CN104540960A - 胶原肽组合物的制造方法、dpp-4阻碍剂和血糖值升高抑制剂 - Google Patents

胶原肽组合物的制造方法、dpp-4阻碍剂和血糖值升高抑制剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供新的胶原肽组合物的制造方法、和含有所述胶原肽组合物的DPP-4阻碍剂、血糖值升高抑制剂。在胶原和/或明胶溶液中添加来自生姜根茎的酶进行分解，生成含有以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽的肽组合物。这样得到的胶原肽组合物DPP-4阻碍活性高，且血糖值升高抑制效果优异。

Description

胶原肽组合物的制造方法、DPP-4阻碍剂和血糖值升高抑制剂
技术领域
本发明涉及胶原肽组合物的制造方法、含有所述胶原肽组合物的二肽基肽酶4阻碍剂(以下简称为DPP-4阻碍剂)和血糖值升高抑制剂。
背景技术
近年来，从胶原、明胶的水解物中发现大量的活性肽。作为活性肽的用途，有以Hyp-Gly为关节炎、褥疮抑制剂(专利文献1)、以Ala-Hyp、Leu-Hyp、Ala-Hyp-Gly为明胶合成促进剂(专利文献2)、以Gly-X-Y-(Gly-Z-W)表示的肽为血糖值升高抑制剂(专利文献3)、以Gly-Pro-Ala-Gly为DPP-4阻碍剂(专利文献4)、以Pro-Hyp的成纤维细胞增殖促进作用为化妆品(专利文献5)等大量的报告。另外，关于口服摄取了胶原、明胶时的消化、吸收、代谢，报告了Pro-Hyp、Ala-Hyp、Leu-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly等二肽、三肽在血中存在(非专利文献1)、Hyp-Gly在血中存在(非专利文献2)。由于这些肽具有生理活性(专利文献1、专利文献2、专利文献5)，因此，二肽、三肽在血中转移被认为是胶原在口服摄取中的机制之一。水解胶原、明胶的蛋白质分解酶数量众多，为了通过其中的任何一个、或它们的组合来有效地生成生理活性肽而进行研究，蛋白质分解酶的选择成为重要的因素之一。
胶原具有甘氨酸每三个残基便重复、以所谓被称作胶原样序列的-(Gly-氨基酸X-氨基酸Y)n-表示的特征性氨基酸序列，作为每到该单元便分解的蛋白质分解酶，具有细菌胶原酶。使用细菌胶原酶进行分解的方法是得到Gly-X-Y型肽的优异方法。作为关于由细菌胶原酶生成的肽的生理活性的报告，有使用所述以Gly-X-Y-(Gly-Z-W)表示的肽的血糖值升高抑制剂(专利文献3)、使用Gly-Ala-Arg等三肽的胶原生成促进剂(专利文献6)等。
另一方面，也有使多个蛋白质分解酶组合地以多个阶段进行反应来获得所需要的肽的方法。例如有为了制造含有L-脯氨酰基-L-羟基脯氨酸的组合物，首先用具有胶原酶活性的蛋白酶进行处理，接着使肽链端解酶作用的方法(专利文献7)。另外，也有为了得到Glu-Hyp-Gly、Leu-Hyp-Gly、Ser-Hyp-Gly，在1次酶处理中使来自胶原酶、黄曲霉的蛋白酶作用，接着作为2次酶处理，在从N末端起第2个存在除脯氨酸或羟基脯氨酸以外的氨基酸的情况下使氨基酸从N末端起游离的肽酶作用，从而生成1次酶处理物不含有的肽的方法(专利文献8)。
另一方面，下述公知的：生姜中含有生姜蛋白酶(Zingibain)(非专利文献3)；胶原也可被除细菌胶原酶等以外的生姜蛋白酶分解(非专利文献4)；以及从将生姜根茎在极性溶剂中粉碎、干燥该过滤残渣而成的粉末中提取的酶的蛋白酶活性比直接从生姜根茎中提取的酶的蛋白酶活性高。
并且已知：生姜蛋白酶是脯氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，在从N末端侧读取时，切断与Pro的C末端侧相邻的氨基酸残基与下一个氨基酸残基之间的肽键(专利文献9)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2010-106003号公报
专利文献2：日本特开2010-24200号公报
专利文献3：国际公开第2008/66070号
专利文献4：国际公开第2013/65832号
专利文献5：日本特开2007-1981号公报
专利文献6：日本特开2003-137807号公报
专利文献7：日本特开2012-135222号公报
专利文献8：国际公开第2012/102308号
专利文献9：日本特表2007-522822号公报
非专利文献
非专利文献1：J.Agric.Food Chem.2005Aug 10；53(16):6531-6536.
非专利文献2：Food Chemistry 1291019-10242011.
非专利文献3：生姜蛋白分解酶的分离纯化、营养与粮食,1973年,26卷6号,p377-383.
非专利文献4：Plant collagenase:unique collagenolytic activity of cysteine proteases fromginger,Biochim Biophys Acta,2007年,1770卷12号,p1627-1635.
非专利文献5：Preparation of proteolytic activity rich ginger powder and evaluation of itstenderizing effect on spent-hen muscles,Journal of Muscle Foods,2006年,17卷2号,p174-184.
