KR101834993B1 - 환자가 병원감염에 걸릴 가능성을 결정하고 패혈 증후군 진행의 예후를 결정하는 방법 - Google Patents

환자가 병원감염에 걸릴 가능성을 결정하고 패혈 증후군 진행의 예후를 결정하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환자가 병원감염에 걸릴 가능성을 결정하는 방법, 및 환자에게서 패혈 증후군 진행의 예후를 결정하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기 단계에 따른다: a) 환자에게서 수득된 생물학적 샘플로부터 생물학적 물질이 추출되는 단계; b) 표적 유전자 S100A9 및 S100A8로부터 선택된 하나 이상의 표적 유전자의 발현체로부터 하나 이상의 특이시약이 수득되는 단계; c) 하나 이상의 표적 유전자 S100A9 및 S100A8의 발현이 결정되는 단계, 여기서 미리 결정된 역치 값에 대해 상대적으로 과발현은 병원감염에 걸릴 가능성을 지칭할 뿐만 아니라 패혈 증후군 진행의 나쁜 예후를 지칭하는 것임.

Description

환자가 병원감염에 걸릴 가능성을 결정하고 패혈 증후군 진행의 예후를 결정하는 방법{METHODS FOR DETERMINING THE LIKELIHOOD OF A PATIENT CONTRACTING A NOSOCOMIAL INFECTION AND FOR DETERMINING THE PROGNOSIS OF THE COURSE OF A SEPTIC SYNDROME}
본 발명은 환자가 병원감염에 걸릴 민감성을 결정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 환자의 패혈성 쇼크의 진행을 예후하는 방법에 관한 것이다.
병원감염은 실제 공중위생의 문제로서 여겨진다. 프랑스에서 매년 병원감염에 걸리는 환자의 수는 500000 내지 800000 명으로 추산된다. 병원감염의 발생은 사용되는 의료기술과 같은 다양한 인자들과 연관될 뿐만 아니라, 병원감염에 걸릴 환자의 민감성과도 연관된다. 따라서, 면역결핍된 환자, 영양실조에 걸린 사람, 신생아, 노인, 패혈 증후군에 걸린 사람, 광범위한 화상을 입은 환자 및 정신적 외상을 입은 사람은 다른 사람들에 비해 병원감염에 더 잘 걸릴 수 있다.
감염에 대한 전신성 반응인 패혈 증후군은 중환자실에서 사망의 주요한 원인 중 하나이다. 이는 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염으로부터 야기될 수 있다. 패혈 증후군은 그의 중증도에 따라 분류될 수 있다. 중증도의 증가 순서에 따라 하기와 같이 구분된다: SIRS(전신성 염증 반응 증후군), 패혈증, 중증 패혈증 및 패혈성 쇼크. 따라서, 2001년에 전문가 집단은 상기 4개의 임상 증후군[1]을 정의하기 위한 기준을 제안하였다:
- SIRS는 다양한 감염성 원인 또는 비감염성 원인에 의해 유발되는 전신성 염증 반응이다. 비감염성 원인에 의해 유발되는 SIRS 상태 중에서, 트라우마 상태, 화상, 췌장염 및 급성 호흡기 증후군이 언급될 수 있다. 하기 징후의 둘 이상을 나타내는 전신성 염증 반응: a) 38℃보다 높거나 36℃보다 낮은 온도; b) 분당 90회의 심장박동보다 높은 심박수; c) 분당 20회의 호흡보다 높은 호흡수; d) 12000/mm3 보다 높거나 4000/mm3보다 낮은 백혈구,
- 패혈증은 감염과 관련된 전신성 염증 반응의 증후군이다.
- 중증 패혈증은 하나 이상의 기관의 동맥 저혈압 및/또는 관류저하 및/또는 기능장애와 연관된 패혈증이다.
- 패혈성 쇼크는 지속성 저혈압과 연관된 중증 패혈증이며, 이는 하기에 의해 특징지어질 수 있다:
- 식별된 전염 부위의 존재,
- 승압제에 의한 적절한 처치 및 충전에도 불구한 지속성 저혈압.
일반적으로, 패혈증의 징후, 중증 패혈증의 징후 및 패혈성 쇼크의 징후는 매우 유사하며, 상기 3개의 상태 사이의 차이점은 주로 모든 생체기능의 장애 수준에 있다. 패혈성 쇼크 동안, 주로 혈압 저하, 심박급속, 호흡과다, 피부의 상강현상(marbling), 저체온증 또는 고체온증, 몸의 떨림이 관찰된다. 또한, 이러한 징후들에는, 감염의 주목되는 부분(신장, 폐, 중추신경계, 소화계 및 혈액 응고계)과는 다른 기관들의 기능 저하와 함께 "표적(target)" 기관의 기능 장애가 수반되며, 이는 요량 감소증(<0.5　ml/kg/h), 신부전, 저산소혈증, 혈소판감소증, 불안 및 혼란에 반영된다.
또한, 패혈 증후군을 앓는 환자는 병원감염, 즉 의료 시설 내 체류와 연관된 감염에 대해 거의 예민하다. 이러한 예민성은 상기 환자의 생존과 우수한 회복에 상당한 영향을 미친다.
패혈증 단계에서 중증 패혈증 단계로, 이어서 패혈성 쇼크 단계로 이어지는 패혈 증후군의 진행은 전신성이 아니며, 그 이유는 패혈증 환자의 약 64%에서 중증 패혈증이 발달되며, 중증 패혈증 환자의 23%에서 패혈성 쇼크로 진행되기 때문이다. 이러한 패혈성 쇼크의 마지막 단계 이전에, 환자가 생리병리학적 과정을 멈추고 역전시키기 위해 처치가 처방되어야 한다. 따라서, 충분한 혈류역학적 상태가 회복되어야 하고, 효과적인 통풍이 제공되어야 한다. 또한, 가능한한 세균학적 데이터에 기초한 항생 치료와 쇼크의 대증요법이 동시에 수행되어야 한다.
비록 패혈 증후군, 특히 패혈성 쇼크가 진행된 일부 환자들이 표준관리, 예컨대 감염원을 나타내는 세균학적 분석 결과를 수득하기 전에 시행되는 광범위 항생제 치료에 의해 소생될 수 있을지라도, 훨씬 더 중증의 패혈 증후군이 진행된 다른 환자들은 활성화된 단백질 C와 같은 집중치료를 수행하는 것이 필요한 것으로 여겨진다. 매우 높은 비용은 별문제로 하더라도, 이러한 종류의 치료는 환자를 원하지 않는 심각한 효과(응고 장애 등)의 위험에 노출시킨다.
따라서, 상기 치료에 의해 이득을 볼 것 같은 환자를 효과적으로 표적으로 삼는 것은 매우 중요하다. 이에 따라, 전신성 염증 반응의 병인에 대한 지식, 및 전신성 염증 반응을 나타내는 환자의 병원감염에 대한 민감성의 결정은, 환자에게 적합한 치료를 제안하기 위해 필수적이다. 환자에게 중요한 또다른 인자는 가능한한 빨리 패혈성 쇼크의 진행을 예후할 수 있는 것이다.
오늘에 이르기까지, 병원감염의 진행에 대한 환자의 민감성, 특히 감염과 연관되는지에 관계없이 전신성 염증 반응을 나타내는 환자의 민감성을 결정하기 위한 테스트는 수행되지 않았다. 놀랍게도, 본 발명자는 유전자 S100A9 및/또는 S100A8의 발현을 분석하는 것이 상기 민감성의 결정에 특히 적합하다는 점, 또한 패혈성 쇼크의 진행을 예후하는데 적합하다는 점을 입증하였다.
본 발명에 대해 더 기재하기에 앞서, 하기의 정의들이 본 발명의 이해를 돕기 위해 주어진다.
패혈 증후군은 감염에 대한 전신성 반응(systemic response)을 의미한다. 이러한 패혈 증후군은 SIRS 단계, 패혈증 단계, 중증 패혈증 단계 또는 패혈성 쇼크 단계에 있을 수 있다. 바람직하게는, 패혈 증후군은 패혈성 쇼크이다.
병원감염은 환자가 의료 시설에 입장할 때 존재하지 않았으며 입장한지 48시간 후에 상기 의료 시설에서 걸린 임의의 감염을 의미한다.
표적 유전자라는 용어는 S100A9 유전자 및 S100A8 유전자, 특히 GenBank에서 접근번호 NM_002965.3의 S100A9 유전자 및 GenBank에서 접근번호 NM_002964.3의 S100A8 유전자를 의미한다.
S100A9 유전자 및 S100A8 유전자의 발현 산물은 메신저 RNA 또는 mRNA의 단편, cDNA 또는 cDNA의 단편, 단백질 또는 단백질 단편을 의미한다.
생물학적 샘플은 환자에게서 수득된 임의의 물질을 의미하며, 여기에는 유전자의 발현을 검출할 수 있게 하는 생물학적 물질이 포함될 수 있다. 특히, 이는 환자의 혈액, 혈청, 타액 또는 조직 또는 순환성 세포의 샘플일 수 있다. 상기 생물학적 샘플은 당업계의 통상의 기술자에게 알려진 샘플, 예컨대 특히 혈액 샘플을 채취하는 임의의 수단에 의해 수득된다.
생물학적 물질은 유전자, 예컨대 특히 핵산 또는 단백질, 또는 이의 코딩 서열의 발현을 검출할 수 있게 하는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 핵산은 RNA(리보핵산), 예컨대 mRNA(메신저 RNA)일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 생물학적 물질은 핵산이며, 더욱더 바람직하게는 mRNA이다.
생물학적 샘플로부터 생물학적 물질의 추출은 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 핵산의 추출 또는 단백질의 추출을 위한 모든 프로토콜에 의해 수행될 수 있다.
참고로, 핵산은 특히 하기에 의해 추출될 수 있다:
- (이후의 반응을 방해하는 세포 잔해로서) 미생물의 단백질 및/또는 지방 엔벨로프에 포함된 핵산을 유리시키기 위하여, 생물학적 샘플에 존재하는 세포를 용균시키는 단계. 일례로서, 하기의 특허출원에 기재된 용균 방법을 사용할 수 있다:
- 혼합된 자기적 및 기계적 용균과 관련하여 WO-A-00/05338,
- 전기적 용균과 관련하여 WO-A-99/53304, 및
- 기계적 용균과 관련하여 WO-A-99/15321.
