WO2021045189A1 - 大腸がんマーカー、及びこれを用いた検査方法 - Google Patents

大腸がんマーカー、及びこれを用いた検査方法 Download PDF

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tissue
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幸嗣 植田
池田　篤志
聡 長山
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公益財団法人がん研究会
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a novel marker for detecting colorectal cancer and a test method using the marker.
  • colorectal cancer has the third highest morbidity rate and the second highest cancer mortality rate (Non-Patent Document 1). According to the statistics of the Japan Cancer Society, the number of deaths from colorectal cancer is the highest among women and the third highest among men, and about 50,000 men and women die from colorectal cancer annually (2016 statistics). Since colorectal cancer is a cancer with a relatively high cure rate if it is detected early and treatment is started, it is important to detect it early and start treatment in order to reduce the number of deaths. Has been done.
  • Extracellular vesicles have been energetically studied, and their functions are being elucidated.
  • Extracellular vesicles are classified into exosomes, microvesicles, and apoptotic bodies according to their size, and all of them are stable in body fluids such as blood and urine.
  • Exosomes and microvesicles contain proteins, miRNAs, mRNAs, etc., and are said to reflect the properties of the cells from which they are derived. Therefore, disease-specific markers are contained in exosomes and microvesicles secreted from diseased cells such as cancer. Therefore, it is considered to be useful for diagnosing diseases, especially cancer, by analyzing extracellular vesicles.
  • extracellular vesicles secreted from cancer cells not only contain molecules involved in cancer development, but also mediate cancer infiltration, metastasis, immunosuppression, and angiogenesis. There is. That is, extracellular vesicles also function as a communication tool between secreted cells and uptake cells.
  • extracellular vesicles are contained in body fluids such as blood and urine, so that they can be prepared and diagnosed in a minimally invasive and non-invasive manner. This is a great advantage for patients because it can be a substitute for tissue biopsy when regular examination is required after surgery or when it is difficult to collect the diseased part.
  • body fluids such as blood and urine
  • extracellular vesicles may be a useful resource for early cancer diagnosis.
  • proteins contained in extracellular vesicles are also used as biomarkers for colorectal cancer (Patent Documents). 1, 2).
  • Patent Document 1 describes a method for detecting metastasis of colorectal cancer using an exosome sample. Detecting metastatic cancer is also an important issue, but if colorectal cancer can be detected at an early stage, the probability of cure will increase. Therefore, obtaining a marker that can detect colorectal cancer at an early stage is difficult. It is considered to be a higher priority issue.
  • Patent Document 2 is a method for detecting colorectal cancer by measuring the amount of exosomes expressing CD147.
  • CD147 is a protein that is expressed not only in colorectal cancer but also in various cancer cells and stromal cells. Therefore, it cannot be expected as a method for specifically detecting colorectal cancer.
  • An object of the present invention is to detect a novel marker of colorectal cancer contained in exosomes.
  • the colorectal cancer markers contained in the extracellular vesicles shown below are novel markers and can be used to test colorectal cancer with high sensitivity.
  • a method for testing colorectal cancer which comprises detecting at least one biomarker shown in Table 1.
  • the profiling of extracellular vesicles (tissue-exudative extracellular fibers, Te-EVs) exuding from tissue and tissue proteins is shown.
  • the present invention relates to a novel colorectal cancer marker contained in extracellular vesicles.
  • the markers disclosed below can detect colon cancer by examining extracellular vesicles contained in blood, and thus serve as a minimally invasive examination method. Furthermore, by testing in combination with the existing cancer marker CEA, it becomes possible to detect colorectal cancer more accurately even at an early stage.
  • Extracellular vesicles (this-exudative extracellular vesicles, hereinafter referred to as Te-EVs) that exude from the tissue obtained from the site of colon cancer resected by surgery and the normal site around the cancer site are defined. It was isolated and purified as follows.
  • the tissue of about 1 cm 3 excised by surgery is cut into several pieces of tissue, washed with PBS, immersed in 1.5 ml of serum-free RPMI1640, and placed on a rotator under 37 ° C. and 5% CO 2 conditions.
  • Extracellular vesicles were exuded for 3 hours.
  • the culture broth was centrifuged at 3,000 xg for 30 minutes, then 12,000 xg for 30 minutes to remove large fragments such as tissue fragments and cell fragments, and extracellularly centrifuged at 100,000 xg for 1 hour.
  • Vesicles were isolated.
  • the isolated extracellular vesicles were suspended in 1 ml PBS and washed by centrifugation at 100,000 ⁇ g for 1 hour (washing step). The washing step was repeated twice to isolate and purify extracellular vesicles.
  • tissue sample about 3 mm 3 tissue was homogenized in 400 ⁇ l of PTS buffer (2.5 mM HEPES (pH 7.6), 12 mM sodium digesty collate, 12 mM N-Lauroylsarcosinate sodium salt), and sonicated with a probe sonicator. After centrifugation at 15,000 g for 15 minutes, the supernatant was digested with trypsin and subjected to LC / MS analysis. The original tissue is used for analysis of both cancerous and non-cancerous parts.