发明内容
发明要解决的问题
在以X表示氨基酸残基的情况下，以X-Hyp-Gly表示的三肽中存在具有特有的生理活性的肽。所述专利文献2中，记载有Ala-Hyp-Gly具有胶原合成促进作用并可在生物体胶原合成促进用化妆品、皮肤治疗药等中使用。另外，所述专利文献8中称Glu-Hyp-Gly、Leu-Hyp-Gly等具有DPP-4阻碍活性。然而，以X-Hyp-Gly表示的肽不能仅通过细菌胶原酶分解胶原蛋白、明胶而生成。这是因为：细菌胶原酶在Gly的N末端侧切断因而切断上述式的Hyp与Gly之间的肽键。所以，所述专利文献2中通过人工合成生成Ala-Hyp-Gly，所述专利文献8中使用多个酶以2阶段反应生成。然而，在工业生产中，人工合成、将多个酶组合成为工序数变多、成本高的一个原因。因此，期望开发出可高效地分解胶原、明胶并生成以X-Hyp-Gly表示的三肽的胶原肽组合物的制造方法。
通常，口服摄取的蛋白质、肽被消化道酶分解成氨基酸、二肽、三肽，从小肠上皮通过氨基酸转运子、肽转运子摄入到血液中。如前所述，二肽、三肽在血中较稳定地存在且存在具有生理活性的二肽、三肽。通过生姜蛋白酶，可生成含有脯氨酸残基的肽，但其种类多，关于其生理活性的研究正在进行。如果发现新的药效，就能够有效地利用由简单的方法获得的肽。
鉴于上述现状，本发明的目的在于，提供以胶原和/或明胶作为原料、可高效地制造以X-Hyp-Gly表示的三肽的胶原肽组合物的制造方法。
另外，本发明的目的还在于，提供基于上述胶原肽组合物的生理活性的DPP-4阻碍剂和血糖值升高抑制剂。
用于解决课题的方法
本发明者们发现如果在胶原和/或明胶溶液中添加来自生姜根茎的酶，则从C末端起第2个的氨基酸残基能够产生Hyp的胶原肽；在获得的胶原肽组合物中含有以X-Hyp-Gly表示的肽，并且也同时生成以X-Pro-Gly表示的肽等；获得的胶原肽组合物的DPP-4阻碍活性高；如果将其对动物口服给药，则具有降血糖的效果，从而完成了本发明。
即，本发明提供胶原肽组合物的制造方法，其特征在于，在胶原和/或明胶溶液中添加来自生姜根茎的酶进行分解，生成含有以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽的肽组合物。
另外，本发明提供上述胶原肽组合物的制造方法，其特征在于，将生姜根茎的干燥粉碎物用作所述来自生姜根茎的酶。
另外，本发明提供上述胶原肽组合物的制造方法，其特征在于，将含有谷胱甘肽的酵母与所述来自生姜根茎的酶一同以0.005～0.5w/v％的范围添加，和/或调节到pH4.0～6.0的范围使其反应。
另外，本发明提供上述胶原肽组合物的制造方法，其特征在于，所述肽组合物所含的以所述式表示的肽的含量是所述胶原和/或明胶的0.01摩尔％以上。
另外，本发明提供胶原肽组合物的制造方法，其特征在于，进一步含有以X-Pro-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽。
另外，本发明提供含有由上述制造方法得到的胶原肽组合物的DPP-4阻碍剂。
另外，本发明提供含有由上述制造方法得到的胶原肽组合物的血糖值升高抑制剂。
发明的效果
根据本发明，能够通过在胶原、明胶溶液中添加来自生姜根茎的酶来以1阶段的酶反应制造含有以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽的胶原肽组合物。
根据本发明，能够将由所述制造方法获得的胶原肽组合物用于DPP-4阻碍剂和血糖值升高抑制剂等。
附图说明
图1：是表示实施例4的结果的图，是在来自牛的明胶中添加来自生姜的生姜根茎有机溶液干燥粉碎物而得的肽溶液的DPP-4阻碍曲线的图。
图2：是表示实施例4的结果的图，是在重组人明胶中添加来自生姜的生姜根茎有机溶液干燥粉碎物而得的肽溶液的DPP-4阻碍曲线的图。
图3：是表示实施例5的结果的图，是表示将来自牛的明胶用来自生姜的生姜根茎有机溶液干燥粉碎物分解而形成的胶原肽组合物对小鼠给药的情况的血糖值降低作用的图。将不添加胶原肽组合物的阴性对照组、和预先将捷诺维片(Januvia)给药的阳性对照组的结果一并记载。
图4：是表示实施例5的结果的图，是表示在血糖测定时同时测定的胰岛素浓度的结果的图。
图5：是表示实施例6的结果的图，是表示将在来自牛的明胶中添加来自生姜的生姜根茎有机溶液干燥粉碎物而得的胶原肽组合物对健康正常人规定量给药的情况的血糖值随时间变化的图。
图6：是表示实施例6的结果的图，是表示血糖值到120分钟后的累积值(AUC)的值的图。
具体实施方式
本发明的第一是胶原肽组合物的制造方法，其特征在于，在胶原和/或明胶溶液中添加来自生姜根茎的酶进行分解，生成含有以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽的肽组合物。以下，对本发明进行详细说明。
(1)胶原和/或明胶
本发明中使用的胶原是构成真皮、韧带、腱、骨、软骨等的蛋白质中的一种。作为本发明中使用的胶原，可以是来自牛、猪、鸡、鱼类、其他、任意动物种的胶原。除以往以来已知的I～XXVIII型以外，也可以是新发现的胶原。而且，还可以是胶原的变种。作为这种变种，是将脯氨酸排列来代替构成胶原的羟基脯氨酸的非羟基化胶原。即，形成三重螺旋结构的胶原链的每一条具有包含以-(Gly-氨基酸X-氨基酸Y)n-表示的胶原样序列的一级结构部分。在细胞内合成由所述一级结构形成的前α链，接着对脯氨酸进行羟基化，经糖基化后作为3条链的前胶原分泌到细胞外，受到酶处理而成为胶原。由于胶原的三重螺旋结构通过羟基脯氨酸形成的氢键而稳定化，因此脯氨酸的羟基化是必需的工序。然而，作为本发明中使用的胶原，例如可以是前α链所含有的脯氨酸在不被羟基化成羟脯氨酸的条件下生成的非羟基化胶原。这是由于即使非羟基化胶原，也与胶原同样地通过来自生姜根茎的酶进行分解。作为所述非羟基化胶原，可以是将构成三重螺旋的任意前α链的基因插入制造而得的重组胶原。由于非羟基化胶原的脯氨酸含量高，因此通过来自生姜根茎的酶的分解效率优异。