당업계의 통상의 기술자라면, 공지된 다른 용균 방법들, 예컨대 열적 또는 삼투압적 쇼크 또는 구아니디움 염과 같은 카오트로픽제에 의한 화학적 용균(US-A-5,234,809)을 사용할 수 있다.
- 용균 단계에서 염석된(salted-out) 다른 세포 구성성분으로부터 핵산을 분리할 수 있게 하는 정제 단계. 이러한 단계는 일반적으로 핵산을 농축시킬 수 있게 한다. 일례로서, 흡착 또는 공유(특허 US-A-4,672,040 및 US-A-5,750,338 참조)에 의해 임의적으로 올리고뉴클레오티드로 코팅된 자기 입자를 사용하고, 이에 따라 세척 단계에 의해 상기 자기 입자에 부착된 핵산을 정제할 수 있다. 이러한 핵산의 정제 단계는 상기 핵산의 증폭이 이어서 필요한 경우에 특히 유리하다. 상기 자기 입자의 특히 흥미로운 구현예는 특허출원 WO-A-97/45202 및 WO-A-99/35500에 기재되어 있다. 핵산의 정제 방법의 또다른 흥미로운 예는 컬럼 형태의 실리카 또는 불활성 입자[2] 또는 자기 입자(Merck: MagPrep□ Silica, Promega: MagneSil™ Paramagnetic particles) 형태의 실리카의 사용이다. 널리 사용되는 또다른 방법들은 컬럼 내 이온교환수지 또는 상자성 미립자 형태(Whatman: DEAE-Magarose)에 기초한다(Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344). 본 발명과 매우 관련되지만 제한적이지 않은 또다른 방법에는, 금속산화물 지지체(Xtrana 회사 제조: Xtra-Bind™ 매트릭스)에 대한 흡착의 방법이 있다. 이러한 추출 단계는 자동화 장치에서 수행될 수 있다. easyMAG® 자동화 장치가 특히 적합하다.
특이시약(specific reagent)은 표적 유전자의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 증명하기 위하여 생물학적 물질과 반응하는 시약을 의미하며, 상기 발현은 표적 유전자로부터 생성된 mRNA의 분석에 의해 결정되거나, 또는 표적 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 분석에 의해 결정될 수 있다.
참고로, 표적 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 분석에 의해 표적 유전자의 발현을 결정하고자 하는 경우, 상기 특이시약에는 상기 표적 유전자에 의해 인코딩된 단백질에 대해 특이적인 하나 이상의 항체가 포함된다.
참고로, 표적 유전자로부터 출발하여 전사된 mRNA의 분석에 의해 표적 유전자의 발현을 결정하고자 하는 경우, 상기 특이시약에는 상기 mRNA의 상보적 DNA에 대해 특이적인 하나 이상의 증폭 프라이머(이는 표적 유전자에 대해 특이적인 증폭 프라이머로 지칭됨)가 포함된다. mRNA에 대해 상보적인 DNA는 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 프로토콜에 따라 수득될 수 있다. 참고로, 전체 RNA(리보솜 RNA, 전달 RNA, mRNA를 포함함)는 생물학적 샘플로부터 추출된다. 이어서, 역전사의 반응은 역전사 효소에 의해 수행되며, 이는 RNA 단편으로부터 DNA의 상보적 단편(cDNA)을 수득할 수 있게 한다. 상기 단계의 수행은 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 특히 메신저 RNA에 상보적인 DNA만 수득하고자 하는 경우, 이러한 효소적 단계는 티민 염기만 포함하는 뉴클레오티드 단편(polyT)의 존재하에서 수행되며, 이는 다양한 mRNA의 polyA 서열에 대한 상보성에 의해 하이브리드화되어 polyT-polyA 복합체를 형성하고, 이어서 역전사 효소에 의해 수행되는 역전사 작용을 위한 개시점으로서 주어진다. 그 후, 생물학적 샘플에 초기에 존재하는 다양한 메신저 RNA에 대해 상보적인 다양한 DNA가 수득된다. 하기에서, cDNA는 메신저 RNA에 대해 상보적인 DNA를 나타낸다.
증폭 프라이머는 5 내지 100개의 뉴클레오티드 단위, 바람직하게는 15 내지 25개의 뉴클레오티드 단위를 가지며, 효소적 증폭 반응에서와 같은 효소적 중합의 개시를 위한 특정 조건에서 하이브리드화의 특이성을 보유한 뉴클레오티드 단편을 의미한다.
효소적 증폭 반응은 하나 이상의 효소가 작용함으로써 특이적 증폭 프라이머에 의해 표적 뉴클레오티드 단편의 다수의 복제물을 생성하는 과정을 의미한다. 이러한 증폭 반응은 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 특히 하기의 기법들이 언급될 수 있다: PCR(폴리머라제 연쇄 반응), LCR(리가제 연쇄 반응), RCR(복구 연쇄 반응), 특허출원 WO-A-90/06995의 3SR(자가 유지 서열 복제), NASBA(핵산 서열-기재 증폭), 및 특허 US-A-5,399,491의 TMA(전사 매개 증폭).
앰플리콘(amplicon)이라는 용어는 효소적 증폭 기법에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 바람직하게는, 효소적 증폭이 PCR인 경우, 특이시약에는 표적 유전자로부터 생성된 mRNA에 대해 상보적인 DNA의 특정 영역을 증폭하기 위하여 둘 이상의 특이적 증폭 프라이머가 포함된다. 효소적 증폭이 역전사 반응 이후에 수행되는 PCR인 경우, 이는 RT-PCR로 지칭된다.
하이브리드화 프로브는 5 내지 100개의 뉴클레오티드 단위, 특히 6 내지 35개의 뉴클레오티드 단위를 포함하며, 표적 뉴클레오티드 단편과 하이브리드 복합체를 형성하는 특정 조건에서 하이브리드화의 특이성을 보유한 뉴클레오티드 단편을 의미한다. 본 발명에서, 상기 표적 뉴클레오티드 단편은 메신저 RNA에 포함된 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 메신저 RNA의 역전사에 의해 수득된 상보적 DNA에 포함된 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
하이브리드화는 적절한 조건에서, 예컨대 하이브리드화 프로브 및 표적 뉴클레오티드 단편과 같이 충분히 상보적인 서열을 갖는 2개의 뉴클레오티드 단편이 안정하고 특이적인 수소 결합에 의해 이중 가닥을 형성할 수 있는 동안의 과정을 의미한다. 폴리뉴클레오티드에 "하이브리드화될 수 있는" 뉴클레오티드 단편은, 각 경우에 공지된 방식에서 결정될 수 있는 하이브리드화의 조건에서 상기 폴리뉴클레오티드에 하이브리화될 수 있는 단편이다. 하이브리드화의 조건은 엄격도(stringency), 즉 작동 조건의 엄격에 의해 결정된다. 엄격도가 증가하면서 수행되는 상황에서, 하이브리드화는 점점 더 특이적이 된다. 엄격도는 특히 프로브/표적 듀플렉스(duplex)의 염기 조성물의 작용으로서 정의되며, 2개의 핵산 사이의 미스매치 정도에 의해서도 정의된다. 또한, 엄격도는 반응 파라미터, 예컨대 하이브리드화 용액에 존재하는 이온 종의 농도와 유형, 변성제의 성질 및 농도 및/또는 하이브리드화 온도의 작용일 수 있다. 하이브리드화 반응이 수행되어야 하는 조건의 엄격도는 사용되는 하이브리드화 프로브에 주로 의존할 것이다. 이러한 모든 데이터들은 잘 알려져 있으며, 당업계의 통상의 기술자라면 적합한 조건을 결정할 수 있다. 일반적으로, 사용되는 하이브리드화 프로브의 길이에 따라, 하이브리드화 반응을 위한 온도는 약 0.5 내지 1 M 농도의 염류용액에서 약 20 내지 70℃, 특히 35 내지 65℃이다. 그 후, 하이브리드화 반응의 검출 단계가 수행된다.
검출은 물리적인 방법에 의한 직접적인 검출, 또는 마커에 의한 검출 방법을 의미한다. 핵산[4, 5]을 검출하기 위한 다수의 방법들이 존재한다.
마커는 신호를 생성할 수 있는 추적자를 의미한다. 이러한 추적자의 비제한적인 예에는, 예컨대 호스래디쉬 페록시다제, 알칼리 포스파타제, 베타갈락토시다제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제와 같은 비색법, 형광 또는 발광에 의해 검출될 수 있는 신호를 생성하는 효소; 발색단, 예컨대 형광, 발광 또는 착색 화합물; 전자현미경에 의해 또는 전도성과 같은 전기적 성질로부터, 전류법 또는 전압전류법에 의해, 또는 임피던스의 측정에 의해 검출될 수 있는 전자밀도 군; 회절, 표면 플라스몬 공명, 접촉각 변화와 같은 광학적 방법에 의해, 또는 원자력 분광법, 터널 효과와 같은 물리적 방법 등에 의해 검출될 수 있는 군; 방사성 분자, 예컨대 32P, 35S 또는 125I가 포함된다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 효소적 증폭 단계 동안 표지될 수 있으며, 예컨대 증폭 반응에 대해 표지된 트리포스페이트 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 표지된 뉴클레오티드는 PCR과 같이 DNA를 생성하는 증폭 시스템에서 데옥시리보뉴클레오티드이거나, 또는 TMA 또는 NASBA 기법과 같은 RNA를 생성하는 증폭 기법에서 리보뉴클레오티드일 것이다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 증폭 단계 이후에 표지될 수 있으며, 예컨대 공보 WO-A-91/19812에 기재되어 있는 샌드위치 하이브리드화 기법에 따라 표지된 프로브를 하이브리드화시킴으로써 표지될 수 있다.
본 발명에서, 하이브리드화 프로브는 소위 캡쳐(capture) 프로브일 수 있다. 이 경우, 표적 뉴클레오티드 단편은 마커에 의해 미리 표지될 수 있다. 소위 캡쳐 프로브는 임의의 적합한 수단에 의해, 예컨대 공유 또는 흡착에 의해 직접적으로 또는 간접적으로, 고체 지지체상에 고정화되거나 고정화가 가능해질 수 있다. 그 후, 하이브리드화 반응은 상기 검출 프로브와 표지된 표적 뉴클레오티드 단편 사이에서 수행된다.
또한, 하이브리드화 프로브는 소위 검출(detection) 프로브일 수 있다. 이 경우, 하이브리드화 프로브는 마커에 의해 표지될 수 있다. 그 후, 하이브리드화 반응은 상기 캡쳐 프로브와 표지된 표적 뉴클레오티드 단편 사이에서 수행된다.