  • PTS buffer 2.5 mM HEPES (pH 7.6), 12 mM sodium digesty collate, 12 mM N-Lauroylsarcosinate sodium salt
  • Mass spectrometry was performed by Orbitrap Fusion Technology meter (Thermo Scientific) connected with UltraMate 3000 RLSC nano-flow HPLC (Thermo Scientific) equipped with 0.075 x 150 mm C18 tip-colum (Nikkyo Technos).
  • the analysis conditions are as follows.
  • Peptides were separated using a 2-step gradient consisting of 250 ln / min and 0.1% formic acid-containing acetonitrile concentration of 2-35% for 95 minutes and 35-95% for 15 minutes.
  • the HPLC eluate was ionized at a spray voltage of 2 kV and the spectrum in the 350-1500 m / z range was analyzed in full MS ion scan mode with a resolution of 60,000.
  • the CID MS / MS scan was acquired in the Data dependency acquisition (DDA) mode in which the Dynamic exclusion function was enabled.
  • DDA Data dependency acquisition
  • Protein identification was analyzed by Proteome Discoverer software (Thermo Scientific) with SEQ (Thermo Scientific) and Mascot (Matrix Science) search engines, and the peptide identification threshold was set to False Discovery Rate 1%. MaxQuant software was used to quantify the protein. The protein quantification values were standardized so that the total value of all protein quantification values was constant between each sample.
  • Te-EVs and tissue proteome analysis Proteome analysis of the colon cancer site, Te-EVs obtained by exudation from the surrounding normal tissue, and the resected original tissue was performed. As a result of mass spectrometry, 8370 kinds of proteins were identified in the sample directly extracted from the original tissue, and 6307 kinds of proteins were identified from Te-EVs. 4942 types of proteins were commonly found in both, and 9735 types of proteins were identified in total (Fig. 2a).
  • Te-EVs obtained from the cancerous part and the normal tissue around the cancerous part were analyzed.
  • a total of 6307 proteins were identified in Te-EVs obtained from cancerous areas and normal tissues.
  • the breakdown is 6166 types of proteins identified by Te-EVs obtained from the cancerous part, 5800 types of proteins identified by Te-EVs obtained from normal tissues, 5569 types of proteins common to both, and cancer.
  • CD9, CD63, and CD151 belonging to the membrane protein tetraspanin family are known as extracellular vesicles, especially exosome markers.
  • the amount of protein derived from the original tissue of these proteins and the amount of protein derived from Te-EVs were comparatively quantified.
  • CD9, CD63, and CD151 were significantly abundant in Te-EVs (Fig. 2e).
  • a Vacuolar protein sorting (VPS) family protein was newly identified as a protein contained in a large amount in Te-EVs.
  • the abundance of VPS family proteins was clearly different between the tissue-derived protein and the Te-EVs-derived protein (Fig. 2f).
  • VPS family proteins can be used as new markers for extracellular vesicles such as exosomes.
  • CAT1 Availability of CAT1 as a biomarker
  • CAT1 contained in the tissue was analyzed by Western blotting.
  • Te-EVs obtained from normal tissues and cancerous areas were fixed by a conventional method, reacted with CAT1 antibody (rabbit polyclonal antibody), and anti-rabbit IgG antibody labeled with 40 nm gold particles was used as a secondary antibody. Observation with a transmission electron microscope was performed (Fig. 3d). As a result, it was possible to confirm the binding of the anti-CAT1 antibody to the membrane surface of Te-EVs obtained from the cancerous part.
  • the CAT1 antibody was prepared by immunizing a rabbit with a peptide at positions 145 to 160 of CAT1.
  • CAT1 could be detected by tissue staining (Fig. 3e, f). Immunochemical staining was performed using a BOND-III fully automatic IHC staining device (Leica Biosystems) using a paraffin section as an anti-CAT1 antibody (Proteintech) and an anti-CD31 antibody (DAKO) as a primary antibody. The expression of CAT1 was clearly higher in the cancerous part than in the surrounding normal tissues. As shown in FIG. 3e, the staining intensity was classified from 0 to +2, and the cancerous part of the colorectal cancer patients classified into stages I to IV was analyzed by immunohistochemical staining (FIG. 3f). As a result, it was confirmed that the staining intensity was clearly higher in the cancerous part than in the peripheral normal part (N).
  • the measurement result of CAT1 amount of extracellular vesicles by Elisa was analyzed by ROC curve.
  • the cutoff value of CAT1 was set to 0.015 ( ⁇ g / ⁇ l)
  • the sensitivity was 48.1% and the specificity was 92%.
  • CEA carcinoembryonic antigen
  • the sensitivity was 31.5% for CEA, while it was 48.1% for CAT1.
  • the area under curve (AUC) was 0.774 for CAT1 and 0.770 for CEA, but when CAT1 and CEA were used in combination, AUC showed a higher value of 0.874.
  • CAT1 is useful as a marker for colorectal cancer because it is expressed on the surface of extracellular vesicles in plasma and can be measured by ELISA. In addition, it can be measured even in early stage of colorectal cancer, and by combining with existing markers, colorectal cancer can be detected more sensitively.
  • GCC was analyzed.
  • a sandwich ELISA system was constructed to quantify GCC on exosomes in plasma (Fig. 5a left).