此外，明胶是胶原的分解物。三重螺旋结构是经加热处理等改性而形成3条α链的主成分，也含有α链的二聚体(β成分)、α链的三聚体(γ成分)。另一方面，由于经处理过程中的热经历、及其他而将分子间、分子内键的一部分无规地切断，因此分子量的分布处于几万～几十万，但大部分明胶的肽键是未分解的状态。所以可与胶原同样地将明胶用作反应原料。
作为胶原和/或明胶溶液的胶原和/或明胶的浓度，优选为0.1～75质量％，更优选为1～50质量％，进一步优选为5～50质量％。
(2)来自生姜根茎的酶
本发明的特征在于，以胶原和/或明胶作为底物，用来自生姜根茎的酶进行分解。生姜中含有生姜蛋白酶是公知的，但本发明中能够不提取、分离生姜蛋白酶地用全部生姜根茎的干燥粉碎物进行分解反应。此外，以前以来已知在生姜蛋白酶从N末端侧读取时，切断与Pro的C末端侧相邻的氨基酸残基与下一个氨基酸残基之间的肽键，但针对Hyp的效果完全未知。在本发明中，发现：如果使来自生姜根茎的酶与胶原作用，则在1阶段的酶反应中生成以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽。通过细菌胶原酶，则切断Hyp与Gly之间的肽键，因此不能高效地生成以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽。
对于本发明中使用的生姜根茎，只要具有胶原分解酶活性就不受特别的限制。能够广泛地使用市售的生姜根茎。
来自生姜根茎的酶可以是从生姜根茎提取的酶，也可以是从干燥生姜根茎中得到的酶。这是由于任一种均可将胶原分解而生成以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽。
本发明中，作为来自生姜根茎的酶，能够直接使用生姜根茎的干燥粉碎物。通过添加到胶原和/或明胶溶液中，能够不经过酶提取、纯化的工序、简单地进行分解反应。而且如后述的实施例所示，这是由于干燥粉碎物与直接使用生姜粉碎物的情况相比，胶原的分解率优异。
干燥生姜根茎能够通过由冻干、通风干燥、极性有机溶剂等带来的脱水、和它们的组合来制备。干燥生姜根茎能够将其粉碎、将粉碎物直接用作来自生姜根茎的酶。
另外，能够将生姜根茎在乙醇等极性有机溶剂中粉碎、经过滤等与有机溶剂分离而得的残渣干燥而得的物质用作来自生姜根茎的酶。在本发明中，这些都是生姜根茎的干燥粉碎物。从能够迅速地脱水、且可除去姜烯酚、姜酚等除酶以外的生姜根茎包含物的观点考虑，在极性有机溶剂中粉碎生姜根茎的方法优异。此外，虽然生姜根茎含有大量的纤维，但也可以是包含着纤维粉碎而得的粉碎物。粉碎能够通过研钵、捣磨机、球磨机、均化器、切割研磨机等进行。
(3)分解反应
本发明中，在胶原和/或明胶溶液中添加的来自生姜根茎的酶的量能够通过所使用的来自生姜根茎的酶的形状、其他进行适当选择，例如使用生姜根茎的干燥粉碎物的情况，为胶原和/或明胶溶液的1～30质量％，优选为2～20质量％，特别优选为5～10质量％。
通过分解反应，生成以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽。而且，也生成从C末端起第2位的氨基酸残基为Pro的、以X-Pro-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)、Gly-Pro-X(式中，X表示除Gly以外的氨基酸残基)表示的肽。此外，通过调整反应时间，也生成与Pro、Hyp的C末端侧相邻的氨基酸残基与下一个氨基酸残基之间的肽键的一部分没有被切断而残留的肽。因此，也生成以Gly-Pro-X-Gly-Pro-X(式中，X表示除Gly以外、可以相同也可以不同的氨基酸残基)、X-Hyp-Gly-Pro-X(式中，X表示除Gly以外的、可以相同也可以不同的氨基酸残基)表示的肽等。对于是否生成它们，能够通过取出反应液的一部分进行肽的定量分析而简单地确认。
反应优选在pH4.0～7.0下进行。这是由于在该范围以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽的生成率优异。更优选为pH4.0～低于5.6，特别优选为pH4.0～5.2。对反应液的pH与获得的胶原肽组合物的关系进行了详细研究，结果明确了在pH4.0～低于5.6的范围以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽的生成率优异。对于可同时生成的以X-Pro-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽，如果以各肽各自的生成量变成最大的pH进行判断，则在pH5.6～6.0生成率优异，因此根据肽种类而最适pH不同。这意思是可通过调节反应液的pH来制备得到的肽组成不同的胶原肽组合物。通过以pH4.0～低于5.6的范围进行反应，能够制造以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽的含量高的胶原肽组合物。此外，以pH4.0～5.6的范围进行反应，由此Gly-Pro-X-Gly-Pro-X(式中，X表示除Gly以外、可以相同也可以不同的氨基酸残基)、X-Hyp-Gly-Pro-X(式中，X表示除Gly以外、可以相同也可以不同的氨基酸残基)的生成量也增加。
