TW577744B

TW577744B - Medicinal compositions containing 3,6-anhydrogalactopyranose as active ingredient

Info

Publication number: TW577744B
Application number: TW089100722A
Authority: TW
Inventors: Tatsuji Enoki; Hiroaki Sagawa; Jun Tomono; Takanari Tominaga; Eiji Nishiyama
Original assignee: Takara Shuzo Co
Priority date: 1999-01-20
Filing date: 2000-01-18
Publication date: 2004-03-01
Also published as: WO2000043018A1; CN1344162A; EP1166786A1; CN1304008C; US6608032B1; KR20010089808A; EP1166786A4; AU2005300A

Description

577744 A7 B7 五、發明説明（技術領域本發明係關於一種醫藥組合物；詳言之，係關於一種以來自藻類之生理活性物質作為有效成分的醫藥品。此外，本發明亦關於一種含有該生理活性組合物之機能性飲食品。技術背景炎症，一般認為是生物體為防禦外來之侵襲而發動，產生内因性的活性物質，以調適身體狀態的結果。然而，由其所引發的反應卻往往造成危害，而導致疾病狀態。此外，發生於自體免疫疾病中之炎症，其免疫細胞會將自體視為異物，即使是正常細胞，也會對其產生有害的反應。屬於自體免疫疾病之一種的慢性關節性風溼，係一發生於關節部位之特異性炎症；此種慢性關節性風溼的藥物治療法，包括以固醇類、非固醇類抗炎症劑，以及金、 D -音黴胺等寬解導入藥劑所進行之内科治療方式。將瓊脂等衍生自藻類之寡糖作為食品素材的開發工作，正受到廣大的期待（Food Chemicals，1988-2，40-44 ;別冊 Food Chemicals-4，1990 年 12 月，127·131 ;特開平 6- 38691號）；但對於其等之抗炎症作用、抗風溼作用等，卻尚不明。發明目的本發明之目的在於開發一種具有抗炎症作用及抗風溼作用等生理機能之高安全性物質，並提供一種用於對該化 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐)

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:物具有感受性之疾病，而以該物質作為有效成分之抗人症劑及抗風溼劑等醫藥品，以及一種以該物質作為構成成分之機能性飲食品。本發明之揭示内容以下茲對本發明作一概說：本發明之第一項發明，係_ 種醫藥組合物，其係用於治療或預防糖尿病、風溼、須抑制炎症之疾病、須抑制α_葡糖菩酶之疾病、須抑制前列腺素合成之疾病、須抑制内毒素休克之疾病、須抑制間白素產生之疾病、須謗發血紅素加氧酶產生之疾病、員抑制腫瘤壞死因子產生或抑制發癌之疾病；該組合物係包含至少一種選自下列之化合物作為有效成分：選自式（I) (I) 所示之3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛體、其水合物及彼等之甲基化體或2-0·硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物。本發明之第二項發明，係一種疾病症狀改善用飲食品或疾病預防用飲食品，其係用於改善或預防糖尿病、風邊、須抑制炎症之疾病、須抑制α -葡糖:y：酶之疾病、須抑制前列腺素合成之疾病、須抑制内毒素休克之疾病、 -5 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)

裴

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線 577744 A7 B7 五、發明説明（3 ) 須抑制間白素產生之疾病、須謗發血紅素加氧酶產生之疾病、須抑制腫瘤壞死因子產生或發癌之疾病；該組合物中包含、添加及/或稀釋有至少一種選自下列之化合物：選自式（I)所示之3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛體、其水合物及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物。本發明之第三項發明，係選自式（j)所示之3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛體、其水合物及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物中至少一種化合物，用於製造抗糖尿病劑、抗風澄劑、杬炎症劑、α -葡糖苷酶抑制劑、前列腺素合成抑制劑、内毒素休克抑制劑、間白素產生抑制劑、血紅素加氧酶產生謗發劑、腫瘤壞死因子產生抑制劑或發癌抑制劑上之用途。圖式簡要說明、圖1 ·添加壤脂二糖、瓊脂四糖或瓊脂六糖後，於各種培養條件下培養時，其培養基中之Ν02·濃度圖。、圖2 ·添加瓊脂二糖、瓊脂四糖或瓊脂六糖後，於各種條件下培養時，其培養基中細胞内過氧化物量在正系範圍内之細胞所佔比例（％)圖。、圖3 ·添加瓊脂二糖、瓊脂四糖或瓊脂六糖後，於各種 ^養^件下培養時’其培養基中之前列腺素Ej度圖。圖4 ·於各種培養條件下培養時，其培養基中之濃

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k -6 577744 A7 ---—____B7 五、發明説明（4 ) 圖5 :於各種培養條件下培養時，其培養基中之前列腺素1濃度圖。圖6 ··本發明寡糖對於小鼠π型膠原蛋白關節炎模型之預防效果圖。圖7:本發明寡糖對於小鼠π型膠原蛋白關節炎模型之治療效果圖。圖8 ··本發明寡糖對於路易士大鼠在糖負荷後血糖值上昇之抑制作用圖。圖9·本發明寡糖對於自然發病之糖尿病大鼠的血糖值降低作用圖。圖10 :本發明寡糖對於自然發病之糖尿病大鼠在糖負荷後血糖值上昇之抑制作用圖。圖11 :本發明寡糖對於以ΤΡΑ謗發之小鼠耳殼浮腫模型的浮腫抑制作用圖。圖12 :本發明寡糖對於以τρΑ謗發之小鼠發癌模型的發癌抑制作用圖。圖中Α表對腫瘤數之作用，Β表對腫瘤發生率之作用。圖13 :於各樣本中添加花生四烯酸時之前列腺素^生成圖》圖14 :於各樣本中添加前列腺素&時之前列腺素匕生成圖。 _ 圖15 :添加各樣本時之前列腺素I生成圖。圖16·於各培養條件下培養時，其培養上清液中之濃度圖。本紙張尺度適用中國囷家標準(CNS) A4規格(21〇 x 297公釐) A7 B7 五、發明説明（5 ) 圖17 :各培養條件下之培養上清液中的IL-6濃度圖。圖18 ·於各培養條件下培養時，其培養上清液中之IL- W濃度圖^ 發明詳細說明本發明中’由式（I)所示之3,6_脫水吡喃半乳糖（以下僅稱3,6-脫水吡喃半乳糖），其醛體即為下式（1)1所示之化合物；其水合物即為下式（1)11所示之化合物。此外，3,6_脫水咐喃半乳糖之甲基化體及2·〇·硫酸化體，即下式示之化合物；彼等之搭體，則為下式VI及νπ 物；至於彼等之水合物，則為下式vnuux所式II :

(II) (III) 式I V :

本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) (IV) 577744 A7 B7 五、發明説明（6 ) 式V :

(V) 式V I :

(VI)

式V I

(VI I) 式V I I I :

(VIII) -9 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) ^ / / /44 A7

式I X :

說月β中'式⑴-IX的構造，雖亦可以其他表現形式二ΐ此處則以前面所列之式⑴·ΙΧ來涵蓋該等其他表現=式或彼等所有可能之互變異性體。其次，式⑴·ΙΧ (IX) 組配置万式，只要具有所需之活性，並無特別限疋，不論是D-型、L•型’或其等之混合物，均無不可。本發明〈可溶性糖化合物雖無特別限定，不過由於其為含有至^種選自3,6•脫水p比喃半乳糖、其兹體、其水合物及彼等之2-0-甲基化體或2_〇_硫酸化體之化合物(以下將之總稱為「式⑴·ΙΧ化合物」）的可溶性糖化合物，其製法係將含有至少-種式⑴_Ιχ化合物之物質（以下僅稱原料物質），於低於ρΗ7之酸性條件下，經由酸分解及/或酵素分解而製得，或是利用化學合成法製得亦可。本發明之可溶性糖化合物，只要是使用時不會固化或半固化 (凝膠化）之化合物即可，並無特限定。從而，含有至少一種選自式（I)-DC之化合物且使用時會溶膠化的糖化合物，即包含於本發明之可溶性糖化合物之範疇中。至於較為適用於本發明之可溶性糖化合物，則包括諸如該等非還原端為L-半乳糖-6-硫酸以外之糖的糖化合物等，例如瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖 '瓊脂八糖、κ -角叉二糖 -10-

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及…吡半乳糖基脫水-2-0-甲基-L-半乳糖等糖化人物。 ° 用於製得該可溶性糖化合物之原料物質並無特別限定，例如瓊脂糖、瓊脂膠、呋諾蘭（7/今>)、卜啉（水爪7^ 今夕）、角叉聚糖、夫魯西拉藍（7瓜七今今y)、黑普内安 (匕7幸7>)等紅藻之黏質多糖（共立出版（株）發行，多糖生化學1-化學編，_ ,第314頁（1969))。此外，含有此等多糖之物質，亦可作為原料物質。例如，在瓊脂糖、瓊脂膠之原料方面，可利用石花菜科之瑪草（7夕寸）、歐呢草 (才二〆寸）、歐柏草（才才7、、甘）、由依可利（二彳丰y )等，海髮海苔科之海髮、歐海髮（才才才)等，伊葛斯科之伊葛斯、艾葛海苔（工リ）等，或是其他的紅藻類；通常是混合搭配數種藻類以作為原料。原料藻類一般是用已在日曬下乾燥過者；但本發明中可用生的藻類及乾燥過的藻類。其次，亦可用該等在乾燥蒸發水分同時進行漂白、一般稱為漂白原藻者。以熱水萃取原料藻類後，經由冷卻手續，即可獲得洋菜凍。以凍結脫水或壓榨脫水的方式，自此洋菜凍中除去水分，並加以乾燥後，製得瓊脂。瓊脂之使用，不僅不論其來源藻類為何，且可製為棒狀、帶狀、板狀、線狀、粉末狀等各種型態使用。通常瓊脂中含有約7〇%之瓊脂糖以及約30%之瓊脂膠；當進_步純化後，亦可調製出更高純度之瓊脂糖《對純化瓊脂糖而言，從純度低者至純度南者’不論其瘦脂糖含量如何，均可使用。 -11 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

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發明説明原料物質中，包括前述瓊脂之原料藻類、洋菜凍、純化壤月HI糖、純化瓊脂膠，以及此等物質之製造步騾中所得的中間產物或副產物等。瓊脂糖為一種以交互結合之D-半乳糖與3,6-脫水半乳糖為王結構的多糖，其係D-半乳糖之第i位置與3,6·脫水_ L-半乳糖 < 第4位置，經由糖甞鍵而相互键結；或是 3,6·脫水-L-半乳糖之第！位置與D_半乳糖之第3位置，經由α·糖：y：鍵而相互鍵結^ α-1，3鍵結可利用稀酸進行溫和水解’或是用α_瓊脂糖酶（Carb〇hydr Res，第66卷，第 207頁（1978))進行水解，·而β-1，4鍵結則可用β -瓊脂糖酶加以選擇性地水解。此外’角又聚糖則是一種存在於司葛海苔科（只半乂 U )、味林科（U y )、茨海苔科（彳〆今y y )等紅藻類中之多糖；目前已知有κ -角叉聚糖、λ -角叉聚糖、η -角又聚糖。 κ -角叉聚糖具有由d_半乳糖_4 -硫酸之第1位置與3,6_ 脫水-D -半乳糖之第4位置經由β -糖甞鍵結所交互重複構成之基本構造，或是由3,6-脫水-D-半乳糖之第1位置與 D 半乳糖-4 -硫酸之第3位置經由α _糖甞鍵結所交互重複構成之基本構造。λ·角叉聚糖具有由D·半乳糖乏第1位置與D -半乳糖-2,6-二硫酸之第4位置經由β -糖甞鍵結所交互重複構成之基本構造，或是由D-半乳糖-2,6-二硫酸之第1位置與D -半乳糖之第3位置經由α -糖芸鍵結所交互重複構成之基本構造。角叉聚糖目前一般是作為食品的凝 -12- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4规格(21〇χ297公釐)

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(10 五、發明説明膠化劑使用。八，前述原科物質以化學、物理及/或酵素方法加刀解後所得者，亦包含於本發明原料物質之範園内。刀其中’化學分解方法例如於酸性至中性條件下之水解作用，物理分解方法例如利用電磁波及超音波等照射，至於酵素分解方法，則例如利用諸如瓊脂糖酶等水解酵素進行水解。糖酶將原料物質於酸性至中性條件下進行水解時，其分解條件/、要疋適cr下列化合物生成者均可，並無特別限定^ ，有抗糖尿病作用、抗風溼作用、抗炎症作用、心葡糖荅酶抑制作用、前列腺素合成抑制作用、内毒素休克抑制作用、間白素產生抑制作用、血紅素加氧酶產生謗發作用、腫瘤壞死因子產生抑制作用及/或發癌抑制作用的式（Ι)-ΙΧ化合物、至少含有一種此等化合物之可溶性糖化合物-例如瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、 κ-角叉二糖（以下僅稱角叉二糖）及卜D-吡半乳糖基-3,卜脫水-2-〇-甲基-L-半乳糖等糖化合物，或是非還原端為L· 半乳糖-6 -硫酸以外之糖，而於其還原端則具有選自式 (I)-IX化合物之糖化合物。舉例而言，將原料物質溶解於或懸浮於酸中，並使其反應，即可生成本發明所使用之選自式（I)-IX之化合物，以及至少含有一種此等化合物之可溶性糖化合物。再者，如於反應時加熱，則生成前述之選自式（I) -IX之化合物，以及至少含有一種此等化合物之可溶性糖化合物所需的 -13- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 577744 A7 -----__B7 _;__ 五、發明説明（11 ) 反應時間，將可獲得縮短。原料物質（例如瓊脂糖或含有瓊脂糖之物質等）所溶解或所懸浮之酸，其種類並無特別限定，可用鹽酸、硫酸、硝酸等無機酸，檸檬酸、甲酸、醋酸、乳酸、抗壞血酸等有機酸’或是陽離子交換樹脂、陽離子交換纖維、陽離子交換膜等固體酸等。酸的濃度亦無特別限制，可使用〇〇〇〇1-5當量，較佳為〇·〇〇 Μ當量之濃度。此外，反應溫度亦無特別限制，可將之设定為0-200Χ：，較佳為20-130°C。其次，反應時間也沒有特別限制，可設定為數秒至數日之間。酸的種類及濃度、反應溫度及反應時間，須依作為原料之至少含有一種選自式（I) -IX之化合物之物質（例如壤脂糖、角叉聚糖等）之種類，以及作為目的化合物之選自式（〗）之化合物、含有此等化合物之糖化合物的生成量、作為目的化合物於還原端具有選自式（Ι)-Ιχ之化合物之可溶性糖化合物之聚合度等因素，加以適當選擇。一般而言，選擇比弱酸更強之強酸、比低濃度之酸更高濃度之酸、比低溫更高之高溫，即可使酸分解反應更快速地進行。此外，當使用固體酸時，一般而言，強陽離子交換樹脂的分解反應效率，比起弱陽離子交換樹脂，要來得高。而當其相對於原料物質之使用量越多時，或其作用溫度越高時’酸分解反應亦可加速進行例如，將瓊脂以1 0重量％之濃度懸浮於0 1Ν鹽酸中，在 100°C下加熱13分鐘使其溶解，除去不溶物後所得之本發 -14- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X297公釐） ---------- 577744 A7 B7 五、發明説明（12 ) 明中所用的糖化合物溶液，即使將之冷卻，於其結冰點也不會凝膠化。將此液中所含糖類，以凝膠過濾hplc、順相HPLC等方法加以分析時，將幾乎不會見到高分子糖類之存在’其大部分皆分解為可溶性之1 0糖以下的糖化合物°同樣地，在使用固定酸之情形，將1重量比例之市售強陽離子交換樹脂Na型，以1N鹽酸使成11型後，將其加入7 9重量比例之脫鹽水中，再加入丨〇重量比例的瓊脂使其懸浮’於95 t下加熱180分鐘後，所得之本發明糖化合物溶液，即使將之冷卻，於其結冰點也不會凝膠化。將此液中所含糖類，以凝膠過濾HPLC、順相HPLC等方法加以分析時，將幾乎不會見到高分子糖類之存在，其大部分皆分解為可溶性之1 0糖以下的糖化合物。此外’在製造本發明中所用之該等於還原端具有選自式 (I) -IX化合物之可溶性糖化合物之際，如利用檸檬酸、乳酸、韻果酸等有機酸，並於酸濃度數10 mM至數Μ間，加熱溫度70-95°C間，加熱時間數1 〇分至24小時間，選擇適當的反應條件，即可大量地生成具有生理活性的寡糖，例如抗氧化作用寡糖。此外，於水解後，如維持其酸性而不令其變為鹼性環境，則所生成之該生理活性寡糖將具有長期間的保存安定性。本發明中所用之選自式（I) -IX化合物，以及至少含有一種此等化合物之可溶性糖化合物，例如瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ -角叉二糖及β-Κ吡半乳糖基-3,6-脫水-2-0-甲基_L-半乳糖等糖化合物，可直接用 -15- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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原料物質之分解物本身，或是加以中和後再使用亦可· 此外也可將之純化後使用。選自式（1)-汉化合物，以友於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物，例如壤脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、^角叉二糖 D-吡半乳糖基-3,6-脫水半乳糖等寡糖，可用諸如編程性細胞死亡謗發活性或制癌活性作為指標，而加以純化。純化方法可為化學方法、物理方法^ ^種習知純化方法；亦可組合各種傳統上習知純化方法，包括凝膠過濾法、利用分子量分液膜所進行之分液法、溶劑萃取法、利用離子交換樹脂等各種層析法，即可純化該等於酸分解物中所生成、且具有編程性細胞死亡謗發活性之目標物質，亦即前述之選自式（Ζ) -Ιχ化合物，以及至少含有一種此等化合物之可溶性糖化合物。如此所得之化合物，其構造可藉由質量分析法、核磁共振法、紫外線吸收光譜之測定、紅外線吸收光譜之測定等各種習知方法來加以解析。本發明有效成分中之一個例子，亦即壤脂二糖，係D _ 半乳糖之第1位置與3,6_脫水-L-半乳糖之第4位置，經由 β_糖謀鍵而鍵結之雙糖。由於3,6-脫水-L·半乳糖之第1 位置為變旋異構物之碳原子，因此存在有α型與β型；二者均涵蓋於本發明所用的瓊脂二中。本發明中作為有效成分使用之該等於還原端具有選自式 (1) -IX化合物之糖化合物，係糖與選自式（！）-ΙΧ之化合物的第1位置以外之羥基相結合所構成者；只要其為具有抗 -16 - 本紙張尺度適財® ®家標準(CNS) Α4規格(21GX 297公爱)

