结肠直肠癌组织中的12种(16％)在BAT-26标记中显示MSI。发现34种近端结肠癌中的10种(29％)具有MSI，并且发现40种远端结肠直肠癌中只有2种(5％)含有MSI。MSI在统计学上与近端位置相关(p＜0.01)。在12种具有MSI的结肠直肠癌中发现所有的5种β-连环蛋白突变(5/12，42％)，并且在62种具有MSS(微卫星稳定性)的结肠直肠癌中未发现一种。β-连环蛋白突变在具有MSI的结肠直肠癌中比在具有MSS的那些中更常见(p＜0.001)。
尽管已经描述和举例说明了主题发明的实施方案，但明显的是在不背离本发明的精神条件下可对其进行各种改变和修改，所述本发明精神是应该只由后附权利要求的范围限制。
序列表
<110> 国立癌中心
<120> β-连环蛋白寡核苷酸微芯片和使用它检测β-连环蛋白突变的方法
<130> PCA30321/NCC
<160> 127
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 29W
<400> 1
cagcaacagt cttacctgga c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 29M1
<400> 2
gcagcaacag acttacctgg a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 29M2
<400> 3
gcagcaacag gcttacctgg a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 29M3
<400> 4
gcagcaacag ccttacctgg a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 29M4
<400> 5
cagcaacagt attacctgga c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 29M5
<400> 6
cagcaacagt gttacctgga c 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 29M6
<400> 7
cagcaacagt tttacctgga c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 29M7
<400> 8
agcaacagtc atacctggac t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 29M8
<400> 9
agcaacagtc gtacctggac t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 29M9
<400> 10
agcaacagtc ctacctggac t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 29D
<400> 11
ggcagcaaca gtacctggac t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 31W
<400> 12
cagtcttacc tggactctgg a 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 31M1
<400> 13
acagtcttac atggactctg g 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 31M2
<400> 14
acagtcttac ttggactctg g 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 31M3
<400> 15
acagtcttac gtggactctg g 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 31M4
<400> 16
cagtcttacc aggactctgg a 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 31M5
<400> 17
cagtcttacc gggactctgg a 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 31M6
<400> 18
cagtcttacc cggactctgg a 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 31M7
<400> 19
agtcttacct agactctgga a 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 31M8
<400> 20
agtcttacct cgactctgga a 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 31M9
<400> 21
agtcttacct tgactctgga a 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 31D
<400> 22
aacagtctta cgactctgga a 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 32W
<400> 23
tcttacctgg actctggaat c 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 32M1
<400> 24
gtcttacctg cactctggaa t 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 32M2
<400> 25
gtcttacctg tactctggaa t 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 32M3
<400> 26
gtcttacctg aactctggaa t 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 32M4
<400> 27
tcttacctgg cctctggaat c 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 32M5
<400> 28
tcttacctgg tctctggaat c 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 32M6
<400> 29
tcttacctgg gctctggaat c 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 32M7
<400> 30
cttacctgga gtctggaatc c 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 32M8
<400> 31
cttacctgga ttctggaatc c 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 32M9
<400> 32
cttacctgga atctggaatc c 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 32D
<400> 33
agtcttacct gtctggaatc c 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 33W
<400> 34
tacctggact ctggaatcca t 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 33M1
<400> 35
ttacctggac actggaatcc a 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 33M2
<400> 36
ttacctggac gctggaatcc a 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 33M3
<400> 37
ttacctggac cctggaatcc a 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 33M4
<400> 38
tacctggact gtggaatcca t 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 33M5
<400> 39
tacctggact atggaatcca t 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 33M6
<400> 40
tacctggact ttggaatcca t 21
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 33M7
<400> 41
acctggactc aggaatccat t 21
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 33M8
<400> 42
acctggactc gggaatccat t 21
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 33M9
<400> 43
acctggactc cggaatccat t 21
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 33D
<400> 44
ttacctggac ggaatccatt c 21
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 34W
<400> 45
ctggactctg gaatccattc t 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 34M1
<400> 46
cctggactct tgaatccatt c 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 34M2
<400> 47
cctggactct agaatccatt c 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 34M3
<400> 48
cctggactct cgaatccatt c 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 34M4
<400> 49
ctggactctg taatccattc t 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 34M5