反应中可以添加还原剂。如后述的实施例所述，明确了如果在胶原和/或明胶溶液中添加还原剂使其反应，则以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽的生成率优异。还原剂的浓度可以与来自生姜根茎的酶的添加量相对应地适当选择，使用含谷胱甘肽的酵母提取物的情况，以0.001w/v％以上发挥添加的效果，优选添加量为0.005～0.5w/v％。特别是在还原剂浓度为0.02～0.5w/v％的情况下，以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽的生成量大幅升高。此外，只要还原剂的浓度为0.005～0.5w/v％，Gly-Pro-X-Gly-Pro-X(式中，X表示除Gly以外、可以相同也可以不同的氨基酸残基)、X-Hyp-Gly-Pro-X(式中，X表示除Gly以外、可以相同也可以不同的氨基酸残基)的生成量就也增加。
作为还原剂，存在抗坏血酸、α-生育酚、谷胱甘肽等，特别优选含有SH基团的还原剂。作为含有SH基团的还原剂，有二硫苏糖醇、半胱氨酸、谷胱甘肽、含谷胱甘肽的酵母提取物等。由于含有SH基团的还原剂具有SH基团保护作用，因此推断与来自生姜根茎的酶所含有的酶的SH基团作用而使反应率升高。作为含有SH基团的还原剂，也能够使用来自酿母的含谷胱甘肽的酵母提取物等含谷胱甘肽的酵母提取物。
反应温度为室温～80℃，更优选为40～60℃。对反应时间没有限制，根据底物是胶原、或是明胶而不同。以明胶作为底物的情况，边振荡、搅拌边使其反应8～24h。由此生成胶原肽组合物。
反应的结束能够根据以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽的生成量来决定。此外，可同时生成的肽有以Gly-Pro-X-Gly-Pro-X(式中，X表示除Gly以外、可以相同也可以不同的氨基酸残基)、X-Hyp-Gly-Pro-X(式中，X表示除Gly以外、可以相同也可以不同的氨基酸残基)表示的肽等含有2个以上Pro和/或Hyp的肽。与进行分解相伴地，它们存在受到基于多个Pro和/或Hyp的进一步分解的可能性。因此，优选根据所需要的肽的含量推移来决定反应的结束时间。
(4)胶原肽组合物
本发明中，在以胶原和/或明胶作为底物的情况下，得到的胶原肽组合物含有Leu-Hyp-Gly、Ile-Hyp-Gly、Ala-Hyp-Gly、Ser-Hyp-Gly、Glu-Hyp-Gly、Phe-Hyp-Gly、Arg-Hyp-Gly等以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽中至少一种。而且，也混杂有氨基酸数为3～6、从C末端起第2位的氨基酸残基为Pro的肽。通过将根据本发明制造而得的胶原肽组合物依据规定方法进行纯化，能够分离出以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽。从这点考虑，本发明能够称作：以在胶原和/或明胶溶液中添加来自生姜根茎的酶进行分解为特征的以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽的制造方法。同样地也能够称作：以在胶原和/或明胶溶液中添加来自生姜根茎的酶进行分解为特征的以X-Pro-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)、Gly-Pro-X(式中，X表示除Gly以外的氨基酸残基)、Gly-Pro-X-Gly-Pro-X(式中，X表示除Gly以外、可以相同也可以不同的氨基酸残基)、或X-Hyp-Gly-Pro-X(式中，X表示除Gly以外、可以相同也可以不同的氨基酸残基)表示的肽的制造方法，。
另一方面，在以非羟基化胶原和/或来自非羟基化胶原的明胶作为底物的情况下，由于Pro的含量多，因此制造含有大量以X-Pro-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽的肽组合物。它们也通过纯化胶原肽组合物，能够高效地分离出以X-Pro-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽。由于通过将根据本发明制造而得的胶原肽组合物依据规定方法进行纯化，能够分离出以X-Pro-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽，因此本发明能够称作：以在非羟基化胶原和/或来自非羟基化胶原的明胶溶液中添加来自生姜根茎的酶进行分解为特征的以X-Pro-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽的制造方法。同样地也能够称作：以在非羟基化胶原和/或来自非羟基化胶原的明胶溶液中添加来自生姜根茎的酶进行分解为特征的以X-Pro-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)、Gly-Pro-X(式中，X表示除Gly以外的氨基酸残基)、Gly-Pro-X-Gly-Pro-X(式中，X表示除Gly以外、可以相同也可以不同的氨基酸残基)、或X-Hyp-Gly-Pro-X(式中，X表示除Gly以外、可以相同也可以不同的氨基酸残基)表示的肽的制造方法，。