  • an anti-GCC antibody was used as a capture antibody
  • an anti-CD81 antibody which is an exosome marker
  • Anti-GCC antibody is immobilized, GCC protein is bound, biotin-labeled anti-CD81 antibody (Cosmobio) is bound, streptavidin poly-HRP40 (Fitzgerald) is reacted, and 1-Step Ultra TMB is reacted.
  • -Color was developed by ELISA Substrate Solution (Thermo Fisher Scientific), and measurement was performed with a plate reader.
  • CAT1 and GCC are shown as examples, but all of the 74 types of membrane proteins shown in Table 1 are proteins whose expression is specifically observed in Te-EV extracted from the cancerous part of colorectal cancer patients. is there. Therefore, any protein in Table 1 can be sensitively examined for colorectal cancer by detecting it as a protein expressed on extracellular vesicles by the method exemplified here or a commonly used method. it can. Moreover, although the detection example using plasma is shown here, it is obvious that serum can be used.

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Abstract

大腸がんの手術切除試料から、組織から滲出する細胞外小胞（Ｔｅ－ＥＶｓ）を得て、質量分析により大腸がんに特異的なマーカーを得た。細胞外小胞に移行するタンパク質の中から、大腸がんに特徴的に発現しているタンパク質を解析した。その結果、７４種の膜タンパク質が大腸がんのバイオマーカーとして有用であることが示された。特に、Ｈｉｇｈ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃａｔｉｏｎｉｃ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　１（ＣＡＴ１）及びＧｕａｎｙｌｙｌ　ｃｙｃｌａｓｅ　Ｃ（ＧＣＣ）は有用な大腸がんマーカーである。

Description

大腸がんマーカー、及びこれを用いた検査方法
　本発明は、大腸がんを検出する新規マーカー、及びこれを用いた検査方法に関する。
　大腸がんは罹患率第３位のがんであり、がん死亡率第２位のがんであることが報告されている（非特許文献１）。日本対がん協会の統計においても、大腸がんによる死亡数は女性ではトップ、男性でも３位であり、男女合わせて年間約５万人が大腸がんにより死亡している（２０１６年統計）。大腸がんは早期に発見し治療を開始すれば、比較的治癒率の高いがんであることから、早期に検出し、治療を開始することが死亡数を低下させるためには重要であると考えられている。
　大腸がんは出血を伴うことが多いため、便の中の血液を検出する便潜血検査や大腸内視鏡検査が行われている。便潜血検査は、企業や自治体の検査に組み込まれていることが多いが、大腸がんでも出血を伴わない場合もあり、また、大腸の部位によっては、出血を検出できないなど、偽陰性が多いことが問題となっている。大腸内視鏡検査は、検出感度に優れているが、腸管洗浄の必要性があり肉体的負担が大きいこと、検査費用がかかることなど被験者の負担が大きいことが問題となっている。
　近年、細胞外小胞が精力的に研究され、機能の解明が進んでいる。細胞外小胞は、その大きさによって、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）、微小小胞体（ｍｉｃｏｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）、アポトーシス小体（ａｐｏｔｏｔｉｃ　ｂｏｄｉｅｓ）に分類されているが、いずれも、血液、尿などの体液中に安定に存在する。エクソソーム、微小小胞体には、タンパク質、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡなどが内包されており、由来する細胞の性質を反映すると言われている。したがって、がんなどの疾患細胞から分泌されたエクソソーム、微小小胞体には疾患特異的なマーカーが含有されている。そのため、細胞外小胞を解析することによって、疾患、特にがんの診断には有用であると考えられている。
　がん細胞から分泌された細胞外小胞は、がん発症に関与する分子が内包されているだけではなく、がんの浸潤、転移、免疫抑制、血管新生などを介在することが知られている。すなわち、細胞外小胞は、分泌した細胞と取り込んだ細胞との間のコミュニケーションツールとしても機能している。
　また、上述のように、細胞外小胞は血液、尿などの体液に含まれていることから、低侵襲的、非侵襲的に調製し、診断を行うことができる。これは、手術後、定期的に検査が必要な場合、あるいは疾患部位の採取が困難な場合など、組織生検の代替になり得ることから患者にとって大きいメリットとなる。また、早期がんであっても、がん細胞は特徴的な細胞外小胞を分泌していると考えられることから、細胞外小胞は早期がん診断のための有用なリソースとなる可能性がある。すでに種々の疾患の診断において細胞外小胞の利用が提唱されているが、大腸がんのバイオマーカーとしても細胞外小胞に包含されるタンパク質を利用することがすでに開示されている（特許文献１、２）。
特開２０１７－１３３８３１号公報 国際公開第２０１４／１６７９６９号 国際公開第２０１８／０７９６８９号
Bray F. et al. CA Cancer J Clin 2018; 68(6):394-424; doi 10.3322/caac.21492. Jingushi K. et al. Int. J. Cancer 2018; 142(3):607-617; e-pub ahead of print 2017/10/05; doi 10.1002/ijc.31080. Saigusa D. etal. PLoS One 2016; 11(8): e0160555; e-pub ahead of print 2016/09/01; doi 10.1371/journal.pone.0160555. Hishinuma E. etal. Drug Metab Dispos 2018; 46(8): 1083-1090; e-pub ahead of print 2018/05/18;doi 10.1124/dmd.118.081737.