<400> 50
ctggactctg caatccattc t 21
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 34M6
<400> 51
ctggactctg aaatccattc t 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 34M7
<400> 52
tggactctgg tatccattct g 21
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 34M8
<400> 53
tggactctgg gatccattct g 21
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 34M9
<400> 54
tggactctgg catccattct g 21
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 34D
<400> 55
cctggactct atccattctg g 21
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 35W
<400> 56
gactctggaa tccattctgg t 21
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 35M1
<400> 57
ggactctgga gtccattctg g 21
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 35M2
<400> 58
ggactctgga ctccattctg g 21
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 35M3
<400> 59
ggactctgga ttccattctg g 21
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 35M4
<400> 60
gactctggaa cccattctgg t 21
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 35M5
<400> 61
gactctggaa gccattctgg t 21
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 35M6
<400> 62
gactctggaa accattctgg t 21
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 35M7
<400> 63
actctggaat gcattctggt g 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 35M8
<400> 64
actctggaat acattctggt g 21
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 35M9
<400> 65
actctggaat tcattctggt g 21
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 35D
<400> 66
ggactctgga cattctggtg c 21
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 37W
<400> 67
ggaatccatt ctggtgccac t 21
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 37M1
<400> 68
tggaatccat actggtgcca c 21
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 37M2
<400> 69
tggaatccat cctggtgcca c 21
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 37M3
<400> 70
tggaatccat gctggtgcca c 21
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 37M4
<400> 71
ggaatccatt atggtgccac t 21
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 37M5
<400> 72
ggaatccatt gtggtgccac t 21
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 37M6
<400> 73
ggaatccatt ttggtgccac t 21
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 37M7
<400> 74
gaatccattc aggtgccact a 21
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 37M8
<400> 75
gaatccattc gggtgccact a 21
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 37M9
<400> 76
gaatccattc cggtgccact a 21
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 37D
<400> 77
tggaatccat ggtgccacta c 21
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 38W
<400> 78
atccattctg gtgccactac c 21
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 38M1
<400> 79
aatccattct agtgccacta c 21
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 38M2
<400> 80
aatccattct cgtgccacta c 21
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 38M3
<400> 81
aatccattct tgtgccacta c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 38M4
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atccattctg atgccactac c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 38M5
<400> 83
atccattctg ctgccactac c 21
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 38M6
<400> 84
atccattctg ttgccactac c 21
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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tccattctgg agccactacc a 21
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 38M8
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tccattctgg ggccactacc a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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tccattctgg cgccactacc a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 38D
<400> 88
aatccattct gccactacca c 21
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 41W
<400> 89
ggtgccacta ccacagctcc t 21
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 41M1
<400> 90
tggtgccact tccacagctc c 21
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 41M2
<400> 91
tggtgccact gccacagctc c 21
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 41M3
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tggtgccact cccacagctc c 21
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 41M4
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ggtgccacta gcacagctcc t 21
<210> 94
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 41M5
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ggtgccacta tcacagctcc t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 41M6
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ggtgccacta acacagctcc t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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gtgccactac aacagctcct t 21
<210> 97
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 41M8
<400> 97
gtgccactac tacagctcct t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 41M9