以往以来，已知从N末端起第2位为Pro或Hyp的肽具有DPP-4阻碍活性。根据本发明的制造方法得到的胶原肽组合物也含有从N末端起第2位为Pro、Hyp的肽，如后述的实施例所述，明确了DPP-4阻碍活性优异。
由本发明的制造方法得到的胶原肽组合物含有0.01～25摩尔％以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽，更优选0.05～20摩尔％，特别优选0.1～10摩尔％。此外，基于胶原的一级序列、以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽的理论含有率根据胶原而不同，但约为20～25摩尔％。根据本发明的制造方法，通过使用来自生姜根茎的酶进行1阶段的反应，能够制造在胶原肽组合物中含有以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽的胶原肽组合物。
本发明的第二是含有由所述制造方法得到的胶原肽组合物的DPP-4阻碍剂。
根据本发明的胶原肽组合物的制造方法，生成以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽，如后述实施例所示地含有Leu-Hyp-Gly等DPP-4阻碍活性高的肽。由本发明的制造方法获得的胶原肽组合物进一步含有各种肽。在这些之中，也存在如Ala-Pro-Gly等这样DPP-4阻碍活性高的肽。这种DPP-4阻碍活性优异的肽的含量高的胶原肽组合物能够直接用作DPP-4阻碍剂。
本发明的DPP-4阻碍剂通过口服给药、肠道给药、鼻腔给药而阻碍DPP-4抑制血糖值升高。作为口服给药情况下的剂型，可以将胶原肽组合物作为溶液使用，或者在胶原肽组合物中配合赋形剂制备成片剂、细颗粒剂、丸剂或含剂等，也可以是收纳于胶囊中制成胶囊剂。给药量优选为0.1～50g/天，可以考虑治疗、预防、健康维持等目的、症状、体重、年龄等条件进行适当选择。另外，也可作为添加物摄取。
本发明的DPP-4阻碍剂可以直接使用上述胶原肽组合物，也可以将所述胶原肽组合物含有的特定肽分离，以其作为DPP-4阻碍剂使用。
本发明的第三是含有由所述制造方法获得的胶原肽组合物的血糖值升高抑制剂。
如前所述，由本发明的胶原肽组合物的制造方法获得的胶原肽组合物的DPP-4阻碍活性优异。而且，如后述的实施例所示，将上述胶原肽组合物对健康的小鼠给药，明确了可将饭后的最高血糖值显著性降低。作为肠促胰岛素激素的1种的GLP-1通过促进胰岛素分泌和抑制胰高血糖素分泌来抑制血糖值升高，但其作用依赖于血中糖浓度，仅在一定浓度以上的糖存在下发挥效果。近年来，进行了通过DPP-4阻碍来增强GLP-1的作用而使血糖值降低的尝试，判定DPP-4阻碍剂对于使糖尿病患者的高血糖值降低是有效的。另一方面，在空腹时血糖值正常的情况下，以何种程度抑制饭后的血糖值升高根据DPP-4阻碍剂的性质而不同。例如以往以来作为DPP-4阻碍剂已知的捷诺维的半衰期为9.6～11.6长，因此有时使血糖值过度降低。而上述胶原肽组合物能够通过糖给药前口服给药而使饭后的最高血糖值与对照组相比显著性降低，而且，由于血糖的饭后两小时值是与对照组大致相同的数值，因此使饭后的血中糖浓度稳定地降低。推断这样的血糖值推移是由于：由本发明的制造方法得到的胶原肽组合物来自可食用的胶原和/或明胶，因此作为结果，变成作为正常人的血糖值升高抑制优选的半衰期。根据本发明的胶原肽组合物的制造方法，能够制造安全性优异、可抑制正常人饭后的血糖值升高的胶原肽组合物，该胶原肽组合物对于代谢综合征等生活习惯病的预防、治疗是有效的。本发明的血糖值升高抑制剂可以直接使用上述胶原肽组合物，也可以将所述胶原肽组合物含有的特定肽分离，将其用作血糖值升高抑制剂。
本发明的血糖值升高抑制剂能够通过口服给药、肠道给药、鼻腔给药来抑制健康人饭后血糖值升高。给药量优选为0.1～50g/天，在饭前摄取其量的1/3。此外，给药量可以考虑体重、年龄等条件进行适当选择。另外，也可作为添加物摄取。
本发明的DPP-阻碍剂、血糖值升高抑制剂可以将其配合在食物中口服摄取。作为这种配合了本发明的DPP-4阻碍剂等的食品，能够与蔬菜、水果、含有乳酸菌等的果汁、其他饮料、果冻、酸奶、布丁、冰淇淋等半流动性食物、除此以外其他食材混合制备成固体食物。
实施例
接着举出实施例对本发明进行具体说明，但这些实施例不对本发明任何限制。
(制造例1)
将生姜根茎在30℃冷冻后，添加相对于冷冻生姜5倍量(容量/重量)的30℃的冷乙醇，用切割研磨机充分粉碎，得到浆料。过滤所述浆料除去乙醇，进一步冷冻干燥该残渣，得到生姜根茎有机溶剂干燥粉碎物。
(制造例2)
用切割研磨机粉碎生的生姜根茎，将其制成生姜根茎粗粉碎物。
(制造例3)
将生姜根茎切片，以25～50℃的温度、温风通风3小时进行干燥，得到生姜根茎的干燥物。用切割研磨机粉碎其成粉状，将其制成生姜根茎通风干燥粉碎物。
(实施例1)
用pH4.8的0.1M醋酸钠缓冲液制备来自牛的明胶5质量％溶液。在该溶液中加入制造例1中制备的生姜根茎有机溶剂干燥粉碎物、制造例2中制备的生姜根茎粗粉碎物、制造例3中制备的生姜根茎通风干燥粉碎物，相对于来自牛的明胶以质量换算为1/20倍量，以成为0.2w/v％的方式添加含谷胱甘肽的酵母提取物(株式会社兴人社制，Hithion extract YH-15(谷胱甘肽含有率为15％以上))，边以50℃振荡、搅拌边使其反应16h。反应结束后静置，回收上清得到肽溶液。此外，生姜根茎粗粉碎物换算成干燥重量添加。