　特許文献１に記載されているのは、エクソソーム試料を用いて大腸がんの転移を検出する方法である。転移がんを検出することも重要な課題ではあるが、早期に大腸がんを検出することができれば、治癒の確率が高くなることから、早期に大腸がんを検出できるマーカーを得ることは、より優先的な課題であると考えられる。
　特許文献２には、ＣＤ１４７を発現しているエクソソーム量を測定することにより、大腸がんを検出する方法である。ＣＤ１４７は、大腸がんだけではなく、種々のがん細胞やストローマ細胞で発現が認められるタンパク質である。したがって、大腸がんを特異的に検出する方法としては期待することができない。本発明は、エクソソームに含まれる大腸がんの新規マーカーを検出することを課題とする。
　以下に示す細胞外小胞に含まれる大腸がんマーカーは新規のマーカーであり、これを用いて大腸がんを感度良く検査することができる。
（１）表１記載のバイオマーカーを少なくとも１つ検出することを特徴とする大腸がんの検査方法。
（２）前記バイオマーカーの検出は、血液試料中の細胞外小胞に含まれる量を検出するものである（１）記載の大腸がんの検査方法。
（３）前記血液試料が血漿、又は血清であることを特徴とする（２）記載の大腸がんの検査方法。
（４）前記バイオマーカーの検出は、質量分析によって行う（１）～（３）いずれか１つ記載の大腸がんの検査方法。
（５）前記バイオマーカーの検出は、抗体を用いて行う（１）～（３）いずれか１つ記載の大腸がんの検査方法。
（６）前記バイオマーカーの検出は、組織染色、又はＥＬＩＳＡによって行う（５）記載の大腸がんの検査方法。
（７）前記バイオマーカーが、Ｈｉｇｈ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃａｔｉｏｎｉｃ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　１（ＣＡＴ１）及び／又はＧｕａｎｙｌｙｌ　ｃｙｃｌａｓｅ　Ｃ（ＧＣＣ）であることを特徴とする（１）～（６）いずれか１つ記載の大腸がんの検査方法。
（８）前記バイオマーカーの検出と他のがんマーカーの検出結果を併せて判定することを特徴とする（１）～（７）いずれか１つ記載の大腸がんの検査方法。
（９）他のがんマーカーががん胎児性抗原（ＣＥＡ）である（８）記載の検査方法。
（１０）細胞外小胞に含まれる表１記載の大腸がんのバイオマーカー。
（１１）前記バイオマーカーが、ＣＡＴ１及び／又はＧＣＣである（１０）記載の大腸がんを検出するバイオマーカー。
（１２）前記細胞外小胞は血液試料から得られるものである（１０）、又は（１１）記載の大腸がんのバイオマーカー。
（１３）患者から血液試料を採取し、表１記載のバイオマーカーを少なくとも１つ検出し、バイオマーカーの量を定量することによって、大腸がんを検出することを特徴とする大腸がんの診断方法。
（１４）前記バイオマーカーが、ＣＡＴ１及び／又はＧＣＣであることを特徴とする（１３）記載の大腸がんの診断方法。
（１５）前記バイオマーカーの検出が、質量分析、又は抗体によるものであることを特徴とする（１３）、又は（１４）記載の大腸がんの診断方法。
（１６）前記血液試料が血漿、又は血清であることを特徴とする（１３）～（１５）いずれか１つ記載の大腸がんの診断方法。
（１７）前記バイオマーカーとＣＥＡによる結果を併せて判断することを特徴とする（１３）～（１６）いずれか１つ記載の大腸がんの診断方法。
大腸がんマーカーの探索方法を模式的に示した図。 組織から滲出する細胞外小胞（ｔｉｓｓｕｅ－ｅｘｕｄａｔｉｖｅ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ、Ｔｅ－ＥＶｓ）と組織タンパク質のプロファイリングを示す。組織、及びＴｅ－ＥＶｓで同定されたタンパク質の数の内訳を示す図。 組織、及びＴｅ－ＥＶｓにおいて同定されたタンパク質について、組織、及びＴｅ－ＥＶｓにおける存在量を散布図として示した図。 がん部、非がん部（正常組織）Ｔｅ－ＥＶｓにおいて同定されたタンパク質の数の内訳を示す図。 同定されたＴｅ－ＥＶｓタンパク質の主成分解析の結果を示す図。 テトラスパニンファミリータンパク質であるＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ１５１の組織、及びＴｅ－ＥＶｓでの存在量を示す図。 Ｖａｃｕｏｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｏｒｔｉｎｇ（ＶＰＳ）ファミリータンパク質の組織、及びＴｅ－ＥＶｓでの存在量を示す図。 正常組織、がん部から得られたＴｅ－ＥＶｓに含まれるタンパク質の発現プロファイルをｖｏｌｃａｎｏ　ｐｌｏｔで示した図。 患者毎に、正常組織、がん部から得られたＴｅ－ＥＶｓのＨｉｇｈ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃａｔｉｏｎｉｃ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　１（ＣＡＴ１）の質量分析における信号強度を示した図。 患者毎に、正常組織（非がん部）、がん部のＣＡＴ１発現をウェスタンブロッティングにより解析した図。 透過型電子顕微鏡により、細胞外小胞におけるＣＡＴ１の存在を示した図。 免疫化学染色により、組織中のＣＡＴ１発現を解析した図。 免疫化学染色により、組織中のＣＡＴ１発現の強度を解析した図。 ＣＡＴ１の細胞外小胞における存在量をＥＬＩＳＡにより解析した図。 細胞外小胞におけるＣＡＴ１の存在量から、大腸がん検出感度、特異度をＲＯＣ曲線によって解析した図。 ＧＣＣの細胞外小胞における存在量を定量する解析方法を示した図。 患者血漿中の細胞外小胞におけるＧＣＣ量を定量した結果を示す図。