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線 577744 A7 ^_B7 五、發明説明（14 ) 糖尿病作用、抗風溼作用、抗炎症作用、α -葡糖甞酶抑制作用、前列腺素合成抑制作用、内毒素休克抑制作用、間白素產生抑制作用、血紅素加氧酶產生謗發作用、腫瘤壞死因子產生抑制作用及/或發癌抑制作用之化合物即可’並無特別限制。例如，其可為原料物質之分解物，包括瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、瓊脂十糖及β-D-吡半乳糖基_3,卜脫水甲基-L-半乳糖等瓊脂糖之酸分解物或α -瓊脂糖酶分解物等。此外’亦可為角叉聚糖之酸分解物或角叉糖酶分解物，例如角叉二糖等。其次，本發明之該等於還原端具有選自式（I) -IX化合物之糖化合物中，亦包括由選自葡萄糖、甘露糖、半乳糖等己糖，木糖、阿拉伯糖、核糖等戊糖，葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、古洛糖醛酸等糖醛酸，葡糖胺、半乳糖胺等胺糖，乙醯神經胺酸等唾液酸，岩藻糖等脫氧糖，以及彼等之酯類、醯胺及内酯中之一個或複數個，與選自式（][卜Ιχ之化合物的第i位置以外之經基相結合所構成者。另外，在此等於還原端具有選自式（I) -IX化合物之糖化合物上，例如瓊脂二糖、瓊脂四糖、壤脂穴糖、瓊脂八糖、κ_角叉二糖及比半乳糖基_3,6-脫水-2-0-曱基_L-半乳糖等糖化合物上，結合有丙酮酸及/或硫酸基者，或是該糖化合物之幾基經甲基化者，均亦包括在本發明之該等於還原端具有選自式（1)_ IX化合物I糖化合物中。此外，如前所述，本發明之該等於還原端具有選自式（I) _IX化合物之糖化合物中，以其 -17- 表紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱) — -- 577744 A7 _ B7 五、發明説明（15 ) 非還原端為L -半乳糖-6-硫酸以外之糖為佳。於還原端具有3,6-脫水吡喃半乳糖或其2-〇-甲基化體之糖化合物，由於其還原端之化合物的第1位置為變旋異構物之碳原子，因此存在有α型與β型；二者均可作為前述之於還原端具有3,6·脫水吡喃半乳糖或其孓〇-甲基化體之糖化合物，而用於本發明。此外，孩等化合物只要具有抗糖尿病作用、抗風溼作用、抗炎症作用、CC -葡糖苷酶抑制作用、前列腺素合成抑制作用、内毒素休克抑制作用、間白素產生抑制作用、血紅素加氧酶產生謗發作用、腫瘤壞死因子產生抑制作用及/或發癌抑制作用等生理活性即可，至於分子量方面，並無特別限定。在本發明中所用之選自式（I) -Ιχ化合物，以及於還原端含有該化合物之可溶性糖化合物的還原端化合物方面，不論是α型、β型、醛型、含水型之混合物以及型、L-型之混合物等，均可作為該等化合物使用。如此，本發明中所用之選自式（Ι)-Ιχ化合物，以及於還原端含有該化合物之可溶性糖化合物的還原端化合物，皆具有抗糖尿病作用、抗風溼作用、抗炎症作用、心葡糖甞酶抑制作用、前列腺素合成抑制作用、内毒素休克抑制作用、間白素產生抑制作用、血紅素加氧酶產生謗發作用、腫瘤壞死因子產生抑制作用及/或發癌抑制作用，因此，根據本發明，首先便可提供一種治療劑或預防劑，其係用於糖尿病、風溼、須抑制炎症之疾病、須 -18-

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葡糖㈣之疾病、須抑制前列腺素合成之疾病、 =制内毒素休克之疾病、續抑制間白素產生之疾病、發血紅素加氧酶產生之疾冑、須抑制腫瘤壞死因子產生或抑制發癌之疾病，且該治療劑或預防劑中係包含至y種選自下列化合物以作為有效成分：選自式⑴_ιχ 之化Q物，以及於還原端含有該化合物之可溶性糖化合物。 . 本發明之治療用或預防用醫藥組合物，可作為抗糖尿病劑、抗風溼劑、抗炎症劑、^葡糖答酶抑制劑、血糖上昇抑制劑、抗高脂血症劑、抗肥胖劑、前列腺素合成抑制劑、内毒素休克抑制劑、間白素產生抑制劑、血紅素加氧酶產生謗發劑、腫瘤壞死因子產生抑制劑、活性氧產生抑制劑、一氧化氮（Ν〇)產生抑制劑、過氧化物產生抑制劑、發癌抑制劑等。風溼係一種於骨膜細胞或軟骨細胞中發生病變之疾病；而本發明中所用之化合物，由於具有滑膜細胞增殖抑制等作周，因此可作為抗風溼劑使用。此外’本發明中所用之化合物，對於慢性關節性風溼等内臟特異性自體免疫疾病或炎症性疾病，可抑制被認為是直接引起炎症的腫瘤壞死因子之產生。從而，炎症、風溼’特別是慢性關節性風溼等，其症狀便可因此獲得改善；作為炎症標記之C反應蛋白質（CRP)值、類風溼因子（rheumatoid factor, RF因子）值、紅血球沈降速度（血沈）值等均急速大幅下降，而步行困難等合併症狀亦有顯著 -19-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 577744 A7 B7 五、發明説明（17 ) 改善。腫瘤壞死因子，是以「謗發腫瘤部位出血性壞死之因子」而被發現的；不過現在其已被歸類於與炎症之基本反應，亦即活體防禦及免疫機制有廣泛相關的細胞動素之一種。此種腫瘤壞死因子在其產生的調節機制上具有相當大之缺漏，故對於宿主帶來各種不妥之處；無論是腫瘤壞死因子的過度產生或在未調節之情況下的產生，都與諸多的疾病有關，包括慢性關節性風溼、風溼性脊髓:炎、變形性關節症、痛風性關節炎、敗血症、敗血性休克、内毒素休克、革蘭氏陰性菌敗血症、毒性休克症候群、腦性瘧疾、慢性肺炎、移植物對宿主反應、同種宜植物排斥反應、流行性感冒等感染症所致之發熱及肌肉痛、感染或惡性腫瘤之二次性惡液質、人類後天性免疫不全症候群（AIDS)之二次性惡液質、AIDS相關症候群、蟹足紅斑性狼瘡腫形成、潰瘍性大腸炎、多發性硬化症、自體免疫糖尿病及全身紅斑性狼瘡等自體免疫疾病 (Molecular Medicine，第 33 卷，第 1010-1020頁，第 1182-1189頁（1996)) » 本發明之腫瘤壞死因子產生抑制劑，可用於治療由腫瘤壞死因子所媒介之病狀，或是因該因子而惡化之病狀。本發明中所用之化合物，亦可_抑制氧化物質（例如活性氧）之產生，因此以該化合物作為有效成分之諸如活性氧產生抑制劑等抗氧化劑，便可用來治療或預防各種導因於活性氧之產生及/或過剩的疾病。 -20- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱·)

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本發明中所稱之「須抑制>^〇產生的疾病」，並無特別限疋包括由毒性休克或是以某種細胞動素進行治療時所致之全身性血壓低下、血壓反應低下、自體免疫疾病、炎症、關節炎、風溼性關節炎、糖尿病、炎症性腸病、血管機能不權、病因性血管擴張、組織損傷、心臟血管系缺血、痛感過敏症、腦缺血、伴隨血管新生之疾病、癌症等疾病。在腦缺血中及再灌流後，其N0之產生增加；伴隨而來的就是腦組織受到損傷。因此，當腦缺血時，如對患者投予本發明之NO產生抑制劑，即可減輕腦組織之損傷，其預後情況亦可獲得改善。組織之炎症以及疼痛之引起，均與花生四烯酸代謝有很大的關係《衍生自細胞膜磷脂質之花生四烯酸，於體内經由環氧化酶之作用，而代謝成前列腺素、前列環素、凝血黃素原三者。其中，前列腺素除具有血管擴張作用外，亦具有伴隨血管擴張而生之流向内臟血流增加作用；尤其是在炎症部位，前列腺素1及12會因該血流增加作用，而增加浮腫與白血球浸潤現象。亦即，如投予本發明t前列腺素Ε2合成抑制劑，以抑制前列腺素之生合成，將可發揮鎮痛、抗炎症作用^再者，由於浸潤於炎症部位之白血球會產生活性氧2而引起氧化壓迫狀態，因此具有抑制前列腺素生合成作用之本發明前列腺素& 合成抑制劑，對於氧化壓迫所致之前述各種疾患、疾病之預防及治療，甚或防止惡化而言，均有極佳之功效。 -21 - 本紙張尺度適用中圉國豕標準(CNS) A4規格(210X297公爱) ---

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線 577744 A7 B7 五、發明説明（19 ) 此外，如前所述，N 0會謗發已被認為是炎症性病變特徵之浮腫現象，亦即血管通透性亢進作用，而造成炎症調介物-即前列腺素類-之生合成的亢進；經由本發明之 N 0產生抑制效果與前列腺素E 2合成抑制效果的相乘作用，在鎮痛、抗炎症作用，以及由氧化壓迫所致之各種疾患及疾病之預防與治療或防止惡化方面，將展現相乘之效果。如將強力發癌促發劑12-0-十四酿基弗波醇-13-乙酸酯 (TPA)塗布於皮膚，則塗布部位之細胞的花生四烯酸代謝作用將因此而受到促進，而產生前列腺素、白三烯、凝血黃素等化學物質。此等炎症性物質會使血管通透性亢進，引起皮膚浮腫。與花生四烯酸代謝產物有關的皮膚疾病’已知如紅斑、膨疹等急性蓴麻疹；故可抑制ΤΡΑκ 致之浮腫的物質，將可有效用於此等疾患上。此外，在 ΤΡΑ所致之皮膚疾病模型方面，因組織學上之類似點，一般是利用乾癖模型；因而可抑制ΤΡΑ所致浮腫之物質，亦可作為乾癖治療藥使用。在發癌的過程中，包括對細胞中DNA造成損傷之突變原性（起始）階段，以及細胞增殖失去控制（促進）階段；一般認為細胞之癌化必須經過此等過程。 DMBAi作用係作為起始劑，而ΤΡΑ則是作為促進劑而促進發癌。TPA之促進作用，除了直接性的變異作用外，尚知可藉由活體的炎症謗導而引起發癌作用。亦即，τρΑ 可自巨噬細胞等炎症細胞中，引aN〇、前列腺素匕等炎 -22- t纸張尺度適財g S家料(CNS) A4規格(2齡撕公爱)--- 577744 A7 B7 五、發明説明（20 ) 症性調介物之游離。前列腺素E2可選擇性地活化Th2細胞，而Th2細胞之活化又與Thl之抑制有關。另一方面， N 0則可選擇性地抑制Thl。如此，N 0與前列腺素E2對於 Thl之抑制作用，便會抑制活體對癌症之防禦機制，而謗導發癌。目前為止，由具有抑制前列腺素E2作用之 NSAID、固醇等所進行之發癌抑制作用，已有文獻提及。至今為止，關於綠茶或其成分中之兒茶酸類具有發癌抑制作用的發現，亦有若干文獻加以報告（Okabe，S.等人，Jpn. J. Cancer Res. 90: 733-739，1999; Yamane，Τ·等人，Molecular Medicine 33: 394-399，1996; Wang, Ζ·等人，Cancer Res· 52: 1162-1170，1992)。其他已揭示之發癌抑制物質，尚有維生素類、非固醇系抗炎症藥、鈣及硒之類的礦物質、N -乙醯基半胱胺酸等抗氧化物質等。關於寡糖之報告，則有今夕千二口一只之發癌抑制作用（Ponz de Leon等人，Scand. J. Gastroenterol. Suppl. 222: 72-75, 1997; Challa A.等人，Carcinogenesis 18: 517-521，1991)、半乳寡糖對大腸癌之發癌抑制作用 (Wijnands，Μ· V·等人，Carcinogenesis 20: 651-656，1999)，以及果寡糖（或寡果糖）對大腸癌之發癌抑制作用及胸部癌症之制癌作用等（Pierre，F.等人，Cancer Res. 57: 225-228, 1997; Taper，Η· S·等人，J· Nutr.」29: 1488-1491，1999)。然而，卻從未有關於瓊脂所衍生之寡糖具有此等發癌抑制作用的報告。由選自式（I) ·ΐχ之化合物以及於還原端含有該化合物之 •23- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(210X297公釐)