将得到的肽溶液在下述LC/MS测定条件下分离，对构成寡肽的一部分的含量进行定量。另外，对于用作原料的来自牛的明胶也与上述同样地测定寡肽的含量。将结果示于表1。
如表1所示，对于来自生姜根茎的酶，即使使用生姜根茎粗粉碎物、生姜根茎通风干燥粉碎物和生姜根茎有机溶剂干燥粉碎物中任一种的情况，均会生成以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽。与生姜根茎粗粉碎物相比，在使用生姜根茎通风干燥粉碎物、生姜根茎有机溶剂干燥粉碎物的情况下，以上述式表示的肽的含量显著增高。
(1)LC/MS测定条件
高效液相色谱：1200Series(Agilent Technologies)，
质量分析装置：3200QTRAP(AB Sciex)，
分析柱：Allure PFPP 5μm，4.6mmi.d.×150mm(RESTEK)，
柱温：40℃，
流动相：A液；0.1％甲酸，B液；100％乙腈，
梯度条件：
0～7.5分钟：A液100％，
7.5～17.5分钟：A液100～70％；B液0～30％，
17.5～20分钟：A液70～50％；B液30～50％，
20～31分钟：A液50％；B液50％，
31.1～36分钟：A液1％；B液99％，
36.1分钟～45分钟：A液100％，
流速：0.6mL/min。
(2)质量分析条件：
离子化：ESI，阳极，
分析模式：Multiple Reaction Monitoring(MRM)模式，
离子喷雾电压：3kV，
离子源温度：600℃。
(实施例2)
用pH4.8的0.1M醋酸钠缓冲液制备来自牛的明胶5质量％溶液。在该明胶溶液中加入与制造1同样新制备的生姜根茎有机溶剂干燥粉碎物，相对于来自牛的明胶以质量换算为1/20倍量，进一步分别以成为0w/v％、0.001w/v％、0.005w/v％、0.02w/v％、0.1w/v％以及0.5w/v％的方式添加含谷胱甘肽的酵母提取物，边以50℃振荡、搅拌边使其反应16h。反应结束后静置，回收上清得到肽溶液。将这些肽溶液在与实施例1同样的LC/MS测定条件下分离，以及对构成其的寡肽的含量进行定量。将寡肽的含量示于表2。
如表2所示，在将生姜根茎有机溶剂干燥粉碎物以相对于明胶为1/20倍量添加的情况下，如果以成为0.02～0.5w/v％的方式添加含谷胱甘肽的酵母提取物，则肽的生成率大幅增加。
(实施例3)
通过醋酸钠缓冲液或磷酸钠缓冲液制备pH为4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、6.4及6.8的溶液，在其中溶解实施例1中使用的来自牛的明胶制备成5质量％明胶溶液。在该溶液中分别加入实施例2中制备的生姜根茎有机溶剂干燥粉碎物，相对于来自牛的明胶以质量换算为1/20倍量，进一步以成为0.2w/v％的方式添加含谷胱甘肽的酵母提取物(谷胱甘肽含有率为15％以上)，边以50℃振荡、搅拌边使其反应16h。反应结束后静置，回收上清得到肽溶液。将这些肽溶液在与实施例1同样的LC/MS测定条件下分离，以及对构成其的寡肽的含量进行定量。将寡肽的含量示于表3。
如表3所示，如果用各肽各自的生成量为最大的pH进行判断，则在pH4.0～5.2的范围以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽的生成率增加。另一方面，可同时生成的X-Pro-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)在pH5.6～6.0的范围生成率优异。在用来自生姜根茎的酶进行分解的情况下，启示了通过调节反应液的pH，可调整获得的胶原肽组合物含有的肽的量。
(实施例4)
使用与制造例1同样新制备的生姜根茎有机溶剂干燥粉碎物，将其添加量变更成相对于来自牛的明胶以质量换算为1/10倍量，除此之外，与实施例1同样地进行操作，得到肽溶液。另外，用重组人明胶(株式会社免疫生物研究所制，Neosilk-human collagen I)来代替来自牛的明胶，除此之外，与上述同样地进行操作，得到肽溶液。
对于这些肽溶液，在与实施例1同样的LC/MS测定条件下分离，对肽溶液含有的寡肽的一部分的含量进行定量。另外，对于该肽溶液，按照下述测定DPP-4阻碍率和IC50值。将测定的寡肽的含量与IC50值示于表4。将由来自牛的明胶得到的肽组合物的DPP-4阻碍曲线示于图1，由重组人明胶得到的肽组合物的DPP-4阻碍曲线示于图2。
如表4的IC50值所示，由重组人明胶得到的肽组合物与由来自牛的明胶得到的肽组合物相比，DPP-4阻碍活性优异。这意思是例如通过以由蚕得到的重组蛋白质表达体系制备的“不含有Hyp的重组人胶原”为底物，与以“含有Hyp的来自天然的胶原、明胶”为底物的情况相比，可制造DPP-4阻碍活性优异的肽组合物。DPP-4阻碍活性的不同来自含有的各肽相对于DPP-4阻碍活性的IC50值。如前所述，构成胶原的Hyp是在生物合成胶原时通过脯氨酸羟基化酶对Pro进行羟基化而生成的。在胶原序列-Gly-X-Y-中，X位的Pro几乎没有被羟基化，但大量Y位的Pro被羟基化。如对寡肽相对于DPP-4阻碍活性的IC50值进行了评价的表6所示，例如如果将X-Hyp-Gly与X-Pro-Gly进行比较，则X-Pro-Gly的DPP-4阻碍活性强。所以推断得到了下述结果：重组人胶原Y位的Pro的羟基化率低，得到的肽组合物相对于DPP-4阻碍活性的IC50值变低，DPP-4阻碍活性优异。