　本発明は細胞外小胞に含まれる新規大腸がんマーカーに関する。以下に開示するマーカーは、血液中に含まれる細胞外小胞を検査することにより大腸がんを検出できるので、低侵襲の検査方法となる。さらに、既存のがんマーカーであるＣＥＡと組み合わせて検査することによって、早期であってもより精度よく大腸がんを検出することが可能となる。
[細胞外小胞の単離方法]
　本願発明者のグループは、腎細胞がんにおいて、手術で切除したがん部（がん組織）、がん組織の周囲の正常組織（非がん部）を培養液中に静置し、がん組織、正常組織から細胞外小胞を分泌させ、これらを回収、解析することによって、腎細胞がんに特異的なマーカーを探索する方法、及びマーカーについて開示している（特許文献３、非特許文献２）。この方法を大腸がんに適用し、新規マーカーを見出した。最初に、マーカーの探索方法について説明する（図１）。
　手術により切除した大腸がんの部位、及びがん部周辺の正常部位から組織を得て、組織から滲出する細胞外小胞（ｔｉｓｓｕｅ－ｅｘｕｄａｔｉｖｅ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ、以下、Ｔｅ－ＥＶｓと記載する。）を以下のようにして単離精製した。
　手術により切除した１ｃｍ３程度の組織は、さらに数個の組織片に切断し、ＰＢＳで洗浄し、１．５ｍｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０に浸漬し、３７℃、５％ＣＯ２条件下、ローテーター上で３時間細胞外小胞を滲出させた。培養液は、３,０００×ｇ、３０分、次いで１２,０００×ｇ、３０分の遠心により、組織片や細胞片など大きな断片を除き、１００,０００×ｇ、１時間の遠心で細胞外小胞を単離した。単離した細胞外小胞は、１ｍｌ　ＰＢＳに懸濁し、１００,０００×ｇ、１時間の遠心による洗浄を行った（洗浄工程）。洗浄工程は２回繰り返し、細胞外小胞を単離、精製した。
[ＬＣ/ＭＳによる大腸がんマーカーの解析]
　Ｔｅ－ＥＶタンパク質１０μｇはＳＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ、２５ｍＭ　ｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（ＴＥＣＰ）中で、３７℃、３０分静置後、５０ｍＭヨードアセトアミド、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、室温、遮光条件下で４５分アルキル化処理を行った後、電気泳動を行った。分離ゲル中をタンパク質が２ｍｍほど移動した後、ＣＢＢ染色を行い、タンパク質のバンドを切り出し、脱色後、Ｔｒｙｐｓｉｎ/Ｌｙｓ-Ｃ　ＭｉＸ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。得られたペプチドは、質量分析により解析した。
　また、Ｔｅ－ＥＶｓを得た原組織からタンパク質を直接抽出し、同様にトリプシン消化、ＬＣ／ＭＳ解析を行い、得られたデータの検討に用いた。組織サンプルは、３ｍｍ３程度の組織を４００μｌのＰＴＳ緩衝液（２．５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、１２ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｏｌａｔｅ、１２ｍＭ　Ｎ－Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ）中でホモジナイズし、プローブソニケーターでソニケーションし、１５，０００ｇで１５分遠心後、上清をトリプシン消化、ＬＣ／ＭＳ解析を行った。原組織は、がん部、非がん部を合わせて解析に用いている。
　質量分析は０．０７５×１５０ｍｍのＣ１８　ｔｉｐ－ｃｏｌｕｍｎ（Ｎｉｋｋｙｏ　Ｔｅｃｈｎｏｓ）を備えたＵｌｔｉＭａｔｅ　３０００　ＲＬＳＣ　ｎａｎｏ－ｆｌｏｗ　ＨＰＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を接続したＯｒｂｉｔｒａｐ　Ｆｕｓｉｏｎ　Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって行った。分析条件は以下のとおりである。
　２５０　ｎｌ／ｍｉｎで０．１％ギ酸入りアセトニトリル濃度２～３５％　９５分間、３５～９５％　１５分間からなる２ステップグラジェントを使用してペプチドの分離を行った。ＨＰＬＣ溶出液を２ｋＶのスプレー電圧でイオン化し、３５０～１５００ｍ／ｚ範囲のスペクトルをフルＭＳイオンスキャンモードにより分解能６０，０００で解析した。ＣＩＤ　ＭＳ／ＭＳスキャンは、Ｄｙｎａｍｉｃ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ機能を有効にしたＤａｔａ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（ＤＤＡ）モードで取得した。