소위 캡쳐 프로브가 사용되는지 또는 소위 검출 프로브가 사용되는지에 관계없이, 하이브리드화 반응은 고체 지지체상에서 수행될 수 있으며, 상기 고체 지지체에는 핵산이 고정화될 수 있는 모든 물질들이 포함된다. 임의적으로 화학변형된 합성 물질 또는 천연 물질이 고체 지지체로서 사용될 수 있으며, 특히 폴리사카라이드, 예컨대 셀룰로스 기재 물질, 예컨대 종이, 셀룰로스 아세테이트 및 니트로셀룰로스와 같은 셀룰로스 유도체, 또는 덱스트란, 폴리머, 코폴리머, 특히 스티렌 유형의 모노머 기재 물질, 목화와 같은 천연섬유, 및 나일론과 같은 합성섬유; 미네랄 물질, 예컨대 실리카, 석영, 유리, 세라믹; 라텍스; 자기 입자; 금속 유도체, 겔 등이 사용될 수 있다. 상기 고체 지지체는 마이크로적정 플레이트, 특허출원 WO-A-94/12670에 기재되어 있는 막, 입자 또는 바이오칩의 형태일 수 있다.
본 발명에서, S100A9 유전자 및 S100A8 유전자의 발현의 결정은 주어진 시간 동안 전사된 mRNA의 발현에 의해 분석될 수 있다. 이 경우, 생물학적 물질은 핵산이며, 특이시약은 전술한 임의의 증폭 프라이머 또는 하이브리드화 프로브일 수 있다.
표적 유전자의 발현은 하기와 같이 결정될 수 있다:
1) 생물학적 샘플로부터 전체 RNA를 추출한 후에, 생물학적 샘플에 초기에 존재하는 다양한 메신저 RNA에 대해 상보적인 다양한 DNA(또는 cDNA)를 수득하기 위하여, 역전사 단계가 전술한 바와 같이 수행된다.
2) 상기 cDNA는 특이적으로 증폭된다. 이 경우, 사용되는 특이시약에는 전술한 바와 같이 표적 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 증폭 프라이머가 포함된다. 이러한 단계는 특히 PCR 유형의 증폭 반응에 의해 또는 임의의 다른 적절한 증폭 기법에 의해 수행될 수 있다.
3) 상기 표적 유전자의 발현은 cDNA를 정량화함으로써 결정된다. cDNA는 특히 포화시까지 수행된 증폭 반응으로부터 수득된 정량화 범위를 사용함으로써 정량화될 수 있다. 다양한 단계들(역전사, PCR 등) 동안 관찰될 수 있는 효소 효능의 가변성을 고려하기 위하여, 다른 그룹의 환자에게서 발현이 유사한 소위 하우스키핑 유전자의 발현을 동시에 결정함으로써, 다른 그룹의 환자의 표적 유전자의 발현은 표준화될 수 있다. 표적 유전자의 발현 대 하우스키핑 유전자의 발현의 비를 확인함으로써, 다른 실험들 사이의 임의의 가변성은 이에 따라 보정된다. 특히, 당업계의 통상의 기술자라면 하기의 공보를 참조할 수 있다[6,7].
또한, 표적 유전자의 발현은 하기와 같이 결정될 수 있다:
1) 생물학적 샘플로부터 전체 RNA를 추출한 후에, 생물학적 샘플에 초기에 존재하는 다양한 메신저 RNA에 대해 상보적인 다양한 DNA(또는 cDNA)를 수득하기 위하여, 역전사 단계가 전술한 바와 같이 수행된다.
2) 상기 cDNA가 막에 고정화된다.
3) 표적 유전자에 대해 특이적인 미리 표지된 하이브리드화 프로브에 cDNA를 하이브리드화시킴으로써, 표적 유전자의 발현을 결정한다. 이러한 하이브리드화 기법은 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 특히 노던 블롯팅이 언급될 수 있다. 상기 하이브리드화 반응은, 특히 표적 유전자가 약하게 발현되는 경우, 표적 유전자의 메신저 RNA에 대해 상보적인 DNA를 특이적으로 증폭시키는 단계 이후에 수행될 수 있다.
또한, 표적 유전자의 발현은 표적 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 발현에 의해 분석될 수 있다. 이 경우, 생물학적 물질은 단백질이며, 리간드를 포함하거나 포함하지 않은 여러개의 검출 기법이 사용될 수 있다. 질량 분석법이 리간드를 포함하지 않는 검출 기법으로서 사용될 수 있다. 특이시약은 리간드를 포함하는 검출 시스템에 대해 표적 유전자에 의해 인코딩된 단백질에 특이적인 항체일 수 있다.
표적 유전자에 의해 번역된 단백질에 특이적인 재조합 항체는 당업계의 통상의 기술자에게 알려진 통상의 방법에 따라 원핵 유기체, 예컨대 박테리아로부터, 또는 진핵 유기체, 예컨대 효모, 포유류, 식물, 곤충, 동물의 세포로부터, 또는 세포외 생성 시스템에 의해 수득될 수 있다.
모노클로날 항체는 당업계의 통상의 기술자에게 알려진 통상의 기법, 예컨대 하이브리도마 기법(이의 일반 원리는 하기에 기재됨)에 따라 제조될 수 있다. 먼저, 동물, 일반적으로 마우스(또는 시험관내 면역의 범위 내에서 배양한 세포)는 관심대상인 표적 항원에 의해 면역화되고, 이의 B 림프구는 이어서 상기 항원에 대한 항체를 생성할 수 있다. 그 후, 상기 항체-생성 림프구는 "불멸의(immortal)" 골수 세포(예를 들어, 뮤린)와 융합되어, 하이브리도마를 생성한다. 이에 따라 수득된 세포들의 불균일한 혼합물로부터, 특정 항체를 생성할 수 있고 무한정으로 증가시킬 수 있는 세포가 이어서 선택된다. 각 하이브리도마는 클론의 형태로 증가되며, 각각은 모노클로날 항체를 생성시키며, 상기 항체의 관심대상인 항원과 관련된 인식의 성질은 예컨대 ELISA에 의해, 1개 또는 2개 차원의 면역전달(immunotransfer)에 의해, 면역형광법에 의해, 또는 바이오센서에 의해 테스트될 수 있다. 이에 따라 선택된 모노클로날 항체는 이어서 정제되며, 특히 친화성 크로마토그래피가 사용된다.
항체 단편은 예컨대 단백질분해에 의해 수득될 수 있다. 따라서, 이는 효소적 소화에 의해 수득될 수 있으며, Fab 유형의 단편(파파인[8]에 의한 처치) 또는 F(ab)'2 유형의 단편(펩신[9]에 의한 처치)를 야기한다. 또한, 이는 재조합 방법[10]에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 목적에 적합할 수 있는 또다른 항체 단편에는 Fv 단편이 포함되며, 이는 Fab 단편의 가변 경쇄 도메인(VL)과 가변 중쇄 도메인(VH)의 비공유 연결로 구성된, 이에 따라 2개의 폴리펩티드 사슬의 연결로 이루어진 다이머이다. 2개의 폴리펩티드 사슬의 분리 때문에 Fv 단편의 안정성을 향상시키기 위하여, 상기 Fv 단편은 도메인 VL과 도메인 VH[11] 사이에 적합한 펩티드 결합을 삽입함으로써 유전공학에 의해 변형될 수 있다. 이는 단일 폴리펩티드 사슬로 구성됨에 따라 scFv("단쇄 가변 단편")로 지칭된다. 바람직하게는 15 내지 25개의 아미노산으로 구성된 펩티드 결합의 사용은 도메인의 C-말단 끝을 다른 도메인의 N-말단 끝에 연결할 수 있게 해주며, 이에 따라 완전한 형태의 항체와 유사한 결합 성질이 부여된 모노머 분자를 구성한다. VL 도메인과 VH 도메인의 2개의 방향은 상기 도메인들의 기능적 성질이 동일할 때 적합하다(VL-연결-VH 및 VH-연결-VL). 물론, 전술한 면역학적 특징을 갖고 당업계의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 단편이 본 발명의 목적에 적합할 수 있다.
생물학적 물질이 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질인 경우, 웨스턴 블롯 또는 ELISA에 의해, 또는 생물학적 물질에 기초한 화학발광법과 같이 당업계의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 다른 방법에 의해, 상기 단백질을 검출 및/또는 정량화함으로써 유전자의 발현이 결정될 수 있다.
상기 ELISA 기법("효소 결합 면역흡착 측정법")은 고체 지지체상의 면역효소 측정법이다. 이러한 테스트는 EIA("효소 면역측정법")의 더 일반적인 범위 내에 있으며, 이러한 측정법은 효소-촉매 반응과 짝지어진다. 상기 기법은 1개 또는 2개의 항체를 사용한다. 면역 복합체(항원/항체)의 형성을 검출하기 위한 항체는 효소와 짝지어지며, 이는 색소생성 기질 또는 형광생성 기질에 의해 신호의 방출을 생성할 수 있다.
웨스턴 블롯팅은 샘플 내 특정 단백질에 대해 특이적인 항체에 의해 상기 단백질을 검출하기 위한 테스트이며, 이는 하기에 기재된 단계들을 포함한다.
제1단계는 겔 전기영동이며, 이는 크기에 따라 샘플의 단백질을 분리할 수 있게 해준다.
그 후, 겔 내 단백질은 압력에 의해 또는 전류의 적용에 의해 막(니트로셀룰로스, PVDF 등)으로 이동되며, 상기 단백질은 소수성 및 이온성 상호작용을 통해 막에 고정되게 된다.
비특이적 상호작용의 부위가 포화된 후에, 조사대상인 단백질에 대해 특이적인 제1 항체(일차 항체)가 막과 함께 인큐베이트된다.
이어서, 상기 막은 헹굼을 통해 결합되지 않은 일차 항체가 제거되고, 그 후 일차 항체에 결합하게 될 소위 이차 항체와 인큐베이트된다. 상기 이차 항체는 막에 대해 조사할 때 단백질의 시각적인 식별을 허용하는 효소에 결합되는 것이 일반적이다. 효소에 의해 표지된 기질의 첨가는 막에서 가시적인 착색 반응을 일으킨다.