测定方法
(1)DPP-4阻碍率的测定方法
将在50mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.5)中溶解有试样的样品溶液35μl、与在50mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.5)溶解的DPP-4(西格玛公司制，来自猪肾脏；8.6mU/ml)15μl在微板孔(NUNC公司制，商品名“237015”)中混合，37℃培育10分钟。
在其中添加和混合预先保温在37℃的底物溶液(以10μM在50mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.5)中溶解有甘氨酰脯氨酸-4-甲基香豆素-7-酰胺(Gly-Pro-MCA)的溶液)50μl，以37℃使其反应20分钟。
用酶标仪型荧光检测器(Corona电气公司制，商品名“SH-9000”)随时间地测定被DPP-4游离出的7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的荧光强度。此外，测定波长以380nm的激发波长、460nm的测定波长进行。此外，以使用相同量50mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.5)来代替样品的样品作为对照，测定荧光强度。
DPP-4的活性用荧光强度变化量在反应时间中的平均斜率表示，对于DPP-4阻碍率，以对照为100％，将所述对照减去样品的活性而得的部分作为抑制率(100％)计算出。
(2)IC50值的测定方法
以上述DPP-4阻碍率的测定方法为基准，由使样品浓度变化而得到的阻碍率计算出DPP-4活性在反应体系1ml换算时的50％抑制浓度(IC50值)。
(实施例5)
用pH4.8的0.1M醋酸钠缓冲液制备来自牛的明胶5质量％溶液。在该溶液中加入与制造例1同样新制备的生姜根茎有机溶剂干燥粉碎物，相对于来自牛的明胶以质量换算为1/10倍量，以成为0.2w/v％的方式添加含谷胱甘肽的酵母提取物(谷胱甘肽含有率为15％以上)，边以50℃振荡、搅拌边使其反应16h。将得到的反应液过滤后，回收滤液，获得肽溶液。对该溶液灭菌处理后，用喷雾干燥器干燥，得到肽粉末。
对将得到的肽粉末给药的情况下血糖值的变动进行评价。
(1)将25只8周龄C57BL/6J雄性小鼠驯化饲养一周(日本Charles River)。糖负荷试验前7天期间对各鼠给予0.25ml蒸馏水，驯化成口服给药。
(2)从糖负荷试验的前一天16点起使其除水以外断食18小时。测定空腹时血糖值，以空腹时血糖值相等的方式分成5组(n＝5)。五组由阳性对照组、胶原肽组合物给药组(400mg/kg、1000mg/kg、2000mg/kg)、阴性对照组构成。
(i)对阳性对照组：在给予20w/v％糖水溶液1小时前，以3mg/kg将西他列汀(MSD公司制，捷诺维)口服给药。
(ii)对胶原肽组合物给药组：在给予药葡萄糖15分钟前，将上述肽粉末溶解在蒸馏水中以给药量为400mg/kg、1000mg/kg、2000mg/kg的方式口服给药。
(iii)阴性对照组：在给予糖15分钟前，以20ml/kg口服给予蒸馏水。
(3)给予糖。在给予糖时，以10ml/kg给予20w/v％糖水溶液。
(4)给予葡萄糖后，在15、30、60、120分钟从尾部采血，用简易血糖测定器(ArkrayFactory制，GT-164)测定血糖值。将结果示于图3。此外，组间统计学上的显著性差异用Aspin-Welch的t检验。在图3中，*表示相对于蒸馏水给药组P＜0.05的显著性差异，**表示相对于蒸馏水给药组P＜0.01的显著性差异。
(5)在测定血糖时用肝素采血管进行25μl的采血，使用ELISA试剂盒(LbisInsulin-Mouse-U型)测定胰岛素的浓度。将结果示于图4。组间统计学上的显著性差异用Aspin-Welch的t检验。在图4中，*表示相对于蒸馏水给药组P＜0.05的显著性差异，**表示相对于蒸馏水给药组P＜0.01的显著性差异。
如图3所示，给予注射用水的阴性对照组中，从给予糖前为血糖值60mg/dL升高到在给予糖15分钟后为440mg/dL，在给予糖30分钟为380mg/dL，在60分钟后为280mg/dL逐渐减少。而阳性对照组中，在给予糖15分钟后升高到220mg/dL，但在给药后以30分钟～120分钟半衰到125～150mg/dL，并维持该值。
而胶原肽组合物给药组中，1000mg/kg给药组和2000mg/kg给药组在给予糖15分钟后均为250mg/dL，显示出了与阴性对照组显著性低的血糖值。其后，给药30分钟时为220～250mg/dL、给药120分钟时为250～280mg/dL，完全没有观察到血糖值的剧烈变化。但是，400mg/kg的给药组显示出了与阴性对照组大致相同的血糖值的推移。
如图4所示，对于胶原肽组合物给药组，与阴性对照组相比，血中胰岛素浓度升高。由此，推断出血糖值升高抑制效果的一部分是促进胰岛素分泌和抑制分解。另一方面，与阳性对照组相比，其作用温和，没有得到药剂程度的效果。
(实施例6)
将与实施例5同样新制备的肽粉末对9位健康正常人给药，观察对饭后血糖值的作用。