　タンパク質の同定は、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｎｅｎｔｉｆｉｃ）においてＳＥＱＵＥＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｎｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）検索エンジンで解析し、ペプチド同定閾値としてＦａｌｓｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｒａｔｅ　１％未満と設定した。タンパク質の定量には、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアを使用した。タンパク質定量値は各サンプル間で全タンパク質定量値の合計値が一定になるよう標準化した。
[Ｔｅ－ＥＶｓ、及び組織のプロテオーム解析]
　大腸がん部位、周辺の正常組織から滲出させて得たＴｅ－ＥＶｓ、及び切除した原組織のプロテオーム解析を行った。質量分析の結果、原組織から直接抽出した試料では、８３７０種のタンパク質が同定され、Ｔｅ－ＥＶｓからは６３０７種のタンパク質が同定された。両者に共通して認められたタンパク質は４９４２種、両者合わせて９７３５種のタンパク質が同定された（図２ａ）。
　Ｔｅ－ＥＶｓ、及び原組織で同定されたタンパク質の存在量を散布図とし解析を行った。Ｔｅ－ＥＶｓで存在が確認されたタンパク質、組織で存在が確認されたタンパク質の相関係数は、０．１８５であった（図２ｂ）。この結果は、組織で発現しているタンパク質と、細胞外小胞の中に内包されるタンパク質との間の相関が非常に低いことを示している。
　次に、がん部、がん部周辺の正常組織から得たＴｅ－ＥＶｓで同定されたタンパク質の結果を解析した。がん部、及び正常組織から得たＴｅ－ＥＶｓでは、合計６３０７種のタンパク質が同定された。内訳はがん部から得たＴｅ－ＥＶｓで同定されたタンパク質は６１６６種、正常組織から得たＴｅ－ＥＶｓで同定されたタンパク質は５８００種であり、両者に共通したタンパク質は５６５９種、がん部に特異的なタンパク質は５０７種、正常組織に特異的なタンパク質は１４１種であった。同定されたＴｅ－ＥＶｓタンパク質の主成分分析の結果から、発現プロファイルはがん部から得られたＴｅ－ＥＶｓと、正常組織から得られたＴｅ－ＥＶｓの２つの明らかに異なるグループに分類することが可能であった（図２ｄ）。
　膜タンパク質テトラスパニンファミリーに属するＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ１５１は細胞外小胞、特にエクソソームマーカーとして知られている。これらタンパク質の原組織由来のタンパク質量、Ｔｅ－ＥＶｓ由来のタンパク質量を比較定量した。その結果、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ１５１は有意にＴｅ－ＥＶｓに多量に存在していた（図２ｅ）。また、新たにＴｅ－ＥＶｓに多量に含まれているタンパク質としてＶａｃｕｏｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｏｒｔｉｎｇ（ＶＰＳ）ファミリータンパク質を同定した。ＶＰＳファミリータンパク質の存在量は、組織由来のタンパク質とＴｅ－ＥＶｓ由来のタンパク質で明らかに差が認められた（図２ｆ）。ＶＰＳファミリータンパク質は、エクソソームなどの細胞外小胞の新しいマーカーとして使用することができる。
　組織から直接得たタンパク質のプロファイリングとＴｅ－ＥＶｓのタンパク質のプロファイリングの結果（図２ｂ）は、各タンパク質の組織中での発現量と、細胞外小胞に含まれる量の相関関数も低いことを示している。また、テトラスパニンファミリー、ＶＰＳファミリータンパク質の量の違い（図２ｅ、２ｆ）などを鑑みると、細胞外小胞には選択的にタンパク質が移行しており、細胞外小胞に含まれるタンパク質の種類は限定されているものであると結論付けられる。したがって、細胞外小胞に含まれるタンパク質をバイオマーカーとする場合には、組織での発現ではなく、細胞外小胞に移行したタンパク質を解析する必要がある。
［大腸がんに特異的なマーカーの解析］
　Ｔｅ－ＥＶｓでの存在が確認されたタンパク質のうち、５３３２種のタンパクが正常組織から得たＴｅ－ＥＶｓ、がん部から得たＴｅ－ＥＶｓ両者で同定され、定量することができた。正常組織、がん部から得られた５３３２種のタンパク質量をｖｏｌｃａｎｏ　ｐｌｏｔとして表示した（図３ａ）。その結果、正常組織Ｔｅ－ＥＶｓと比較して、５４４種のタンパク質が有意に（ｐ＜０．０５）に、がん部Ｔｅ－ＥＶｓに多量に内包されていた。５４４種のタンパク質のうち、７４種のタンパク質がＵｎｉＰｌｏｔデータベースの解析から、膜タンパク質であり、細胞膜に局在し、バイオマーカーとして有用であることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に記載した７４種のタンパク質はいずれも膜タンパク質として細胞外小胞に表出していると考えられることから、ＥＬＩＳＡなど従来から臨床に用いられている方法によって、簡単に検出することができる。これら膜タンパク質のうち、大腸がんとの関連がすでに報告されている（非特許文献３、４）、Ｈｉｇｈ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃａｔｉｏｎｉｃ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　１（ＣＡＴ１、以下、ＣＡＴ１と記載する。）、及びＧｕａｎｙｌｙｌ　ｃｙｃｌａｓｅ　Ｃ（以下、ＧＣＣと記載する。表１中には、Ｈｅａｔ－ｓｔａｂｌｅ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒと記載。）を細胞外小胞において検出可能なバイオマーカーとして利用可能か検討を行った。