S100A9 유전자 및/또는 S100A8 유전자의 발현을 분석함으로써, 병원감염에 걸릴 환자의 민감성, 특히 전신성 염증 반응을 나타내는 환자의 민감성을 결정하는 것이 가능하고, 패혈 증후군의 진행을 예후하는 것이 가능하다. 예컨대 병원감염에 걸릴 민감성이 알려지지 않은 환자에게서 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 분석하고, 예민한 환자의 표적 유전자의 평균 발현의 알려진 값과 예민하지 않은 환자의 표적 유전자의 평균 발현의 알려진 값을 비교함으로써, 환자가 병원감염에 걸릴 가능성이 있는지 여부를 결정하는 것이 가능하다. 동일한 방식으로, 예컨대 하나 이상의 표적 유전자의 발현을 분석하고, 표적 유전자의 알려진 발현의 평균과 비교함으로써, 생존 또는 사망의 예후를 포함하여 패혈 증후군의 진행을 예후하는 것이 가능하다.
따라서, 본 발명은 하기에 따라 병원감염에 걸릴 환자의 민감성을 결정하는 방법에 관한 것이다:
a) 환자에게서 수득된 생물학적 샘플로부터 생물학적 물질이 추출된다.
b) S100A9 및 S100A8 표적 유전자로부터 선택된 하나 이상의 표적 유전자의 발현 산물의 하나 이상의 특이시약이 제조된다.
c) 하나 이상의 표적 유전자 S100A9 및 S100A8의 발현이 결정되고, 특정 역치 값에 대해 상대적으로 과발현은 병원감염에 걸릴 민감성의 지표이다.
상기 c) 단계에서, S100A9 표적 유전자 및 S100A8 표적 유전자의 발현을 결정할 수 있으며, 특정 역치 값에 대해 상대적인 S100A9 표적 유전자의 과발현과 특정 역치 값에 대해 상대적인 S100A8 표적 유전자의 과발현은 병원감염에 걸릴 민감성의 지표가 된다.
당업계의 통상의 기술자라면 역치 값을 결정하는 다양한 가능한 방법들을 갖고 있다. 일례로서, 유덴 지수(Youden's index)의 결정이 언급될 수 있다.
유덴 지수는 비-에러(non-error)의 전체 수준의 측정에 대응한다. 이는 0과 1 사이에서 가변적이며, 여기에서 0은 두 개의 군의 구별을 허용하지 않는 테스트에 대한 값이며, 1은 두 개의 군의 완전한 구별을 허용하는 테스트에 대한 값이다. 유덴 지수의 최대값은 위(false) 결과(위음성 또는 위양성)의 수가 가장 낮은 역치 값에 대응한다. 유덴 지수가 1에 가까울수록, 진단 성능은 더 우수하다[12].
특히, 생물학적 샘플은 감염과 연관되는지 여부에 관계없이 전신성 염증 반응을 나타내는 환자로부터 획득된다. 생물학적 샘플은 혈액 샘플일 수 있으며, 추출된 생물학적 물질은 그 중에서도 핵산일 수 있다. 바람직하게는, 전체 RNA는 생물학적 샘플로부터 추출되며, 표적 유전자의 발현은 mRNA의 발현을 분석함으로써 결정된다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 특이시약에는 S100A9 표적 유전자 및/또는 S100A8 표적 유전자의 발현 산물에 대해 특이적인 하나 이상의 증폭 프라이머 또는 하나 이상의 하이브리드화 프로브; 또는 S100A9 표적 유전자 및/또는 S100A8 표적 유전자의 발현 산물에 대해 특이적인 하나 이상의 항체가 포함된다.
상기 방법은 SIRS, 패혈증, 중증 패혈증 및 패혈성 쇼크와 같은 패혈 증후군을 앓는 환자, 즉 감염에 대해 전신성 염증 반응을 갖는 환자에 대해 병원감염에 걸릴 민감성을 결정하는데 특히 적합하다.
따라서, S100A9 유전자 및/또는 S100A8 유전자의 발현 산물에 대해 특이적인 시약은, 감염과 연관되는지 여부에 관계없이 특히 전신성 염증 반응을 갖는 환자에 대해 환자가 병원감염에 걸릴 민감성을 결정하기 위해 사용된다. 상기 시약에는, S100A9 표적 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 하이브리드화 프로브, S100A8 표적 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 하이브리드화 프로브, S100A9 표적 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 증폭 프라이머, S100A8 표적 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 증폭 프라이머, S100A9 유전자의 발현 산물에 대해 특이적인 하나 이상의 항체, 또는 S100A8 유전자의 발현 산물에 대해 특이적인 하나 이상의 항체가 포함될 수 있다.
또한, S100A9 및/또는 S100A8 유전자의 발현의 분석은 패혈 증후군의 진행의 예후(생존 및 사망을 포함하는 예후)를 가능하게 한다.
따라서, 본 발명은 하기에 따라 환자에게서 패혈 증후군의 진행을 예후하는 방법을 제안한다:
a) 환자에게서 수득된 생물학적 샘플로부터 생물학적 물질이 추출된다.
b) S100A9 및 S100A8 표적 유전자로부터 선택된 하나 이상의 표적 유전자의 발현 산물의 하나 이상의 특이시약이 제조된다.
c) 하나 이상의 표적 유전자 S100A9 및 S100A8의 발현이 결정되고, 특정 역치 값에 대해 상대적으로 저발현은 패혈 증후군의 진행의 좋은 예후의 지표이고, 특정 역치 값에 대해 상대적으로 과발현은 패혈 증후군의 진행의 나쁜 예후의 지표이다.
상기 c) 단계에서, S100A9 표적 유전자 및 S100A8 표적 유전자의 발현을 결정할 수 있으며, 특정 역치 값에 대해 상대적인 S100A9 표적 유전자의 저발현과 특정 역치 값에 대해 상대적인 S100A8 표적 유전자의 저발현은 패혈 증후군의 진행의 좋은 예후의 지표가 되며; 특정 역치 값에 대해 상대적인 S100A9 표적 유전자의 과발현과 특정 역치 값에 대해 상대적인 S100A8 표적 유전자의 과발현은 패혈 증후군의 진행의 나쁜 예후의 지표가 된다.
역치 값을 결정하는 것은 당업계의 통상의 기술자의 능력 내에 있다. 일례로서, 유덴 지수의 결정이 언급될 수 있다. 유덴 지수는 비-에러(non-error)의 전체 수준의 측정에 대응한다. 이는 0과 1 사이에서 가변적이며, 여기에서 0은 두 개의 군의 구별을 허용하지 않는 테스트에 대한 값이며, 1은 두 개의 군의 완전한 구별을 허용하는 테스트에 대한 값이다. 유덴 지수의 최대값은 위(false) 결과(위음성 또는 위양성)의 수가 가장 낮은 역치 값에 대응한다. 유덴 지수가 1에 가까울수록, 진단 성능은 더 우수하다[12].
생물학적 샘플은 혈액 샘플일 수 있으며, 추출된 생물학적 물질은 그 중에서도 핵산일 수 있다. 바람직하게는, 전체 RNA는 생물학적 샘플로부터 추출되며, 표적 유전자의 발현은 mRNA의 발현을 분석함으로써 결정된다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 특이시약에는 S100A9 표적 유전자 및/또는 S100A8 표적 유전자의 발현 산물에 대해 특이적인 하나 이상의 증폭 프라이머 또는 하나 이상의 하이브리드화 프로브; 또는 S100A9 표적 유전자 및/또는 S100A8 표적 유전자의 발현 산물에 대해 특이적인 하나 이상의 항체가 포함된다.
따라서, S100A9 유전자 및/또는 S100A8 유전자의 발현 산물에 대해 특이적인 시약은, 환자에게서 패혈 증후군의 진행의 예후(생존 또는 사망의 예후를 포함함)를 위해 사용된다. 상기 시약에는, S100A9 표적 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 하이브리드화 프로브, S100A8 표적 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 하이브리드화 프로브, S100A9 표적 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 증폭 프라이머, S100A8 표적 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 증폭 프라이머, S100A9 유전자의 발현 산물에 대해 특이적인 하나 이상의 항체, 또는 S100A8 유전자의 발현 산물에 대해 특이적인 하나 이상의 항체가 포함될 수 있다.
도 1은 S100A8 및 S100A9의 유전자 발현의 상관관계를 나타낸다(n=86). 이는 스피어만 계수(Spearman coefficient)가 0.90보다 큰 분자 S100A9 및 S100A8의 유전자 발현 사이에 존재하는 강한 상관관계를 보여준다(r=0.9134). 분자 S100A9 및 S100A8의 유전자 발현은 병원감염에 걸릴 수 있는 환자를 구별하는 능력과 패혈 증후군의 진행을 예후하는 능력에서 유사성을 나타낸다.
도 2는 패혈성 쇼크가 발생된 후 D7과 D10 사이에 획득된 샘플에 대해, 생존한 환자와 생존하지 못한 환자 사이에서 S100A8 유전자의 발현의 유의적인 차이(p=0.0461)를 나타낸다. 범례: HV = 건강한 지원자; S = 생존한 환자; NS = 생존하지 못한 환자.
실시예 1 - S100A9 유전자의 발현의 조사
테스트 샘플
패혈성 쇼크 이후 D1, D2 또는 D3에 샘플링된(H0는 승압 치료제의 주입 시점임), 44명의 건강한 지원자 군(S)과 148명의 패혈 증후군 환자 군(SEP)이, 말초혈액에서 S100A9 유전자의 발현을 비교하기 위해 사용되었다. 44명의 건강한 환자 군(S)과 148명의 패혈성 쇼크 발생 환자 군(SEP)은 식별되었다.
RNA의 추출과 cDNA의 합성
각 환자에 대해, 생물학적 샘플은 환자(SEP)에게서 진행된 패혈 증후군이 개시된 이후 첫 10일 동안 정기적으로 획득한 혈액 샘플이었다. 건강한 환자(S)에 대해서도 동일한 프로토콜에 의해 샘플링이 수행되었다. 이러한 샘플들은 PAXgene™ Blood RNA 튜브(PreAnalytiX, Frankin Lakes, USA)에서 직접적으로 수집되었다.