<400> 98
gtgccactac gacagctcct t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 41D
<400> 99
tggtgccact acagctcctt c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 45W
<400> 100
acagctcctt ctctgagtgg t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 45M1
<400> 101
cacagctcct actctgagtg g 21
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 45M2
<400> 102
cacagctcct gctctgagtg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 45M3
<400> 103
cacagctcct cctctgagtg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 45M4
<400> 104
acagctcctt gtctgagtgg t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 45M5
<400> 105
acagctcctt atctgagtgg t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 45M6
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acagctcctt ttctgagtgg t 21
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<211> 21
<212> DNA
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cagctccttc actgagtggt a 21
<210> 108
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 45M8
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cagctccttc gctgagtggt a 21
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 45M9
<400> 109
cagctccttc cctgagtggt a 21
<210> 110
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 45D
<400> 110
ccacagctcc tctgagtggt a 21
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 48W
<400> 111
tctctgagtg gtaaaggcaa t 21
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 48M1
<400> 112
ttctctgagt agtaaaggca a 21
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 48M2
<400> 113
ttctctgagt tgtaaaggca a 21
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 48M3
<400> 114
ttctctgagt cgtaaaggca a 21
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 48M4
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tctctgagtg ataaaggcaa t 21
<210> 116
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 48M5
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tctctgagtg ctaaaggcaa t 21
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 48M6
<400> 117
tctctgagtg ttaaaggcaa t 21
<210> 118
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 48M7
<400> 118
ctctgagtgg aaaaggcaat c 21
<210> 119
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 48M8
<400> 119
ctctgagtgg caaaggcaat c 21
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 48M9
<400> 120
ctctgagtgg gaaaggcaat c 21
<210> 121
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 48D
<400> 121
ttctctgagt aaaggcaatc c 21
<210> 122
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Exon-3F
<400> 122
gatttgatgg agttggacat gg 22
<210> 123
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Exon-3R
<400> 123
tgttcttgag tgaaggactg ag 22
<210> 124
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Long-3F
<400> 124
aaaatccagc gtggacaatg g 21
<210> 125
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Long-3R
<400> 125
tgtggcaagt tctgcatcat c 21
<210> 126
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BAT26-F
<400> 126
tgactacttt tgacttcagc c 21
<210> 127
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BAT26-R
<400> 127
aaccattcaa catttttaac cc 22
Claims (15)
1.一种用于检测β-连环蛋白突变的β-连环蛋白寡核苷酸微芯片，其包括众多固定于固体基质表面上的寡核苷酸，其中设计所述寡核苷酸以检测在β-连环蛋白基因突变热点处的各种突变。
2.权利要求1的β-连环蛋白寡核苷酸微芯片，其中所述β-连环蛋白基因突变热点是密码子29，31，32，33，34，35，37，38，41，45和48。
3.权利要求1的β-连环蛋白寡核苷酸微芯片，其中设计所述寡核苷酸以检测在密码子29，31，32，33，34，35，37，38，41，45和48处9种类型的错义突变，1种类型的符合读框的缺失和一种野生型。
4.权利要求3的β-连环蛋白寡核苷酸微芯片，其中用于检测在密码子29，31，32，33，34，35，37，38，41，45和48处的错义突变的所述寡核苷酸分别是SEQ ID Nos.2至10，SEQ ID Nos.13至21，SEQ ID Nos.24至32，SEQ ID Nos.35至43，SEQ ID Nos.46至54，SEQ ID Nos.57至65，SEQID Nos.68至76，SEQ ID Nos.79至87，SEQ ID Nos.90至98，SEQ IDNos.101至109，和SEQ ID Nos.112至120的那些。
5.权利要求3的β-连环蛋白寡核苷酸微芯片，其中用于检测在密码子29，31，32，33，34，35，37，38，41，45和48处符合读框的缺失的所述寡核苷酸分别是SEQ ID No.11，SEQ ID No.22，SEQ ID No.33，SEQ ID No.44，SEQ ID No.55，SEQ ID No.66，SEQ ID No.77，SEQ ID No.88，SEQ ID No.99，SEQ ID No.110，和SEQ ID No.121的那些。
6.权利要求3的β-连环蛋白寡核苷酸微芯片，其中用于检测在密码子29，31，32，33，34，35，37，38，41，45和48处的野生型的所述寡核苷酸分别是SEQ ID No.1，SEQ ID No.12，SEQ ID No.23，SEQ ID No.34，SEQ IDNo.45，SEQ ID No.56，SEQ ID No.67，SEQ ID No.78，SEQ ID No.89，SEQ ID No.100，和SEQ ID No.111的那些。
7.一种制备权利要求1至6中任何一项的β-连环蛋白寡核苷酸微芯片的方法，其包括：
1)在微点样溶液中混合各种所述寡核苷酸并分配至孔板；
2)使用微阵列点样仪将所述寡核苷酸点样在固体基质表面；
3)将所述寡核苷酸固定在固体基质表面并洗涤；
4)通过在95℃水中浸泡固体基质使所述固定了的寡核苷酸变性，然后用硼氢化钠溶液处理所述固体基质；和
5)洗涤和干燥所述固体基质。
8.权利要求7的制备方法，其中每一种在步骤(1)中使用的所述寡核苷酸具有一种带有5’氨基修饰的12个碳原子的间隔臂。
9.权利要求7的制备方法，其中步骤(2)中的所述固体基质是玻璃，改性聚硅氧烷，塑料盒，或聚合物板。
10.权利要求9的制备方法，其中用一种醛或胺涂布所述固体基质。
11.权利要求7的制备方法，步骤(2)的每个寡核苷酸斑点是具有100-500μm直径的圆形。
12.权利要求11的制备方法，以200-800μm间隔的多行多列形式排列步骤(2)的所述寡核苷酸斑点。
13.一种使用权利要求1的β-连环蛋白寡核苷酸微芯片检测β-连环蛋白突变的方法，包含
1)从受试患者的血液制备荧光染料标记的DNA样品；
2)使所述标记的DNA样品与在β-连环蛋白寡芯片上的寡核苷酸斑点反应；
3)洗涤反应的寡芯片以去除未结合的样品DNA；
4)使用荧光读数器检测特定寡核苷酸斑点的杂交模式；和
5)检验基因突变的存在。
14.权利要求13的方法，其中步骤(1)的所述荧光染料选自Cy5，Cy3，德克萨斯红，荧光素和丽丝胺罗丹明。
15.权利要求13的方法，其中步骤(2)的所述反应是在用水蒸气饱和的45～60℃的培养箱中进行3～9小时。
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