［ＣＡＴ１のバイオマーカーとしての利用可能性］
　手術によって得られた大腸がん切除サンプルから調製したＴｅ－ＥＶｓを用いてＣＡＴ１存在量を検討した。１０人の患者の手術サンプルから、がん部、正常組織Ｔｅ－ＥＶｓにおけるＣＡＴ１タンパク量の比較を行った（図３ｂ）。１０人の患者すべてにおいて、がん部から得たＴｅ－ＥＶｓのＣＡＴ１の存在量の方が有意に高かった（ｐ＝５．０×１０－３、ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ＝６．２）。
　さらに、組織中に含まれるＣＡＴ１の量をウェスタンブロッティングにより解析した。正常組織（Ｎ、非がん部）、がん部（Ｔ）に含まれるＣＡＴ１タンパク質は、がん部で明らかに発現が高かった（図３ｃ）。ＣＤ９の発現量で正規化し、ＣＡＴ１の発現量を定量したところ、ＣＡＴ１のがん部での発現量は、正常組織と比較して、有意に（ｐ＝０．０２５）高発現であることが認められた（図３ｃ、右グラフ）。
　次に、ＣＡＴ１が細胞外小胞の表面に表出しているか解析を行った。正常組織、がん部から得られたＴｅ－ＥＶｓを常法により固定し、ＣＡＴ１抗体（ウサギポリクローナル抗体）と反応させ、４０ｎｍ金粒子で標識された抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として使用し、透過電子顕微鏡観察を行った（図３ｄ）。その結果、がん部から得られたＴｅ－ＥＶｓの膜表面に抗ＣＡＴ１抗体の結合を確認することができた。なお、ＣＡＴ１抗体は、ウサギにＣＡＴ１の１４５～１６０位のペプチドを免疫して作製した。
　次に、組織染色によってＣＡＴ１が検出可能か検討を行った（図３ｅ、ｆ）。免疫化学染色は、パラフィン切片を抗ＣＡＴ１抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）、及び抗ＣＤ３１抗体（ＤＡＫＯ）を一次抗体として、ＢＯＮＤ－ＩＩＩ全自動ＩＨＣ染色装置（Ｌｅｉｃａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行われた。ＣＡＴ１の発現は、周囲の正常組織と比較して、明らかにがん部で高い発現が見られた。図３ｅに示すように、染色強度を０～＋２まで分類し、ステージＩ～ＩＶまでに分類された大腸がん患者のがん部を免疫組織染色を行い解析した（図３ｆ）。その結果、周辺正常部（Ｎ）と比較して、がん部で明らかに染色強度が高いことが認められた。
　大腸がんは早期発見が重要である。血漿中の細胞外小胞に内包されるＣＡＴ１量によって、がんを検査することができれば、早期発見につながる可能性が高い。また、臨床現場では、がんの検査などでＥＬＩＳＡが多用されている。そこで、２５名の健常者、ステージＩ～ＩＶの大腸がん患者（ステージI：２３名、ＩＩ：２５名、ＩＩＩ：２５名、ＩＶ：２１名）の血漿中の細胞外小胞におけるＣＡＴ１量を、サンドイッチＥＬＩＳＡによって解析を行った（図４ａ）。ＥＬＩＳＡは基板に上述のウサギに免疫して得られた抗ＣＡＴ１抗体を固定し、細胞外小胞と反応させた。検出は、ビオチン標識キット（Ｂｉｏｔｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２、ＤＯＪＩＮＤＯ）によりビオチン標識した抗ＣＤ８１抗体（ＣＯＳＭＯ　ＢＩＯ）、次にストレプトアビジンｐｏｌｙ－ＨＲＰ４０（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）を反応させ、１－Ｓｔｅｐ　Ｕｌｔｒａ　ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発色させ、プレートリーダーで測定を行った。その結果、すべてのステージの大腸がん患者で、健常者に対するＣＡＴ１発現量に有意な差が認められた（ステージＩ:ｐ＝２．０×１０－６、 ＩＩ：６．４×１０－６、ＩＩＩ：１．４×１０－７、ＩＶ：１．４×１０－３）。
　細胞外小胞のＣＡＴ１量のＥＬＩＳＡによる測定結果をＲＯＣ曲線により解析した。ＣＡＴ１のカットオフ値を０．０１５（μg／μｌ）と設定すると、感度４８．１％、特異度９２％であった。既存のマーカーとして用いられているがん胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｉｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）と比較すると、感度はＣＥＡが３１．５％であるのに対し、ＣＡＴ１では４８．１％とより高い値を示した（図４ｂ）。また、ａｒｅａ　ｕｎｄｅｒ　ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）はＣＡＴ１では０．７７４、ＣＥＡでは０．７７０であったが、ＣＡＴ１、ＣＥＡを組み合わせて用いるとＡＵＣは０．８７４とより高い値を示した。