혈액 샘플링 단계 이후에 세포의 완전한 용해를 달성하기 위하여, 상기 튜브를 4시간 동안 실온에 놓아두었으며, 그 후 생물학적 물질을 추출할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 보다 정확하게 말하자면, 상기 프로토콜에서, 전체 RNA는 제조업자의 권고에 따라 PAXgene Blood RNA® 키트(PreAnalytiX)에 의해 추출되었다. 요약하면, 상기 튜브는 원심분리되어(10분, 3000g), 핵산 펠릿(pellet)이 수득되었다. 상기 펠릿은 세척되었으며, 단백질의 소화에 필요한 프로테이나제 K를 함유하는 완충액 내에 포함되었다(55℃에서 10분). 반복 원심분리(5분, 19000g)가 수행되어 세포 잔해가 제거되었으며, 핵산의 고정을 위한 조건을 최적화하기 위해 에탄올이 첨가되었다. 전체 RNA가 컬럼 PAXgene RNA 스핀 컬럼상에 특이적으로 고정되었으며, 컬럼의 용출 이전에 RNAse free DNAse set™(Qiagen Ltd, Crawley, UK)를 사용하여 오염 DNA의 소화가 수행되었다.
각각의 추출에 대해, 전체 RNA의 질은 RNA 6000 Nano Chip™ 키트(Agilent technologies)를 사용하여 모세관 전기영동에 의해 확인되었다. 사용된 기구는 bioanalyzer 2100이다. 역전사(RT) 반응은 최종 부피 20　μl에서 수행되었다. 전체 RNA(0.5　μg)는 1　μl의 50　μM polyT 및 1　μl의 어닐링 완충액과 혼합되었으며, 그 후 65℃에서 5분 동안 인큐베이트되었다. 얼음에서 냉각한 후에, 상기 용액은 10　μl의 2x First Strand Reaction Mix 및 2　μl의 SuperScript III/RNase™ OUT Enzyme Mix RT(15 U/μl)와 혼합되었으며, 상기 모든 생성물들은 SuperScript First Strand Synthesis Super Mix™ RT-PCR 시스템(Invitrogen)으로부터 수득된 것이다. 역전사는 50℃에서 50분 동안 수행되었으며, 그 후 85℃에서 5분 동안 인큐베이션되었다. 마지막으로, cDNA의 각 용액은 DEPC 물에서 1/10까지 희석되었다.
정량화를 위한 표준 범위의 제조
건강한 대상체로부터 획득한 cDNA의 풀에서 시작하여, S100A9 표적 유전자(GenBank No. NM_002965.3)의 153-179 영역의 증폭이 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)에 의해 수행되었으며, 이는 하기의 프라이머 쌍을 이용하여 포화될 때까지 실시되었다:
센스 프라이머: 5'-TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3'(서열번호 1)
안티센스 프라이머: 5'-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3'(서열번호 2)
실시간 PCR에 의한 mRNA의 발현의 분석
전술한 바와 같이 cDNA로 역전사된 S100A9 표적 유전자의 mRNA는 LightCycler™(Roche)를 사용하여 실시간 정량적 PCR에 의해 정량화되었다. PCR 반응은 Fast-Start™ DNA Master SYBR Green I 실시간 PCR 키트(Roche Molecular Biochemicals)를 사용하여 수행되었다. 각각의 PCR은 3.6　μl의 물, 2.4　μl의 MgCl2, 2　μl의 SYBR Green mix(Fast start DNA master SYBR green + Taq DNA 폴리머라제) 및 1μl의 각각의 프라이머(10　μM) 및 10　μl의 cDNA 용액을 포함하는 최종부피 20　μl에서 수행되었다. 사용된 프라이머는 전술한 것과 같다.
95℃에서 10분의 변성 단계 이후에, 40회 사이클의 "터치-다운(touch-down)" PCR 프로토콜(95℃에서 10초, 68-58℃에서 10초의 하이브리드화, 그 후 72℃에서 16초의 연장)에 의해 증폭이 수행된다. 각 사이클의 끝에서, SYBR Green에 의해 발산된 형광이 측정되었다.
증폭의 특이성을 확인하기 위하여, PCR 산물에 대해 체계적으로 용융 곡선의 분석이 수행되었다(LightCycler™ - Roche). 이를 위해, PCR 산물은 0.1℃/s의 증가율로 58℃에서 98℃까지 증가하는 온도에서 처리되었다. 각각의 PCR 산물에 대해, 특이적 용융 온도를 특징으로 하는 곡선을 분석하는 동안 단일 피크가 얻어졌다.
하우스키핑 유전자 CPB의 정량화에 필요한 프라이머의 조합이 Search-LC(Heidelberg, Germany; 참조번호 488116)에 의해 제공되었다.
하우스키핑 유전자 시클로필린 B의 mRNA의 양에 대해 상대적인 표적 mRNA의 양은, LightCycler Relative Quantification Software™(Roche Molecular Biochemicals)를 사용한 상대적 정량화 기법에 의해 분석되었다. LightCycler™ 소프트웨어(Roche)의 "이차 도함수 최대 방법(Second Derivative Maximum Method)"이 각 샘플에 대해 "교차점(Crossing Point: Cp)"을 자동적으로 결정하기 위해 사용되었다. Cp의 값은 형광이 배경 소음(background noise)과 유의적으로 달라지기 위한 사이클의 횟수로서 정의되었다.
다섯 개의 일련의 1/10 희석이, 복제수(copy number)의 로그의 함수로서 Cp를 나타내는 검량선(calibration curve)을 만들어내기 위하여, 각각의 표준에 대해 4번 수행되었다. 표준 희석이 최적화되었으며, 이에 따라 검량선은 표적 유전자 및 하우스키핑 유전자에 대해 예상되는 발현 수준을 포함시켰다. 표적 유전자 및 하우스키핑 유전자에 대한 PCR의 효과를 나타내는 상대표준 곡선이 만들어졌으며, 이는 LightCycler Relative Quantification Software(Roche Molecular Biochemicals)에 의한 정량화를 수행하기 위해 사용되었다.
수득된 결과
수득된 결과는 하기 표 1에 나타낸다.
환자 N 중앙값 하 사분위수(lower quartile) 상 사분위수(upper quartile)
S 44 1.46 1.065 1.87
SEP 148 16.62 11.87 25.835
건강한 대상체와 패혈성 쇼크 환자 사이의 만-휘트니(Mann-Whitney) 테스트의 p 값은 0.0001보다 작다.
패혈성 쇼크의 첫 3일에 걸쳐 마커 S100A9의 발현은 건강한 기증자에 대해 상대적으로 유의적으로 과발현되었다.
실시예 2 - S100A8 유전자의 발현의 조사
테스트 샘플
패혈성 쇼크 이후 D7과 D10 사이에 샘플링된(H0는 승압 치료제의 주입 시점임), 32명의 건강한 지원자 군(S)과 86명의 패혈 증후군 환자 군(SEP)이, 말초혈액에서 S100A8 유전자의 발현을 비교하기 위해 사용되었다. 32명의 건강한 환자 군(S)과 86명의 패혈성 쇼크 발생 환자 군(SEP)은 식별되었다.
RNA의 추출과 cDNA의 합성
각 환자에 대해, 생물학적 샘플은 환자(SEP)에게서 진행된 패혈 증후군이 개시된 이후 첫 10일 동안 정기적으로 획득한 혈액 샘플이다. 건강한 환자(S)에 대해서도 동일한 프로토콜에 따라 샘플링이 수행되었다. 이러한 샘플들은 PAXgene™ Blood RNA 튜브(PreAnalytiX, Frankin Lakes, USA)에서 직접적으로 수집되었다.
혈액 샘플을 수집하는 단계 이후에 세포의 완전한 용해를 달성하기 위하여, 상기 튜브를 4시간 동안 실온에 놓아두었으며, 그 후 생물학적 물질을 추출할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 보다 정확하게 말하자면, 상기 프로토콜에서, 전체 RNA는 제조업자의 권고에 따라 PAXgene Blood RNA® 키트(PreAnalytiX)에 의해 추출되었다. 요약하면, 상기 튜브는 원심분리되어(10분, 3000g), 핵산 펠릿(pellet)이 수득되었다. 상기 펠릿은 세척되었으며, 단백질의 소화에 필요한 프로테이나제 K를 함유하는 완충액 내에 포함되었다(55℃에서 10분). 반복 원심분리(5분, 19000g)가 수행되어 세포 잔해가 제거되었으며, 핵산의 고정을 위한 조건을 최적화하기 위해 에탄올이 첨가되었다. 전체 RNA가 컬럼 PAXgene RNA 스핀 컬럼상에 특이적으로 고정되었으며, 컬럼의 용출 이전에 RNAse free DNAse set™(Qiagen Ltd, Crawley, UK)를 사용하여 오염 DNA의 소화가 수행되었다.
각각의 추출에 대해, 전체 RNA의 질은 RNA 6000 Nano Chip™ 키트(Agilent technologies)를 사용하여 모세관 전기영동에 의해 확인되었다. 사용된 기구는 bioanalyzer 2100이다. 역전사(RT) 반응은 최종 부피 20　μl에서 수행되었다. 전체 RNA(0.5　μg)는 1　μl의 50　μM polyT 및 1　μl의 어닐링 완충액과 혼합되었으며, 그 후 65℃에서 5분 동안 인큐베이트되었다. 얼음에서 냉각한 후에, 상기 용액은 10　μl의 2x First Strand Reaction Mix 및 2　μl의 SuperScript III/RNase™ OUT Enzyme Mix RT(15 U/μl)와 혼합되었으며, 상기 모든 생성물들은 SuperScript First Strand Synthesis Super Mix™ RT-PCR 시스템(Invitrogen)으로부터 수득된 것이다. 역전사는 50℃에서 50분 동안 수행되었으며, 그 후 85℃에서 5분 동안 인큐베이션되었다. 마지막으로, cDNA의 각 용액은 DEPC 물에서 1/10까지 희석되었다.
정량화를 위한 표준 범위의 제조
건강한 대상체로부터 획득한 cDNA의 풀에서 시작하여, S100A8 표적 유전자(GenBank No. NM_002964.3)의 129-280 영역의 증폭이 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)에 의해 수행되었으며, 이는 하기의 프라이머 쌍을 이용하여 포화될 때까지 실시되었다:
센스 프라이머: 5'-ATTTCCATGCCGTCTACAGG-3'(서열번호 3)
안티센스 프라이머: 5'-CACCAGAATGAGGAACTCCT-3'(서열번호 4)
실시간 PCR에 의한 mRNA의 발현의 분석
전술한 바와 같이 cDNA로 역전사된 S100A8 표적 유전자의 mRNA는 LightCycler™(Roche)를 사용하여 실시간 정량적 PCR에 의해 정량화되었다. PCR 반응은 Fast-Start™ DNA Master SYBR Green I 실시간 PCR 키트(Roche Molecular Biochemicals)를 사용하여 수행되었다. 각각의 PCR은 3.6　μl의 물, 2.4　μl의 MgCl2, 2　μl의 SYBR Green mix(Fast start DNA master SYBR green + Taq DNA 폴리머라제) 및 1μl의 각각의 프라이머(10　μM) 및 10　μl의 cDNA 용액을 포함하는 최종부피 20　μl에서 수행되었다. 사용된 프라이머는 전술한 것과 같다.