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---— _ B7 五、發明説明（21 ) 可溶性糖化合物所組成之群中選出的化合物，可抑制TPA 所致之炎症’並抑制由炎症因子所致之發癌作用。以選自此等化合物中之化合物作為有效成分，即可製造並提供發癌抑制劑、發癌抑制用飲食品。間白素係由淋巴球、單核球等所生產的蛋白質性生物活性物質之總稱。目前已知有間白素1-18之存在。本發明中所稱之間白素，可為IL-6、IL-10等。 IL-6作為謗導Β細胞之最終分化的分化因子，其cDna已經選殖元成^ IL-6不僅與免疫反應有關，亦參與造血系統、神經系統之細胞分化、急性反應等，並且與各種免疫異常及炎症性疾病、淋巴系統腫瘤之發病等，均有密切關係。此外，IL-6可謗導B細胞產生抗體，而產生^%、 IgG、IgA等各類型的免疫球蛋白；但其與IL-4並不相同，亦與類型轉換作用無關。再者，IL-6亦可作為B細胞或漿細胞之增殖因子而活動。另一方面，其亦與T細胞系有關；它可使T細胞增殖及分化^ IL-6也和造血系統有關； b與IL-3相互協調’使G 0期縮短’藉此令造血幹細胞增殖。此外，它亦可促進巨核球之成熟、謗導血小板增加。IL-6同時又與活體對於細胞或病毒感染及惡性腫瘤等所產生即刻反應的急性期反應有所關連。此外，IL-6與神經系統亦有關連，它由神經母細胞瘤及星狀細胞瘤等神經系細胞所分泌，而參與神經系統的分化謗導作用。於慢性關節性風溼及全身性紅斑性狼瘡等疾病中，均可見B 細胞之活化，使得患者的關節液中有高濃度之IL-6存在。 -24 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱) 577744 A7 B7 五、發明説明（22 ) -- 以全身，淋巴結腫脹為特徵之Castleman症候群，其血中的IL-6濃度亦非常高。具有類似自體免疫疾病症狀的心房黏液腫患者，其腫瘤細胞會產生大量的IL-6。此外，因為多發性骨髓瘤患者的骨髓瘤細胞，其增殖作用可為抗比-6 抗體所抑制，故IL-6本身即為骨髓瘤細胞之自身增殖因子的可能性極高。再者，於原發性絲球體腎炎患者的尿中’亦含有IL-6;因此il-6之作用亦包括作為腎絲球微血管間細胞之増殖因子（宮園浩平及菅村和夫編，Bi〇Science 用語予<7今”一：寸彳卜力彳>•增殖因子，28_29頁，羊土社（1995))。對於前述發病原因被認為是由IL-6異常產生所致之疾患’如投予本發明所用之化合物，即可抑制il_6 之產生，而達到治療或預防其症狀之目的。其次，須抑制IL-10產生之疾病，係包括例如伴隨免疫功能衰退之各種疾病。在血紅素加氧酶（HO)中，存在有33 kDa之HO-1與36 kDa 之HO-2兩個同工酶^ η〇·2，是在HO-1之N端多具有由20 個胺基酸殘基所構成的胺基酸序列；其餘部分之相同性雖僅有40-50%’然其南次構造卻十分相似。兩者均在其c 端具有疏水性區域，並經由此部分而與微粒體膜相結合。將微粒體以胰蛋白酶處理時，即可獲得具有血紅素分解活性之可溶性分液，因此含有活性中心.之大功能區域，應係突出於細胞質侧。 ΗΟ-1為一種謗導酵素，其可因為基質之血紅素、重金屬離子、特定種類的有機化合物、過氧化氫，或是熱衝 -25- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐） 577744 A7 B7 五、發明説明（23 ) 擊UV照射、缺血等各種化學性、物理性要因，而於各種細胞中被顯著地謗導出來β H0-2為一種構成酵素，其表現於各組織中，而於腦及精囊等中之活性為特高^ H 〇可將血紅素分解為膽綠素、co、鐵，而膽綠素再經由還原酶之作用，形成膽紅素。此膽紅素具有脂肪酸之抗氧化作用、脂質自由基之清除作用、伴隨嗜中性球之貪食而大量產生之氧自由基所致之璘脂質、中性脂肪、膽固醇之氫過氧化物的產生抑制作用、與動脈硬化發病深切相關的LDL(低密度脂蛋白）之產生抑制作用、單一態氧之清除作用等等抗氧化物質之活性；作為内因性抗氧化物質 I一份子’膽紅素在活體内擔負著極重要之任務。由於各種自由基不僅作用於脂質，亦作用於蛋白質、核酸等各種活體物質，成為引起慢性疾病、癌症之重要因素；而膽紅素則可減少此等自由基（水小7 4 U y研究會編，「求爪7 4 V ν·/\Λ的◦生命科學：遺傳病·尔沁·工學應用々◦展開」，東京化學同人（1995))。亦即，藉由謗導 H0，即可謗發具有抗氧化活性之膽紅素的產生，而可用於治療或預防由各種自由基所致之疾病。本發明中所用之化合物’由於可謗導H0之產生，因此對於前述各種須謗導H0產生之疾病的治療或預防而言，誠屬極為有用者。 . 前述之本發明治療用或預防用醫藥組合物，例如抗糖尿病劑’其製造方法係用至少一種選自下列化合物作為有效成分：選自式（I)-IX之化合物，以及於還原端含有該化 -26- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7

^物之可溶性糖化合物；再將之與習用的醫藥用載劑組〇，並予以製劑化，便可製得所欲之組合物。固：t而言，可將此等化合物搭配藥學上可接受之液狀或狀載劑，並視需要添加溶劑、分散劑、乳化劑、緩 ”劑、安定劑、賦形劑、結合劑、崩壞劑、潤滑劑等，製士蟀劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等固形劑、通常液劑、懸浮劑、乳劑等液劑。此外，亦可將之製成乾燥品，於其使用前再添加適當載劑，以令其呈液狀。本f明之醫藥組合物，可以口服劑，或是注射劑、點滴用劑等非口服劑等任何方式，投予需要之患者。醫藥用載劑可依前述投予型態及劑型加以適當選擇；如為口服劑，則可利用諸如澱粉、乳糖、白糖、甘露糖醇、叛甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽類等。此外，為配製口服劑，可再添加結合劑、崩壞劑、界面活性劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑、著色劑、香料等。另一方面，如為非口服劑，則可依常法，將本發明中作為有效成分之具有呈成性細胞死亡謗發性之糖化合物，溶於或懸浮於作為稀釋劑之注射用蒸餾水、生理食鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、落花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等中，再視需要添加殺菌劑、安定劑、等張化劑、無痛化劑等，而加以配製^ 本發明之醫藥組合物，應選用適合於其製劑型態的投予路徑。投予方法並無特別限定，内用、外用及注射等， -27-本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 577744 A7 B7

均無不可。如為注射劑，則可經由靜脈内、肌肉内、皮下、皮内等方法投予患者；至於外用劑中，亦包括劑。本發明醫藥組合物，例如抗糖尿病劑，其投予量應依其製劑型態、投予方法、使用目的及所施用之患者的年齡、體重 '症狀等，加以適當之設定；雖非絕對之用量，不過一般而言，製劑中所含有效成分之量，成人每日為10微克-200毫克/公斤。當然投予量會依條件之不同而有變動，有時只要用較前述投予量為少之量即為已足，有時則必須超過前述之用量範圍。本發明藥劑除了直接口服外，也可添加任意飲食品，而以日常方式攝同樣地，本發明的抗風溼劑、抗炎症劑、葡糖菩酶抑制劑、血糖上昇抑制劑、抗高脂血症劑、抗肥胖劑、前列腺素合成抑制劑、内毒素休克抑制劑、間白素產生抑制劑、血紅素加氧酶產生謗發劑、腫瘤壞死因子產生抑制劑或發癌抑制劑等，其製造方法係用至少一種選自下列化合物作為有效成分！選自式（Ι)-Ιχ之化合物，以及於還原端含有該化合物之可溶性糖化合物；再將之與習用的醫藥用載劑組合，並予以製劑化，便可製得所欲之組合物。此等製劑之製造，可依前述醫藥組合物之製法進行。此等抗風溼劑、抗炎症劑、α—葡糖甞酶抑制劑、血糖上昇抑制劑、抗高脂血症劑、抗肥胖劑、前列腺素合成訂

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577744 A7 _B7 五、發明説明（26 1 ~ 抑制劑、内毒素休克抑制劑、間白素產生抑制劑、血紅素加氧酶產生謗發劑、腫瘤壞死因子產生抑制劑或發癌抑制劑，應選用適合於其製劑型態的投予路徑。投予方法並無特別限定，内用、外用及注射等，均無不可。如為注射劑’則可經由靜脈内、肌肉内、皮下、皮内等方法投予患者；至於外用劑中，亦包括坐劑。此外，此等抗風溼劑、抗炎症劑、α -葡糖：y：酶抑制劑、血糖上昇抑制劑、彳/L»南脂血症劑、抗肥胖劑 '前列腺素合成抑制劑、内毒素休克抑制劑、間白素產生抑制劑、血紅素加氧酶產生謗發劑、腫瘤·壞死因子產生抑制劑或發癌抑制劑’其投予量應依其製劑型態、投予方法、使用目的及所施用之患者的年齡、體重、症狀等，加以適當之設定；雖非絕對之用量，不過一般而言，製劑中所含有效成分之量，成人每日為10微克-200毫克/公斤。當然投予量會依條件之不同而有變動，有時只要用較前述投予量為少之量即為已足，有時則必須超過前述之用量範圍。本發明藥劑除了直接口服外，也可添加任意飲食品，而以曰常方式攝取。其次，本發明之飲食品，係包含、添加及/或稀釋有至少一種選自下列之化合物而組成的食品或飲料：選自式 (I) -IX之化合物以及含有該化合_物之可溶性糖化合物；例如本發明之飲食品，可為包含、添加及/或稀釋有至少一種選自原料物質於未滿pH 7之酸性條件下的酸分解物及/ 或酵素分解物所生成之瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六 -29- I纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) ~' >//744 A7 -------------B7 五、發明説明（27 ) —------ 9瓊知八糖、K_角又二糖及β-D-毗半乳糖基-3,6-脫水_ 、甲基_L_半乳糖等糖化合物而組成之食品或飲料。基 ^其抗糖尿病作用、抗風澄作用、抗炎症作用、α•葡糖酶抑制作用、前列腺素合成抑制作用、内毒素休克抑制作用、間白素產生抑制作用、血紅素加氧酶產生謗發作用、腫瘤壞死因子產生抑制作用及/或發癌抑制作用， =該等對於選自式（D-ix之化合物以及含有該化合物之可，性糖化合物之至少一種具有感受性之糖尿病、風溼、 j抑制炎症之疾病、須抑制α ·葡糖甞酶之疾病、須抑制則列腺素合成之疾病、須抑制内毒素休克之疾病、須抑制間白素產生之疾病、須謗發血紅素加氧酶產生之疾病須抑制腫瘤壞死因子產生之疾病的症狀改善與預防而3 ’本發明之飲食品誠屬極為有用者，甚至對於發癌之抑制亦十分有效。本發明之食品或飲料的製法，並無特別限制，可採用調理、加工及一般所用食品或飲料之製法；只要是可使製得之食品或飲料中，含有至少一種選自下列之化合物作為有效成分者即可··選自式化合物以及於還原端含有該化合物之可溶性糖化合物；例如至少一種選自原料物質於未滿pH 7之酸性條件下的酸分解物及/或酵素分解物所生成之瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉二糖及吡半乳糖基-3,6-脫水_2-〇-甲基-^ 半乳糖等之化合物作為有效成分。本發明之教食品，並無特別限制；例如穀物加工品（麵 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

魚肉火腿、魚肉香腸柄煮等）、乳製品（原孝、煉乳、奶粉、冰淇诗 ‘醃潰物類、果汁、蔬I 餅乾類、加餘麵包、J :::二澱粉類加工品、營養增補加工品、麵類、通包=麵包類：銘類、萘麥麵類、魏、細粉、粉絲、 )油|曰加工品（可塑性油脂、炸油、沙拉油、美乃涵類、淋醬等、士 5 t 且加工品（豆腐類、味噌、納豆 _加Xw(火Ιϋ_、培根、壓製火腿、香腸等）、水，(冷康魚漿、魚板、竹輪、魚肉山芋丸句、牛蒡等）炸魚、魚丸、壽司、费鰹魚、魚卵加工品、水產罐頭、乳、奶油、優格、牛油、乳酪等）、蔬果加工品（糊類、果醬類汁、综合飲料）、點心類（巧克力粒、麻籍、米果類等）、酒類飲料（日本酒、中國酒、葡 /酉、威士忌、燒酒、伏特加、白蘭地、琴酒、萊姆酒啤酒：清涼酒類㈣、水果酒、果香甜酒等）、休閒飲： (綠茶、紅茶、烏龍茶、咖啡、清涼飲料、乳酸飲料等）調味料（醬油、調味醬、醋、調味酒等）、罐裝瓶裝或：裝食品（牛飯、釜飯、紅豆飯、咖哩，以及其他各種已; 理完成之食品）、半乾燥或濃縮食品（牛肝醬、其他塗醬，蕎麥麵或烏龍麵醬汁、濃縮湯類等）、乾燥食品（速食4 ，、速食咖哩、即溶咖啡、果汁粉、湯汁粉、速食味] 两、已調理食品、已調理飲料、已調理湯等）、冷凍食， (火銷料、茶碗蒸、蒲燒鳗、漢堡牛排、燒賣、餘子、種冰棒、水果雞尾酒等）、固形食品、液體食品（湯等）’ 香辛料類等農產及林產加工品、畜產加工品、水產加 -31 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐) -------------

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577744 A7 B7 五、發明説明（29 ) 品等。本發明之飲食品，係包含、添加及/或稀釋有至少一種選自下列之化合物而組成者：選自式（I)-IX之化合物以及於還原端含有該化合物之可溶性糖化合物；例如係由包含、添加及/或稀釋有至少一種選自原料物質於未滿pH 7 之酸性條件下的酸分解物及/或酵素分解物所生成之瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉二糖及 β-D-吡半乳糖基-3,6-脫水-2-0-甲基-L-半乳糖等糖化合物而組成者；其含量只要是能表現其生理機能之必要量即可，且其形狀亦無限制，包括片狀、顆粒狀、膠囊狀等可經口攝取的各種形狀》 3,6-脫水吡喃半乳糖、其2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物’其半縮酸環很容易開環，故其末端易於出現醛結構。此醛及3,6-脫水吡喃半乳糖之醛體的醛結構，很容易與對醛有反應性之化合物（例如胺基酸等親核性物質）發生反應，而反應後之式（I) -IX化合物或糖化合物（例如寡糖）’位於其還原端之選自式（I) 化合物將會不見。由此，選自式（I)-IX之化合物以及於還原端具有此等化合物之寡糖，其所擁有的各種生理活性將會完全喪失。換言之，為了使飲料或食品中所含之選自式（〗）-IX之化合物或是於還原端具有此等化合物之糖化合物能保持安定狀態，必須令該等對於此等醛結構具有反應性之化合物的莫耳;農度’維持在低於則述各種酸結構之莫耳濃度的狀 -32- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X297^^7 裝訂