　以上の結果から、ＣＡＴ１は血漿中の細胞外小胞表面に表出しており、ＥＬＩＳＡで測定可能であることから、大腸がんのマーカーとして有用であることが示された。また、早期の大腸がんでも測定可能であり、既存のマーカーと組み合わせることによって、より感度よく大腸がんを検出することができる。
［ＧＣＣのバイオマーカーとしての利用可能性］
　次に、ＧＣＣについて解析を行った。血漿中のエクソソーム上のＧＣＣを定量するためのサンドイッチＥＬＩＳＡの系を構築した（図５ａ左）。エクソソーム上のＧＣＣを選択的に検出するために、捕捉抗体として抗ＧＣＣ抗体を用い、検出抗体としてエクソソームマーカーである抗ＣＤ８１抗体を用いた。抗ＧＣＣ抗体（Ａｔｌａｓ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）を固相化し、ＧＣＣタンパク質を結合させ、ビオチン標識抗ＣＤ８１抗体（コスモバイオ社）を結合させ、ストレプトアビジンｐｏｌｙ－ＨＲＰ４０（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）を反応させ、１－Ｓｔｅｐ　Ｕｌｔｒａ　ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発色させ、プレートリーダーで測定を行った。
　定量的な解析が可能であることは、ＣＤ８１フラグメント（３６－５４位）とＧＣＣフラグメント（１７４－１８９位）が融合したＧＳＴタンパク質を作製し、確認を行った。ＧＣＣ－ＣＤ８１融合体タンパク質を用いて、構築した系によりＥＬＩＳＡを行い、標準曲線とした（図５ａ右）。感度良くＧＣＣを定量できる系が構築されている。
　健常者７２名、大腸がん患者２８５名（ステージＩ：７２名、ステージＩＩ：７０名、ステージＩＩＩ：７２名、ステージＩＶ：７１名）の血漿サンプル中のＧＣＣ量を測定した（図５ｂ）。その結果、健常者と全大腸がん患者間で有意にＧＣＣ量に差が認められただけではなく、ステージ毎の比較においても、ステージＩ、ＩＩ、ＩＶで有意にＧＣＣ発現量に差が認められた。以上の結果から、ＧＣＣも大腸がんを検出するエクソソーム上のマーカーとして有用であることが示された。
　ここでは、ＣＡＴ１及びＧＣＣを例に示したが、表１に記載した７４種の膜タンパク質はいずれも大腸がん患者のがん部より抽出したＴｅ－ＥＶに特異的に発現が認められるタンパク質である。したがって、表１のいずれのタンパク質もここで例示した方法、あるいは通常用いられている方法により細胞外小胞上に表出しているタンパク質として検出することにより、感度良く大腸がんを検査することができる。また、ここでは血漿を用いた検出例を示したが、血清を用いることができることは自明である。
　また、表１に記載したマーカーを複数用いたり、ＣＥＡなど周知のマーカーと併せて使用することにより、より感度、特異度の高い大腸がんのマーカーとすることができる。上記実施例で示したように、血液試料を使用する低侵襲な方法であり、早期に大腸がんを発見することが可能であることから、非常に有用な検査方法である。

Claims (12)

  1. 　表１記載のバイオマーカーを少なくとも１つ検出することを特徴とする大腸がんの検査方法。
  2. 　前記バイオマーカーの検出は、
    　血液試料中の細胞外小胞に含まれる量を検出するものである請求項１記載の大腸がんの検査方法。
  3. 　前記血液試料が血漿、又は血清であることを特徴とする請求項２記載の大腸がんの検査方法。
  4. 　前記バイオマーカーの検出は、質量分析によって行う請求項１～３いずれか１項記載の大腸がんの検査方法。
  5. 　前記バイオマーカーの検出は、抗体を用いて行う請求項１～３いずれか１項記載の大腸がんの検査方法。
  6. 　前記バイオマーカーの検出は、組織染色、又はＥＬＩＳＡによって行う請求項５記載の大腸がんの検査方法。
  7. 　前記バイオマーカーが、
    　Ｈｉｇｈ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃａｔｉｏｎｉｃ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　１（ＣＡＴ１）及び／又はＧｕａｎｙｌｙｌ　ｃｙｃｌａｓｅ　Ｃ（ＧＣＣ）であることを特徴とする請求項１～６いずれか１項記載の大腸がんの検査方法。
  8. 　前記バイオマーカーの検出と他のがんマーカーの検出結果を併せて判定することを特徴とする請求項１～７いずれか１項記載の大腸がんの検査方法。
  9. 　他のがんマーカーががん胎児性抗原（ＣＥＡ）である請求項８記載の検査方法。
  10. 　細胞外小胞に含まれる表１記載の大腸がんのバイオマーカー。
  11. 　前記バイオマーカーが、
    　ＣＡＴ１及び／又はＧＣＣである請求項１０記載の大腸がんを検出するバイオマーカー。
  12. 　前記細胞外小胞は血液試料から得られるものである請求項１０、又は１１記載の大腸がんのバイオマーカー。
     
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