(1)饮用溶解有25g肽粉末的水100ml、或作为对照的水100ml。在饮用肽粉末后经过30分钟后，饮用Trelan G液75g(味之素制药株式会社制，含葡萄糖75克)225ml。饮用75g的Trelan G液后，测定30分钟后、60分钟后、120分钟后的血糖值。在1周后，更换水和肽粉末进行同样的糖负荷试验。将结果示于图5。此外，组间统计学上的显著性差异使用Tukey-Kramer test。在图5中，*表示对于蒸馏水给药组P＜0.05的显著性差异。
(2)计算出上述(1)的血糖值到120分钟后的累积值(AUC)。将结果示于图6。此外，组间统计学上的显著性差异使用Tukey-Kramer test。在图5中，*表示对于蒸馏水给药组P＜0.01的显著性差异。
如图5所示，如果对健康正常人口服摄取由本发明的制造方法得到的胶原肽组合物，则统计学上显著性地抑制了在摄取葡萄糖60分钟中的饭后血糖值升高。显示出了葡萄糖摄取120分钟的饭后血糖值进一步降低，抑制葡萄糖摄取后血糖值的剧烈变化。同样地如图6所示，血糖值到120分钟后的累积值与对照组相比，显示出了统计学上显著性低值。
(比较例)
制备含有2mM氯化钙、来自牛的明胶5质量％溶液，用1M碳酸钠调节至pH7.8。以成为0.1w/v％的方式在该溶液中添加来自梭菌属的胶原酶(罗氏公司制，Liberase C/T)，边以30℃振荡、搅拌边使其反应20h，在沸水中加热5分钟停止酶反应，得到肽溶液。将该肽溶液在与实施例1同样的LC/MS测定条件下分离，对构成其的寡肽的含量进行定量。将寡肽的含量示于表5。另外，用得到的肽溶液与实施例4同样地进行操作测定IC50值，IC50值为0.21mg/ml。
如表5所示，使用来自梭菌属的胶原酶的情况，没有生成以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽。
(参考例)
对于实施例1中得到的肽溶液含有的寡肽的一部分，与实施例4同样地测定IC50值。将结果示于表6。
如表6所示，以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基)表示的肽包含对于DPP-4阻碍活性的IC50值低的肽。另外，胶原肽组合物含有的肽也包含针对DPP-4阻碍活性的IC50值低的肽。
[表1]
(mg/g)
[表2]
(mg/g)
底物：来自牛的明胶，pH：4.8，酶/明胶比：1/20
[表3]
(mg/g)
底物：来自牛的明胶，含有含谷胱甘肽的酵母提取物：0.02w/v％，
酶/明胶比：1/20
[表4]
(mg/g)
pH：4.8，酶/明胶比：1/10，
含有含谷胱甘肽的酵母提取物：0.02w/v％
[表5]
来自梭菌属的胶原酶分解物(mg/g)
寡肽 含量
GlyProHyp 38.000
GlyProAla 6.800
GlyProVal 3.445
GlyProSer 6.500
GlyProGln 4.900
LeuHypGly 0.000
IleHypGly N.D.
AlaHypGly N.D.
SerHypGly N.D.
GluHypGly N.D.
AlaProGly N.D.
LeuProGly N.D.
LeuHypGlyProAla N.D.
GlyProIleGlyProVal 0.007
IC50值 0.21mg/ml
[表6]
本发明不受上述实施方式限定，可进行各种变形和应用。另外，也可以将上述实施方式的各构成要素自由组合。
本发明基于2012年7月25日申请的日本专利申请2012-164522号。将日本国专利申请2012-164522号说明书、专利权利要求的范围、附图全部作为参照援引至本说明书中。
产业上的可利用性
根据本发明的制造方法，能够提供DPP-4阻碍活性优异的DPP-4阻碍剂、血糖值升高抑制剂，是有用的。

Claims (7)

1.一种胶原肽组合物的制造方法，其特征在于，在胶原和/或明胶溶液中添加来自生姜根茎的酶进行分解，生成含有以X-Hyp-Gly表示的肽的肽组合物，X-Pro-Gly式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述的胶原肽组合物的制造方法，其特征在于，将生姜根茎的干燥粉碎物用作所述来自生姜根茎的酶。
3.根据权利要求1或2所述的胶原肽组合物的制造方法，其特征在于，将含有谷胱甘肽的酵母与所述来自生姜根茎的酶一同以0.005～0.5w/v％的范围添加，和/或调节到pH4.0～6.0的范围使其反应。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的胶原肽组合物的制造方法，其特征在于，所述肽组合物所含的以所述式表示的肽的含量是在所述胶原和/或明胶的0.01摩尔％以上。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的胶原肽组合物的制造方法，其特征在于，进一步含有以X-Pro-Gly表示的肽，X-Pro-Gly式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基。
6.一种DPP-4阻碍剂，其特征在于，含有由权利要求1～5中任一项所述的制造方法得到的胶原肽组合物。
7.一种血糖值升高抑制剂，其特征在于，含有由权利要求1～5中任一项所述的制造方法得到的胶原肽组合物。
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