線 577744 A7 f____ B7 五、發明説明（30 ) 態下。由上’在本發明之食品或飲料的製造過程中，將對於此等對酸結構具有反應性之化合物的量進行控制—此乃前所未見者一，以使選自式（I)-IX之化合物或是於還原端具有該化合物之寡糖等化合物，不會遭受實質上的減少，藉此即可成功地提供含有高量之此等化合物的食品或飲料。

線此外’由於本發明發現：選自式（1)_1：^之化合物，以及於還原端具有該化合物之糖化合物的還原端上所存在的選自式（I) -IX化合物，於酸性下呈現安定狀態；因此本發明之食品或飲料之製法即全程於酸性下進行，以將所得食品或飲料製成酸性食品或酸性飲料。如此，即可成功地提供一種酸性食品或酸性飲料，其含有高量之至少一種選自下列之化合物：選自式G)_IX之化合物以及於還原端含有該化合物之可溶性糖化合物。此外，選自式（I)-IX之化合物以及於還原端含有該化合物之可溶性糖化合物，例如衍生自瓊脂的瓊脂寡糖等，對於由脂多糖（LPS)及TPA等所謗發之炎症調介物，例如 N 〇、前列腺素E2 (PGE2)等之產生，均有抑制效果，因此亦可作為發癌預防用食品添加劑。本發明中所用之選自式（I) -IX之化合物或是於還原端含有該化合物之可溶性糖化合物等化合物，不論何者，當以1克/公斤之投予量，經口或腹腔内投予小鼠時’均未見有任何急性毒性作用。 •33- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 577744 A7 B7

五、發明説明（31 實施例以下兹舉若干參考例及實施例，以更具體地說明本發明；惟本發明之範圍並不受此等實例之限制。參考例1 將瓊脂（agar.noble)懸浮於0.1N HC1中，使濃度為10%，並於100°C下加熱19分鐘。將此試料1〇毫升置入經水平衡過之TOYOPEARL HW40C(東y —社製）管柱（4.4公分X 8 5 公分），以每分1.4亳升之流速，令水呈移動相而進行凝膠過滤層析。所沖提出之物質用示差折射計檢測，每7毫升收集一次。在沖提時間第406分、第435分、第471分及第524分時，為其高峰點；將對應於各高峰點之分液，點滴於矽膠6〇片F254 (夕小夕社製）上，並以i•丁醇：乙醇：水=5:5:1之比例加以展開，再用苔黑酚-硫酸法進行分析，即知此等物質依次為壤脂八糖、瓊脂六糖、壤脂四糖及瓊脂二糖。將此等分液予以凍乾，得到30毫克的瓊脂八糖、ι〇〇毫克的瓊脂六糖、150毫克的瓊脂四糖及14〇毫克的瓊脂二糖。參考例2 (1)將市售瓊脂（伊那瓊脂型號s_7，伊那食品工業社製）150克與食用擰檬酸（無水）（三榮源工7 •工7 了 {社製）15克，以去離子水合併為15升，將品溫上昇至92它後，於92-95°C下，保持攪拌130分鐘。接著，將其冷卻至室溫，以矽藻土 545(七亏卜社製）之〇5%主體加料法進行 -34- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 577744 A7 B7 五、發明説明（32 ) 過濾，以配製濾液（瓊脂分解寡糖溶液），再用下述之順相 HPLC加以分析。管柱：PALPAK型號S (4.6 X 250公釐，寶酒造社製， CA8300) 溶劑A : 90%乙腈水溶液溶劑B : 50%乙腈水溶液流速：1毫升/分鐘沖提：溶劑A (10分鐘）4自溶劑A至溶劑B之直線濃度梯度（40分鐘）-> 溶劑B (10分鐘）

檢測：195奈米時之吸光度管柱溫度：4(TC 檢測之結果，確認糖化合物之瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖，確實均以主成分之比例生成。此夕卜，用以下之條件進行順相HPLC、凝膠過濾HPLC，亦可得相同之結果。 ⑷ 管柱：TOSOH TSK-gel Amide-80 (4.6 X250公釐，東 y — 社製）

溶劑：60% CH3CN 流速：0.7毫升/分鐘檢測：RI偵測器 _ 管柱溫度：80°C (b) 管柱：TOSOH TSK_gel ALPHA-2500 X 2 (7.8 X300公釐， -35- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 裝訂

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東y—社製）

溶劑：h2o 流速：0.3毫升/分鐘檢測：RI偵測器管柱溫度·· 6 0°C 該滤液之pH約為2.6,酸度為〇.92，白利糖度為92%，

而依下述參考例2·⑺之方法所測定的環脂二糖生成量則為 43· 1 mM。 (2)利用F -套組乳糖/半乳糖（< 一 >方—？ X碌式會社製，錢1763〇3)，令壤脂二糖與卜半乳葡料酶二裝用，再用測定所生成半乳糖之濃度的方法，進行瓊糖之定量。 — 前述定量方法係依套組的使用方法進行，但卜半乳葡糖誓酶的反應，則變更為37t、i小時。檢量基準線是用乳糖來製作，於算出乳糖換算的莫耳濃度(mM)後，再將之轉換為瓊脂二糖濃度（毫克/毫升）^ 用前述參考例1所製備之瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖，以前述方法嘗試對其定量。結果為：瓊脂二糖之計算值與實測值一致；至於瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂人糖，利用上述方法並無法實質檢測出任何^ 果。亦即’除了瓊脂二糖以外的瓊脂寡糖，錢利用：述檢測方法進行實質檢測；由此可知，藉由前述方法，可進行壤脂寡糖中之瓊脂二糖的濃度測定。參考例3 -36-

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將市售瓊脂（伊那瓊脂型號S_7，伊那食品工業（株）製）溶於脫鹽水中，使濃度為1〇% w/v，再添加強陽離子交換樹脂活性型（H+)(〜7 ^才 >，三菱化學，SK_1〇4)，使濃度為1% w/v，於95。(：下水解3小時，待反應後令溫度降至常溫’進行固液分離（自溶液中除去樹脂）^所得液體用活性炭處理（活性炭濃度4% w/v)，以除去著色物質等；於過濾（孔徑大小為0.1微米之濾器）後，減壓濃縮之，並再度過濾（孔徑大小為0.2微米之濾器），依常法凍乾，以製成含有瓊脂二糖之組合物的形式，製備瓊脂二糖。該瓊脂二糖之組成如下··水分。％，半乳糖3 4%，瓊脂二糖30.7%、瓊脂四糖、瓊脂六糖等瓊脂寡糖為62 4%， pH則為4.1。實例1 將RAW264.7細胞（ATCC TIB 71)懸浮於含有1〇%牛胎兒血清、不含酚紅、含有2 mM L-麩胺酸醯胺（今彳7于v夕才 "工>夕々社製’編號25030-149)之Dulbecco氏改良Eagle培養基彳才々4夕力一社製，編號12_917F)中，使呈3><1〇5 個/毫升，再分別添加500微升於48孔微量培養皿之各孔中’然後在5 %二氧化碳氣體存在下，於3 7 °C下培養6小時。將參考例1中所製之瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖溶於水，使其濃度為5 mM ;再將過濾滅菌處理後之各寡糖水溶液，分別添加10微升於各孔中，然後再培養〇.5小時或5小時。接著，於各孔中加入10微升之5微克/毫升脂多糖（LPS，SIGMA社製，編號L-2012)、2000 U/毫升干擾 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 577744 A7 B7 五、發明説明（35 ) 素γ (IFNy，口只乇八彳才社所售，編號GZM-MG-IFN)水溶液，並培養1 2小時後，測定N 0於培養基中氧化所產生之 NCV濃度。此外，並另設未添加LPS、IFNy之組，與未添加瓊脂二糖、壤脂四糖、瓊脂六糖之組，作為對照之用。經過前述培養後，於100微升之培養上清液中，添加 100微升之4 %格里斯試劑（SIGMA社製，編號G4410);在室溫下放置1 5分鐘後，測定490奈米時之吸光度。從利用溶於前述培養基中之已知濃度的NaN02所繪製之檢量線，計算培養基中所含之Ν02Ί農度。其測定均以3組行之。結果為：瓊脂二糖、瓊脂四糖及瓊脂六糖均可抑制由 LPS、IFNY所致之謗導NO產生的效果。其次，於添加 LPS、IFNy之前已在瓊脂寡糖存在下培養了 5小時之組中，其對NO產生之抑制效果遠超過僅在瓊脂寡糖存在下培養 0.5小時之組。再者，當糖鏈愈長時，亦即在添加了瓊脂四糖、瓊脂六糖之組中，其對N 0產生之抑制效果亦遠超過添加瓊脂二糖之組。茲將前述結果示於圖1。亦即，圖 1所示者，係於各培養條件下培養時，其培養基中的Ν02· 濃度。圖1中之橫軸係表培養條件，而縱軸係表Ν02·濃度 (μΜ)。 _ 實例2 將HL-60細胞添加於含有10%牛胎兒血清、1.3%二甲亞颯（同仁化學社製，編號346-03615)之RPMI 1640培養基 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 裝訂

577744 A7 B7 五、發明説明（36 ) 4才々4夕力一社製，編號12-702F)中，於5%二氧化碳氣體之存在下，於37 t：下培養1週，製備出已令其分化為嗜中性球般之細胞（以下稱為HL-60NU)。

裝將參考例1中所製之瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖溶於水，使其濃度為5 mM，再予以過濾滅菌處理。令HL-60Nu細胞懸浮於含有10%牛胎兒血清之RPMI 1640培養基中，使呈2.5X105個/2.4毫升，再添加50微升之前述各寡糖水溶液，然後在5 %二氧化碳氣體存在下，於37它下培養2小時。然後於各孔中加入5亳克/毫升弗波醇12•豆蔻酸酯13_乙酸酯（TPA，半、社製，編號13139_〇19)水溶液5 0微升’再培養5小時後，測定細胞中之過氧化物。此外，並另設未添加TPA之組，與未添加瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖之組，作為對照之用。經過前述培養後，於各孔中添加5 2，，7，-二氯螢光素訂

二乙酸酯（SIGMA社製，編號D6833)二甲亞砜溶液1〇微升，進一步培養30分鐘。然後用離心法回收細胞，以磷酸緩衝食鹽水沖洗2次後，依細胞工學別冊實驗7。口卜〕— u —X活性氧實驗。口卜^；_々（1994年秀潤社），第5卜 54頁所載之方法，利測定與細胞内過氧化物呈比例生成之2，，7f-二氯螢光素。結果為：於瓊脂二糖、瓊脂四糖之組，對於受τρΑ謗導細胞内之過氧化物生成，具有些許的抑制作用；而瓊俨六糖之組中則確實發揮抑制之效用。兹將結果示於圖2 : 亦即，圖2所不者，係於各種培養條件下培養時，其掉養 -39·

577744 A7 B7 五、發明説明（37 ) 基中細胞内過氧化物量在正常範圍内之細胞所佔比例 (%)，其中橫料表培養條件，而縱軸則為細胞内過氧化物量仍在正常範圍内之細胞，所佔之比例（〇/〇)。實例3

裝將RAW264.7細胞（ATCC TIB 71)懸浮於含有1〇%牛胎兒血清之Dulbecco氏改良Eagle培養基（八彳才々4夕力一社製，編號12-604F)中，使呈3X105個/毫升，再分別添加 500微升於48孔微量培養皿之各孔中，然後在5%二氧化碳氣體存在下，於37它下培養6小時。將參考例i中所製之瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖溶於水，使其濃度為5 πιΜ ’再將過滤滅菌處理後之各寡糖水溶液，分別添加微升於各孔中，然後再培養〇·5小時或5小時。接著，於各孔中加入10微升之50微克/毫升LPS水溶液，並培養12小時後，測定前列腺素Ε2之量。此外，並另設未添加Lps之訂

組，與未添加瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖之組，作為對照之用。經過前述培養後，利用前列腺素Hz ELISA套組（孝才夕工 >社製，編號404110)，測定培養上清液中之前列腺素^ 量。其測定均以3組行之。結果為：瓊脂二糖、瓊脂四糖及瓊脂六糖均有抑制由 LPS所致之謗導前列腺素E2產生的效果。其次，於添加 LPS之前已在瓊脂寡糖存在下培養了 5小時之組中，其對前列腺素E2產生之抑制效果遠超過僅在瓊脂寡糖存在下培養0.5小時之組。茲將前述結果示於圖3。亦即，圖^所 -40 -

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於各培養條件下培養時 π f呵，夬瑨養暴中的素£2濃度。圖3中之橫軸係表培養條件二=腺素E2濃度（奈克/亳升）。實例4 ⑴對於1升之由參考例2所製備㈣脂分解寡糖溶液，加入碳酸鈣（和光純藥社製，編號034-00425) 8.5克，於5 °C下挽拌—晚，將之過㈣得㈣液。其處理前的轉檬酸濃，為11,40毫克/毫升’但經過前述處理，其結果變為 1.37當克/毫升。此外，_濃度在處理前為。25毫克/毫 .升，而處理後則為〇·62毫克/毫升。 (2)將實例4·⑴所載之脫檸檬酸瓊脂分解寡糖溶液予以凍乾以製成粉末，再溶於自來水中，使濃度為1〇%，配製成10%瓊脂寡糖溶液。令ddy小鼠（日本SLC; ，7週齡）於η日之内自由飲用前述所配製之10%瓊脂寡糖溶液；至於對照組則令小鼠自由飲用自來水。而各組之數目為2隻小鼠❶然後於其腹腔中注入含有1〇〇/。牛胎兒血清之RPMi 164〇培養基（〆彳才々 4夕力一社製，編號12-702F) 4毫升，並充分按摩後，進行抽取’即可收集到2隻小鼠份量的腹腔細胞。將細胞懸浮於含有10%牛胎兒血清之RPMI 1640培養基中，使呈1〇6 個/毫升；再於48孔微量培養皿中各添加500微升，然後在5 %二氧化碳氣體存在下以及3 7 °C中培養2小時後，除去培養上清液，即得接著性細胞，將之作為腹腔巨噬細胞使用。於各孔中重新添加含有10%牛胎兒血清、不含酚紅、含有2 mM L_麩胺酸醯胺之Dulbecco氏改良Eagle培養 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝訂

線 577744 A7 B7 五發明説明（39 基0、彳才々 < 夕力一社製，編號12-917F)各500微升，再加入10微升之5微克/毫升LPS、2000 U/毫升IFNY水溶液，並培養1 2小時後，依實例1之方法測定Ν Ο於培養基中氧化所產生之N〇2·濃度。此外，並另設未添加LPS、IFNy水溪1液之組’作為對照之用。其測定均以3組行之。結果為：從自由飲用10%瓊脂寡糖溶液之小鼠所獲得之腹腔巨嗟細胞中，對於NO之產生確有顯著的抑制效果；顯示自由飲用瓊脂寡糖者，具有極強之NO產生抑制作用。兹將前述結果示於圖4。亦即，圖4所示者，係於各培養條件下培養時，其培養基中的N〇2-濃度；其中橫軸係表培養條件，而縱軸係表N〇2-濃度（μΜ)。實例5 將實例4-(1)所載之脫檸檬酸瓊脂分解寡糖溶液予以凍乾以製成粉末，再溶於自來水中，使濃度為1〇%，配製成 10%瓊脂寡糖溶液。令ddy小鼠（日本SLC;夕只，7週齡）於21日之内自由飲用前述所配製之10%瓊脂寡糖溶液；至於對照組則令小鼠自由飲用自來水。而各組之數目為2隻小鼠。然後於其腹腔中注入含有1〇〇/0牛胎兒血清之RPMI 1640培養基（〆彳才々 4夕力一社製，編號^7^17)4毫升，並充分按摩後，進行抽取’即可收集到2隻小鼠份量的腹腔細胞。將細胞懸浮於含有10%牛胎兒血清之RPMI 1640培養基中，使呈106個/ 毫升；再於48孔微量培養m中各添加500微升，然後在 5 %二氧化碳氣體存在下以及3 7 〇c中培養2小時後，除去 -42- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