95℃에서 10분의 변성 단계 이후에, 40회 사이클의 "터치-다운(touch-down)" PCR 프로토콜(95℃에서 10초, 68-58℃에서 10초의 하이브리드화, 그 후 72℃에서 16초의 연장)에 의해 증폭이 수행된다. 각 사이클의 끝에서, SYBR Green에 의해 발산된 형광이 측정되었다.
증폭의 특이성을 확인하기 위하여, PCR 산물에 대해 체계적으로 용융 곡선의 분석이 수행되었다(LightCycler™ - Roche). 이를 위해, PCR 산물은 0.1℃/s의 증가율로 58℃에서 98℃까지 증가하는 온도에서 처리되었다. 각각의 PCR 산물에 대해, 특이적 용융 온도를 특징으로 하는 곡선을 분석하는 동안 단일 피크가 얻어졌다.
하우스키핑 유전자 CPB의 정량화에 필요한 프라이머의 조합이 Search-LC(Heidelberg, Germany; 참조번호 488116)에 의해 제공되었다.
하우스키핑 유전자 시클로필린 B의 mRNA의 양에 대해 상대적인 표적 mRNA의 양은, LightCycler Relative Quantification Software™(Roche Molecular Biochemicals)를 사용한 상대적 정량화 기법에 의해 분석되었다. LightCycler™ 소프트웨어(Roche)의 "이차 도함수 최대 방법(Second Derivative Maximum Method)"이 각 샘플에 대해 "교차점(Crossing Point: Cp)"을 자동적으로 결정하기 위해 사용되었다. Cp의 값은 형광이 배경 소음과 유의적으로 달라지기 위한 사이클의 횟수로서 정의되었다.
다섯 개의 일련의 1/10 희석이, 복제수(copy number)의 로그의 함수로서 Cp를 나타내는 검량선을 만들어내기 위하여, 각각의 표준에 대해 4번 수행되었다. 표준 희석이 최적화되었으며, 이에 따라 검량선은 표적 유전자 및 하우스키핑 유전자에 대해 예상되는 발현 수준을 포함시켰다. 표적 유전자 및 하우스키핑 유전자에 대한 PCR의 효과를 나타내는 상대표준 곡선이 만들어졌으며, 이는 LightCycler Relative Quantification Software(Roche Molecular Biochemicals)에 의한 정량화를 수행하기 위해 사용되었다.
수득된 결과
수득된 결과는 하기 표 2에 나타낸다.
환자 N 중앙값 하 사분위수(lower quartile) 상 사분위수(upper quartile)
S 32 12.9 8.5 20.4
SEP 86 183.5 96.6 438.5
건강한 대상체와 패혈성 쇼크 환자 사이의 만-휘트니(Mann-Whitney) 테스트의 p 값은 0.0001보다 작다.
패혈성 쇼크 이후 D7 내지 D10에서 S100A8 마커의 발현은 건강한 기증자에 대해 상대적으로 유의적으로 과발현되었다.
실시예 3 - 패혈성 쇼크 환자에게서 S100A8의 생존 예후 값의 조사
테스트 샘플
본 시험은 패혈성 쇼크가 진행되고 Lyon-Sud 병원의 외과 또는 내과 집중치료실에 수용된 86명의 환자 집단에 대해 수행되었다. 패혈성 쇼크 이후 D7, D8, D9 또는 D10에(H0는 승압 치료의 개시 시점임), 이들 환자로부터 샘플이 수집되었다.
RNA의 추출과 cDNA의 합성
각 환자에 대해, 생물학적 샘플은 패혈 증후군(환자 SEP)이 개시된 이후 첫 10일 동안 매일 획득한 혈액 샘플이다. 이러한 샘플들은 PAXgene™ Blood RNA 튜브(PreAnalytiX, Frankin Lakes, USA)에서 직접적으로 수집되었다.
혈액 샘플을 수집하는 단계 이후에 세포의 완전한 용해를 달성하기 위하여, 상기 튜브를 4시간 동안 실온에 놓아두었으며, 그 후 생물학적 물질을 추출할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 보다 정확하게 말하자면, 상기 프로토콜에서, 전체 RNA는 제조업자의 권고에 따라 PAXgene Blood RNA® 키트(PreAnalytiX)에 의해 추출되었다. 요약하면, 상기 튜브는 원심분리되어(10분 동안 3000g), 핵산 펠릿이 수득되었다. 상기 펠릿은 세척되었으며, 단백질의 소화에 필요한 프로테이나제 K를 함유하는 완충액 내에 포함되었다(55℃에서 10분). 반복 원심분리(5분 동안 19000g)가 수행되어 세포 잔해가 제거되었으며, 핵산의 고정을 위한 조건을 최적화하기 위해 에탄올이 첨가되었다. 전체 RNA가 컬럼 PAXgene RNA 스핀 컬럼™상에 특이적으로 고정되었으며, 컬럼의 용출 이전에 RNAse free DNAse set™(Qiagen Ltd, Crawley, UK)를 사용하여 오염 DNA의 소화가 수행되었다.
각각의 추출에 대해, 전체 RNA의 질은 RNA 6000 Nano Chip™ 키트(Agilent technologies)를 사용하여 모세관 전기영동에 의해 확인되었다. 사용된 기구는 bioanalyzer 2100™이다. 역전사(RT) 반응은 최종 부피 20　μl에서 수행되었다. 전체 RNA(0.5　μg)는 1　μl의 50　μM 올리고(dT) 및 1　μl의 어닐링 완충액과 혼합되었으며, 그 후 65℃에서 5분 동안 인큐베이트되었다. 얼음에서 냉각한 후에, 상기 용액은 10　μl의 2x First Strand Reaction Mix 및 2　μl의 SuperScript III/RNase OUT Enzyme Mix RT(15 U/μl)와 혼합되었으며, 상기 모든 생성물들은 SuperScript First Strand Synthesis Super Mix™ RT-PCR 시스템(Invitrogen)으로부터 수득된 것이다. 역전사는 50℃에서 50분 동안 수행되었으며, 그 후 85℃에서 5분 동안 인큐베이션되었다. 마지막으로, cDNA의 각 용액은 DEPC 물에서 1/10까지 희석되었다.
정량화를 위한 표준 범위의 제조
건강한 대상체로부터 획득한 cDNA의 풀에서 시작하여, S100A8 표적 유전자(GenBank No. NM_002964.3)의 129-280 영역의 증폭이 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)에 의해 수행되었으며, 이는 하기의 프라이머 쌍을 이용하여 포화될 때까지 실시되었다:
센스 프라이머: 5'-ATTTCCATGCCGTCTACAGG-3'(서열번호 3)
안티센스 프라이머: 5'-CACCAGAATGAGGAACTCCT-3'(서열번호 4)
실시간 정량적 PCR에 의한 mRNA의 발현의 분석
전술한 바와 같이 cDNA로 역전사된 S100A8 표적 유전자의 mRNA는 LightCycler™ 2.0(Roche)를 사용하여 실시간 정량적 PCR에 의해 정량화되었다. PCR 반응은 Fast-Start™ DNA Master SYBR Green I 실시간 PCR 키트(Roche Molecular Biochemicals)를 사용하여 수행되었다. 각각의 PCR은 3.6　μl의 물, 2.4　μl의 MgCl2, 2　μl의 SYBR Green mix(Fast start DNA master SYBR green + Taq DNA 폴리머라제) 및 1μl의 각각의 프라이머(10　μM) 및 10　μl의 cDNA 용액을 포함하는 최종부피 20　μl에서 수행되었다. 사용된 프라이머는 전술한 것과 같다.
95℃에서 10분의 변성 단계 이후에, 40회 사이클의 "터치-다운(touch-down)" PCR 프로토콜(95℃에서 10초, 68-58℃에서 10초의 하이브리드화(0.5℃/사이클), 그 후 72℃에서 16초의 연장)에 의해 증폭이 수행된다. 각 사이클의 끝에서, SYBR Green에 의해 발산된 형광이 측정되었다.
증폭의 특이성을 확인하기 위하여, PCR 산물에 대해 체계적으로 용융 곡선의 분석이 수행되었다(LightCycler™ 2.0 - Roche). 이를 위해, PCR 산물은 0.1℃/s의 증가율로 58℃에서 98℃까지 증가하는 온도에서 처리되었다. 각각의 PCR 산물에 대해, 특이적 용융 온도를 특징으로 하는 곡선을 분석하는 동안 단일 피크가 얻어졌다.
하우스키핑 유전자 CPB의 정량화에 필요한 프라이머의 조합이 Search-LC(Heidelberg, Germany; 참조번호 488116)에 의해 제공되었다.
하우스키핑 유전자 시클로필린 B의 mRNA의 양에 대해 상대적인 표적 mRNA의 양은, LightCycler Relative Quantification Software™(Roche Molecular Biochemicals)를 사용한 상대적 정량화 기법에 의해 분석되었다. LightCycler™ 소프트웨어(Roche)의 "이차 도함수 최대 방법(Second Derivative Maximum Method)"이 각 샘플에 대해 "교차점(Crossing Point: Cp)"을 자동적으로 결정하기 위해 사용되었다. Cp의 값은 형광이 배경 소음과 유의적으로 달라지기 위한 사이클의 횟수로서 정의되었다.
다섯 개의 일련의 1/10 희석이, 복제개수(copy number)의 로그의 함수로서 Cp를 나타내는 검량선을 만들어내기 위하여, 각각의 표준에 대해 4번 수행되었다. 표준 희석이 최적화되었으며, 이에 따라 검량선은 표적 유전자 및 하우스키핑 유전자에 대해 예상되는 발현 수준을 포함시켰다. 표적 유전자 및 하우스키핑 유전자에 대한 PCR의 효과를 나타내는 상대표준 곡선이 만들어졌으며, 이는 LightCycler Relative Quantification Software(Roche Molecular Biochemicals)에 의한 정량화를 수행하기 위해 사용되었다.
