JP2011213707A - メタロプロテアーゼ産生抑制剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】寒天、アガロース、及びアガロオリゴ糖からなる群より選択される少なくとも1種の化合物を含むメタロプロテアーゼ産生抑制剤、当該剤を含む医薬組成物、並びに前記剤を含む皮膚及び/又は骨の老化防止用組成物が提供される。本発明のメタロプロテアーゼ産生抑制剤は、優れたメタロプロテアーゼ産生抑制作用を示し、かつ副作用を示さないため、生化学分野において特に有用である。
【選択図】図1
Description
正常ヒト膝関節軟骨細胞(Lonza社製)を軟骨細胞専用培地(Lonza社製)に1×105個/mLになるように懸濁し、得られた懸濁液を96穴プレートの各ウェルに0.2mLずつ加えて5% 炭酸ガス存在下、37℃で4日間培養した。次に、10% ウシ胎児血清、1% Penicillin−Streptomycin含有、ダルベッコ改良イーグル培地(シグマ社製、D5796)、及び当該培地に濃度が25、50、あるいは100μg/mLとなるようにアガロオリゴ糖〔アガオリゴ(登録商標)、タカラバイオ社製〕を溶解させた培地を調製し、前記培養物の培地と交換した。アガロオリゴ糖濃度がそれぞれ異なる培地に培地交換された細胞について、5% 炭酸ガス存在下、37℃で24時間培養した。続いて、各ウェルに0.1μg/mL human IL−1β(genzyme社製)を10μLずつ添加し、更に5% 炭酸ガス存在下、37℃で4時間培養した。なお、陰性対照として、IL−1βを添加しない区分を設定した。培養終了後、各ウェルの細胞より、CellAmp(登録商標) Direct RNA Prep Kit for RT−PCR(Real Time)(タカラバイオ社製)及びPrimeScript(登録商標) RT reagent Kit(Perfect Real Time)(タカラバイオ社製)を用いてcDNA溶液を調製した。
正常ヒト膝関節軟骨細胞を軟骨細胞専用培地に8×104個/mLになるように懸濁し、12穴プレートの各ウェルに2mLずつ加えて5% 炭酸ガス存在下、37℃で2日間培養した。次に、10%ウシ胎児血清、1% Penicillin−Streptomycin含有、ダルベッコ改良イーグル培地、及び当該培地に濃度が25、50、あるいは100μg/mLとなるようにアガロオリゴ糖〔アガオリゴ(登録商標)、タカラバイオ社製〕を溶解させた培地を調製し、当該培地を1ウェルあたり1mL用いて前記培養物の培地交換を行った。アガロオリゴ糖濃度がそれぞれ異なる培地に培地交換された細胞について、5% 炭酸ガス存在下、37℃で4時間培養した。続いて、各ウェルに1μg/mL human IL−1βを5μLずつ添加し、更に5% 炭酸ガス存在下、37℃で12時間培養した。なお、陰性対照として、IL−1βを添加しない区分を設定した。培養終了後、培養上清を回収し、培養上清中のMMP−3量をQuantikine(登録商標)Human MMP−3 Immunoassay(R&D system社製)を用いて測定した。
正常ヒト膝関節軟骨細胞を軟骨細胞専用培地に1×105個/mLになるように懸濁し、48穴プレートの各ウェルに0.5mLずつ加えて5% 炭酸ガス存在下、37℃で3日間培養した。次に、10%ウシ胎児血清、1% Penicillin−Streptomycin含有、ダルベッコ改良イーグル培地、及び当該培地に濃度が12.5、25、50、100あるいは150μg/mlとなるようにアガロオリゴ糖〔アガオリゴ(登録商標)、タカラバイオ社製〕を溶解させた培地を調製し、当該培地1ウェルあたり0.5mLを前記培養物の培地交換に使用した。アガロオリゴ糖濃度がそれぞれ異なる培地に交換された懸濁液について、5% 炭酸ガス存在下、37℃で24時間培養した。続いて、各ウェルに0.1μg/ml human IL−1βを25μLずつ添加し、更に5% 炭酸ガス存在下、37℃で8時間培養した。なお、陰性対照として、IL−1βを添加しない区分を設定した。培養終了後、培養上清を回収し、培養上清中のpro−MMP−1量をQuantikine(登録商標)Human pro−MMP−1 Immunoassay(R&D system社製)を用いて測定し、MMP−13量をHuman MMP−13 ELISA Kit(Ray Biotech社製)を用いて測定した。
human MMP−1、MMP−3、MMP−13遺伝子に特異的なプライマー対の代わりにhuman ADAMTS−4及びADAMTS−5遺伝子に特異的なプライマー対を用いた以外は実施例1と同様の方法で、正常ヒト膝関節軟骨細胞におけるアガロオリゴ糖のIL−β誘導性ADAMTS mRNA発現抑制活性を調べた。human ADAMTS−4に特異的なプライマー対の配列を配列番号:9及び配列番号10に、human ADAMTS−5特異的なプライマー対の配列を配列番号:11及び配列番号12に示す。測定は、全て3連で行った。なお、各mRNA発現量は、陰性対照区分のmRNA発現量に対する相対量として以下の式により算出した。
SEQ ID NO:2 ; A PCR primer specific to GAPDH gene.
SEQ ID NO:3 ; A PCR primer specific to MMP-1 gene.
SEQ ID NO:4 ; A PCR primer specific to MMP-1 gene.
SEQ ID NO:5 ; A PCR primer specific to MMP-3 gene.
SEQ ID NO:6 ; A PCR primer specific to MMP-3 gene.
SEQ ID NO:7 ; A PCR primer specific to MMP-13 gene.
SEQ ID NO:8 ; A PCR primer specific to MMP-13 gene.
SEQ ID NO:9 ; A PCR primer specific to ADAMTS-4 gene.
SEQ ID NO:10 ; A PCR primer specific to ADAMTS-4 gene.
SEQ ID NO:11 ; A PCR primer specific to ADAMTS-5 gene.
SEQ ID NO:12 ; A PCR primer specific to ADAMTS-5 gene.
Claims (7)
- 寒天、アガロース、及びアガロオリゴ糖からなる群より選択される少なくとも1種の化合物を含むメタロプロテアーゼ産生抑制剤。
- 寒天が低分子化された寒天である請求項1に記載のメタロプロテアーゼ産生抑制剤。
- アガロオリゴ糖が、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオース、アガロオクタオース、及びアガロデカオースからなる群より選択される少なくとも1種の化合物である請求項1に記載のメタロプロテアーゼ産生抑制剤。
- マトリックスメタロプロテアーゼ及び/又はADAMTSの産生抑制剤である請求項1に記載のメタロプロテアーゼ産生抑制剤。
- マトリックスメタロプロテアーゼ−1、マトリックスメタロプロテアーゼ−3、マトリックスメタロプロテアーゼ−13、ADAMTS−4、及びADAMTS−5からなる群より選択された少なくとも1種のメタロプロテアーゼの産生抑制剤である請求項4に記載のメタロプロテアーゼ産生抑制剤。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のメタロプロテアーゼ産生抑制剤を含む、ガンの浸潤及び/又はガンの転移抑制用の医薬組成物。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のメタロプロテアーゼ産生抑制剤を含む、皮膚及び/又は骨の老化防止用組成物。
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2010
- 2010-10-04 JP JP2010224569A patent/JP2011213707A/ja active Pending
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