裝訂

線 577744

培養上清液，即得接著性細胞，將之作為腹腔巨噬細胞使用1於各孔中重新添加含有1〇%牛胎兒血清之Dulbecc〇氏改良Eagle培養基（^才々4夕力_社製，編號i2_6〇4F) 各500微升，再加入10微升之5微克/毫升水溶液，並培養 1 2小時後，測定前列腺素之量。此外，並另設未添加 LPS之組以作為對照之用。經過前述培養後，利用前列腺素£2 ELISA套組測定培養上巧液中之前列腺素E 2量。其測定均以3組行之。結果為：從自由飲用10%瓊脂寡糖溶液之小鼠所獲得之腹腔巨嗤細胞中，對於前列腺素ε2之產生確有顯著的抑制效果；顯示自由飲用瓊脂寡糖者，具有極強之前列腺素ε2產生抑制作用。兹將前述結果示於圖5。亦即，圖5所示者，係於各培養條件下培養時，其培養基中的前列腺素ε2濃度；其中橫軸係表培養條件，而縱軸係表前列腺素£2濃度（奈克/毫升）。實例6 (1)利用發色基質對-硝基苯基葡萄哌喃糖菩，使與 a -葡糖菩酶作用，再用比色法定量其水解後呈游離狀態之4 -硝基盼，藉此測定a _葡糖苷酶之活性。將1 0微升之葡糖苷酶溶液（40 mU/毫升，衍生自S. cerevisiae，SIGMA社製，溶於1〇 mM磷酸緩衝液、pH 7.2 (3 7C)中）與含有1〇微升檢體之溶液（溶於鱗酸緩衝液、pH 7.2 (37°C )中）混合後，添加80微升之1.5毫克/毫升基質溶液（SIGMA社製，溶於1〇 mM磷酸緩衝液、pH 7.2 -43-本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 577744 A7 B7 五、發明説明（41 ) (37 °C )中），開始反應。於3 7 °C下反應4 0分鐘後，測定 410奈米（島津uv 2200)時之吸光度。其結果示於表1。至於此時之殘存活性，則以未添加檢體者為100%而加以算表1 α -葡糖苷酶抑制活性（殘存活性。/〇) ΟμΜ 5μΜ 50μΜ 500μΜ ΙΟΟΟμΜ 5000μΜ 脫水半乳糖 100 100 100 100 100 100 覆脂二糖 100 100 100 100 100 100 瓊脂四糖 100 100 97 75 32 20 瓊脂六糖 100 91 91 47 35 7 瓊脂八糖 100 91 90 32 26 11 新瓊脂二糖 100 100 100 100 100 100 新瓊脂四糖 100 100 93 89 76 42 新瓊脂六糖 100 100 100 93 71 8 由前述結果可知，4糖以上之瓊脂寡糖以及4糖以上的新瓊脂寡糖，確實具有α -葡糖菩酶抑制活性。其次，α違脂寡糖的-葡糖甞酶抑制活性，相較於新瓊脂寡糖而言，要來得更強。本實驗所用之瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖檢體，係用參考例1中所配製者；而脫水半乳糖（7十J シ社製）、新瓊脂二糖（SIGMA社製）、新瓊脂四糖（7十^7> 社製）、新瓊脂六糖（フナフシ社製），則是用市售品。 (2)依下述方法，利用得自大鼠小腸黏膜之粗酵素樣品 (根據 Arne Dahlqvist，Anal. Biochem·，7，18-25 (1964)之方 -44 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐）裝訂

線 577744

發明説明法製得），測定參考例！中所配製之瓊脂四糖或瓊脂六糖於試管内之α -葡糖荅酶抑制活性。

裝訂

酵素反應之進行’係於經1〇磷酸缓衝液ρΗ 7.0適當稀釋過之受測物質溶液〗〇微升中，添加8 〇微升之蔗糖、甘露糖、海藻糖及可溶性澱粉之相同缓衝液溶液以作為基質，使其最終濃度為1〇〇 mM(在可溶性澱粉方面則為〇·5%);再添加由大鼠小腸配製而得之粗酵素溶液1〇微升，於3 7 t：下反應2 0分鐘。酵素活性係以前述反應液中所生成之葡萄糖量為準，其求出方法示於前述反應液中加^3亳升之葡萄糖測定用試劑（和光純藥社製），令其於 3 7 °C下反應5分鐘後，測定5〇5奈米時之吸光度，而加以求得。對於各基質之分解作用的抑制活性，係以利用前述方法針對4種不同濃度所測得之活性，相對於對照組之殘存活性（％)來表示而算出^兹將瓊脂四糖存在下對各基質I殘存活性（％)示於表2 ;而將瓊脂六糖存在下對各基質之殘存活性（％)示於表3。

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577744 A7 B7 五、發明説明（43 70 1 92 93 97 可溶性澱粉 (Ki) ’可得壤脂四糖為7.4 _ ::瓊脂質常7數$ 福。此外，環脂歸再q糖料基質時，具有較以甘露糖為基質時為強之α-葡糖:y：酶抑制活性。實例7 =衍生乂牛關節之11型膠原蛋白_，勝原蛋白技術研修會)3笔克/毫升’與等量的弗氏完全佐劑(fca)混合製成乳劑’投予6it齡雄性DBA/1J系小鼠的尾根部皮下⑽ 微克/0.1¾升/小鼠）。3週後再以同樣方式追加投予，以謗發II型膠原蛋白關節炎。將、參考例2-(1)所載之瓊脂分解寡糖溶液用自來水稀釋為 3.3倍或33.3倍；由膠原蛋白初次進行敏化時起（亦即檢討預防效果之時），或由進行追加免疫時起（即檢討治療效果時），令小鼠自由飲用之。而對照組則令其自由飲用自來水。以1 0隻為一組所進行之關節炎發病情況評價，係以如下方式決疋分數，並以[發病小鼠全部分數之合計/每組小鼠之隻數]來表示（最高1 6分）p亦即，〇分：無變化r i 分· 1指或多指腫脹；2分：全體可見發紅及腫脹；3分：全體可見嚴重之腫脹；4分：伴有關節之僵直性變化。結果示於圖6、7。其縱軸係表關節炎分數，而橫軸則 46 本纸張尺度適用中@ g家標準(CNS) M規格(加㈣7公爱） 577744 A7 B7

表經過日數（日）。圖中各數值係以平均值±標準誤差表示。白圈表對照組，白四角表攝取3 3倍稀釋溶液之組，白三角則表攝取33.3倍稀釋溶液之組。圖中之*、**係‘ 在Mann-Whitney U檢定中，該組相對於對照組具有 ρ<0·05、0.01之顯著差異。、、/' 預防效果：實驗期間中之平均飲水量，於3 3倍稀釋溶液攝取組方面，約為130亳升/公斤，而於33 3倍稀釋溶液攝取組方面，則約為220毫升/公斤。相對於對照組在第 62曰以後之關節炎分數即有顯著上昇之情況，3 3倍稀釋溶液攝取組則表現顯著的抑制效果。治療效果：實驗期間中之平均飲水量，於3 3倍稀釋溶液攝取組方面，約為150亳升/公斤，而於33 3倍稀釋溶液攝取組方面，則約為230毫升/公斤。3·3倍稀釋溶液攝取組在第6 2日以後，即表現顯著的抑制效果。由前述結果可知，瓊脂寡糖對於小鼠11型膠原蛋白關節炎，確有預防及治療效果。因此，其對於慢性關節性風溼之效用，誠可令人期待。實例8 先將實例4-(1)之脫檸檬酸瓊脂分解寡糖溶液凍乾後製成粉末，並以10%、5 %、1 %之濃度將之溶於自來水中，配製成10%、5%、1%之瓊脂寡糖溶液。令6週齡之雌性 CDF1系小鼠自由飲用此等10〇/〇、5 %、1 %瓊脂寡糖溶液。稀釋時是用自來水，而對照組亦同樣給予自來水。於攝取飲水開始之第19日，將高劑量之LPS行腹腔内投予（300 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

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577744 A7 B7 五、發明説明（45 ) 微克/小鼠），以製作内毒素休克致死模型，並檢討至72 小時後之致死抑制作用（實驗（1))。另對於以同樣條件飲水1 9日之小鼠，腹腔内投予低劑量之LPS (2 0微克/小鼠），用市售之ELISA套組（R&D社）測定1小時後血清中的 TNF-α濃度（實驗（2))。另一方面，為製作内毒素肝病變模型，對小鼠同時腹腔内投予半乳糖胺（SIGMA社）（2 0毫克/小鼠）與LPS (0.01微克/小鼠），以製作猛暴性肝炎之致死模型，並檢討其延長壽命效果（實驗（3))。結果示於表4。實驗期間中之瓊脂寡糖攝取量，投予 1 0、5、1 %之各組，分別約為2 〇、9、2克/公斤/日。在實驗（1)、（3)中，投予1〇%瓊脂寡糖溶液之組，確有顯著之致死抑制作用。於實驗（2)中，投予1〇%瓊脂寡糖溶液之組’對於血清中TNF-cc濃度則確有抑制效果。 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 577744 A7 B7 五、發明説明（46 ) 表4 組 (1)致死率死亡數/總數(％) (2) TNF (微克/毫升)(n) (3)致死率死亡數/總數(％) 對照組 7/8 (88) 10·4±1·6 (4) 8/8 (100) 10%瓊脂寡糖溶液 2/8* (25) 7.4±0·8 (4) 4/7* (57) 5%瓊脂寡糖溶液 6/8 (75) 12·8±1·6 (4) 7/8 (88) 1%瓊脂寡糖溶液 8/8 (100) 11.3±1·0 (4) 8/8 (100) 表中各數值係以平均值土標準誤差表示；而*係表在 Mann-Whitney U檢定中，該組相對於對照組具有p<0.05之顯著差異。治療癌症之化學療法，在身為有效療法之反面，同時也會損傷患者的生體防禦系統，而使其易於感染。在此情況下，由細菌感染所致之敗血症，便成為致死性疾病。而瓊脂寡糖不僅可在沒有此等副作用之情況下發揮抗癌作用，並且可抑制因敗血症所致之死亡結果。另一方面，由於實驗中所用的大鼠與小鼠，其對於内毒素具有遠高於人類之耐性，因此在製作病態模型時，常會使用某些方法以預先提高其敏感性。其中一種即為併用半乳糖胺之模型，而此模型同時又可作為猛暴性肝炎模型之用。身為肝炎猛暴化以及慢性肝炎之惡化因子之一的内毒素，其在臨床上之對於上述病況之惡化的重要性亦可見一斑。由本實驗之結果可知，如令慢性肝炎患者服用，將可預防病況之惡化。實例9 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝訂

線 577744 A7 B7 五、發明説明（47 ) (1)用13週齡之雄性Lewis大鼠，以蔗糖負荷進行糖負荷實驗。將蔗糖以2克/公斤之劑量，經口投予已絕食18小時之大鼠。在臨投予前、投予15、30、60、120分鐘後，自尾靜脈採血，用測定套組（GLU孝才シッテス卜；シ/テ只卜社）測定血漿中之葡萄糖濃度。從進行糖負荷實驗前 4週起，令大鼠飲用參考例2-(1)所配製之瓊脂分解寡糖溶液的3.3倍稀釋標準液及1〇倍稀釋溶液（n=5)。至於對照組則給予自來水（N=2)。4週内的平均飲水量，在投予3.3倍稀釋溶液之組方面，為8〇毫升/公斤/日；而投予10倍稀釋溶液之組則為1〇〇毫升/公斤/日。結果示於圖8 ^圖中橫軸係表蔗糖投予後所經過之時間，而縱軸則表血糖值（毫克/分升）^對照組血糖值之推移係以圓圈表示，而投予3 3倍稀釋溶液之組是以四方形、投予10倍稀釋溶液之組則是以菱形表示。對照組的血糖值於上昇至糖負荷60分鐘後，即開始下降。藉由瓊脂寡糖之飲水投予，在糖負荷前（亦即絕食時）之血糖值降低，而對於糖負荷後之血糖值上昇，亦有抑制之傾向。通常空腹時之血糖值會減少，而進食後則會有暫時性之上昇’隨著時間之經過，便會回復原來的水準。此種生理機能，係由糖刺激致使胰臟分泌之荷爾蒙所調控者。在臨床上，診斷此機能是否正常的方法，即係於空腹時施以糖負荷，並測定血糖的歷時變化。 -50- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇Χ297公釐) 裝訂

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五、發明説明（48 ) 由本實例中利用大鼠及蔗糖負荷所進行的糖負荷實驗結果，可確認瓊脂寡糖之飲水投予所具有之極佳功效。由此可知’瓊脂寡糖在血糖調控機能方面，確實具有所欲之效果。

(2)令59週齡之雄性WBN/Kob大鼠，藉由飲水攝食參考例2-(1)所配製之瓊脂分解寡糖溶液之3 3倍稀釋溶液；至於對照組則給予自來水（N=3)。自投予壤脂寡糖時起，連日由尾靜脈採血，用測定套組 (GLU孝才シッテス卜；シッテス卜社）測定血漿中之葡萄糖濃度。裝於實驗期間中，投予瓊脂寡糖之組的平均飲水量，為 300毫升/公斤/曰。訂