결과의 분석
S100A8 유전자의 발현이 환자의 생존과 상관관계가 있는지 여부를 결정하기 위하여, 만-휘트니(Mann-Whitney) 테스트가 수행되었다. 도 2는 패혈성 쇼크가 발생된 후 D7과 D10 사이에 획득된 샘플에 대해, 생존한 환자와 생존하지 못한 환자 사이에서 S100A8 유전자의 발현의 유의적인 차이(p=0.0461)를 나타낸다.
실시예 4 - 병원감염에 대한 환자의 민감성을 결정하기 위한, S100A9 유전자의 발현의 조사
테스트 샘플
본 시험은 패혈성 쇼크가 진행되고 Lyon-Sud 병원의 외과 또는 내과 집중치료실에 수용된 93명의 환자 집단에 대해 수행되었다. 패혈성 쇼크 이후 D7, D8, D9 또는 D10에(H0는 승압 치료의 개시 시점임), 이들 환자로부터 샘플이 수집되었다.
패혈성 쇼크가 진행된 상기 환자들 중에서, 27명의 환자들은 쇼크에 대해 이차적인 병원감염이 나타났으며, 66명의 환자들은 이 집단을 관찰한지 53일 동안 병원감염이 나타나지 않았다.
RNA의 추출과 cDNA의 합성
각 환자에 대해, 생물학적 샘플은 패혈 증후군(환자 SEP)이 개시된 이후 첫 10일 동안 정기적으로 획득한 혈액 샘플이다. 건강한 대상체(S)에 대해서도 동일한 프로토콜에 따라 샘플이 획득되었다. 이러한 샘플들은 PAXgene™ Blood RNA 튜브(PreAnalytiX, Frankin Lakes, USA)에서 직접적으로 수집되었다.
혈액 샘플을 수집하는 단계 이후에 세포의 완전한 용해를 달성하기 위하여, 상기 튜브를 4시간 동안 실온에 놓아두었으며, 그 후 생물학적 물질을 추출할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 보다 정확하게 말하자면, 상기 프로토콜에서, 전체 RNA는 제조업자의 권고에 따라 PAXgene Blood RNA® 키트(PreAnalytiX)에 의해 추출되었다. 요약하면, 상기 튜브는 원심분리되어(10분, 3000g), 핵산 펠릿이 수득되었다. 상기 펠릿은 세척되었으며, 단백질의 소화에 필요한 프로테이나제 K를 함유하는 완충액 내에 포함되었다(55℃에서 10분). 반복 원심분리(5분, 19000g)가 수행되어 세포 잔해가 제거되었으며, 핵산의 고정을 위한 조건을 최적화하기 위해 에탄올이 첨가되었다. 전체 RNA가 컬럼 PAXgene RNA 스핀 컬럼™상에 특이적으로 고정되었으며, 컬럼의 용출 이전에 RNAse free DNAse set™(Qiagen Ltd, Crawley, UK)를 사용하여 오염 DNA의 소화가 수행되었다.
각각의 추출에 대해, 전체 RNA의 질은 RNA 6000 Nano Chip™ 키트(Agilent technologies)를 사용하여 모세관 전기영동에 의해 확인되었다. 사용된 기구는 bioanalyzer 2100™이다. 역전사(RT) 반응은 최종 부피 20　μl에서 수행되었다. 전체 RNA(0.5　μg)는 1　μl의 50　μM polyT 및 1　μl의 50　μM 올리고(dT) 및 1　μl의 어닐링 완충액과 혼합되었으며, 그 후 65℃에서 5분 동안 인큐베이트되었다. 얼음에서 냉각한 후에, 상기 용액은 10　μl의 2x First Strand Reaction Mix 및 2　μl의 SuperScript III/RNase OUT Enzyme Mix RT(15 U/μl)와 혼합되었으며, 상기 모든 생성물들은 SuperScript First Strand Synthesis Super Mix™ RT-PCR 시스템(Invitrogen)으로부터 수득된 것이다. 역전사는 50℃에서 50분 동안 수행되었으며, 그 후 85℃에서 5분 동안 인큐베이션되었다. 마지막으로, cDNA의 각 용액은 DEPC 물에서 1/10까지 희석되었다.
정량화를 위한 표준 범위의 제조
건강한 대상체로부터 획득한 cDNA의 풀에서 시작하여, S100A9 표적 유전자(GenBank No. NM_002965.3)의 153-179 영역의 증폭이 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)에 의해 수행되었으며, 이는 하기의 프라이머 쌍을 이용하여 포화될 때까지 실시되었다:
센스 프라이머: 5'-TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3'(서열번호 1)
안티센스 프라이머: 5'-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3'(서열번호 2)
실시간 PCR에 의한 mRNA의 발현의 분석
전술한 바와 같이 cDNA로 역전사된 S100A9 표적 유전자의 mRNA는 LightCycler™(Roche)를 사용하여 실시간 정량적 PCR에 의해 정량화되었다. PCR 반응은 Fast-Start™ DNA Master SYBR Green I 실시간 PCR 키트(Roche Molecular Biochemicals)를 사용하여 수행되었다. 각각의 PCR은 3.6　μl의 물, 2.4　μl의 MgCl2, 2　μl의 SYBR Green mix(Fast start DNA master SYBR green + Taq DNA 폴리머라제) 및 1μl의 각각의 프라이머(10　μM) 및 10　μl의 cDNA 용액을 포함하는 최종부피 20　μl에서 수행되었다. 사용된 프라이머는 전술한 것과 같다.
95℃에서 10분의 변성 단계 이후에, 40회 사이클의 "터치-다운(touch-down)" PCR 프로토콜(95℃에서 10초, 68-58℃에서 10초의 하이브리드화, 그 후 72℃에서 16초의 연장)에 의해 증폭이 수행된다. 각 사이클의 끝에서, SYBR Green에 의해 발산된 형광이 측정되었다.
증폭의 특이성을 확인하기 위하여, PCR 산물에 대해 체계적으로 용융 곡선의 분석이 수행되었다(LightCycler™ - Roche). 이를 위해, PCR 산물은 0.1℃/s의 증가율로 58℃에서 98℃까지 증가하는 온도에서 처리되었다. 각각의 PCR 산물에 대해, 특이적 용융 온도를 특징으로 하는 곡선을 분석하는 동안 단일 피크가 얻어졌다.
하우스키핑 유전자 CPB의 정량화에 필요한 프라이머의 조합이 Search-LC(Heidelberg, Germany; 참조번호 488116)에 의해 제공되었다.
하우스키핑 유전자 시클로필린 B의 mRNA의 양에 대해 상대적인 표적 mRNA의 양은, LightCycler Relative Quantification Software™(Roche Molecular Biochemicals)를 사용한 상대적 정량화 기법에 의해 분석되었다. LightCycler™ 소프트웨어(Roche)의 "이차 도함수 최대 방법(Second Derivative Maximum Method)"이 각 샘플에 대해 "교차점(Crossing Point: Cp)"을 자동적으로 결정하기 위해 사용되었다. Cp의 값은 형광이 배경 소음과 유의적으로 달라지기 위한 사이클의 횟수로서 정의되었다.
다섯 개의 일련의 1/10 희석이, 복제수(copy number)의 로그의 함수로서 Cp를 나타내는 검량선을 만들어내기 위하여, 각각의 표준에 대해 4번 수행되었다. 표준 희석이 최적화되었으며, 이에 따라 검량선은 표적 유전자 및 하우스키핑 유전자에 대해 예상되는 발현 수준을 포함시켰다. 표적 유전자 및 하우스키핑 유전자에 대한 PCR의 효과를 나타내는 상대표준 곡선이 만들어졌으며, 이는 LightCycler Relative Quantification Software(Roche Molecular Biochemicals)에 의한 정량화를 수행하기 위해 사용되었다.
일변량 분석 및 다변량 분석의 결과
병원감염의 발생에 영향을 미치는 변수를 결정하기 위하여, 일변량 분석이 수행되었으며, 그 후 다변량 분석이 수행되었다. 상기 일변량 분석은, 패혈성 쇼크가 개시된 후 D7 내지 D10에 mRNA의 S100A9 마커에 대해 그리고 다양한 변수들의 함수로서 병원감염에 걸리거나 걸리지 않은 상태의 로지스틱 회귀 분석을 함으로써 수행된다. 그 후, 다변량 로지스틱 회귀 분석이 일변량 분석과 0.15보다 작은 유의수준 (p)을 나타내는 변수들에 대해 수행된다. "백워드(backward)" 선택 방법(시작할때 모든 변수들이 모델에 산입되고, 그 후 변수들은 하나씩 제외됨)이 유의적 역치 값(significance threshold) 0.05에서 사용된다. 그 결과는 하기 표 3에 나타낸다. 오즈비(O.R.)와 이의 95% 신뢰구간이 각 결과에 대해 보여진다.
일변량 분석(N=93) 다변량 분석(N=93)
OR 95% CI p OR 95% CI p
성별
 남성 1 - -
여성 1.6 0.641-3.997 0.3143
나이(년)
 > 65 1 - - - - -
≤65 2.04 0.814-5.115 0.1285 - - 0.1186
입원시의 SAPS II > 51 1 - -
≤51 1.107 0.450-2.723 0.8246
입원시의 SOFA < 10 1 - - - - -
≥10 3.036 1.132-8.144 0.0274 - - 0.1384
동반이환율(co-morbidity) 0 1 - -
≥1 1.021 0.414-2.514 0.9645
감염의 유형
 병원감염 1 - -
지역사회감염 1.144 0.467-2.803 0.7682
감염의 부위

 폐 1 - -
복부 1.735 0.644-4.672 0.3268
기타 1.172 0.299-4.597 0.8540
S100A9(mRNA)
 < 6.1 1 - - 1 - -
≥6.1 6.27 1.718-22.891 0.0055 6.242 1.662-23.447 0.0067
OR: 오즈비(Odds Ratio)
CI: 신뢰구간(confidence interval)
P: 유의적 역치 값(significance threshold)
상기 표 3에서 볼 수 있듯이, 다변량 분석에 따르면, 패혈성 쇼크가 발생한 후 7일 내지 10일에 6.1 이상의 S100A9 마커 발현은 병원감염의 발생 가능성을 유의적으로 증가시킨다(오즈비 6.2)는 점이 보여진다.