結果示於圖9。圖中橫軸係表自開始投予時起之日數，而縱軸則表血糖值（毫克/分升）。對照組血糖值之推移係以白圈表示，而投予瓊脂寡糖之組是以黑圈表示。於實驗期間内，對照組一直維持一定的高血糖值；但與此相對的是，投予瓊脂寡糖之組的血糖值則有缓慢下降之趨自然罹患糖尿病之WBN/Kob大鼠，自其出生後約3個月大時起，其胰臟及產生炎症性之病變，然後血糖值便缓慢上昇；因此可以之作為具有前述症狀之糖尿病模型而用於實驗。此次所用之動物顯示極高之血糖值於病發後經過若干月數後，應即處於重症化之狀態。而飲水投予瓊脂寡糖之 -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 577744 A7 B7 五、發明説明（49 ) 方式所具有的降低血糖效果，於糖尿病之治療上實具意義’因此即使是重症患者，亦能期待對之發揮改善致果。 (3)用63週齡之雄性WBN/Kob大鼠，以葡萄糖負荷進行糖負荷實驗《將葡萄糖以2克/公斤之劑量，經口投予已絕食18小時之大鼠。在臨投予前、投予Η、3〇、6〇、 120、240分鐘後，自尾靜脈採血，用測定套組（GL|J才才y 7于只卜；夕7于只卜社）測定血漿中之葡萄糖濃度。從進行糖負荷實驗前4週起，令大鼠飲用參考例2-〇)所配製之瓊脂分解寡糖溶液的3.3倍稀釋溶液（N=3)。至於對照組則給予自來水（N=3)。投予瓊脂寡糖之組的平均飲水量，為 300¾升/公斤/日。結果示於圖1〇。圖中橫軸係表葡萄糖投予後所經過之時間，而縱軸則表血糖值（毫克/分升）^對照組血糖值之推移係以白圈表示，而投予瓊脂寡糖之組是以黑圈表示〇對照組的血糖值於上昇至糖負荷6 〇分鐘後，即開始緩慢了降。經由瓊脂寡糖之飲水投予，不僅使糖負荷前（亦即絕食時）之血糖值降低，而對於糖負荷後之血糖值上昇，亦有抑制之傾向。通#空腹時之血糖值會減少，而進食後則會有暫時性之上昇，隨著時間之經過，便會回復原來的水準。但是在糖尿病I病態中，即使空腹，其血糖也不會下降；而進食後血糖則比平常更為上昇。此外，通常胰臟受到糖刺 -52- ^^^中國國家^?^A4規格(21〇x^^) --~ - 577744 A7 B7 五、發明説明（50 ) 激即分泌荷爾蒙，藉以調控血糖；但於病態的情況下，此機能亦變得異常。在臨床上，診斷此機能是否正常的方法，即係於空腹時施以糖負荷，並測定血糖的歷時變化。此次實驗中，係利用自然罹患糖尿病之WBN/Kob大鼠，以葡萄糖負荷來進行糖負荷實驗；由其結果可確認瓊脂寡糖之飲水投予方式確實發揮功效。因此，即使是血糖控制機能異常的疾病，藉由瓊脂寡糖之效果，亦能期待其機能得以獲得改善。 (4 )以120毫克/公斤之比例，對5週齡之雄性ddy小鼠，腹腔内投予鏈脲黴素（十力今4于只夕社），以製作糖尿病模型。自投予鏈脲黴素之一週後，開始令小鼠飲用參考例 2-(1)所配製之瓊脂分解寡糖溶液的3.3倍、33.3倍、333倍稀釋溶液。對照組則給予自來水（N=5-6)。從投予瓊脂寡糖開始，以及第2、4、9、14日後，自眼底脈採血，用測定套組（GLU孝才シ/于只卜；シ/于只卜社）測定血漿中之葡萄糖濃度。結果示於表5。表中之數值係以平均值土標準誤差表示。此外，表中之*、* *係表在5 %以及1 %之危險率下，該組與對照組間具有顯著差異。表5_ 血糖值(毫克/分升）第〇曰第2曰第4曰第9曰第14日對照組(N=6) 286.0±34.1 376.4±60.3 374.0±53.7 500.1±46.5 546.8±26.7 投予3.3倍稀釋溶液之組(N=5) 272.5157.0 326.5±79.6 364.3±83.4 297.8±81.4 373·5±65·0* -53- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐）裝訂

線 577744 A7 B7 五、發明説明（51 ) 投予33.3倍稀釋溶液之組(N=6) 255.0±51.1 290.9±62.0 271.4±59.6 298.0±74.3* 361.9±75.7* 投予333倍稀釋溶液之組(N=6)_264.4133.3 246.0±29.5 238.1±31.3 271.1155.2* 324.1±55.3** 對照組中，其血糖值連日緩慢上昇，於實驗終了時已呈重症之高血糖狀態。而投予3.3倍及33.3倍稀釋溶液之組，於投予第9日時起，而投予333倍稀釋溶液之組則於投予第1 4日時起，其血糖值比起對照組確有顯著之降低，改善了對照組中所見之高血糖症狀。鏈脲黴素糖尿病模型，由於其騰臟蘭氏小島的不可逆細胞病變，在實驗上可作成高血壓病態模型，故極為常用。對血糖之調控而言，胰臟蘭氏小島所分泌的荷爾蒙係屬不可或缺者，因此由其病變所致之胰島素分泌不全現象，將成為引起高血糖之主要因素。由於在鏈脉黴素糖尿病模型中，可藉由覆脂寡糖之投予，而改善其高血糖症狀；因此，其亦具有抗糖尿病作用，乃屬當然。實例1 0 於ICR系小鼠（才只，7週齡，體重約3 0克；日本工乂工小シ一）之右耳殼的全部外侧表面上，均塗上TPA (羊夕J社）丙酮溶液5奈莫耳/20微升；並以3隻為一組，測定TPA塗布後2小時之PGE2量及TPA塗布後6小時之耳殼浮腫程度。 PGE2之測定，係由放血而死的小鼠身上，切取其全部耳 •54- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）裝訂

線 577744 A7 B7 五、發明説明（52 ) 殼，加上500微升之萃取液（100毫莫耳/升Tris鹽酸緩衝液、1毫莫耳/升EDTA、2毫莫耳/升還原麩胺胱肽、2微莫耳/升血紅蛋白），使其均質化；再以1〇,〇〇〇 G離心1 0分鐘，回收上清液。於上清液中添加500微升之80%乙醇與 10微升之冰醋酸，靜置5分鐘後，再以2,500 G離心5分鐘，回收上清液。將回收之上清液加於C18管柱，以2毫升水及2毫升己烷沖提，於沖提液中加入4亳升之含有1 % 醇類之乙基丙酮後，回收乙基丙酮層，再以氮氣蒸發乾固之。萃取物中之PGE2量，係以ELISA套組（孝才夕工 >社）加以測定。耳殼浮腫之測定，係由放血而死的小鼠身上，切取其 TPA塗布部位之全部耳殼，測定其重量。實例4-(1)所製備之脫檸檬酸瓊脂分解寡糖溶液，經凍乾後所製成之粉末的投予方式，可為局部塗布或添加於飲水中。亦即，當採用局部塗布時，於TPA塗布前3 0分鐘，先將該粉末之3%或10%溶液塗於右耳殼兩侧全部表面上並風乾之。當採用飲水攝取時，則自塗布TPA之1 4曰前起，至殺死時為止，將該粉末之3 %或10%溶液裝入給水瓶中，使小鼠自由攝取。耳殼PGE2量之測定結果示於表6。表6 _ 耳殼萃取液中之pge2量（奈克/毫升）平均值±標準誤差正常小鼠組 (未塗布TPA) 1.1±0.3 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 裝訂

577744 A7 B7 五、發明説明（53 ) 對照小鼠組 (塗布TPA) 3.1±0.4 凍乾粉末10%溶液塗布組 1·9±0·3 (相對於對照組小鼠之ρ < 0 · 0 5) 凍乾粉末10%溶液攝取組 1·3±0·3 (相對於對照組小鼠之ρ<0·01) 如表6所示，由於TPA之塗布，使得對照組比起正常小鼠，約增加了 3倍的卩0£2量。另一方面，於投予凍乾粉末 10%溶液之組中，不論是塗布或飲水攝取，其炎症部位之 PGE2產生量均較對照組有顯著之減少（顯著差異之檢定是以乂于二々一浐> 卜t檢定法進行，並以p<0.05為統計學上之顯著標準。）耳殼部分之重量測定結果，係算出相對於未塗布TPA之耳殼重量之增加率，以此增加率表示結果。茲將結果示於圖1 1。圖中縱軸係塗布TPA之小鼠相對於未塗布TPA小鼠之耳殼重量增加率；各長條及誤差線，則是表1組3隻小鼠之平均值與標準誤差。對照組和脫擰檬酸瓊脂分解寡糖溶液投予組間的顯著差異檢定，是以只于二々一歹 > 卜 t檢定法進行，並以p<0.05為統計學上之顯著標準。由結果中可知，塗布TPA將使得對照組增加2倍以上之重量。另外，投予凍乾粉末10%溶液之組中，不論是用塗布或飲水攝取的方式，其耳殼之重量增加程度均較對照組來得顯著減少，顯示瓊脂寡i確實具有浮腫抑制作用。實例1 1 用ICR小鼠（雌性，9週齡，體重約30克；日本SLC)進行 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）裝訂

線 577744

發明説明實驗’各組1 〇隻。將小鼠背部體毛剔除，塗上溶於1〇〇微升丙酮11〇〇微克7，12-二甲基苯并[&]蔥（£)]^^人，31(}%人社）以起始發癌。1週後，再於同部位上以每週2次、連績 20週之頻率’塗布溶於ι〇〇微升丙_之1微克丁？入（于力今 4于只夕社），以促進發癌。瑷脂分解寡糖溶液之投予，可以局部塗布或加於飲水中之方式進行·。至於瓊脂分解寡糖溶液，是用參考例2气i) 中所載之瓊脂分解寡糖溶液（以下稱為1〇%瓊脂分解寡糖溶液）、10%瓊脂分解寡糖溶液的3 3倍水稀釋物（以下稱為 3 °/。瓊脂分解寡糖溶液）、10%瓊脂分解寡糖溶液的1 〇倍水稀釋物（以下稱為1 %瓊脂分解寡糖溶液）。當採瓊脂分解寡糖溶液之局部塗布法時，係於DMB A塗布之30分鐘前，以及每次τρα塗布之3〇分鐘前，在背部先塗上10%瓊脂分解寡糖溶液，並風乾之。當採飲水攝取時，則是從DMBA塗布前7日起，將1 %或3 %之瓊脂分解寡糖溶液裝入給水瓶，令小鼠自由攝取至於對照組則是飲用自來水。對於各組小鼠，於開始塗布TPA時起2 0週内，每週計數每隻小鼠背部所發生的腫瘤數目，並計算發生腫瘤的小鼠數目。兹將實驗結果示於圖12。圖12中A及B之縱軸係表腫瘤發生率’以及每隻小鼠所發生的腫瘤數目；而橫轴則表自開始塗布TPA時起之曰數（週）。對照組中，於開始塗布TPA之第7週時，即見有1成的腫 -57- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 577744 A7 __B7 五、發明説明（55 ) 瘤發生率；至第11週時所有實驗的小鼠均發生，而第2〇週時之腫瘤平均數達19.3個。另外，在以飲水攝取瓊脂寡糖之組方面’其第20週之腫瘤數如下：1 %為88個，3 % 為2.8個，可見有顯著之抑制作用。而以塗布壤脂寡糖溶液方式進行投予者，則完全未見有任何腫瘤發生。實例1 2 將由人類慢性風溼患者之滑膜所建構之纖維母細胞株 DSEK細胞（其係作為活體外之風溼模型之用，由埼玉醫科大學综合醫療中心第二内科所保存），用含有1〇% FBs(〆 4才夕ッ力一社製）<Iscov_MEM培養基（imdm :羊彳〕 BRL社製），於5% C〇2存在下及37。(：之溫度中進行培養，直到細胞於培養器中呈飽和狀態為止；再將細胞用胰蛋白酶EDTA溶液才々< 夕ッ力一社製）懸浮於前述培養基中，使濃度為3X104個/毫升，並將之分別以2〇〇微升注入96孔微量培養皿（FALC0N社製）之各孔中。培養5_7日後，於細胞約呈80%飽和時，更換培養基，加入含有25、 50、75、100、200或400 μΜ瓊脂二糖之前述培養基2〇〇微升。以72小時為實驗時間長度，每隔以小時便歷時性地添加ίο微升之預混wst-1(寶酒造社製，ΜΚ4〇〇)，於37它下反應3.5小時，i以450奈米時之吸光度（a·)扣除㈣夺米時之吸光度（Α㈣)後所得之值，作為細胞增殖率。結果示於表7。 -58-

577744 A7 B7 五、發明説明（56 ) 表7 瓊脂二糖培養時間 24小時 48小時 72小時細胞增殖度濃度(μΜ) (Α450-650) 0 1.04 1.27 1.46 50 1.00 1.49 1.27 100 0.88 1.87 1.26 200 0.89 1.50 0.93 400 0.87 0.52 0.47 800 0.54 0.45 0.56 裝而由A45G-65q之數據所求得之半數細胞增殖抑制濃度ic50 值，於24小時為225.3 μΜ，72小時則為169.1 μΜ。由上，於活體外之風溼模型DSEK細胞中添加瓊脂二糖時，相較於添加PBS之對照組，添加各化合物之組的風溼細胞增殖現象確實獲得抑制。此外，於歷時性的觀察中，此等化合物不僅持績其增殖抑制活性，並隨著時間之進展，甚有增強活性之趨勢。由以上之結果，瓊脂二糖具有抗風溼活性，應可將之開發作為慢性風溼之有效治療劑及健康食品使用。再者，於DSEK細胞培養中，每隔24小時歷時性地回收 150微升/孔之培養上清液，並針對瓊脂二糖對於此細胞所衍生之細胞動素（人類TGF-β、人類FGF-β，以及人類IL-10) 的產生效果之影響（即對於其等細胞動素表現之影響），利 -59- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐）訂

577744 A7 B7 五、發明説明（57 ) 用對各種細胞動素具有特異性之ELISA套組（人類FGF-β與人類IL-10，是用INTERGEN社製者；而人類TGF-β則是用 Promega社製者），來加以測定。其結果為：瓊脂二糖對於人類IL-10、人類FGF-β及人類 TGF-β之產生，均有抑制作用。實例1 3 將HL-60細胞（ATCC CCL-240)懸浮於含有具100 μΜ羥基脲之10%牛胎兒血清（孚夕J社製）的RPMI 1640培養基（〆彳才々 < 夕力一社製，編號12-702F)中，使呈5X105個/毫升；加20毫升於10公分之培養皿上，於5 %二氧化碳氣體之存在下，於3 7 °C下培養一晚，使細胞停止於G 1期。以離心回收此細胞，再度懸浮於含有具100 μΜ羥基脲之10%牛胎兒血清（羊7''口社製）的RPMI 1640培養基中，使呈5 Χ105 個/毫升，並各添加5毫升於6孔微量培養皿之各孔。另外在未以羥基脲處理之細胞方面，將HL-60細胞懸浮於含有 10%牛胎兒血清（半'7口社製）的RPMI 1640培養基中，使呈 IX 105個/毫升，並各添加5毫升於6孔微量培養皿之各孔。於羥基脲處理過之細胞部分，在各孔中添加50微升之瓊脂二糖（80 mM、60 mM、40 mM、20 mM)、瓊脂六糖 (80 mM、60 mM、40 mM、20 mM)水溶液；而於未經經基脲處理過之細胞部分，則是在各孔中添加50微升之瓊脂二糖（40 mM、30 mM、20 mM、10 mM)、壤脂六糖（40 mM、3 0 mM、20 mM、10 mM)水溶液，再培養4 8小時。然後回收培養液，以離心收集細胞，並將之懸浮於含有10% -60- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝訂

577744 A7 B7 五、發明説明（58 ) 牛胎兒血清（半7 J社製）的RPMI 1640培養基中；用其中 100微升，以預混WST-1細胞增殖分析系統（寶酒造社製， MK400)測定其活細胞數。結果為：對於經羥基脲處理過之細胞的5 0 %增殖抑制濃度（IC5〇)，所有的檢體均比未處理細胞來得高。其結果示於表8。亦即，表8係將各檢體及其Ι<：5〇(μΜ)集中列出之表。由此可知，瓊脂寡糖對於停滯於G 1期之細胞而言，毒性相當低。換言之，因為一般然為活體内幾乎全部細胞都是停滯於G 1期之狀態，故瓊脂寡糖可說是一種對於活體的毒性十分低下的藥劑。表8 經經基膽處理之細胞未經經基脲處理之細胞 (μΜ) (μΜ) 瓊脂二糖 401 210.6 瓊脂六糖 383 205.3 實例1 4 (1)將RAW264.7細胞（ATCC TIB 71)懸浮於含有10%牛胎兒血清（半社製）之Dulbecco氏改良Eagle培養基（〆彳才々γ夕力一社製，編號12-604F)中，使呈3 X 105個/毫升，再分別添加5毫升於6孔微量培養m之各孔中，然後在5% 二氧化碳氣體存在下，於37 °C下培養一晚。在各孔中添加50微升之10 mM瓊脂二糖或瓊脂六糖水溶液，再培養 0.6小時後，於各孔添加5 0微升之100微克/毫升脂多糖 (LPS，SIGMA社製，編號L-2012)水溶液，並培養1 2小 -61 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 裝訂