실시예 5 - S100A9 유전자 발현과 S100A8 유전자 발현의 상관관계의 조사
테스트 샘플
본 시험은 패혈성 쇼크가 진행되고 Lyon-Sud 병원의 외과 또는 내과 집중치료실에 수용된 86명의 환자 집단에 대해 수행되었다. 패혈성 쇼크 이후 D7, D8, D9 또는 D10에(H0는 승압 치료의 개시 시점임), 이들 환자로부터 샘플이 수집되었다.
RNA의 추출과 cDNA의 합성
각 환자에 대해, 생물학적 샘플은 패혈 증후군(환자 SEP)이 개시된 이후 첫 10일 동안 매일 획득한 혈액 샘플이다. 이러한 샘플들은 PAXgene™ Blood RNA 튜브(PreAnalytiX, Frankin Lakes, USA)에서 직접적으로 수집되었다.
혈액 샘플을 수집하는 단계 이후에 세포의 완전한 용해를 달성하기 위하여, 상기 튜브를 4시간 동안 실온에 놓아두었으며, 그 후 생물학적 물질을 추출할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 보다 정확하게 말하자면, 상기 프로토콜에서, 전체 RNA는 제조업자의 권고에 따라 PAXgene Blood RNA® 키트(PreAnalytiX)에 의해 추출되었다. 요약하면, 상기 튜브는 원심분리되어(10분, 3000g), 핵산 펠릿이 수득되었다. 상기 펠릿은 세척되었으며, 단백질의 소화에 필요한 프로테이나제 K를 함유하는 완충액 내에 포함되었다(55℃에서 10분). 반복 원심분리(5분, 19000g)가 수행되어 세포 잔해가 제거되었으며, 핵산의 고정을 위한 조건을 최적화하기 위해 에탄올이 첨가되었다. 전체 RNA가 컬럼 PAXgene RNA 스핀 컬럼™상에 특이적으로 고정되었으며, 컬럼의 용출 이전에 RNAse free DNAse set™(Qiagen Ltd, Crawley, UK)를 사용하여 오염 DNA의 소화가 수행되었다.
각각의 추출에 대해, 전체 RNA의 질은 RNA 6000 Nano Chip™ 키트(Agilent technologies)를 사용하여 모세관 전기영동에 의해 확인되었다. 사용된 기구는 bioanalyzer 2100™이다. 역전사(RT) 반응은 최종 부피 20　μl에서 수행되었다. 전체 RNA(0.5　μg)는 1　μl의 50　μM 올리고(dT) 및 1　μl의 어닐링 완충액과 혼합되었으며, 그 후 65℃에서 5분 동안 인큐베이트되었다. 얼음에서 냉각한 후에, 상기 용액은 10　μl의 2x First Strand Reaction Mix 및 2　μl의 SuperScript III/RNase OUT Enzyme Mix RT(15 U/μl)와 혼합되었으며, 상기 모든 생성물들은 SuperScript First Strand Synthesis Super Mix™ RT-PCR 시스템(Invitrogen)으로부터 수득된 것이다. 역전사는 50℃에서 50분 동안 수행되었으며, 그 후 85℃에서 5분 동안 인큐베이션되었다. 마지막으로, cDNA의 각 용액은 DEPC 물에서 1/10까지 희석되었다.
정량화를 위한 표준 범위의 제조
건강한 대상체로부터 획득한 cDNA의 풀에서 시작하여, S100A9 표적 유전자(GenBank No. NM_002965.3)의 153-179 영역의 증폭이 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)에 의해 수행되었으며, 이는 하기의 프라이머 쌍을 이용하여 포화될 때까지 실시되었다:
센스 프라이머: 5'-TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3'(서열번호 1)
안티센스 프라이머: 5'-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3'(서열번호 2)
건강한 대상체로부터 획득한 cDNA의 풀에서 시작하여, S100A8 표적 유전자(GenBank No. NM_002964.3)의 129-280 영역의 증폭이 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)에 의해 수행되었으며, 이는 하기의 프라이머 쌍을 이용하여 포화될 때까지 실시되었다:
센스 프라이머: 5'-ATTTCCATGCCGTCTACAGG-3'(서열번호 3)
안티센스 프라이머: 5'-CACCAGAATGAGGAACTCCT-3'(서열번호 4)
실시간 정량적 PCR에 의한 mRNA의 발현의 분석
전술한 바와 같이 cDNA로 역전사된 S100A9 및 S100A8 표적 유전자의 mRNA는 LightCycler™ 2.0(Roche)를 사용하여 실시간 정량적 PCR에 의해 정량화되었다. PCR 반응은 Fast-Start™ DNA Master SYBR Green I 실시간 PCR 키트(Roche Molecular Biochemicals)를 사용하여 수행되었다. 각각의 PCR은 3.6　μl의 물, 2.4　μl의 MgCl2, 2　μl의 SYBR Green mix(Fast start DNA master SYBR green + Taq DNA 폴리머라제) 및 1μl의 각각의 프라이머(10　μM) 및 10　μl의 cDNA 용액을 포함하는 최종부피 20　μl에서 수행되었다. 사용된 프라이머는 전술한 것과 같다.
95℃에서 10분의 변성 단계 이후에, 40회 사이클의 "터치-다운(touch-down)" PCR 프로토콜(95℃에서 10초, 68-58℃에서 10초의 하이브리드화(0.5℃/사이클), 그 후 72℃에서 16초의 연장)에 의해 증폭이 수행된다. 각 사이클의 끝에서, SYBR Green에 의해 발산된 형광이 측정되었다.
증폭의 특이성을 확인하기 위하여, PCR 산물에 대해 체계적으로 용융 곡선의 분석이 수행되었다(LightCycler™ 2.0 - Roche). 이를 위해, PCR 산물은 0.1℃/s의 증가율로 58℃에서 98℃까지 증가하는 온도에서 처리되었다. 각각의 PCR 산물에 대해, 특이적 용융 온도를 특징으로 하는 곡선을 분석하는 동안 단일 피크가 얻어졌다.
하우스키핑 유전자 CPB의 정량화에 필요한 프라이머의 조합이 Search-LC(Heidelberg, Germany; 참조번호 488116)에 의해 제공되었다.
하우스키핑 유전자 시클로필린 B의 mRNA의 양에 대해 상대적인 표적 mRNA의 양은, LightCycler Relative Quantification Software™(Roche Molecular Biochemicals)를 사용한 상대적 정량화 기법에 의해 분석되었다. LightCycler™ 소프트웨어(Roche)의 "이차 도함수 최대 방법(Second Derivative Maximum Method)"이 각 샘플에 대해 "교차점(Crossing Point: Cp)"을 자동적으로 결정하기 위해 사용되었다. Cp의 값은 형광이 배경 소음과 유의적으로 달라지기 위한 사이클의 횟수로서 정의되었다.
다섯 개의 일련의 1/10 희석이, 복제수(copy number)의 로그의 함수로서 Cp를 나타내는 검량선을 만들어내기 위하여, 각각의 표준에 대해 4번 수행되었다. 표준 희석이 최적화되었으며, 이에 따라 검량선은 표적 유전자 및 하우스키핑 유전자에 대해 예상되는 발현 수준을 포함시켰다. 표적 유전자 및 하우스키핑 유전자에 대한 PCR의 효과를 나타내는 상대표준 곡선이 만들어졌으며, 이는 LightCycler Relative Quantification Software(Roche Molecular Biochemicals)에 의한 정량화를 수행하기 위해 사용되었다.
결과의 분석
S100A9 유전자의 발현이 S100A8 유전자의 발현과 상관관계가 있는지 여부를 결정하기 위하여, 상관관계 분석이 수행되었다. 도 1에 나타난 결과는, 스피어만 계수(Spearman coefficient)가 0.90보다 큰 2개의 분자 S100A9 및 S100A8의 유전자 발현 사이에 강한 상관관계가 존재한다는 점을 보여준다. 따라서, 분자 S100A9 및 S100A8의 유전자 발현은 병원감염에 걸릴 수 있는 환자를 구별하는 능력과 패혈 증후군의 진행을 예후하는 능력에서 유사성을 나타낸다.
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Claims (32)

  1. 하기 단계를 포함하는, 패혈증이 발생한 환자의 병원감염에 걸릴 민감성을 결정하는 방법:
    a) 패혈증이 발생한 환자에게서 수득된 생물학적 샘플로부터 생물학적 물질이 추출되는 단계,
    b) S100A9 표적 유전자의 발현 산물의 하나 이상의 특이시약이 제조되는 단계로, 상기 특이시약이 S100A9 표적 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 증폭 프라이머 또는 하이브리드화 프로브를 포함하거나, 또는 S100A9 표적 유전자의 발현 산물에 대해 특이적인 하나 이상의 항체를 포함하는, 단계,
    c) 표적 유전자 S100A9의 발현이 결정되는 단계, 여기서 특정 역치 값에 대해 상대적으로 과발현은 병원감염에 걸릴 민감성의 지표를 나타냄.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 S100A9 표적 유전자의 발현이 상기 c) 단계에서 결정되며, 여기서 특정 역치 값에 대해 상대적인 S100A9 표적 유전자의 과발현은 병원감염에 걸릴 민감성의 지표를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은, 감염과 연관되는지 여부에 관계없이 전신성 염증 반응을 나타내는 환자로부터 획득된 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플이 혈액 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 생물학적 물질이 핵산 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 S100A9 유전자의 발현 산물의 특이시약이, S100A9 표적 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 증폭 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 S100A9 유전자의 발현 산물의 특이시약이, S100A9 표적 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 하이브리드화 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 S100A9 유전자의 발현 산물의 특이시약이, S100A9 유전자의 발현 산물에 대해 특이적인 하나 이상의 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 삭제
  12. 패혈증이 발생한 환자가 병원감염에 걸릴 민감성을 결정하기 위한, S100A9 유전자의 발현 산물의 하나 이상의 특이시약의 사용방법으로, 상기 특이시약이 S100A9 표적 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 증폭 프라이머 또는 하이브리드화 프로브를 포함하거나, 또는 S100A9 표적 유전자의 발현 산물에 대해 특이적인 하나 이상의 항체를 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 S100A9 유전자의 발현 산물의 특이시약이, S100A9 표적 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 하이브리드화 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용방법.
  14. 삭제
  15. 제12항에 있어서,
    상기 S100A9 유전자의 발현 산물의 특이시약이, S100A9 표적 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 증폭 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용방법.
  16. 삭제
  17. 제12항에 있어서,
    상기 S100A9 유전자의 발현 산물의 특이시약이, S100A9 유전자의 발현 산물에 대해 특이적인 하나 이상의 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용방법.
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