線 577744 A7 B7 五、發明説明（59 ) 時。將細胞用刮勺自培養皿上剥下後回收之，並懸浮於含有1微克/毫升胃蛋白抑制素A (SIGMA社製，P53 18)、1 微克/毫升亮精三肽（SIGMA社製，L2884)、1 mM苯甲磺醯氟（十力今彳于只夕社製，273-27)、10 mM乙二胺四醋酸二氫二納、0.1% Triton X-100之磷酸緩衝食鹽水中，於凍結溶解1次後，經由離心，將上清液作成蛋白質分液。蛋白質分液中之蛋白質含量，是以Micro BCA蛋白質分析試劑 (寶酒造社販賣了只社製，P7411)來測定。將如此配製之各蛋白質分液樣本，與等量之含有4 %月桂基硫酸鈉 (SDS)、2% 2-氫硫基乙醇、0.001%溴酚藍、20%甘油之 0.125 M Tris鹽酸緩衝液（pH 6.8)予以混合，於100°C下處理 5分鐘後，將之裝料至7.5% SDS-聚丙婦醯胺凝膠上，以20 mA之固定電流進行電泳。電泳後之凝膠，用含有48 mM Tris、39 mM甘胺酸、20%甲醇、0.0375% SDS之印跡缓衝液，藉由轉移印跡SD槽半乾印跡裝置（Bio-Rad社製）及其所附之方法，在15 V之固定電壓下，於25分鐘内，將之轉印於PVDF膜（S U水了社製，IPVH000 10)。轉印後之PVDF 膜，在封嵌工一只（大曰本製藥社製，UK-B25)溶液中及4 °C下靜置一晚，以將之封嵌。封嵌後之膜，以含有0.1% Tween 20之鱗酸缓衝食鹽水，於15分鐘内，在緩慢振動下沖洗3次。接著於含有5 0奈克/毫升抗環氧化酶2抗體 (卜今 > 只夕°夕シ3 >今求亏卜U 社製，C22420)之10%封嵌工一只、含有0.1% Tween 20之磷酸缓衝食鹽水中，於室溫下，在緩慢振動下反應1小時；再用含有0.1% Tween 20 -62- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）裝訂

577744 A7 B7 五、發明説明（6Q ) 之难酸缓衝食鹽水，於1 5分鐘内，在緩慢振動下沖洗3 次。然後於含有經0· 1%過氧化酶所標識之兔的抗小鼠IgG (H+L)抗體（甘V〆v F社製，61-6520)的10%封嵌工一只、含有0.1% Tween 20之麟酸緩衝食鹽水中，於室溫下，在緩慢振動下反應1小時；再用含有0.1% Tween 20之鱗酸緩衝食鹽水，於1 5分鐘内，在緩慢振動下沖洗5次。然後將 PVDF膜利用.西氏墨潰化合光測濃度法試劑Plus(第一化學社販賣NEN亏彳7寸彳工 > 只7。口 /夕7社製，NEL103)，依其所附方法進行染色，並感光於X光底片（Kodak社製， CAT165 1454)上。感光後之底片用FPM800(富士 7 4小厶社製）顯像。結果為：於添加LPS之組中，可檢測出環氧化酶2蛋白質；而於0.6小時前添加瓊脂二糖、覆脂六糖之組中，亦未對於LPS所謗導的環氧化酶2蛋白質表現之亢進現象有任何抑制作用。 (2)將RAW264.7細胞（ATCC TIB 71)懸浮於含有10%牛胎兒血清（半' y 口社製）之Dulbecco氏改良Eagle培養基（〆彳才々 < 夕力一·社製，編號12-604F)中，使呈3 X 105個/毫升，再分別添加5毫升於6孔微量培養皿之各孔中，然後在5 % 二氧化碳氣體存在下，於37 °C下培養一晚。在各孔中添加50微升之10 mM瓊脂二糖或瓊脂六糖水溶液，再培養 0.6小時後，於各孔添加5 0微升之100微克/毫升脂多糖 (LPS，SIGMA社製，編號L-2012)水溶液，並培養5小時。除去培養上清液，於各孔中添加1毫升之Cat rimox-14(寶 -63- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

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577744 A7 B7 五、發明説明（61 ) 酒造社販賣7彳才彳才于夕/口夕一社製，WA002)溶液，以吸量管吸移後，回收溶液，再依所附之程序製備 RNA。所製備之RNA用RNA-PCR套組（AMV)第2.1版（寶酒造社製，R019A)進行RT-PCR。逆轉錄反應係用隨機引子 (N6)(寶酒造社製，3801)，於3 0 °C下進行1 0分鐘、42 °C 下30分鐘，及99 °C下5分鐘；再以所合成之cDNA為模版 ’ 用環氧化酶 2 之引子 (GGCACTTGCATTGATGGTGGCT :序列編號 1 ，以及 CAAGCAGTGGCAAGGCCTCCA:序列編號2)，於 94〇C 下進行PCR反應2分鐘，再進行（94°C下30秒、55°C下1分鐘、72 °C下1分鐘）共30循環，最後於72 °C下進行5分鐘。反應完成後，將檢體置於2%瓊脂糖凝膠上，以100V 進行電泳。電泳後用溴化乙啶染色，於UV照射下觀察凝膠。結果如下：在添加LPS之組中，可檢測出由環氧化酶2 mRNA所產生之條帶；而於0.6小時前添加瓊脂二糖或瓊脂六糖之組中，對於LPS所謗導之環氧化酶2mRNA的合成亢進現象，均未見任何抑制作用。由實例1 4或下述實例1 5之結果，可知瓊脂寡糖對於前列腺素E2之產生的抑制作用，並非基於對環氧化酶2之表現的抑制。 - 實例1 5 (1)將RAW264.7細胞（ATCC TIB 71)懸浮於含有10%牛胎兒血清（羊7 J社製）之Dulbecco氏改良Eagle培養基（〆彳才 -64- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝訂

577744 A7 B7 五、發明説明（62 ) 々4夕力一社製，編號12-604F)中，使呈1 X ι〇6個/毫升，再分別添加20¾升於徑長10公分之培養皿中，然後在5% 二氧化碳氣體存在下，於37 °C下培養一晚。在各培養皿中添加200微升之10 mM瓊脂六糖或下面實例15-(2)所得之 DGE水溶液，再培養5小時後，於各孔添加200微升之1〇〇微克/毫升脂多糖（LPS，SIGMA社製，編號l-2012)水溶液，並培養1 2小時。另外，則以添加2〇〇微升水代替前述之檢體樣本，以作為對照之用。將細胞用刮勺自培養皿上剥下後回收之，並懸浮於含有1微克/亳升胃蛋白抑制素A (SIGMA社製，P5318)、1微克/毫升亮精三肽（SIGMA 社製’ L2884)、1 mM表甲橫酿氣（于力今 <于只夕社製， 273·27)之0.1M Tris缓衝液（pH 8.0)中，並用超音波破碎機將細胞膜打碎後，經由離心回收上清液，作成粗酵素分液。粗酵素分液中之蛋白質含量，是以Micro BCA蛋白質分析試劑（寶酒造社販賣t。7只社製，P7411)來測定。於 100微升之如此配製之各粗酵素分液樣本中，添加5微升之200 mM之麩胺胱肽（十力今4于只夕社製，170-50)水溶液、2.5微升之200 mM L-腎上腺素水懸浮液（十力今彳于只夕社製’ 010-04)後，再加入1微升之3 mM花生四婦酸（^彳社製，90010.1)水溶液或1微升之100微克/毫升前列腺素H2(^r彳7 >社製，17〇2〇)於3_7 °C下令其反應3 0分鐘後’於100。(：下加熱2分鐘以停止反應。反應液中之前列腺素E2含量，以前列腺素e2 ELISA套組（NEOGEN社製， 404110)測定之。 -65- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 577744

結果如下：與對照組相較，添加瓊脂六糖或添加〇〇£之組中，不論是在添加花生四烯酸或添加前列腺素化的情形下’其前列腺素E2之生成均受到抑制。由此可知，壤脂穴糖或DGE具有在比前列腺素H2之生成過程更為下游處發揮抑制前列腺素E 2之作用的機制。圖丨3所示者，係將花生四燁酸添加於各樣本中時，其前列腺素E2生成的情況，其中橫轴係表各樣本，而縱轴則表相當於1亳克蛋白質之前列腺素E2生成量（奈克/亳升）。圖14所示者，係將則列腺素Η 2添加於各樣本中時，其前列腺素E 2生成的情況；其中橫軸係表各樣本，而縱軸則表相當於1毫克蛋白質之前列腺素Ε2生成量（奈克/亳升）。 (2)以下茲進行DGE之製備，亦即式又 Η

(X) ! 所表之L-甘油-1，5-環氧-1αβ，6-二羥基_順式β己_3-烯_2-酮之製備。將2.5克市售瓊脂（agar.n〇ble)懸浮於5〇毫升之〇·ΐΝ HC1 中，在10CTC下加熱13分鐘使其溶解。將之冷卻至室溫後，以NaOH調整為pH 12，再進行中和處理。將中和處理物以下述之順向HPLC進行分離，大量收集保留時間4·05分至4· 16分間之分液，即得到dgE。 •66- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 577744 A7 B7 五、發明説明（64 ) 管柱：PALPAK型號S (4·6 X 250公釐，寶酒造社製）溶劑A : 90%乙腈水溶液溶劑B : 50%乙腈水溶液流速：1毫升/分鐘沖提：移動相A ( 1 0分鐘）-> 自移動相A至移動相B之直線濃度梯度（4 0分鐘）4移動相B ( 1 0分鐘）檢測：195奈米時之吸光度管柱溫度：4(TC 實例1 6 於實例15所製備之粗酵素分液100微升中，加入2.5微升之200 mM麩胺胱肽水溶液、2.5微升之200 mM L-腎上腺素水懸浮液，以作為對照樣本；亦於另一粗酵素分液中加入1微升之100 mM瓊脂二糖水溶液或100 mM瓊脂六糖水溶液或10 mM DGE水溶液，以作為實驗樣本。此外，在陰性對照組方面，則是添加1微升水；而於陽性對照組，則加入1微升之13 mM尼美斯理多（二〆XU卜')(兮4^>社製，70640)溶液。接著，加入1微升之3 mM花生四烯酸溶液，於37 °C下令其反應5分鐘。於100°C下加熱2分鐘以停止反應。反應液中之前列腺素E2含量，以前列腺素E2 ELISA套組測定之。結果如下：在添加尼美斯理多之組中，其前列腺素Ey之生成均受到抑制；而添加瓊脂二糖、瓊脂六糖或添加DGE 之組中，其前列腺素E2i生成則均未受到抑制。換言之，由此可知，瓊脂二糖、瓊脂六糖或DGE三者，均無法 -67- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

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577744 A7 B7 五、發明説明（65 ) 抑制由花生四烯酸合成前列腺素E2之各種酵素的作用。結果示於圖1 5。圖1 5所示者，係添加各樣本時之前列腺素E2生成量；其中橫軸係表各樣本，而縱軸則表相當於1 毫克蛋白質之前列腺素£2生成量（奈克/毫升）。實例17 於ddy小.鼠（日本SLC ; /只，7週齡）腹腔中注入含有10% 牛胎兒血清之RPMI 1640培養基（〆彳才々4夕力一社製，編號12-702F)4毫升，並充分按摩後，進行抽取，即可得到腹腔細胞。將腹腔細胞懸浮於含有10%牛胎兒血清之RPMI 1640培養基中，使呈106個/亳升；再於48孔微量培養皿中各添加500微升，然後在5%二氧化碳氣體存在下以及37 °C中培養2小時後，除去培養上清液，即得接著性細胞，將之作為腹腔巨噬細胞使用。於各孔中重新添加含有10% 牛胎兒血清、不含酚紅、含有2 mML-麩胺酸醯胺之 Dulbecco氏改良Eagle培養基（〆彳才々4夕力一社製，編號 12-917F)各500微升。然後再於各孔中添加參考例1中所得之5微升20 mM、10 mM、5 mM瓊脂二糖水溶液後，加入5 微升之10微克/毫升12-0-十四醯基弗波醇-13-乙酸酯 (TPA ;半yrr社製，13 139-019)水溶液，並進一步培養14 小時後，回收培養上清液。培養上清液中之間白素6 (IL-6) 含量，用酵素免疫夹層分析（ELISA ; Matched antibody Pair Sample Pak-mouse IL-6，工 > 卜’ ^ χ y社製）測定之。另外則設未添加瓊脂二糖、TPA水溶液之組，以作為對照之用。其測定均以2組行之。 -68- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 577744

結果如下··於添加瓊脂二换、一糖又組中，其對於TPA所謗發 < IL-6產生作用的抑制程户 / 1 + 一度係隨耆瓊脂二糖之濃度之增加而有提高之趨勢。其結果示於圖16。亦即，圖！6所示 ί ·’係於f培養條件下培養時，其培養上清液中之IL-6濃:，其中檢軸表培養條件，而縱輔則表il_6之濃度（奈克/ 笔升）。實例1 8 1參考例3所載之壤脂二糖溶於自來水中，使濃度為 1.3%’以配製成下面實驗所用之13%瓊脂二糖溶液。令ddy小鼠（日本SLC; ^，7週齡）於"日之内自由飲用前述所配製之10%瓊脂二糖溶液；至於對照組則令小鼠自由飲用自來水。而各組之數目為2隻小鼠。然後於其腹腔中/主入含有10%牛胎兒血清<rpmi 164〇培養基（〆彳才々 4夕力社製，編號12-702F)4亳升，並充分按摩後，進行抽取即可收集到2隻小鼠份量的腹腔細胞。將腹腔細胞懸6浮於含有10%牛胎兒血清之RPMI 164〇培養基中，使呈 1〇6個/毫升；再於48孔微量培養皿中各添加5〇〇微升，然後在一氧化碳氣體存在下以及37 °C中培養2小時後，除去^養上清液，即侍接著性細胞，將之作為腹腔巨嗟細胞使用。於各孔中重新添加含有10%牛胎兒血清、不含盼紅、含有2 mM L-麩胺酸醯胺之Dulbecco氏改良Eagle培養基（a彳才々4夕力—社製，編號12-917F)各500微升，再添加5微升之1〇〇微克/毫升脂多糖（LPS，SIGMA社製，編號L-2012)水溶液，並進一步培養ι5小時後，回收培養上 -69-

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線 577744 A7

清液。培養上清液中之間白素6 (IL-6)含量，用酵素免疫夹層分析法測定之。另外則設未添加LPS之組，以作為對照之用。其測定均以2組行之。結果如下：由自由飲用瓊脂二糖溶液之小鼠中所製得之腹腔巨嗟細胞中，其對於LPS所謗發之IL-6產生作用的抑制程度’係隨著瓊脂二糖之濃度之增加而有提高之趨勢。其結果示於圖1 7。亦即，圖1 7所示者，係於各培養條件下培養時，其培養上清液中之1]1-6濃度；其中橫軸表培養條件，而縱軸則表IL-6之濃度（奈克/亳升）。將RAW264.7細胞（ATCC TIB 71)懸浮於含有1〇%牛胎兒血清（半7、1:7社製）之Dulbecco氏改良Eagle培養基彳才々彳夕力—社製，編號12-604F)中，使呈3X105個/毫升；再於48孔微量培養皿之各孔中各添加〇5亳升，然後在5%二氧化碳氣體存在下以及37它中培養一晚。於各孔中添加參考例1中所載1 〇 mM瓊脂二糖或瓊脂六糖水溶液5微升，並進一步培養5小時後，於各孔中添加5微升之100微克/ 毫升脂多糖（LPS，SIGMA社製，編號L-2012)水溶液，再培養1 8小時，回收培養上清液。培養上清液中之間白素忉 (IL-10)含量，用酵素免疫夾層分析法測定之。另外則設未添加LPS水溶液之組，以作為對照之用。其測定均以2組行之。、、結果如下：在添加瓊脂二糖、瓊脂六糖之組中，對於 LPS所謗發之;[1^10產生作用，均有抑制效果。认圖…亦即，圖18所示者，係於各培養條件下於 -70-

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線 577744 A7 B7 五、發明説明（68 ) 其培養上清液中之IL-10濃度；其中橫軸表培養條件，而縱軸則表IL-10之濃度（皮克/毫升）。實例1 9 將RAW264.7細胞（ATCC TIB 71)懸浮於含有10%牛胎兒血清（半7 口社製）之Dulbecco氏改良Eagle培養基（〆彳才々 4夕力一社製，編號12-604F)中，使呈3 X 105個/毫升；再於6孔微量培養皿之各孔中各添加5毫升，然後在5 %二氧化碳氣體存在下以及37 °C中培養一晚。於各孔中添加參考例1中所載20 mM、10 mM或5 mM之瓊脂二糖或瓊脂六糖水溶液5 0微升，並進一步培養1 5小時。此外，亦設有添加5微升之3 mM 15-去氧-Δ12，14前列腺素J2 (夂彳 S力小社製，18570)二甲亞颯溶液之組，以作為血紅素加氧酶1謗導之陽性對照組；以及添加水之組，以作為陰性對照組。將細胞用刮勺自培養皿上剥下後回收之，並懸浮於含有0·05 mM胃蛋白抑制素A (SIGMA社製，P5318)、 0·2 mM亮精三肽（SIGMA社製，L2884)、1 mM苯甲磺醯氟 (十力今彳于只夕社製，273-27)、10 mM乙二胺四醋酸二氫二鈉、0.1%Triton X-100 之 0.1M Tris-HCl緩衝液（pH 7.5) 中，於凍結溶解1次後，經由離心，將上清液作成蛋白質分液。蛋白質分液中之蛋白質含量，是以Micro BCA蛋白質分析試劑（寶酒造社販賣社製，P7411)來測定。將如此配製之各蛋白質分液樣本，與等量之含有4%月桂基硫酸鈉（SDS)、2% 2-氫硫基乙醇、0.001%溴酚藍、20% 甘油之0.125河丁1^-鹽酸缓衝液&116.8)予以混合，於100 -71- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）裝訂

線 577744 A7 B7 五、發明説明（69 ) °C下處理5分鐘後，將蛋白質之量為10微升的樣本，裝料至12.5% SDS-聚丙烯醯胺凝膠上，以20 mA之固定電流進行電泳。電泳後之凝膠，用含有48 mM Tris、39 mM甘胺酸、20%甲醇、0.0375% SDS之印跡缓衝液，藉由轉移印跡SD槽半乾印跡裝置（Bio-Rad社製）及其所附之方法，在 15V之固定電壓下，於25分鐘内，將之轉印於PVDF膜（三 U社製，IPVH000 10)。轉印後之PVDF膜，在封嵌工一只（大曰本製藥社製，UK-B25)溶液中及4。(：下靜置一晚，以將之封嵌。封嵌後之膜，以含有0.1% Tween 20之磷酸緩衝食鹽水，於1 5分鐘内，在緩慢振動下沖洗3次。接著於含有200奈克/毫升抗血紅素加氧酶1抗體（N-19 ;寸 > 夕夕小一 X社製，sc-7696)之10%封嵌工一只、含有0.1% Tween 20之磷酸缓衝食鹽水中，於室溫下，在緩慢振動下反應1小時；然後用含有0.1% Tween 20之磷酸缓衝食鹽水’於1 5分鐘内，在缓慢振動下沖洗3次。其次，於含有經0 · 1 %過氧化酶所標識之兔的抗小鼠IgG (H+L)抗體（寸、彳〆7卜社製’ 61-1620)的10%封喪工一只、含有0.1% Tween 20之轉酸緩衝食鹽水中，於室溫下，在緩慢振動下反應1 小時；再用含有〇· 1% Tween 20之磷酸缓衝食鹽水，於15 分鐘内’在緩慢振動下沖洗5次。然後將PVDF膜利用西氏墨潰化合光测濃度法試劑Plus(第一化學社販賣NEN 5冷7 寸4工V只7 口〆夕7社製，NEL103)，依其所附方法進行染色’並感光於X光底片（Kodak社製，CAT165 1454)上。感光後之底片用FPM800(富士 7 4小Λ社製）顯像。 -72- 本纸張尺度適用中國國家操準(CNS) A4規格(21〇X297公釐) 裝訂

577744 A7 B7 五、發明説明（70 ) 結果為：於添加瓊脂二糖、瓊脂六糖之組中，均可見由血紅素加氧酶1蛋白質所產生之條帶。此外，條帶之強度係隨瓊脂二糖、瓊脂六糖之濃度而增加。其結果示於表 9。表中血紅素加氧酶1蛋白質之條帶的強度大小，係以+ 之記號來表示。亦即，完全未見條帶者為-;而+ -、+、 + +之次序，則代表其條帶之強度愈強。表9 試劑血紅素加氧酶1蛋白質之條帶強度水（陰性對照） - 終濃度200 μΜ瓊脂二糖 ++ 終濃度1〇〇 μΜ瓊脂二糖 4* 終濃度50 μΜ瓊脂二糖 + - 終濃度200 μΜ瓊脂六糖 ++ 終濃度100 μΜ瓊脂六糖 + 終濃度50 μΜ瓊脂六糖 + - 15-去氧-Δ12，14前列腺素J2 + (陽性對照）產業上之利用可能性根據本發明，將可提供一種用於維持生體之恆常性及治療或預防糖尿病、風溼、生活習慣病症等疾病的醫藥組合物、機能性食品與機能性飲料。此外，本發明所用之化合物亦具有顯著的發癌抑制作用，故亦可作為用於抑制發癌之食品添加劑。 -73- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 577744 A7 B7 五、發明説明（71 ) 序列表之簡要說明序列編號1 :為增幅環氧化酶2之mRNA所設計的寡核甞酸引子。序列編號2 :為增幅環氧化酶2之mRNA所設計的寡核嘗酸引子。 -74- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 577744 A7 B7 五、發明説明（72 ) 序列表 <110>寶酒造股份有限公司 <120〉醫藥組合物 <130〉 661697 <150> JP 11-11646 <151〉 1999-01-20 <150> JP 11-191808 <151〉 1999-07-06 <150> JP 11-270285 <151〉 1999-09-24 <160〉 2 <210〉 1 <211〉 22 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉為增幅環氧化酶2之mRNA所設計的寡核铝酸引子 <400> 1 GGCACTTGCA TTGATGGTGG CT 22 <210> 2 <211〉 22 <212> DNA <213>人造序列 <220> -75- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝訂

線 577744 A7 B7 五、發明説明（73 ) <223〉為增幅環氧化酶2之mRNA所設計的寡核苷酸引子 <400> 2 CAAGCAGTGG CAAGGCCTCC A 21 -76- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

Claims

577744 91.7.3« .8 ι8 公告本f88 倐01 、申請專利範圍」 —------ 拥充 1. 一種用於治療或預防糖尿病之醫藥組合物，其係包含選自下列之化合物作為有效成分：選自式（I)所示之 3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛體、其水合物及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物，

訂 r 2. —種用於治療或預防風溼之醫藥組合物，其係包含選自下列之化合物作為有效成分：選自式（I)所示之3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛體、其水合物及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物，

⑴丨 3. —種用於治療或預防需要抑制炎症之疾病之醫藥組合 -77- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 々、申請專利範圍物，其係包含選自下列之化合物作為有效成分：選自式（I)所示之3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛體、其水合物及彼等之2-0-甲基化體或2-0·硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物，

4. 一種用於治療或預防需要抑制α·葡糖菩酶之疾病之醫藥組合物，其係包含選自下列之化合物作為有效成分：選自式（I)所示之3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛體、其水合物及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物，

5. —種用於治療或預防需要抑制前列腺素合成之疾病之本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 577744 8 8 8 8 A B c D 申請專利範圍醫藥組合物，其係包含選自下列之化合物作為有效成分：選自式（I)所示之3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛體、其水合物及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物，

(I) 6. —種用於治療或預防需要抑制内毒素休克之疾病之醫藥組合物，其係包含選自下列之化合物作為有效成分：選自式（I)所示之3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛體、其水合物及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物，

0H (I) 7. —種用於治療或預防需要抑制間白素產生之疾病之醫 -79 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 577744 A8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍藥組合物，其係包含選自下列之化合物作為有效成分：選自式（I)所示之3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛體、· 其水合物及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物，

8. —種用於治療或預防需要謗發血紅素加氧酶產生之疾病之醫藥組合物，其係包含選自下列之化合物作為有效成分：選自式（I)所示之3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛體、其水合物及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物，

本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 577744 A8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍 9. 一種用於治療或預防需要抑制腫瘤壞死因子產生之疾病之醫藥組合物，其係包含選自下列之化合物作為有效成分：選自式（I)所示之3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛體、其水合物及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物，

10. —種用於治療或預防需要抑制發癌之疾病之醫藥組合物，其係包含選自下列之化合物作為有效成分：選自式（I)所示之3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛體、其水合物及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物，

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1L根據申請專利範圍第1〜1 0項中任一項之醫藥組合物，其中該糖化合物為含有選自式所示之3,心脫水吡喃半乳糖、其醛體、其水合物及彼等之甲基化體或2_0-硫酸化體等化合物之物質於ρΗ 2〜7之酸性條件下的酸分解物及/或酵素分解物^ 12·根據申請專利範圍第1〜1 0項中任一項之醫藥組合物’其中該含有選自式（I)所示之3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛體、其水合物及彼等之2-0-甲基化體或2·〇·硫酸化體等化合物之物質，為選自瓊脂、瓊脂糖及角又聚糖者。 13·根據申請專利範圍第11項之醫藥組合物，其中該含有選自式（I)所示之3,6-脫水吡喃半乳糖、其醛體、其水合物及彼等之2-0·甲基化體或2-0-硫酸化體等化合物之物質’為選自瓊脂、瓊脂糖及角叉聚糖者。 14·根據申請專利範圍第！〜1 〇項中任一項之醫藥組合物’其中該糖化合物係選自壤脂二糖、瓊脂四糖、環脂六糖、瓊脂八糖、κ-角叉二糖及卜〇_吡半乳糖基· 3,6-脫水-2-0-甲基-L-半乳糖中之糖化合物。 15·根據申請專利範圍第11項之醫藥組合物，其中該糖化合物係選自瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、壤脂八糖、κ-角叉二糖及β-D-吡半乳糖基-3,6_脫水-2·〇·甲基-L_半乳糖中之糖化合物。 16·根據申請專利範圍第1 2項之醫藥組合物，其中該糖化合物係選自瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、壤脂八 -82- 577744 A8 B8 C8 -------- D8 六、申請專利範圍糖、κ_角又二糖及p-D-吡半乳糖基_3,6•脫水_2_〇一甲基-L ·半乳糖中之糖化合物。 17·根據申請專利範圍第1 3項之醫藥組合物，其中該糖化合物係選自瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖、κ_角又二糖及吡半乳糖基·3,6-脫水_2·〇-甲基-L_半乳糖中之糖化合物。 H一種用於改善糖尿病症狀或預防糖尿病之飲食品組合物，該組合物中包含、添加及/或稀釋有選自下列之化合物：選自式（I)所示之3,6-脫水半乳哌喃糖、其酸體、其含水體及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物。 19· 一種用於改善風溼症狀或預防風溼之飲食品組合物，該組合物中包含、添加及/或稀釋有選自下列之化合物·選自式（I)所示之3,6-脫水半乳p底喃糖 '其駿體、其含水體及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物’以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物。 20· —種用於改善需要抑制炎症之疾病症狀或預防需要抑制炎症之疾病之飲食品組合物，該組合物中包含、添加及/或稀釋有選自下列之化合物：選自式（丨）所示之 3,6-脫水半乳哌喃糖、其醛體·、其含水體及彼等之孓〇· 甲基化體或2-0硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物。 21· —種用於改善需要抑制〇^葡糖苷酶之疾病症狀或預防 -83- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格^210X297公釐)'"一~ 577744 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍需要抑制α -葡糖甞酶之疾病之飲食品組合物，該組合物中包含、添加及/或稀釋有選自下列之化合物：選自式（I)所示之3,6-脫水半乳哌喃糖、其醛體、其含水體及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物。 22. —種用於改善需要抑制前列腺素合成之疾病症狀或預防需要抑制前列腺素合成之疾病之飲食品組合物，該組合物中包含、添加及/或稀釋有選自下列之化合物：選自式（I)所示之3,6_脫水半乳哌喃糖、其醛體、其含水體及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物。 23. —種用於改善需要抑制内毒素休克之疾病症狀或預防需要抑制内毒素休克之疾病之飲食品組合物，該組合物中包含、添加及/或稀釋有選自下列之化合物：選自式（I)所示之3,6-脫水半乳哌喃糖、其醛體、其含水體及彼等之2-0-甲基化體或2_0•硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物。 24. —種用於改善需要抑制間白素產生之疾病症狀或預防需要抑制間白素產生之疾病之飲食品組合物，該組合物中包含、添加及/或稀釋有選自下列之化合物：選自式（I)所示之3,6-脫水半乳哌喃糖、其醛體、其含水體及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物。 25. —種用於改善需要謗發血紅素加氧酶產生之疾病症狀 -84 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐）

裝訂 577744 A B c D 々、申請專利範圍或預防需要謗發血紅素加氧酶產生之疾病之飲食品組合物，該組合物中包含、添加及/或稀釋有選自下列之化合物：選自式（I)所示之3,6-脫水半乳哌喃糖、其醛體、其含水體及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物。 26. —種用於改善需要抑制腫瘤壞死因子產生之疾病症狀或預防需要抑制腫瘤壞死因子產生之疾病之飲食品組合物，該組合物中包含、添加及/或稀釋有選自下列之化合物：選自式（I)所示之3,6-脫水半乳哌喃糖、其醛體、其含水體及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物。 27. —種用於改善需要抑制發癌之疾病症狀或預防需要抑制發癌之疾病之飲食品組合物，該組合物中包含、添加及/或稀釋有選自下列之化合物：選自式（I)所示之 3,6-脫水半乳哌喃糖、其醛體、其含水體及彼等之2-0-甲基化體或2-0-硫酸化體之化合物，以及於還原端具有該化合物之可溶性糖化合物。 -85- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)